MXPA06009644A - Deteccion de papilomavirus humano. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a los metodos in vitro para el tamizaje en personas para detectar la presencia de papilomavirus humano (PVH), el cual presenta perdida de regulacion de la expresion del mRNA E6/E7 y la perdida de la multiplicacion y/o expresion de una proteina E6 de longitud completa que codifica el pre-mRNA estabilizado. En particular, la invencion propone los metodos in vitro para el tamizaje de anormalidades celulares persistentes o lesiones CIN III persistentes, cancer in situ o lesiones intraepiteliales escamosas de alto grado (HSIL). Los metodos se utilizan en el contexto de tamizaje de cancer cervical.

Description

DETECCIÓN DE PAPILQMAVIRUS HUMANO Campo de la invención La presente invención se refiere a los métodos in vitro para la detección en individuos humanos de la presencia de virus de papiloma humano (VPH) que muestra perdida de regulación de la expresión del mRNA E6/E7 y pérdida de la reproducción y/o expresión de un pre-mRNA estabilizado que codifica la proteína E6 de longitud completa. En particular, la invención propone métodos in vitro para la detección de infección por VPH transformante, persistente, equivalente a las anormalidades de células persistentes o lesiones de CIN III persistentes, cáncer in situ o lesiones intraepiteliales, escamosas de alto grado (HSIL) . Los métodos son útiles en el contexto de la detección de cáncer cervical.

Antecedente de la invención El carcinoma cervical es una de las enfermedades malignas más comunes en todo el mundo y es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad entre mujeres (Parkin DM, Pisani P, Ferlay J (1993) Int J Cáncer 54: 594-606; Pisani P, Parkin DM, Ferlay J (1993) Int J Cáncer 55: 891-903) . En 1996, en Estados Unidos se pronosticaron 15,700 nuevos casos de cáncer cervical invasivo, y la Organización Mundial de la salud (1990) estima una incidencia anual en todo el mundo de 450,000 casos. La tasa de incidencia anual es diferente en las distintas partes del mundo, abarcando desde 7.6 por 100,000 en el oeste de Asia hasta 46.8 por 100,000 en Sudáfrica (Parkin y col., 1993 ib id.) .

El concepto actual de carcinoma cervical es que es una enfermedad de múltiples etapas, muchas veces se desarrolla durante 10.25 años. El carcinoma de células escamosas, invasivo, del cuello del útero se representa por penetración a través de la lámina basal y la invasión del estroma o la propria de la lámina epitelial. El curso clínico del carcinoma cervical muestra considerables variaciones. El pronóstico ha sido relacionado con la etapa clínica, involucrando los ganglios linfáticos, masa tumoral primaria, el tipo histológico, la profundidad de la invasión y la permeación linfática (Delgado G, y col., (1990) Gynecol Oncol 38: 352-357). Algunas pacientes con características de tumor menos favorables tienen un resultado relativamente bueno, mientras que otras sufren una consecuencia fatal de una enfermedad al principio limitada. Esto muestra una clara necesidad de marcadores para caracterizar mejor los carcinomas cervicales recién diagnosticados, para administrar terapéutica de acuerdo con el riesgo (Ikenberg H, y col., Int. J. Cáncer 59: 322-6. 1994) .

La epidemiología del cáncer cervical ha mostrado una fuerte asociación con patrones religiosos, maritales y sexuales. Casi cien estudios con control de casos han examinado la relación entre VPH y neoplasia cervical, y casi todos han encontrado asociaciones positivas (monografías de IARC, 1995) . Es fuerte la asociación, consistente y específica a un número limitado de tipos virales (Muñoz, N, Bosch FX (1992) . HPV and cervical neoplasia: review of case-control and cohort studies. IARC Sci Publ. 251-261) . Entre los estudios que dan más información, fuertes asociaciones con el DNA del HPV 16 han sido observados con notable consistencia de cáncer invasivo y lesiones CIN de alto grado, descartando la posibilidad de que esta asociación se pueda explicar por casualidad, sesgo o confusión (monografías IARC, 1995) . Evidencia indirecta sugiere que el DNA del HPV detectado en células cancerosas es un buen marcador de la función de la infección por HPV temprana en la carcinogenesia. Se ha documentado relación dosis-respuesta entre carga viral creciente y el riesgo de carcinoma cervical (Muñoz y Bosch, 1992 ibid) . En algunas series más grandes hasta 100% de los tumores fueron positivos para HPV, pero la existencia de carcinomas cervicales que dan negativa la prueba del virus es todavía polémica (Meijer CJ, y col., (1992) Detection of human papillomavirus in cervical scrapes by the polymerasa chain reaction in relation to cytology: possible implications for cervical cáncer screening. IARC Sci Publ 271-281; Das BC, y col., (1993) Cáncer 72: 147-153) .

Los tipos de HPV que se encuentran con mayor frecuencia en carcinomas cervicales de células escamosas son HPV 16 (41%-86%) y 18 (2%-22%) . Además de HPV 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 54, 56, 58, 59, 61, 66 y 68 también han sido encontrados (IARC, monografías, 1995) . Durante la Conferencia Internacional HPV 2000 en Barcelona los HPV 16, 18, 31 y 45 fueron definidos como de alto riesgo, mientras que los HPV 33, 35, 39, 51, 52, 56, 58, 59, 68 fueron definidos como de riesgo intermedio (Keerti V. Shah. P71) . Los trece HPV de alto riesgo más los de riesgo intermedio, juntos se mencionan muchas veces como tipos de HPV asociados con cáncer.

Diversos estudios han explorado la función potencial de las pruebas del HPV para la detección cervical (ver Cuzick y col., A systematic review of the role of human papillomavirus testing withing a cervical screening programme. Healt Technol Assees 3: 14. 1999).

Reid y col., (Reid y col., (1991) Am J Obstet Gynecol 164: 1461-1469) fueron los primeros en demostrar una función para el análisis del HPV en un contexto de escrutinio. Este estudio se llevo a cabo en mujeres de alto riesgo en clínicas de enfermedades de transmisión sexual y ginecólogos especialistas, y utilizó una hibridación Southern blot sensible (poco restrictiva) para la detección de HPV. Participó un total de 1012 mujeres, y también se consideró la cervicografía como posible complemento a la citología. En total se encontraron 23 lesiones CIN II/III, pero solo 12 fueron detectadas por citología (sensibilidad 52%, especificidad 92%). El análisis HPV encontró 16 lesiones de alto grado.

Bauer y col., (Bauer HM, y col., (1991) JAMA 265: 472-477) documentan un estudio precoz basado en PCR utilizando los cebadores MY09/11 (Manos M, y col., (1990) Lancet 335: 734) en mujeres jóvenes que asistían a sus pruebas de frotis de rutina (estudiantes universitarias) . Encontraron una tasa positiva de 46% en 467 mujeres, la cual fue mucho mayor que con el análisis de transferencia puntual (dot blot) (11%) .

En un estudio que utilizaba PCR con cebadores GP5/6 (Van Den Brule AJ, y col., (1990) J Clin Microbiol 28: 2739-2743) van der Brule y col., (Van Den Brule AJ, y col., (1991) Int J Cáncer 48: 404-408) demostraron una muy fuerte correlación de la positividad del HPV con neoplasia cervical según se evaluó por citología. En mujeres mayores (edades de 35-55) con pruebas de citología negativas, la tasa de positividad de HPV fue de solo 3.5%, y esta se redujo a 1.5% si solo se consideraban los tipos 16, 18, 31 y 33, mientras que mujeres con carcinoma histológico in si u todas dieron positiva la prueba de HPV, y 90% tenía uno de los cuatro tipos anteriores. Las mujeres con anormalidades citológicas menos graves tuvieron menores tasas de positividad para HPV en una forma escalonada, mostrando una clara tendencia.

Roda Housman y col., (Roda Housman AM, y col., (1994) Int J Cáncer 56: 802-806) ampliaron estas observaciones estudiando a otras 1373 mujeres con frotis anormales, este estudio también confirmo la creciente gasa de positividad con creciente gravedad de los resultados del frotis. También observaron que el nivel de homogeneidad de HPV disminuyó de 22 tipos para frotis de bajo grado a 10 tipos de "alto riesgo" para frotis de alto grado. Este artículo no incluyó a ninguna mujer con prueba citológica negativa, ni se confirmó la enfermedad citológica por histología.

Cuzick y col., (Cuzick y col., (1992) Lancet 340: 112-113; Cuzick y col., (1994) Br J Cáncer 69: 167-171) fueron los primeros en documentar que el análisis del HPV proporcionó información útil para el triage de anormalidades citológicas detectadas durante el tamizaje aleatorio. En un estudio de 133 mujeres enviadas a colposcopia, ellos encontraron un valor predictivo positivo de 42%, el cual fue semejante al valor para discariosis moderado. Los resultados fueron más sorprendentes para HPV 16, donde se encontraron 39 de 42 mujeres que dieron positiva la prueba de HPV 16 con CIN de alto grado encontrado por bíopsia. Este estudio señala la importancia de evaluar la carga viral y solo considerar los elevados niveles de los tipos de alto riesgo como positivos.

Cox y Col., (Cox JT, y col., (1995) Am J Obstet Gynecol 172: 946-954) demostraron una función para el análisis del HPV utilizando el sistema Irbid Capture™ (DIGINE Corporation, Gaithersburg, MD, USA) para detectar mujeres con frotis en el limite. Esta prueba se hizo en 217 de estas mujeres desde un servicio de referencia universitaria, y se encontró una sensibilidad de 93% para CIN II/III en comparación con 73% para citología repetida. Se encontró que con carga viral alta se debía mejor más el desempeño reduciendo los positivos falsos. Cuando se tomó como corte 5 RLÜ, se encontró un PPV de aproximadamente 24% sin pérdida de sensibilidad.

WO 91/08312 describe métodos para determinar el pronóstico de personas infectadas con HPV, los cuales consisten en medir el nivel de la actividad del HPV detectando transcritos de todos o una parte de los genes de HPV E6 y/o E/ en una muestra, y comparando las mediciones de la actividad de HPV con una relación previamente establecida entre la actividad y el riesgo de progreso a displasia cervical o carcinoma grave.

WO 99/29890 describe los métodos para la evaluación de infección por HPV con base en la medición y análisis de los niveles de expresión génica. En particular, WO 99/29890 describe los métodos que se basan en la medición de los niveles de expresión de dos o más genes de HPV (por ejemplo HPV E6, E7 Ll y E2) y luego la comparación de la relación de la expresión de las combinaciones de estos genes para obtener un indicio de la etapa de la enfermedad ocasionada por HPV en un paciente .

Los presentes inventores han determinado anteriormente que es posible hacer una evaluación clínica útil de la enfermedad asociada con HPV basándose solo en una determinación positiva/negativa sencilla de la expresión de los transcritos de mRNA E6/E7, sin la necesidad de mediciones cuantitativas exactas de los niveles de expresión. Este método es sencillo desde el punto de vista técnico y, en una modalidad preferida, se puede automatizar en un formato de rendimiento medio a elevado. Este método esta descrito con detalle en la Solicitud Internacional publicada del solicitante WO 03/57914.

El método descrito en WO 03/57914 preferentemente se lleva a cabo utilizando el equipo Pre-Tect HPV-Proofer™, el cual está a la disposición en el comercio de Norchip AS. El ensayo HPV-Proofer proporciona tres niveles de información: (1) la identificación del mRNA a partir de cinco tipos de HPV diferentes, específicos (16, 18, 31, 33 y 45); (2) la determinación de la presencia del oncogen mRNA E6/E7 de HPV; y (3) la determinación de la presencia de mRNA E6/E7 de longitud completa que indica la desregulación.

Cada muestra se somete a tres reacciones NASBA doble, por tanto, se reportan seis resultados por cada muestra. Se incluyen controles negativos cada vez para vigilar la contaminación. Se incluyen controles positivos para todos los tipos de HPV para vigilar el desempeño del reactivo. El mRNA de U1A de control celular intrínseco (gen de mantenimiento celular) vigila todo el procedimiento de la prueba para eliminar los posibles negativos falsos. No es posible para el ensayo del HPV-Proofer detectar el DNA de HPV. Para el análisis, interpretación y reporte automatizado de los datos de rutina se utiliza el Software PreTec Analysis Software (PAS) .

La utilidad del ensayo HPV-Proofer ha sido evaluada en al menos 12 estudios clínicos, los inventores presentes ahora han determinado que el ensayo Pre-Tec HPV-Proofer™ no detecta viriones del HPV, aunque detecta el mRNA del HPV a partir de HPV 16, 18, 31, 33 y 45. En cambio, la presencia del transcrito es E6/E7, según se puede determinar con el ensayo HPV-Proofer, indica una pérdida de regulación transcripcional y pérdida de la capacidad para replicar, y/o la expresión de un pre-mRNA de E6/E7 estabilizado que codifica la proteína E6 de longitud completa. Es imposible para el Pre-Tec HPV-Proofer detectar partículas infecciosas del virus HPV, puesto que el virus no puede producir viriones cuando se pierde la regulación transcripcional y se integra el virus. Los virus dentro de las células detectadas como positivas para la expresión de E6/E7 utilizando HPV-Proofer han dejado sus ciclos de vida normales y pierden su regulación del control de la transcripción de los promotores de todos los transcritos E6/E7, o pierde la capacidad de empalme, dejando atrás el transcrito E6/E7 o incluso expresa una forma estabilizada del pre-mRNA de longitud completa que codifica la proteína E6 de longitud completa.

Los inventores también han observado ' que la expresión de los transcritos de mRNA E6/E7 en células infectadas con HPV se correlaciona con los cambios celulares caracterizados como la presencia de núcleos celulares agrandados, aneuplodia (normalmente más de 5 o 9 centrómeros por célula) y también mitosis. Las células que son positivas para la expresión de E6/E7 (por ejemplo utilizando la prueba Pre-Tec HPV-Proofer) tienen algo equivocado, presentan anormalidades celulares y tienen grandes núcleos celulares mutados. Estos resultados también se correlacionan con la caracterización citológica e histológica de lesiones cervicales. Las células que carecen de lesiones de bajo grado definidas por medios citológicos o histológicos, con núcleos celulares agrandados y con menos de 9 centrómeros no dan resultados positivos para la expresión de mRNA de E6/E7 con el HPV-Proofer.

Por tanto, los inventores han determinado que la expresión de los transcritos E6/E7 de papiloma virus humano puede utilizarse como indicador molecular de la presencia de anormalidades celulares asociadas con la presencia de una infección persistente con el virus de papiloma humano. La detección de la expresión de E6/E7, por tanto, se puede utilizar para diferenciar entre lesiones cervicales de alto y bajo grado. En particular, la detección de la expresión de E6/E7 puede discriminar entre muestras CIN III definidas por medios histológicos sin células aneuploidicas y aquellas que tienen células aneuploidicas; las muestras positivas para el mRNA de E6/E7 que codifica la proteína E6 de longitud completa se clasifican como muestras que tienen células aneuploidicas. La detección de la expresión de E6/E7 también puede diferenciar entre casos CIN III o CIN II (casos HSIL) definidos por medios histológicos que van en retroceso y aquellos en los que persiste o avanza la infección; las muestras positivas para el mRNA de E6/E7 que codifica la proteína E6 de longitud completa se clasifican como muestras que tienen una infección que tal vez progrese si se deja sin tratamiento.

Los presentes inventores todavía han concluido que: (1) la incidencia de la expresión de los oncogenes de E6/E7 aumenta con la gravedad de la lesión. (2) la detección oncogénica de HPV mediante la evaluación de la expresión de E6/E7 opcionalmente en combinación con la tipificación de HPV, es un predictor poderoso de lesiones de alto grado. (3) la gran mayoría de los cánceres cervicales (96%) contienen al menos uno de los cinco principales tipos cancerígenos de HPV (HPV 16, 18, 31, 33 y 45) . (4) quienes dieron positiva la prueba para la expresión de E6/E7 con Pre-Tect HPV-Proofer™ con mucho mayor probabilidad mantenían una infección persistente que no dan resultados positivos con HPV-Proofer.

Por consiguiente, en un primer aspecto, la invención propone un método in vi tro para detectar en humanos la presencia de virus de papiloma humano en por lo menos una célula o tejido, en donde el virus de papiloma humano presenta pérdida de regulación de la expresión del mRNA de E6/E7 y pérdida de la reproducción y/o expresión de un pre-mRNA estabilizado que codifica una proteína E6 de longitud completa, el método consiste en detectar la presencia de los transcritos de mRNA del gen de E6/E7 de un virus de papiloma humano que codifique la proteína E6 de longitud completa en una muestra de análisis que contenga mRNA obtenido de la célula o tejido, en donde la presencia de tales transcritos de mRNA E6/E7 en la muestra se toman como indicación de la presencia del virus de papiloma humano que presenta pérdida de regulación de la expresión de mRNA de E6/E7 y pérdida de la reproducción y/o expresión de un pre-mRNA estabilizado que codifica la proteína E6 de longitud completa en la célula o tejido.

En un segundo aspecto, la invención proporciona un método in vitro para detectar en humanos la presencia de cambios celulares caracterizados por núcleos celulares agrandados y aneuploidia celular en por lo menos una célula o tejido, cuyo método consiste en detectar la presencia de los transcritos de mRNA del gen E6/E7 del virus de papiloma humano que codifica una proteína E6/E7 de longitud completa en una muestra de análisis que contiene mRNA obtenido de la célula o tejido, en donde la presencia de estos transcritos de mRNA E6/E7 en la muestra se toman como indicio de que la célula o tejido sometido a prueba presenta cambios celulares.

En un tercer aspecto, la invención proporciona un método in vi tro para detectar en humanos la presencia de infección transformante persistente con virus de papiloma humano en por lo menos una célula o tejido, cuyo método consiste en detectar en el individuo la expresión de los transcritos de mRNA del gen de E6/E7 del virus de papiloma humano que codifican una proteína E6 de longitud completa en una muestra de prueba que contienen mRNA obtenido de la célula o tejido, en donde las personas que dan positiva la expresión de estos transcritos de mRNA del gen de E6/E7 del virus de papiloma humano se clasifican como individuos que tienen una infección transformante, persistente, con virus de papiloma humano en la célula o tejido.

Una "infección transformante, persistente" con uno de los tipos de HPV 16, 18, 31, 33 ó 45 identificado por la presencia de transcritos de mRNA E6/E7 que codifican la proteína E6 de longitud completa a partir de uno de estos subtipos de HPV, se considera que es equivalente a las anormalidades celulares persistentes o lesiones CIN III persistentes, cáncer in situ o lesiones escamosas de alto grado (HSIL) según se evalúa por citología o histología. Por tanto, el método del tercer aspecto de la invención propone un método para detectar la infección transformante, persistente, con virus de papiloma humano equivalente a anormalidades celulares persistentes o lesiones CIN III persistentes, cáncer in situ o lesiones intraepiteliales escamosas de alto grado (HSIL) .

La infección transformante, persistente por HPV, según se define por la presencia persistente de mRNA de HPV E6/E7 que codifica la proteína E6 de longitud completa puede correlacionarse directamente con CIN II positivo, persistente, y por tanto sirve como marcador pronóstico en el programa de detección cervical. En particular, el método de la invención puede ser utilizado en el triage de mujeres en las que se ha identificado que tienen células escamosas atípicas de significancia no determinada (ASCUS) o lesión intraepitelial escamosa de bajo grado (LSIL) con base en la citología/histología. El manejo de pacientes como estas es problemático porque solo una pequeña proporción progresará a neoplasia intraepitelial cervical (CIN) III y carcinoma cervical invasivo (ICC) . El análisis de seguimiento por citología o histología no identifica a todas estas mujeres en mayor riesgo de CIN 11+ . En los estudios clínicos documentados en la presente, la detección de la expresión del mRNA de E6/E7 de longitud completa que codifica la proteína Eß de longitud completa mostró notable especificidad para lesiones cervicales de alto grado, indicando que la presencia de estos transcritos proporciona un marcador pronóstico útil.

Un resultado positivo del tamizaje en los métodos de la invención es indicado por la detección de la expresión de los transcritos de mRNA E6/E7 que codifican una proteína E6 de longitud completa. Un resultado positivo para la expresión de mRNA de E6/E7 indica que el individuo porta virus que presenta pérdida de regulación de la expresión de E6/E7 y/o que expresa un pre-mRNA estabilizado que codifica una proteína E6 de longitud completa y además es indicativo de que el individuo tiene cambios celulares anormales .

El término "pérdida de la regulación de E6/E7", cuando se utiliza en la presente significa una pérdida de la regulación del control de la transcripción de los promotores de todos los transcritos de E6/E7, o una pérdida que la capacidad de empalme normal en los marcos de lectura abiertos de E6/E7.

El término "pre-mRNA estabilizado" se refiere a un transcrito primario de E6/E7 que no ha sufrido ningún episodio de empalme dentro del marco de lectura abierto de E6 y por tanto codifica una proteína de longitud completa y es más establece (es decir, presenta una vida útil más prolongada) en comparación con cualquier transcrito primario (no empalmado) de E6/E7, equivalente, que codifique la proteína E6 de longitud completa expresada por un virus de papiloma humano natural o tipo nativo del mismo subtipo de HPV. El virus de papiloma humano tipo natural o nativo se refiere al virus que no tiene modificación genómica asociada con la infección persistente de un hospedero humano y no esta integrado en el genoma humano. Virus de tipo natural o nativos como estos también se caracterizan porque el empalme del pre-mRNA de E6/E7 o los transcritos de mRNA de longitud completa se presentan muy pronto después de la transcripción, de modo que el pre-mRNA de longitud completa no se acumula dentro de la célula en ningún grado significativo. Así pues, el pre-mRNA generalmente no se traduce para obtener la proteína E6/E7 de longitud completa en células infectadas con el virus tipo nativo o natural porque el pre-mRNA se procesa mediante el aparato de empalme antes de que se pueda llevar a cabo la traducción. Sin embargo, en una célula con anormalidades asociadas con infección transformante, persistente, de HPV, el pre-mRNA se estabiliza y/o no se empalma y por tanto se puede acumular dentro de la célula a un nivel que no se observa en células normales o células proliferativas normales, por ejemplo, las células infectadas con HPV replicante o en reproducción.

En relación con los transcritos primarios E6/E7 (no empalmados) expresados en virus tipo natural o nativo, el pre-mRNA estabilizado se puede modificar, por ejemplo, por la adición de secuencias de mRNA transcritas desde el genoma humano como resultado de la integración vírica o por deleción de las secuencias de HPV, en una región del transcrito fuera del marco de lectura abierto que codifica la proteína E6. Por tanto, el pre-mRNA estabilizad puede ser de secuencia y estructura diferentes a los transcritos primarios (no empalmados) E6/E7 expresados en virus tipo natural o nativo pero todavía codifiquen una proteína de longitud completa E6.

El término "cambios celulares anormales" comprende cambios celulares característicos de una enfermedad más grave que las lesiones cervicales de bajo grado o la lesiones intraepiteliales escamosas menores, incluidos los cambios celulares que son característicos de enfermedad de gravedad igual o mayor que CIN de alto grado (definida como una expansión neoplásica de células transformadas) , CIN (neoplasia intraepitelial cervical) III o neoplasia intraepitelial escamosa alta (HSIL) , incluidas las lesiones con perfil de DNA multiploide y lesiones CIN "malignas" con valores medios del índice del DNA aumentados, alto porcentaje de aneuploidia del DNA y tasas que superan 2.5 c (Hanselaar y col., 1992, Anal Cell Pathol., 4: 315-324; Rihet y col., 1996, J. Clin Pathol 49: 892-896; y McDermott y col., 1997, Br. J. Obstet Gynaecol. 104: 623-625).

La neoplasia intraepitelial cervical (abreviada "CIN"-) también conocida como Displasia Cervical, es un estado cervical causado por el virus de papiloma humano. La CIN se clasifica como I, II ó III dependiendo de su gravedad. Se considera una anormalidad precancerosa, pero no un cáncer real. La forma más leve, CIN I, normalmente desaparece por si misma, aunque raras ocasiones puede progresar a cáncer. Las formas más graves, CIN II y CIN III, la mayoría de las veces permanecen igual o empeoran con el tiempo.

Estas se transforman en cáncer, pero casi nunca si se tratan adecuadamente.

El HPV ha sido identificado como agente causante en el desarrollo de cambio celular en el cuello uterino, los cuales pueden dar origen al desarrollo de carcinoma cervical. Estos cambios celulares se asocian con la expresión constitutiva o persistente de proteínas E6/E7 procedente del genoma vírico de HPV. Así pues, es posible concluir que las personas en las que se puede detectar la expresión de mRNA de E6/E7, particular aquellas personas que presentan expresión E6/E7 persistente cuando se evalúan durante un tiempo, ya manifiestan cambios celulares en el cuello uterino, estos cambios pueden haberse presentado solo en muy pocas células del cuello uterino, y es posible que no se puedan detectar por citología convencional. No obstante, con el uso de métodos sensibles, específicos y exactos para la detección de mRNA de E6/E7 es posible identificar aquellas personas que ya presentan cambios celulares en el cuello uterino en una etapa mucho más temprana que la que sería posible utilizando tamizaje citológico convencional. Esto permite la intervención precoz con tratamientos dirigidos a prevenir el desarrollo de carcinoma cervical.

Como resultado de la integración del HPV en el genoma humano, o como resultado de la "modificación" en un genoma episomal modificado del HPV, se pierde el control normal de la transcripción del oncogén E6/E7 viral (Durst y col., 1985, J Gen Virol, 66 (Pt 7): 1515-1522; Pater y col., Pater, 1985 Virology 145: 313-318; Schwarz y col., 1985, Nature 314: 111-114; Park y col., 1997, ibid) . Por el contrario, en lesiones premalignas y en epitelio normal infectado con HPV, el virus de papiloma predomina en las formas episomales "no modificadas" por tanto puede estar ausente o haber una regulación descendente eficiente de la transcripción del oncogén (E6/E7) (Johnson y col., 1990, J Gen Virol, 71 (Pt 7): 1473-1479; Falcinelli y col., 1993, J Med Virol, 40: 261-265). La integración del DNA del virus de papiloma humano tipo 16 en el genoma humano, según se observa, da origen a una actividad celular/genoma más inestable, y la estabilidad aumentada de los mRNA de E6/E7 (Jeon y Lambert, 1995, Proc Nati Acad Sci USA 92: 1654-1658) . Así pues, la integración de HPV, normalmente encontrada en cánceres cervicales pero solo con muy poca frecuencia se encuentra en lesiones CIN (Carmody y col., 1996, Mol Cell Probes, 10: 107-116), parece ser un episodio importante en la carcínogenía cervical.

En un contexto clínico, la ejecución de los métodos los cuales dependen del tamizaje para la expresión de mRNA de E6/E7 solamente depende crucialmente de la habilidad para registrar un resultado negativo de la expresión del mRNA de E6/E7 con confianza. Esto de nuevo requiere una técnica de detección que tenga una sensibilidad máxima, pero que produzca resultados negativos falsos mínimos. En una modalidad preferida, esto se logra utilizando una técnica de amplificación sensible y detección en tiempo real para tamizar la presencia o ausencia de mRNA de E6/E7. La técnica más preferida es la amplificación NASBA en tiempo real utilizando sondas faros moleculares, como se describe por Leone y col., Nucleic Acids Research., 1998, Vol 26, 2150-2155. Debido a la sensibilidad de esta técnica, la obtención de los resultados negativos falsos se llevan al mínimo y un resultado de "expresión E6/E7 negativa" se puede clasificar con mayor confianza. Esto es muy importante si los ensayos van a ser utilizados en el contexto de un programa de tamizaje clínico.

Se prefiere ensayar la expresión de los transcritos de mRNA para E6/E7 a partir de uno o más (y más preferentemente todos) los tipos de HPV 16, 18, 31, 33 y 45. En una modalidad, el ensayo puede detectar solo estos tipos de HPV. El DNA procedente de los tipos de HPV 16, 18, 31 y 33 ha sido detectado en más de 96% de las muestras de carcinoma cervical en una población de estudio en Noruega. Otros estudios han demostrado que E6 y E7 son casi invariablemente retenidos en los cánceres cervicales, en vista de que su expresión probablemente es necesaria para la conversión a y mantenimiento del estado maligno (Choo y col., 1987, J Med Virol 21: 101-107; Durst y col., 1995, Cáncer Genet Cytogenet, 85: 105-112). Contrario a los sistemas de detección del HPV que se basan en la detección del genoma no dañado o la secuencia génica Ll, la detección de mRNA del HPV expresado desde el área de E6/E7 puede detectar más de 90% de las pacientes directamente relacionadas con un riesgo de desarrollar carcinoma cervical.

En la clínica es posible utilizar los métodos basados en la detección de mRNA de E6/E7 en un post-tamizaje o triage, es decir, análisis posterior de personas que tengan un diagnostico previo de ASCUS, CIN I ó condiloma. El método puede ser utilizado para seleccionar aquellas con un alto riesgo de desarrollar carcinoma cervical de entre el grupo de personas que tienen un diagnostico previo de ASCUS, CIN I o condiloma. El ASCUS, condiloma y CIN I se pueden definir como más o menos el mismo diagnostico debido a la reproducibilidad muy baja entre diferentes citólogos y diferentes departamentos citológicos. Óstór (Int J Gyn Path. 12: 186-192. 1993) encontró que solo alrededor de 1% de los casos de CIN I puede progresar a carcinoma cervical. Así pues, se necesita un método eficiente para identificar la subserie de personas con ASCUS, condiloma o CIN I que estén en un riesgo considerable de desarrollar carcinoma cervical. Uno de los tipos de HPV 16, 18, 31 ó 33 se detecto en 87% de los casos de carcinoma cervical estudiados por Karlsen y col. 1996. Cuando se incluyo HPV 45, casi 90% de las muestras de carcinoma cervical se encontraron relacionadas con estos cinco tipos de HPV. Por tanto, cuando se hicieron los cálculos a partir de los datos proporcionados por Ostdr (Int J. Gyn Path. 12: 186-192. 1993) más de 99.9% son casos en los que se detecto ASCUS, CIN I o condiloma no cubiertos por nuestro Kit HPV-Proofer.

La alta sensibilidad y especificidad del método presente significa que puede encontrar utilidad en el tamizaje primario, en kits de análisis reflex o diagnostico habitual para la detección de mujeres con riesgo alto o muy alto de desarrollar carcinoma cervical.

En el método de la invención, "expresión positiva" de un mRNA se toma para entender expresión por encima del fondo. No existe un requisito absoluto para la determinación cuantitativa exacta del nivel de expresión de mRNA de E6/E7.

En algunas modalidades, los métodos de la invención pueden consistir en una determinación cuantitativa de los niveles de expresión de mRNA. En una modalidad preferida, para obtener una diferencia clara entre "expresión positiva" y "expresión negativa", una determinación de la "expresión positiva" puede requerir la presencia de más de 50 copias del mRNA pertinente (por ml de muestra o por volumen total de la muestra) , mientras que una determinación de "expresión negativa" puede requerir la presencia de menos de una copia del mRNA pertinente (por ml de muestra o por volumen total de la muestra) .

Los métodos de la invención preferentemente incluirán el tamizaje de mRNA de E6/E7 utilizando una técnica que pueda detectar específicamente el mRNA de E6/E7 a partir de los tipos de HPV asociados con cáncer, más preferentemente, de tipos de HPV asociados con cáncer de "alto riesgo". En la modalidad más preferida, los métodos consisten en tamizar el mRNA de E6/E7 utilizando una técnica que pueda detectar el mRNA de E6 a partir de los tipos de HPV 16, 18, 31 y 33, y preferentemente también 45. Más preferentemente, el método detectará específicamente la expresión de mRNA de E6/E7 a partir de por lo menos uno de los tipos de HPV 16, 18, 31, 33, y preferentemente también 45, y más preferentemente todos los cinco tipos. Sin embargo, las mujeres que dan positiva la expresión de E6/E7 a partir de otros tipos diferentes de 16, 18, 31, 33 y 45, por ejemplo 35, 39, 45, 52, 56, 58, 59, 66 y 68, también pueden manifestar anormalidades celulares. Así pues, el método puede comprender el tamizaje de la expresión de mRNA de E6/E7 a partir de uno o más de estos tipos de HPV, más preferentemente además del tamizaje para mRNA de E6/E7 a partir de los tipos de HPV 16, 18, 31, 33 y 45. Ciertos tipos de HPV muestran una distribución geográfica/poblacional notoria. Por tanto, puede ser apropiado incluir los cebadores específicos para un tipo de HPV que sea más frecuente en el área poblacional/geográfica a prueba, por ejemplo, además del tamizaje de los tipos de HPV 16, 18, 31, 33 y 45.

Los métodos de la invención se basan en la detección de los transcritos de mRNA de E6/E7 de longitud completa de algunos o todos los tipos de HPV que codifican una proteína E6 de longitud completa. En estas modalidades, la presencia del mRNA de E6/E7 de longitud completa se toma como resultado positivo del tamizaje.

El término "transcritos de mRNA E6/E7 de longitud completa" excluye cualquiera de las variantes de empalme que ocurren en forma natural, pero comprende transcritos visistrónicos que codifican las proteínas E6/E7 funcionales, de longitud completa. Hasta ahora se han descrito cuatro especies de mRNA de E6/E7 en células infectadas con HPV 16, a saber, un transcrito de E6/E7 no empalmado y tres transcritos empalmados denominados E6* I, E6* II y E6* III (Smotkin D, y col., J Virol. 1989 Mar 63 (3) : 1441-7; Smotkin D, Wettstein FO. Proc Nati Acad Sci USA. 1986 Jul 83 (13): 4680-4; Doobar J y col., Virology. 1990, Sep 178 (1) : 254-62; Cornelissen MT, y col., J Gen Virol. 1990 Jul 71 (Pt 7): 1473-9; Schneider-Mounoury S, y col., J Virol. 1987, Oct 61 (10): 3295-8; Sherman L, y col., Int J Cáncer. 1992 Feb 40 (3): 356-64) . Los cuatro transcritos se transcriben desde un solo promotor (p97) ubicado justo corriente arriba del Segundo ATG del ORF de E6. En el caso de HPV 16, el término "transcritos de E6/E7 de longitud completa" se refiere a los transcritos que contienen toda o prácticamente toda la región del nucleótido (nt) 97 al nt 880 en el ORF de E6, inclusive del nt 97 y 880. Las posiciones de los nucleótidos están numeradas de acuerdo con la nomenclatura normalizada del HPV (ver el compendio del virus de papiloma humano en línea, disponible por la Internet o en forma de artículo de la base de datos HV, Mail Stop K710, Los Alamos Nacional Laboratory, Los Alamos, NM 87545, USA) .

En relación con los tipos de HPV diferentes del HPV 16, transcritos de E6/E7 de "longitud completa" -se puede tomar para incluir los transcritos que contienen secuencias homologas a la región antes mencionada del transcrito de E6/E7 de HPV 16 y para excluir las variantes de empalme de E6. Algunas alineaciones de secuencias de los tipos de HPV están disponibles al público a través del compendio del virus de papiloma humano en línea.

La detección específica de los transcritos de mRNA de E6/E7 de longitud completa se puede lograr, por ejemplo, utilizando cebadores o sondas que sean específicas para la región que este presente solo en los transcritos de E6/E7 de longitud completa, no en las variantes de empalme.

El transcrito E6* I presenta pérdida de una secuencia codificante entre los nucleótidos 226 y 409 (en el tipo de HPV 16) y el transcrito E6* II presenta pérdida de la secuencia codificante entre los nucleótidos 226 y 526 (en el tipo de HPV 16) . Por tanto, se prefiere utilizar por lo menos un cebador o sonda procedente de la región ubicada entre los nucleótidos 226 y 409 del HPV tipo 16 o la región homologa procedente de uno de los tipos de HPV 18, 31, 33 ó 45. La especificidad para los transcritos de longitud completa se puede conseguir mediante el uso de un par de cebadores en los que un cebador sea específico para una secuencia ubicada dentro de esta región, y el otro cebador sea específico para una secuencia ubicada fuera de esta región, o en donde ambos cebadores sean específicos para las secuencias dentro de esta región, preferentemente junto con una sonda específica para una secuencia ubicada dentro de esta región. En otra modalidad, puede ser posible utilizar un par de cebadores en los que ambos cebadores sean específicos para secuencias fuera de esta región en combinación con una sonda específica para una secuencia dentro de la región a fin de conferir especificidad para el mRNA que codifica E6 de longitud completa.

Diferentes tipos de HPV presentan distintos modos de expresión del mRNA de E6/E7. Los mapas de transcritos para diferentes tipos de HPV, incluidos los tipos de HPV 16 y 31, que se pueden utilizar para ayudar en el diseño de sondas o cebadores para la detección de los transcritos de E6/E7 de longitud completa están a la disposición al publico a través del compendio del virus de papiloma humano (como ya se mencionó) .

Método de análisis Los métodos de la invención consisten en el tamizaje de la presencia de los transcritos de E6/E7 en por lo menos una célula o tejido, y más específicamente, en una muestra que contenta RNA procedente de por lo menos una célula o tejido. Por lo menos una célula o tejido debe contener al menos una célula cervical de un tipo que sea susceptible a infección con virus de papiloma humano, es decir, células del epitelio cervical.

Los métodos de tamizaje descritos pueden llevarse a cabo en una preparación de ácido nucleico separado de una muestra clínica o biopsia que contenga células cervicales tomadas de la persona sometida al estudio. Las muestras convenientes que se pueden utilizar como fuente de ácido nucleico pueden ser (pero no exclusivamente) frotis cervicales, biopsias cervicales, raspados cervicales, muestras separadas utilizando cepillos y tampones, etcétera, biopsias de piel/verrugas, también tejidos incrustados en parafina y células fijadas con formalina o metanol .

La preparación del ácido nucleico que será tamizado utilizando los métodos descritos debe contener mRNA, sin embargo, no es necesario que sea una preparación de mRNA poli A+ purificado, y las preparaciones de RNA total o las preparaciones crudas de ácido nucleico total que contengan RNA y DNA genómico, o incluso lisados crudos de células también son convenientes como materia prima para una reacción NASBA. Prácticamente cualquier técnica conocida para la separación de una preparación de ácido nucleico que contenga mRNA se puede utilizar para aislar ácido nucleico de una muestra experimental. Una técnica preferida es el método de aislamiento "Boom" descrito en US-A-5, 234, 809 y EP-B-0389, 063. Este método, que se puede utilizar para separar una preparación de ácido nucleico que contenga RNA y DNA, se basa en las propiedades de unión al ácido nucleico de las partículas de dióxido de silicio en presencia del agente caotrópico tiocianato de guanidina (GuSCN) .

Los métodos de la invención se basan en la evaluación de la transcripción activa del genoma del HPV. Los métodos no se limitan con respecto a la técnica precisa que se utilice para detectar la expresión de mRNA. Múltiples técnicas para la detección de secuencias específicas de mRNA son conocidas en la materia y se pueden utilizar de acuerdo con la invención. Por ejemplo, los mRNA específicos se pueden detectar por técnicas de hibridación, amplificación o secuenciación.

Se prefiere más detectar la expresión de mRNA por medio de una técnica de amplificación, más preferentemente una amplificación isotérmica como NASBA, amplificación mediada por la transcripción, amplificación mediada por señales de la tecnología del RNA, amplificación en fase de solución, isotérmica, y otras. Todos estos métodos son bien conocidos en la materia. Más preferentemente, la expresión de mRNA se detecta por una amplificación isotérmica en combinación en tiempo real del producto de la amplificación. La combinación más preferida es la amplificación por NASBA, acoplada con detección en tiempo real del producto de la amplificación utilizando la tecnología de faros moleculares, como se describe por Leone y col., Nucleic Acids Research, 1998, Vol 26, 2150-2155.

Los métodos para la detección de HPV en una muestra experimental utilizando la técnica de NASBA generalmente consistirán en los siguientes pasos: (a) ensamblar un medio de reacción que contenga los pares de cebadores adecuados, una DNA polimerasa dirigida al RNA, una ribonucleasa que hidrolice la hebra de RNA de un híbrido RNA-DNA sin hidrolizar RNA o DNA mono o bicatenario, una RNA polimerasa que reconozca el promotor, y trifosfatos de ribonucleósido y desoxirribonucleósido; (b) incubar el medio de reacción con una preparación de ácido nucleico obtenido de una muestra experimental que se sospecha que contiene HPV, en condiciones de reacción que permitan una reacción de amplificación NASBA; y (c) detectar y/o medir cuantitativamente cualquier producto específico del HPV de la reacción de amplificación NASBA.

La detección del producto o los productos específicos de la reacción NASBA (es decir, copias traducibles y/o no traducibles (sentido y/o antisentido) del RNA diana) se puede llevar a cabo en algunas formas diferentes. En un abordaje, el producto o los productos de la NASBA se puede detectar utilizando una sonda de hibridación específica del HPV que pueda aparearse específicamente con el producto de la NASBA. La sonda de hibridación puede unirse a una etiqueta indicadora, por ejemplo, un compuesto fluorescente, luminiscente, radioactivo o quimioluminiscente o una etiqueta enzima o cualquier otro tipo de etiqueta conocido para los expertos en la materia. No es crucial el tipo específico de etiqueta, pero debe ser capaz de producir una señal que se pueda detectar por medios externos, por sí mismo o junto con una o más sustancias adicionales (por ejemplo el sustrato para una enzima) .

Un método de detección preferido es el denominado "NASBA en tiempo real" que permite la supervisión continua de la formación del producto de la reacción NASBA en el transcurso de la reacción. En una modalidad preferida esto se puede lograr utilizando un a sonda "faros moleculares" que contienen una secuencia específica de HPV que puede acoplarse al producto de la NASBA, una secuencia de oligonucleótido que forme un tallo doble y un par de porciones fluorescentes/extinguidoras, como se sabe en la técnica y se describe en la presente. Si la sonda faros moleculares se adiciona a la mezcla de reacción antes de la amplificación, puede ser posible vigilar la formación del producto de la NASBA en tiempo real (Leone y col., Nucleic Acids Research, 1998, Vol 26, 2150-2155) . Los equipos de reactivos e instrumentos para llevar a cabo la detección NASBA en tiempo real están disponibles en el comercio (por ejemplo NucliSens™ EasyQ system, De Organon Teknika) .

En otro enfoque, la técnica de faros moleculares se puede incorporar en el oligonucleótido cebador dos permitiendo la monitorización en tiempo real de la reacción de la NASBA sin la necesidad de una sonda de hibridación independiente.

En todavía otro enfoque, los productos de la reacción de NASBA pueden ser monitorizados utilizando una sonda de detección con etiqueta genérica que hibride a una secuencia de nucleótido en el extremo 5' del oligonucleótido cebador dos. Esto es equivalente al sistema de detección "NucliSens™" comercializado por Organon Teknika. En este sistema es posible conferir especificidad para los productos de la NASBA obtenidos del mRNA del HPV diana utilizando sondas de captura específicas del HPV que contengan sondas oligonucleótidos como se describe en la presente unidas a un soporte sólidos, como puede ser microperlas magnéticas. Más preferentemente, la sonda de detección ECL™ comercializada por Organon Teknika. Los amplicones de la NASBA se hibridan a las sondas de captura específicas del HPV y a la sonda ECL genética (a través de una secuencia complementaria en el cebador 2) . Luego de la hibridación, los complejos perla/amplicon/sonda ECL se pueden capturar en el electrodo magnético del lector ECL automático (por ejemplo el lector NucliSens™ comercializado por Organon Teknika) . Después, un impulso de tensión activa la reacción ECL™.

Las modalidades preferidas del método dependen de la amplificación del mRNA de E6/E7 a partir de por lo menos los principales tipos de HPV asociados con cáncer, 16, 18, 31 y 33, y preferentemente también HPV 45. Hay algunas formas distintas en las que esto se puede conseguir.

En una modalidad, pares de cebadores independientes específicos para cada uno de los tipos de HPV 16, 18, 31 y 33, y de preferencia también HPV 45 pueden utilizarse para amplificar transcritos de cada tipo de HPV en forma individual. En otra versión, es posible utilizar mezclas de dos o más pares de cebadores en un solo envase para múltiplejar las reacciones de amplificación.

En otra modalidad, es posible utilizar un único par de cebadores que pueda amplificar una región del gen de E6/E7 a partir de los tipos de HPV 16, 18, 31 y 33, y preferentemente también HPV 45, los cuales entonces permitan la amplificación de todos los cuatro tipos (preferentemente cinco) en una sola reacción de amplificación. Esto podría, por ejemplo, lograrse mediante el uso de un par de cebadores degenerados o por la selección de una región del mRNA de E6/E7 que esté altamente conservado respecto a los tipos de HPV.

El par de cebadores de E6/E7 puede corresponder a cualquier región del mRNA de E6/E7, y puede permitir la amplificación de todo o parte del marco de lectura abierto de E6 y/o el marco de lectura abierto de E7, preferentemente permitirá la amplificación ' de los transcritos de longitud completa que codifican una proteína E6 de longitud completa.

En otro enfoque, la especificidad para múltiples tipos de HPV se puede lograr mediante el uso de cebadores oligonucleótidos degenerados o mezclas complejas de polinucleótidos que presenten menores variaciones de secuencias, preferentemente que correspondan a los sitios de variación de la secuencia entre los genotipos de HPV.

El razonamiento que sustenta el uso de estos cebadores degenerados o mezclas es que la mezcla puede contener por lo menos un par de cebadores capaz de detectar cada tipo de HPV.

En todavía otro enfoque, la especificidad para múltiples tipos de HPV se puede lograr incorporando en los cebadores uno o más nucleótidos de inopina, preferentemente en los sitios de variación de la secuencia entre los genotipos de HPV.

Las listas de los cebadores y sondas adecuados que pueden utilizarse para la detección del mRNA de E6/E7 a partir de diferentes tipos de HPV se pueden encontrar en WO 03/057914 y en WO 03/057927. Todo el contenido de ambas patentes WO 03/057914 y WO 03/057927 se incorpora en la presente para referencia.

El método de la invención preferentemente se lleva a cabo utilizando el ensayo Pre-Tect HPV-Proofer™ y su kit. No obstante, debe entenderse que la invención no se limita al uso de este ensayo específico.

El método de la presente invención clasificará como negativas las muestras negativas y representativas, histológicas, reales a partir del total o parte del cuello uterino, el corpus y/o el canal cervical. Esto proporciona la especificidad sobresaliente que hace del Pre-Tect HPV-Proofer™ uno de los métodos de tamizaje primario más prometedores que se hayan desarrollado.

La especificidad de utilizar Pre-Tect HPV-Proofer™ solo para diagnóstico de mujeres en riesgo de desarrollar carcinoma cervical ha sido demostrado como independiente de la edad y funciona con más de tres veces mayor especificidad que el ensayo basado en DNA comercial, nada más .

La detección de los transcritos de E6/E7 tiene el potencial de identificar qué infecciones de alto riesgo pueden persistir sin tener que realizar pruebas repetidas. La frecuencia de la expresión a partir de oncogenes de E6/E7 aumenta con la gravedad de la lesión.

Los métodos de la invención pueden realizarse en combinación con la determinación del genotipo de HPV por cualquier método conveniente. El término "determinación del genotipo de HPV" se refiere a cualquier técnica que pueda identificar el subtipo o subtipos de HPV presentes en alguna paciente determinada. La evaluación de la actividad oncogénica de HPV por detección de la expresión de E6/E7 en combinación con la tipificación de HPV promete ser un predictor poderoso de lesiones de alto grado.

La invención además se entenderá con referencia a los siguientes ejemplos experimentales y figuras.

Ensayo Pre-Tect HPV-Proofer™ Para todos los ejemplos experimentales que se refieren al uso del kit y ensayo Pre-Tect HPV-Prooferm, el ensayo se realiza utilizando el kit disponible en el comercio de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Más información relacionada con el funcionamiento del ensayo para la detección en tiempo real del mRNA de E6/E7 de HPV se puede encontrar en WO 03/057914, todo el contenido de la cual se incorpora en la presente como referencia.

La siguiente sección experimental resume datos clínicos obtenidos utilizando el ensayo y kit Pre-Tect HPV-Proofer™.

Ejemplo 1 - Expresión del mRNA de E6/E7 a partir del virus de papiloma humano (HPV) cancerígeno en 4136 muestras cervicales recoléctadas de una población i de pacientes externas El objetivo de este estudio fue identificar la presencia del mRNA y DNA de E6/E7 en muestras citológicas HGSIL/CIN3 con confirmación histológica.

Material y métodos : Las muestras fueron recolectadas de una población de pacientes externas , bien filtradas, mujeres mayores de 30 años de edad (n = 4136) . Los transcritos de E6/E7 de cada uno de los tipos de HPV de alto riesgo 16, 18, 31, 33 y 45 fueron detectados por el ensayo Pre-Tect HPV-Proofer™ (NorChip AS, Klokkarstua, Noruega) , con base en el estudio NASBA multiplex en tiempo real. Se investigó la presencia del DNA de HPV por PCR consenso Gp5 + 6+, y las muestras que dieron positiva la prueba de DNA de HPV fueron luego sometidas a la PCR específica del tipo para los tipos de HPV 16, 18, 31, 33 y 45. Las mujeres que tuvieron un diagnóstico citológico de HGSIL fueron referidas a biopsia e histología.

Se documentaron los casos confirmados por histología en el Registro Noruego de Cáncer. En Noruega, el estudio HGSIL citológico se puede dividir en HGSIL/AGUS, HGSIL/ASC-H, HGSIL/CIN2 y HGSIL/CIN3.

Resultados : De los 25 casos de HGSIL citológico, 14 fueron confirmados por histología como CIN2+. Dos casos CIN2+ histológicos fueron por citología diagnosticados como HGSIL/ASC-H y HGSIL/CIN2. El ensayo PreTect HPV Proofer detectó 52% (13/25) de los casos HGSIL citológicos, 86% (12/14) de los casos CIN2+ histológicos y 9% (1/11) de los casos HGSIL citológicos no verificados por histología. Los números para Gp5+/6+ por PCR son 64% (16/25), 93% (13/14), y 27% (3/11), respectivamente. La muestra CIN2+ histológica positiva por PCR consenso, pero negativa por el ensayo Pre-Tect HPV-Proofer, fue identificada como HPV 35. La prevalencia de HGSIL/CIN 3 fue de 0.29% (12/4136) y la prevalencia de CIN2+ histológico fue 56% (14/25) . La sensibilidad, especificidad y valores predictivos positivos y negativos para el ensayo Pre-Tect HPV-Proofer y la PCR consenso se dan en la Tabla 1.

Tabla 1: PPV = valor predictivo positivo NPV = valor predictivo negativo Discusión y conclusión: Hubo una buena concordancia entre los casos HGSIL/CIN3 citológicos y CIN2+ histológicos, solo un caso HGSIL/CIN3 citológico no se confirmó como CIN2+ por histología. En los casos CIN2+ verificados por histología, el grado de detección para el DNA y mRNA de HPV fueron altos y casi idénticos. En los casos de HGSIL citológico no verificados por histología, el grado de detección para Pre-Tect HPV-Proofer fue menor que para PCR consenso. Juntos, HGSIL/CIN3 citológico y Pre-Tect HPV-Proofer detectaron todos los CIN2+ histológicos.

En conclusión, los transcritos de E6/E7 de HPV procedentes de los cinco tipos de HPV cancerígenos que se encuentran con mayor frecuencia, HPV 16, 18, 31, 33 y 45, parecen estar presentes en casi todos los casos de CIN2+ histológicos. La alta especificidad y valor predictivo positivo para Pre-Tect HPV-Proofer es una ventaja en el diagnóstico de HPV y por tanto la detección del mRNA es un complemento adecuado para la citología e histología.

Ejemplo 2 -- Detección de HPV como seguimiento de lesiones de grado bajo en el programa sueco de filtraje ginecológico En Suecia, aproximadamente 40,000 casos de citología por año muestran aberraciones que necesitan seguimiento. La mayoría de los casos experimentan regresión espontánea pero algunos progresan si no se les trata. También hay un problema de la baja sensibilidad de la citología en el procedimiento de seguimiento. Durante la detección de lesiones precancerosas, se ha encontrado que la especificidad y sensibilidad mejoran drásticamente cuándo se realizan análisis de HPV después de la detección de ASCUS ó CIN I citológicos.

El objetivo principal fue evaluar las funciones respectivas de las pruebas de RNA y DNA de HPV en relación con la citología e histología del programa de tamizaje sueco. Otro objetivo importante fue estimar el riesgo de la prueba CIN II + faltante en mujeres con CIN I ó ASCUS pero negativo con el análisis de RNA ó DNA de HPV.

El material de análisis provenía de 15,000 mujeres que seguían el programa de filtraje normal en la parte central de Suecia. Todas las mujeres positivas para ASCUS ó CIN I con citología fueron seleccionadas para otros estudios. Todo el material citológico o histológico fue nuevamente evaluado en forma enmascarada por un patólogo experto. Las muestras que dieron positivo para ASCUS y CIN I (N = 240) fueron evaluadas con Pre-Tect HPV-Proofer (N = 240) y una selección aleatoria de muestras fue analizada utilizando Hybrid Captre II (HCII) y citología (N = 127) y solo citología (N = 112) después de 4 meses. Estas fueron comparadas con histología de las biopsias LEEP (N = 126) después de 7 meses y con Pre-Tect HPV-Proofer (N = 240) , HCII y citología después de 12 meses (Tabla 2) . Todas las muestras con ASCUS y CIN I fueron analizadas para mRNA. Las biopsias LEEP dirigidas a colposcopia (N = 126) fueron tomadas como parte del seguimiento para todas las mujeres con diagnóstico de citología anormal y/o prueba de DNA de HPV positiva (después de 4 meses) . El DNA del HPV fue detectado utilizando el ensayo HCII (Digene, Gatesburg, MD, EUA) . La identificación y tipificación individual de los transcritos de mRNA de E6/E7 del HPV 16, 18, 31, 33 y 45 se llevó a cabo utilizando el ensayo Pre-Tect HPV-Proofer (NorChip AS, Klokkarstua, Noruega) .

Resultados : Los resultados de las pruebas del HPV han sido comparados con las pruebas citológicas 4 y 12 meses después y con diagnóstico de histología 7 meses después del diagnóstico positivo por citología. La frecuencia y distribución de los tipos de HPV se presentan en la Tabla 3. En 19% de los casos se encontró concordancia entre el estudio citológico es histológico. La citología y la prueba del DNA fueron considerablemente más a menudo positivas en lesiones benignas y de grado bajo por histología en comparación con la prueba del RNA. Con la histología como el "patrón dorado", la prueba del RNA reveló un mayor valor predictivo positivo, y mayor especificidad (46% y 85.3%, respectivamente) comparado con la prueba del DNA (31% y 51%, respectivamente) . No obstante, la prueba del DNA reveló una mayor sensibilidad (91%) comparado con la prueba a base del RNA (81%) . 19% de los casos tratados con cotización LEEP mostraron citología aberrante 5 meses después del tratamiento, se encontró que 0.5% eran CIN 11+ . El DNA del HPV fue detectado en 24% y el RNA del HPV se detectó en 6% de estos casos (Tabla 2) .

Tabla 2 : Resultados totales Tabla 3: Resultados histológicos contra los resultados del DNA, RNA de HPV y citológicos Discusión y conclusión: El mayor valor predictivo positivo y la mayor especificidad del método basado en RNA en comparación con el método basado en DNA se puede explicar por el hecho de que la expresión de los oncogenes de E6/E7 es necesaria para el desarrollo y mantenimiento del fenotipo maligno. El riesgo de CIN 11+ faltante en mujeres con CIN I ó ASCUS, pero negativo con las pruebas de RNA ó DNA de HPV fue extremadamente bajo (0.2%), confirmando el valor agregado del análisis de HPV en ASCUS ó CIN I citológico.

Ejemplo 3 - Infecciones de HPV de alto riesgo sin expresión del oncogen en mujeres menores de 30 años El virus de papiloma humano (HPV) es una infección viral común entre mujeres, particularmente en los grupos más jóvenes, aunque la mayoría de las infecciones son pasajeras y asíntomáticas . En los países escandinavos, la prevalencia del HPV en la población de mujeres mayores de 30 años de edad varía entre 5 y 15%, y la prevalencia de HPV en mujeres más jóvenes puede ser tan alta como 30-40%. Asimismo, 70-80% de las mujeres sexualmente activas, en algún momento de su vida, adquirirá una infección por HPV. No obstante, la mayoría de las infecciones se eliminará espontáneamente, y solo una pequeña proporción persistirá y dará origen a neoplasia intraepitelial cervical (CIN) .

El objetivo de este estudio fue comparar la detección de los transcritos de E6/E7 y la detección del DNA de HPV en mujeres menores de 30 años.

Material y métodos: Se analizó un total de 282 muestras cervicales de mujeres menores de 30 años (edad media 26.9). Se extrajo e RNA y DNA utilizando el extractor NucliSens Extractor y la expresión de mRNA de E6/E7 de los tipos de HPV cancerígenos 16, 18, 31, 33 y 45 fue detectada mediante el ensayo Pre-Tect HPV-Proofer (NorChip AS, Klokkarstua, Noruega) . La presencia del DNA del HPV se investigó utilizando PCR consenso Gp5+/6+, y las muestras que dieron positiva la prueba del DNA del HPV fueron luego sometidas a la PCR específica del tipo para los mismos 5 tipos de HPV.

Resultados : Un total de 32.6% (n = 92) muestras fueron positivas para el DNA del HPV mediante PCR Gp5+/6+, y se encontró que 24.8% (n = 70) eran los tipos 16, 18, 31, 33 y 45. El mRNA de E6/E7 de los mismos cinco tipos de HPV fue observado en solo 15.2% (n = 43) de todos los casos.

Los cinco tipos cancerígenos de HPV 16, 18, 31, 33 y 45 representaron 76% (70/92) de las muestras que dieron positiva la prueba del DNA del HPV, mientras que se detectó una expresión de mRNA de E6/E7 en 61% (43/70) de estos casos.

Se obtuvo un resultado citológico positivo en 8/282 casos (2.8%), de los cuales se observó ASCUS en 5/8 casos y condiloma de HPV en 3/8 casos. Para los casos ASCUS, se detectó el DNA del HPV por PCR consenso Gp5+/6+ y PCR específica del tipo en 4/5 casos, mientras que se encontró solo una muestra que contenía mRNA de HPV. Para los casos de condiloma de HPV, no obstante, se detectó el DNA del HPV por PCR consenso Gp5+/6+ en todas las muestras (n = 3) y por PCR específica del tipo en 2/3 casos, mientras que la expresión del mRNA de E6/E7 de HPV fue detectada por Pre-Tect HPV-Proofer en un solo caso.

Discusión: La presencia de HPV en mujeres menores de 30 años es mayor que para mujeres mayores. También este es el caso para la prevalencia de los cinco tipos de HPV cancerígenos 16, 18, 31, 33 y 45 en comparación con otros tipos. La ausencia de transcritos de E6/E7 puede reflejar un estado episomal del virus y por tanto una regulación controlada del proceso de transcripción. Es muy probable que estas infecciones desaparezcan. La integración del virus, no obstante, puede romper el gen de E2 y con ello también su función como regulador de la transcripción de E6/E7.

Conclusión: En esta población de pacientes externas jóvenes, la infección de HPV con expresión de un oncogen se detecta en menos de 50% de las muestras positivas de PCR consenso. Así pues, la monitorización de la expresión del gen de E6/E7 para los tipos de HPV 16, 18, 31, 33 y 45 puede ser un análisis diagnóstico valioso además de la citología. La detección de mRNA puede ser más discriminatoria para la enfermedad progresiva en mujeres jóvenes .

Ejemplo 4 - Métodos basados en DNA contra basados en RNA para el análisis de HPV El objetivo de este estudio fue validar dos ensayos disponibles en el comercio para analizar HPV con el fin de investigar la prevalencia de infecciones de HPV de alto riesgo en mujeres con citología negativa y positiva y para evaluar el resultado del análisis basado en el DNA y basado en el RNA en comparación con la citología e histología.

Material y métodos: La población en estudio fue seleccionada de los departamentos de pacientes externos y ginecólogos privados. Se incluyeron en este estudio 628 mujeres con edad promedio de 40 años (intervalo 19-85) . Primero se tomó un frotis Pap normal, y el material restante fue transferido a un vial PreservCyt™ (Cytyc Corporation) . El análisis para el DNA del HPV de alto riesgo (tipo 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68) se hizo con el ensayo (Hybrid Capture II (Digene Corporation) y la identificación individual de los transcritos de mRNA de E6/E7 del HPV 16, 18, 31, 33 y 45 con el ensayo Pre-Tect HPV-Proofer (NorChip AS) , una técnica NASBA en tiempo real.

Se tomaron las biopsias cuando la prueba para el HPV fue positiva o la citología mostró HSIL. Se consideró como "patrón de oro" a la histología.

Resultados : En 53% de los casos se encontró coincidencia entre la prueba citológica y la histológica. La histología de alto grado (CIN 2+) fue detectada en 61% de las mujeres con citología benigna o de bajo grado. El valor kappa fue de 0.31. En 17% (109/628) de los casos (Tabla 4) se encontraron resultados diferentes de las dos pruebas.

Tabla 4: Análisis HPV relacionado con histología en casos con diferente resultados de las dos pruebas de HPV Ambas pruebas para HPV mostraron asociación significativa con el grado de las lesiones (p<0.001). La prueba del DNA fue más a menudo positiva en lesiones benignas y de grado bajo. El análisis del DNA reveló mayor sensibilidad pero menor especificidad en comparación con el análisis del RNA (Tabla 5) .

Tabla 5: Eficacia del análisis del HPV para detección de CIN 2+ confirmado por histología Conclusión: La prueba del RNA mostró un mayor valor pronóstico y mayor especificidad que el análisis del DNA.

Ejemplo 5 - Permanencia de DNA y RNA específicos del tipo HPV El curso y persistencia de la infección de HPV se analizó en 54 mujeres que dieron positiva la prueba de HPV y estaban libres de cualquier enfermedad citológica utilizando la determinación del genotipo de HPV con un ensayo de arreglo lineal.

El efecto de la infección de HPV sobre el desarrollo de anormalidad citológica cervical (discariosis) fue monitorizada mediante la determinación repetida del genotipo de HPV y evaluación citológica 2 años después. También se hizo en ambos puntos del tiempo la detección de los transcritos de HPV de oncogenes de HPV conocidos E6 y E7 utilizando el ensayo Pre-Tect HPV-Proofer.

Materiales y métodos: Las muestras para la citología basadas en líquido (LBC) fueron obtenidas en 2000 de más de 3000 mujeres como parte de un estudio continuo diseñado para evaluar la persistencia de HPV (datos iniciales) . La prueba LBC consiste en enjuagar una muestra cervical en un vial que contenga una solución preservadora de células, en lugar de depositarla directamente sobre un portaobjetos como se hace durante el frotis convencional para el Papanicolou. Personal de atención primaria llevó a cabo la recolección de especímenes, los portaobjetos de capa plana fueron creados por el procedimiento ThinPrep® y la clasificación citológica se hizo de acuerdo con los lineamientos de la Sociedad Británica para Citología Clínica. Se seleccionó un cohorte de 54 mujeres con base en el resultado citológico normal en los datos iniciales pero que también fueron positivas en la prueba del DNA de HPV para al menos uno de los siguientes tipos de HPV "de alto riesgo": 16, 18, 31, 33 y 45, considerados en Europa como los tipos de alto riesgo que se encuentran más comúnmente y que han sido implicados en >90% de los cánceres. Se llamó a las mujeres para un frotis LBC de seguimiento dos años después de los datos iniciales cuando se hizo la evaluación citológica y el análisis del DNA y RNA del HPV.

Después de la citología, las células residuales de la muestra LBC fueron centrifugadas a 3500 rpm durante 10 minutos y se almacenaron como sedimentos celulares divididos a -70°C antes de la extracción del ácido nucleico y la detección del HPV. La extracción del DNA automatizada se hizo utilizando un aparato BioRobot 9604® (QIAGEN Ltd., Crawley, RU) utilizando los reactivos proporcionados con el kit QIAmp® 96 DNA Swab BioRobot™, mientras que la extracción del RNA se hizo por aplicación de columnas RNeasy (QIAGEN Ltd.) siguiendo el protocolo para la separación de las células animales, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ácido nucleico fue almacenado a -70°C antes de la detección del HPV.

Se emprendió la determinación del genotipo del DNA de HPV por el ensayo de hibridación en un arreglo lineal (LA) que consistió en la hibridación de un amplicon de PCR de 450 nt obtenido por la serie de cebadores PGMY a tiras de nailon que contenían sondas inmovilizadas [Gravitt y col., 2000; Coutlee y col., 2002]. La tira contenía dos niveles de sondas control ß-globina, 18 sondas de HPV de alto riesgo (HR-HPV) : 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 55, 56, 58, 59, 68, 73, 82, 83, y 9 sondas de HPV de bajo riesgo (LR-HPV) : 6, 11, 40, 42, 53, 54, 57, 66, 84. Los reactivos de la PCR, tiras de sondas y reactivos de desarrollo fueron proporcionados por Roche Molecular Systems, Inc. (Alameda).

Cualquier muestra que diera negativa la prueba de ß-globina sería excluida del análisis. La amplificación del RNA se logró a través de una amplificación NASBA isotérmica y la detección específica del tipo se hizo utilizando sondas faros moleculares (MB) contra mRNA de E6/E7 de longitud completa para los tipos de HPV 16, 18, 31, 33, 45. Todos los reactivos necesarios para la amplificación por NASBA y la detección de HPV fueron suministrados como parte del kit PreTect® HPV-Proofer (NorChip, Klokkastua, Noruega) . La detección fluorescente del producto mRNA acumulado se hizo en tiempo real utilizando el analizador NucliSens EasyQ Analyzer y los perfiles fluorescentes se analizaron utilizando el software de análisis PreTect (PAS, NorChip) .

Resultados : Un total de 11/54 (20%) de mujeres desarrolló discariosis después de 2 años con 31/54 y 23/54 mujeres que presentaban infecciones transitorias y persistentes, respectivamente, según se supervisó por la determinación del genotipo del DNA. Las mujeres que mantuvieron la infección por HPV persistentes, específica del tipo fueron mucho más probables de desarrollar discariosis en comparación con las que presentaban una infección pasajera (P<0.001). La presencia de los transcritos de mRNA de HPV de E6-E7 fue menos sensible pero más específica para la detección de la enfermedad en el seguimiento. Además, las mujeres que dieron positiva la prueba del DNA y también positiva para los transcritos del mRNA en los datos iniciales tuvieron mucho mayor probabilidad de albergar la infección persistente en comparación con aquellas en quienes el DNA solo fue detectado en los datos iniciales (p<0.013). Este estudio destaca la importancia de detectar la infección persistente de HPV específica del tipo para identificar aquellas mujeres que están en mayor riesgo de desarrollar anormalidades cervicales. La detección de los transcritos de E6/E7 que codifican la proteína E6 de longitud completa tiene el potencial de identificar las infecciones de HPV de alto riesgo que pueden persistir, incluso cuando se hace la detección en un solo punto del tiempo sin repetir el análisis. La detección de los transcritos de mRNA de E6/E7 identificó las infecciones que con mucho más probabilidad persiste.

Tabla 6. Proporción de infecciones por HPV persistentes, detectables en personas con y sin evidencia concurrente de discariosis en el seguimiento según se detectó por la determinación del genotipo del DNA y la detección del transcrito de RNA del HPV Tabla 7. Comparación de la determinación del genotipo de DNA y la detección del transcrito de RNA para la detección de 11 casos de discariosis Ejemplo 6 Las siguientes tablas resumen la detección de los transcritos de mRNA de E6/E7 de longitud completa mediante Pre-Tect HPV-Proofer contra la detección del DNA de HPV por PCR consenso y específica del tipo en muestras de una población de pacientes externas africanas. Las muestras clasificadas como histología (+) fueron evaluadas como CIN 11+ con base en la prueba histológica.

Los resultados de este estudio muestran la especificidad de un análisis basado en la detección de los transcritos de E6/E7 que codifican la proteína E6 de longitud completa a partir de cualquiera de los tipos de HPV 16, 18, 31,33 ó 45 (por ejemplo el Pre-Tect HPV-Proofer) para muestras que presentaron anormalidades celulares clasificadas como CIN 11+ con base en la prueba histológica. El ensayo del RNA tiene una especificidad semejante a la prueba histológica pero mayor sensibilidad.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. ün método xn vitro de filtraje de personas humanas de la presencia de virus de papiloma humano en por lo menos una célula o tejido, en donde el virus de papiloma humano presenta pérdida de regulación de la expresión del mRNA de E6/E7 y pérdida de la replicación y/o expresa un pre-mRNA estabilizado que codifica la proteína E6 de longitud completa, el método consiste en detectar la presencia de los transcritos de mRNA del gen de E6/E7 de un virus de papiloma humano que codifica la proteína Eß de longitud completa en una muestra de análisis que contiene mRNA obtenido de la célula o tejido, en donde la presencia de tales transcritos de mRNA de E6/E7 en la muestra se toma como indicación de la presencia de virus de papiloma humano que presenta pérdida de regulación de la expresión del mRNA de E6/E7 y pérdida de la replicación y/o expresión de un pre-mRNA estabilizado que codifica la proteína E6 de longitud completa en la célula o tejido.

2. Un método in vitro para el filtraje de individuos humanos par ala presencia de cambios celulares caracterizados por núcleos celulares aumentados y aneuploida celular en por lo menos una célula o tejido, cuyo método consiste en detectar la presencia de los transcritos de mRNA del gen de E6/E7 del virus de papiloma humano que codifica la proteína Eß de longitud completa en una muestra de análisis que contiene mRNA obtenido de la célula o tejido, en donde la presencia de tales transcritos de mRNA de E6/E7 en la muestra se toma como indicación de que la célula o tejido en análisis presenta cambios celulares.

3. Un método in vi tro para el filtraje de personas humanas para la presencia de infección transformante, persistente, con virus de papiloma humano en por lo menos una célula o tejido, cuyo método consiste en filtrar a la persona para la expresión de los transcritos de mRNA del gen de E6/E7 del virus de papiloma humano que codifica una proteína E6 de longitud completa en una muestra de análisis que contiene mRNA obtenido de la célula o tejido, en donde las personas- que dan positiva la prueba de expresión de tales transcritos de mRNA del gen de E6/E7 del virus de papiloma humano son clasificadas como personas que tienen infección transformante, persistente con virus de papiloma humano en la célula o tejido.

4. El método de acuerdo con cualquier de las reivindicaciones 1 a 3, el cual consiste en detectar la presencia de los transcritos de mRNA del gen de E6/E7 del virus de papiloma humano utilizando una técnica que puede detectar el mRNA de E6/E7 de al menos un tipo de HPV asociado con cáncer.

5. El método de conformidad con la reivindicación 4, el cual consiste en detectar la presencia de los transcritos de mRNA del gen de E6/E7 del virus de papiloma humano utilizando una técnica que puede detectar el mRNA de E6/E7 de los tipos de HPV 16, 18, 31, 33 y preferentemente 45.

6. El método de conformidad con la reivindicación 4, el cual consiste en detectar la expresión de los transcritos de mRNA del gen de E6/E7 a partir de cualquiera o cualquier combinación de dos o más de los tipos de HPV 16, 18, 31, 33 ó 45, en donde la presencia de los transcritos de mRNA del gen de E6/E7 del virus de papiloma humano de cualquiera de los tipos de HPV analizados en la muestra se toma como resultado positivo.

7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterízado porque la detección de la expresión de los transcritos de mRNA del gen de E6/E7 se lleva a cabo utilizando una reacción de amplificación para amplificar una región del mRNA, junto con detección en tiempo real de los productos de la reacción de amplificación.

8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la detección de la expresión de los transcritos de mRNA del gen de E6/E7 se lleva a cabo utilizando NASBA en tiempo real.

. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la detección de la expresión de los transcritos de mRNA del gen de E6/E7 se lleva a cabo utilizando el kit de análisis Pre-Tect HPV-Proofer™.

10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque los individuos humanos son individuos previamente identificados como infectados con el DNA del virus de papiloma humano, preferentemente en la célula o tejido que se analiza.

11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque los individuos humanos son individuos que tienen un diagnóstico previo de ASCUS, lesiones CIN 1 o condiloma.

12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, cuando se utiliza para el filtraje primario de personas que no tienen diagnóstico previo de anormalidades cervicales por prueba citológica.