CN1946858A - 人乳头瘤病毒的检测 - Google Patents

人乳头瘤病毒的检测 Download PDF

Info

Publication number
CN1946858A
CN1946858A CNA2005800132724A CN200580013272A CN1946858A CN 1946858 A CN1946858 A CN 1946858A CN A2005800132724 A CNA2005800132724 A CN A2005800132724A CN 200580013272 A CN200580013272 A CN 200580013272A CN 1946858 A CN1946858 A CN 1946858A
Authority
CN
China
Prior art keywords
hpv
mrna
cell
human papillomavirus
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2005800132724A
Other languages
English (en)
Inventor
F·卡尔森
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Norchip AS
Original Assignee
Norchip AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=32050932&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN1946858(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Norchip AS filed Critical Norchip AS
Publication of CN1946858A publication Critical patent/CN1946858A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及针对人乳头瘤病毒(HPV)的存在筛选人类受试者的体外方法，该病毒的存在显示出了E6/E7 mRNA表达调控的缺失以及编码全长E6蛋白的稳定前mRNA复制和/或表达的缺失。特别地，本发明提供了筛选持续细胞异常或持续CIN III病变，原位癌症或重度鳞状上皮病变(HSIL)的体外方法。本方法可用于宫颈癌的筛选。

Description

人乳头瘤病毒的检测
发明领域
本发明涉及针对人乳头瘤病毒(HPV)存在筛选人类受试者的体外方法，该病毒的存在显示出了E6/E7 mRNA表达调控的缺失以及编码全长E6蛋白的稳定前mRNA复制和/或表达的缺失。特别地，本发明提供了筛选持续的转化(transforming)HPV感染的体外方法，所述感染等同于持续的细胞异常或持续的CIN III病变，原位癌症或高度鳞状上皮病变(HSIL)的。本方法可用于宫颈癌的筛选。
发明背景
宫颈癌是世界范围内最普遍的恶性疾病之一，其是引起女性发病和死亡的主要原因之一(Parkin DM，Pisani P，Ferlay J(1993)′Int JCancer 54：594-606；Pisani P，Parkin DM，Ferlay J(1993)Int J Cancer55：891-903)。预测1996年美国有15,700个侵袭性宫颈癌的新病例，并且世界卫生组织估计全世界年度发病率是450,000例(1990)。世界不同地区的年度发病率各有不同，变化的范围是从西亚地区每100,000人7.6例到南非地区的每100,000人46.8例(Parkin等人，1993 ibid)。
当前对于宫颈癌的概念为它是一种多阶段的疾病，经常会发展10-25年的一段时期。子宫颈的侵袭性鳞状细胞癌由穿透基本层并入侵基质或上皮固有粘膜层(lamina propria)的现象所代表。宫颈癌的临床病程显示出相当多的变化。预后已被关联于：临床阶段、淋巴结牵连、初始肿瘤团块、组织学类型、侵入深度和淋巴结渗透等相关(DelgadoG，等人，(1990)Gynecol Oncol 38：352-357)。一些具有较少的有利(lessfavourable)肿瘤特征的患者有相对好的结果，而其他患者却遭受了原本受限的疾病带来的致命结果。这显示了：明确地需要另外的标记物进一步表征刚诊断出的宫颈癌，以便实施与风险适应的治疗(IkenbergH，等人，Int.J.Cancer 59：322-6.1994)。
宫颈癌的流行病学已经显示出和宗教、婚姻及性伴侣强烈相关。已经已针对HPV和宫颈肿瘤形成的联系进行了几乎所有100例的对照研究，几乎所有都发现了正相关(IARC monographs，1995)。这种相关对有限数量的病毒类型而言是强烈的、一致的和特异的(Munoz N，Bosch FX(1992)HPV and cervical neoplasia：review of case-control andcohort studies.IARC Sci Publ 251-261)。在大多数提供信息的研究中，通过侵入性癌症及重度CIN病变之间的显著一致性已观察到了与HPV16DNA的强烈相关，排除了这种相关能够被解释为偶然、偏见或混淆的可能性(IARC monographs，1995)。间接证据显示，癌症细胞中检测到的HPV DNA是针对癌发生早期HPV感染作用的优良标记物。有报道显示，在增加的病毒负载和宫颈癌的风险之间存在剂量应答关系(Munoz and Bosch，1992 ibid)。在一些更大的系列中，高达100％的肿瘤是HPV阳性的，但病毒为阴性的宫颈癌的存在仍然是可以检测到的(Meijer CJ，等人，(1992)Detection of human papillomavirus incervical scrapes by the polymerase chain reaction in relation to cytology：possible implications for cervical cancer screening.IARC Sci Publ 271-281；Das BC，等人，(1993)Cancer 72：147-153)。
在鳞状细胞宫颈癌中发现最频繁的HPV类型是HPV 16(41％-86％)和18(2％-22％)。另外也发现了HPV31、33、35、39、45、51、52、54、56、58、59、61、66和68(IARC，monographs，1995)。在巴塞罗那的HPV2000国际会议中HPV 16、18、31和45被定义为高风险，而HPV33、35、39、51、52、56、58、59、68被定义为中等风险(Keerti V.Shah.P71)。这13种高风险加上中等风险的HPV通常被一起称为癌症相关的HPV类型。
大量的研究已经揭示了HPV检验在宫颈筛选中的潜在作用(见Cuzick等人A systematic review of the role of human papillomavirustesting withing a cervical screening programme.Health Technol Assess3：14.1999)。
Reid等人(Reid R，等人，(1991)Am J Obstet Gynecol 164：1461-1469)最先展示了HPV检验在筛选中的作用。这一研究在来自性传播疾病诊所和妇科专家的高风险女性中执行，并且使用了敏感(低严谨性)Southern印迹杂交来检测HPV。总共涉及1012名女性，并且把子宫颈造影(cervicography)也考虑为细胞学的可能辅助。一共发现23例CIN II/III病变，但只有12例被细胞学手段探测到(敏感性52％，特异性92％)。HPV检验发现16例高度病变。
Bauer等人(Bauer HM，等人，(1991)JAMA 265：472-477)报道了在参加常规涂片检测的年轻女性(大学生)中使用MY09/11引物进行的早期基于PCR的研究(Manos M，等人，(1990)Lancet 335：734)。他们发现在467个女性中有46％的阳性比率，这比点印迹分析的比率(11％)高许多。
在使用GP5/6引物(Van DenBrule AJ，等人，(1990)J ClinMicrobiol 28：2739-2743)进行PCR的研究中van der Brule等人(VanDen Brule AJ，etal.，(1991)Int J Cancer 48：404-408)展示了HPV阳性和根据细胞学评估出的宫颈肿瘤形成之间的非常强的相关性。在年纪大一些的细胞学阴性的女性(35-55岁)中HPV阳性比率仅为3.5％，并且如果仅仅考虑类型6、18、31和33这会降低到1.5％，然而具有组织学原位癌症的女性都是HPV-阳性的，并且90％具有上述四种类型之一。以分级的方式，具有较少的严重组织学异常的女性有较低的HPV阳性比率，这显示出了一种清楚的趋势。
Roda Housman等人(Roda Housman AM，等人，(1994)Int JCancer 56：802-806)通过观测另外1373名女性的异常涂片检测扩展了这些观察。这一研究也证实了增加的阳性比率伴随着涂片结果的严重性的增加。他们也注意到HPV非均一性的水平从针对低度涂片的22种类型降低到针对高度涂片的10种“高风险”类型。这篇文献没有包括任何细胞学阴性的女性或是由组织学证实的细胞学疾病。
Cuzick等人(Cuzick J，等人，(1992)Lancet 340：112-113；Cuzick J，等人，(1994)Br J Cancer 69：167-171)首次报道了HPV检测可提供有用的信息用于对随机筛选中检测到的细胞学异常患者进行分类。在一项涉及133名女性的研究中，参照结肠镜检查他们发现了42％的阳性预测值，这与中度核异常的数值相近。这些结果对HPV16来说最为明显，42例HPV16阳性的女性中有39例在活体检查中发现了高度CIN。这一研究指出了评估病毒负载的重要性，并且只考虑高水平的高风险类型作为阳性。
Cox等人(Cox JT，等人，(1995)Am J Obstet Gynecol 172：946-954)展示了使用杂交捕获系统(DIGENE Corporation，Gaithersburg，MD，USA)的HPV检验用于通过边界涂片检验对女性患者进行拣别分类的作用。这一检验进行于来自一所大学转诊服务的217位此类女性，发现针对CINII/III具有93％的敏感性，而相比之下，针对重复细胞学的比率为73％。通过减少假阳性，发现高病毒负载，以提高性能。当以5RLU作为界限值，在不损失灵敏度下发现了大约24％的PPV。
WO 91/08312描述了测定感染HPV的个体预后的方法，其包含：通过检测样品中E6和/或E7 HPV基因的全部或一部分的转录本来测量HPV活性水平，并且对HPV的活性测量值和预先建立的活性与严重宫颈发育不良或肿瘤进程风险的关系加以比较。
WO 99/29890描述了基于测量和分析基因表达水平以评估HPV感染的方法。特别地，WO 99/29890描述了下述方法，所述方法基于：测量2种或更多HPV基因(例如HPV E6，E7，LI和E2)表达水平，以及继而对这些基因的组合的表达比率加以比较，以提供对患者体内基于HPV的疾病阶段的指示。
本发明人先前已经确定：仅基于对E6/E7 mRNA转录本表达的简单阳性/阴性分析来进行临床上有用的、对HPV相关疾病的评估是可能的，该方法并不需要对表达水平进行精确的定量测量。该方法从技术上讲是简单的，在一种优选的实施方案中，该方法可适应于中高通量模式的自动操作。在申请人的公开的国际申请WO 03/57914中对该方法进行了详细的描述。
在WO 03/57914中描述的方法优选使用Pre-Tect HPV-ProoferTM试剂盒来进行，该试剂盒可从商业渠道购买自Norchip AS。HPVProofer分析提供了三种水平上的信息：(1)鉴别出5种特异不同的HPV-类型(16、18、31、33和45)的mRNA；(2)确定癌基因HPV E6/E7mRNA的存在；和(3)确定指示调控障碍的全长E6/E7mRNA的存在。
对每份样品进行了三次双重NASBA反应，因此针对每份样品报道六个结果。每次都包括阴性对照以监测污染。所有HPV类型都包括阳性对照以监测试剂的性能。固有的细胞对照U1A mRNA(细胞持家基因)监测整个检验流程以消除可能的假阳性。HPV-Proofer分析是不可能检测HPV DNA的。PreTect分析软件(PAS)用于自动常规数据分析、解释和报告。
HPV-Proofer分析的用途已经由至少12项临床研究评估。
发明人现在已经确定Pre-Tect HPV-ProoferTM分析不能检测HPV病毒粒子，即使它能够检测来自于HPV 16、18、31、33和45的HPV-mRNA。相反地，E6/E7转录本的存在，如可通过HPV-Proofer分析确定的，可以指示转录调控的缺失及复制能力的缺失，和/或编码全长E6蛋白的、稳定的E6/E7 pre-mRNA的表达。Pre-Tect HPV-Proofer可以用于检测感染的病毒HPV颗粒，这是因为当转录调控缺失且病毒处于整合状态时病毒不能制造病毒粒子。使用HPV-Proofer检测到的在细胞中代表E6/E7表达阳性的病毒已经偏离了它们正常的生命周期，并且要么丧失了它们对来自所有E6/E7转录本启动子的转录控制的调控，或者要么丧失了剪接能力，将E6/E7转录本留在后面或表达编码全长E6蛋白的全长pre-mRNA的稳定形式。
发明人还已经观察到，E6/E7 mRNA转录本在感染HPV的细胞中的表达与以出现增大的细胞核、非整倍性(一般多于5或9个着丝点/细胞)以及有丝分裂为特征的细胞变化相关。E6/E7表达阳性(例如使用PreTect HPV-Proofer检验)的细胞有时是不正常的，其显示出细胞异常或具有大的成熟细胞核。这些结果也和宫颈病变的细胞学及组织学特征相关。细胞学上或组织学上定义的缺乏具有增大细胞核并具有少于9个着丝点的细胞的低度病变不能给出用HPV-Proofer检测E6/E7 mRNA表达的阳性结果。
因此，发明人已经确定人乳头瘤病毒E6/E7转录本的表达可用作为与存在人乳头瘤病毒持续感染相关的细胞异常存在的分子指示物。E6/E7表达的检测因此可能用于鉴别高度和低度宫颈病变。特别地，E6/E7表达的检测可以辨别组织学定义的没有非整倍性染色体的CINIII样品和那些具有非整倍性染色体细胞的样品；编码全长E6蛋白的E6/E7 mRNA阳性的样品被认定为具有非整倍性染色体的细胞。E6/E7表达的检测也可以鉴别组织学定义的进入退化阶段CIN III或CIN II(HSIL病例)病例与那些感染持续或发展的病例；编码全长E6蛋白的E6/E7 mRNA阳性的样品被认定为：如果不处理的话很可能具有可以发展的感染。
本发明人已经进一步得出结论：
(1)E6/E7癌基因表达的发病率随着病变的严重程度而上升。
(2)通过评估E6/E7表达来检测HPV癌基因活性，任选地与对HPV分类结合，是高度病变的有效预测物。
(3)绝大部分的宫颈癌(96％)含有五种主要致癌HPV类型(HPV16、18、31、33和45)中的至少一种。
(4)与那些没有阳性HPV-Proofer结果的患者相比，利用Pre-TectHPV-ProoferTM检验出E6/E7表达阳性的患者更可能具有持续的感染。
相应地，第一方面本发明提供了一种体外方法，所述方法针对至少一种细胞或组织中人乳头瘤病毒存在筛选人类受试者，其中人乳头瘤病毒显示出了E6/E7 mRNA表达调控的缺失以及编码全长E6蛋白的稳定前mRNA的复制和/或表达的缺失，本方法包括：在包含来源于细胞或组织mRNA的检验样品中检测编码全长E6蛋白的人乳头瘤病毒E6/E7基因的mRNA转录本的存在，其中此类E6/E7 mRNA在样品中的存在转录本被认为是在组织和细胞中存在下述人乳头瘤病毒的指示，所述病毒显示出了具有E6/E7 mRNA表达调控的缺失以及编码全长E6蛋白的稳定前mRNA的复制和/或表达的缺失。
第二个方面本发明提供了一种体外方法，所述方法针对至少一种细胞或组织中存在的以增大的细胞核和细胞非整倍性为特征的细胞变化来筛选人类受试者，该方法包括：在包含来源于细胞或组织mRNA的检验样品中检测编码全长E6蛋白的人乳头瘤病毒E6/E7基因的mRNA转录本的存在，其中此类E6/E7 mRNA转录本在样品中的存在被认为是受试细胞或组织显示出细胞变化的指示物。
第三个方面本发明提供了一种体外方法，所述方法针对至少一种细胞或组织中人乳头瘤病毒持续转化感染的存在来筛选人类受试者，本方法包括：在包含来源于细胞或组织mRNA的检验样品中筛选出具有编码全长E6蛋白的人乳头瘤病毒E6/E7基因mRNA转录本表达的受试者，其中具有人乳头瘤病毒E6/E7基因此类mRNA转录本表达阳性的受试者被认为在细胞或组织中具有人乳头瘤病毒的持续转化感染。
由编码下述HPV亚型之一的全长E6蛋白的人乳头瘤病毒E6/E7转录本的存在所鉴定出的16、18、31、33或45型HPV之一的“持续转化感染”，被认为等同于细胞学或组织学评估出的持续细胞异常或持续CIN III病变、原位癌症或者高度鳞状上皮病变(HSIL)。因此，本发明的第三个方面的方法提供了筛选等同于持续细胞异常或持续CINIII病变、原位癌症或者高度鳞状上皮病变(HSIL)的人乳头瘤病毒持续转化感染的方法。
由编码全长E6蛋白的人乳头瘤病毒E6/E7基因的mRNA的持续存在所定义的HPV持续转化感染可能和持续的CIN II+直接相关，因此可在宫颈筛查程序中作为预后性症状的标记物。特别地，本发明的方法可以用于对基于细胞学/组织学确认为具有非典型未确定意义的鳞状细胞或低度鳞状上皮病变的女性患者进行拣别分类。对所述患者的管理是使人困惑的，因为只有一小部分会发展成为宫颈上皮肿瘤形成(CIN)III和侵入性宫颈癌(ICC)。通过细胞学/组织学的继续检验不能确认所有那些处于高CIN II+风险的女性。在本文报道的临床研究中，对编码全长E6蛋白的全长E6/E7基因mRNA表达的检测，显示出了针对高度宫颈病变的显著特异性，这表面此类转录本的存在提供了一种有用的预后性症状标记物。
使用本发明的方法得到的阳性的筛选结果是由检测到编码全长E6蛋白的E6/E7 mRNA转录本的表达所指示的。E6/E7 mRNA表达的阳性结果指示了受试者携带了下述病毒，所述此病毒显示出E6/E7 mRNA表达调控的缺失和/或所述病毒表达编码全长的E6蛋白的稳定前mRNA，该结果进一步表明受试者具有异常的细胞变化。
本文中使用的术语“E6/E7调控的缺失”指：或者缺失了对所有E6/E7转录本启动子的转录控制调控，或者缺失了E6/E7开放读码框中正常的剪接能力。
术语“稳定的前mRNA”是指：还没有经历E6开放读码框中的任何剪接事件、并且因此编码全长蛋白、且比由相同HPV亚型的天然或野生型人乳头瘤病毒所表达的编码全长E6蛋白的任何等同初级(未剪接)E6/E7转录本更稳定(即，显示出更长的半衰期)的初级E6/E7转录本。天然或野生型人乳头瘤病毒是指没有与持续感染人类宿主相关的基因组修饰并且没有整合到人类基因组内的病毒。这样的天然和野生型病毒也具有紧随转录发生的E6/E7前mRNA或全长mRNA转录本剪接的特征，使得全长前mRNA不会在细胞中积累至任何显著的程度。因此，前mRNA一般并不在被天然或野生型病毒感染的细胞中翻译出全长E6蛋白，这是因为前mRNA在翻译发生前会被剪接器件加工。然而，在具有与持续HPV转化感染相关的异常的细胞中，前mRNA是稳定的和/或不被剪接的并且因此可以在细胞内聚集到一个在正常细胞或正常增殖细胞(例如被复制中的HPV感染的细胞)中所不能观察到的水平。
相对于在天然型或野生型病毒中表达的初级E6/E7(未剪接)的初级转录本而言，稳定前mRNA可以被修饰，例如在位于编码E6蛋白的开放读码框之外的转录本区域中，删除HPV序列或加入转录自作为病毒整合结果的人基因组的mRNA序列。因此稳定的前mRNA可以是与天然型或野生型病毒表达的E6/E7初级(未剪接)转录本不同的序列和结构，但其将仍然编码全长E6蛋白。
术语“异常细胞变化”包括了以比低度宫颈病变或低鳞状上皮病变更严重的疾病为特征的细胞变化，包括了以等价或严重于高度CIN(特征为转化细胞的肿瘤扩张)、CIN(宫颈上皮肿瘤形成)III、或高鳞状上皮肿瘤形成(HSIL)的疾病为特征的细胞变化，包括了多倍DNA增殖病变和伴随有增加的平均DNA指示值、高百分比的DNA非整倍性和2.5c过度率的“恶性”CIN病变(Hanselaar等人，1992，AnalCell Pathol.，4：315-324；Rihet etal.，1996，J.Clin Pathol49：892-896；和McDermott等人，1997，Br.J.Obstet Gynaecol.104：623-625).。
宫颈上皮肿瘤形成(缩写为CIN)也称作宫颈发育不良，是人乳头状瘤病毒导致的一种宫颈状况。CIN根据其严重性分为I，II或III级。它被认为是一种前癌性异常，却并不是实际的癌症。最温和的类型，CIN I，通常只会保持自身状态，虽然它很少能发展成癌症。更加严重的类型，CIN II and CIN III，大部分通常保持原态或随时间而变得更严重。它们能够成为癌症，但是如果经常治疗，大多数情况下不会这样。
HPV已经被定义为一种在子宫颈细胞变化发展中的病原体，它能导致宫颈癌的发展。这些细胞变化和来自于HPV病毒基因组的E6/E7蛋白的组成性或持续表达相关。因此，可以推论出：其中E6/E7 mRNA表达可被检测到的受试者，特别是那些经过一段时间的评估时显示出持续E6/E7表达的受试者，子宫颈已发生了明显细胞变化。这些变化可能已经发生于子宫颈的极少数细胞中，并且可能没有被常规的细胞学方法检测到。尽管如此，随着敏感、特异和准确的检测E6/E7 mRNA的方法的使用，鉴定出在比使用传统细胞学筛选方法可能探测到的时间更早得多的阶段已经显示出子宫颈细胞变化的受试者已经成为可能。这将允许针对预防宫颈癌发展的治疗更早地介入。
作为HPV整合至人基因组的结果或者作为在修饰过的游离HPV基因组中发生的“修饰作用”的结果，对病毒E6/E7癌基因转录的正常控制已经缺失(Durst etal.，1985，J Gen Virol，66(Pt 7)：1515-1522；Pater and Pater，1985 Virology 145：313-318；Schwarz etal.，1985，Nature 314：111-114；Park etal.，1997，ibid)。相反，在恶变前的病变和HPV感染的正常上皮中乳头瘤病毒主要为“未经修饰的”游离体形式，因此癌基因(E6/E7)的转录可能缺乏或被有效负调节(Johnson etal.，1990，J Gen Virol，71(Pt 7)：1473-1479；Falcinelli etal.，1993，J MedVirol，40：261-265)。观察到人乳头瘤病毒类型16的DNA整合进入人基因组会导致更加不稳定的细胞活性/基因组，并且增加了E6和E7mRNA的稳定性(Jeon and Lambert，1995，ProcNatl Acad Sci USA 92：1654-1658)。因此普遍发现于宫颈癌中但仅仅偶然发现于CIN病变中的HPV整合，(Carmody etal.，1996，Mol Cell Probes，10：107-116)，是宫颈癌发生中的一个重要事件。
在临床实践中，依赖仅筛选E6/E7 mRNA表达的方法的性能严重依赖可信地获得针对E6/E7 mRNA表达的阴性结果的能力。这也需要具有最大灵敏度因此产生最少的假阴性结果的检测技术。在一种优选的实施方案中，通过使用灵敏的扩增和实时检测技术以筛选E6/E7mRNA的存在或不存在来实现这样的效果。最优选的技术是使用分子信标探针的实时NASBA扩增，该技术由Leone等人在Nucleic AcidsResearch.，1998，Vol 26，2150-2155中描述。由于本项技术的灵敏度，假阴性结果的发生被最小化，“阴性E6/E7表达”的结果可以以更高的置信水平来获得。如果这种检验被用于临床筛选程序的实践中，这一点就是极端重要的。
优选地，针对来自于16、18、31、33和45型HPV中任何一种或多种(更优选是全部)的E6/E7 mRNA的表达加以检验。在一种实施方案中，这一分析可以只检测上述HPV类型。来自于16、18、31和33型HPV的DNA已经在超过96％的来自于挪威人群的宫颈癌患者样品中被检测到。其它研究已显示，大多数情况下，E6和E7不变地保留在宫颈癌中，因为其表达很可能是转化为恶性状态和维持恶性状态所必需的(Choo etal.，1987，J Med Virol 21：101-107；Durst etal.，1995，Cancer Genet Cytogenet，85：105-112)。和基于对未损伤的基因组或LI基因序列的检测的HPV检测系统相反，对表达自E6/E7区域的HPVmRNA的检测可以检测出超过90％的、与发展宫颈癌风险直接相关的患者。
在临床中，基于检测E6/E7 mRNA的方法可以用于后筛选或患者拣别分类，即对具有前期ASCUS，CIN1或扁平湿疣症状个体的进一步分析。此方法可以用于从具有前期ASCUS，CIN1或扁平湿疣诊断症状的个体群中挑选出那些具有发展成宫颈癌的高风险的患者。由于不同细胞学家和细胞学系之间非常低的再现性，ASCUS，扁平湿疣和CIN1或多或少可以被定义为同样的症状，Ostor(Int J.Gyn Path.12：186-192.1993)发现只有1％左右的CIN 1病例可能发展为宫颈癌，因此迫切需要一种鉴别出具有发展出宫颈癌的实质性风险的ASCUS，扁平湿疣或CIN I的个体亚组的有效的方法。Karlsen等人在1996年的研究中，在87％的宫颈癌病例中检测到了16、18、31或33型HPV之一的存在。再加上HPV 45，接近90％的宫颈癌样品被发现和这5类HPV类型相关。因此，从Ostor(Int J.Gyn Path.12：186-192.1993)提供的数据进行计算，超过99.9％是被检测到具有ASCUS，具有CIN I或扁平湿疣检的病例被我们的HPV-Proofer试剂盒所遗漏。
本方法的高灵敏度和特异性意味着它可以在针对检验女性是否具有发展为宫颈癌的高或很高风险的初始筛选、回复-检验试剂盒或常规诊断中发挥作用。
在本发明的方法中，mRNA的“阳性表达”被认为是高于背景的平均表达。这并不绝对需要对E6/E7 mRNA表达水平的精确定量。
在某些实施方案中，本发明的方法可以包括对mRNA表达水平的定量测量。在一种优选的实施方案中，为了明确区分“阳性表达”和“阴性表达”，确定“阳性表达”可能需要超过50个拷贝的相关mRNA(每毫升样品或每总体积样品)的存在，而确定“阴性表达”可能需要少于1个拷贝的相关mRNA(每毫升样品或每总体积样品)的存在。
本发明的方法将优选涉及：通过使用能够特异地检测来自癌症相关的HPV类型(更加优选地，来自“高风险”的癌症相关HPV类型)的E6/E7 mRNA的技术，来筛选E6/E7 mRNA。在最优选的实施方案中，该方法涉及：通过使用能够检测来自16、18、31和33型、优选45型HPV的E6 mRNA的技术来筛选E6/E7 mRNA。最优选地，该方法将特异检测来自HPV 16、18、31、33型和优选地，还有45型的至少一种的E6/E7 mRNA的表达，并且最优选得，特异检测来自所有五种类型的E6/E7 mRNA的表达。然而，来源于16、18、31、33和45型之外的例如35、39、45、52、56、58、59、66和68型的E6/E7表达阳性的女性可能仍然有明显的细胞异常。因此，本方法可以包括从对来自上述一种或多种HPV类型的E6/E7 mRNA的表达加以筛选，最优选地，这在除对来自16、18、31、33和45型HPV的E6/E7 mRNA的筛选外进行。某些HPV类型呈现显著的地理/种群分布。因此，包括已知在所检验的地理/种群区域中流行的HPV类型是合适的，例如除对16、18、31、33和45型HPV进行筛选之外。
本发明的方法以对编码全长E6蛋白的HPV类型中的一些或全部的全长E6/E7 mRNA转录本的检测为基础。在这些实施方案中，全长E6/E7 mRNA的存在被认为是阳性筛选结果。
术语“全长E6/E7 mRNA转录本”不包括任何天然存在的剪接变体，但包括编码功能性全长E6和E7蛋白的双顺反子转录本。四种E6/E7 mRNA类型迄今为止已经在被HPV16感染的细胞中得到描述，即未剪接的E6转录本和三种被命名为E6*I、E6*II和E6*III的剪接转录本(Smotkin D，等人，J Virol.1989 Mar 63(3)：1441-7；Smotkin D，Wettstein FO.ProcNatl Acad Sci USA.1986 Jul 83(13)：4680-4；Doorbar J.等人，Virology.1990 Sep 178(1)：254-62；Cornelissen MT，等人J Gen Virol.1990 May 71(Pt 5)：1243-6；Johnson MA，等人JGen Virol.1990 Jul 71(Pt 7)：1473-9；Schneider-Maunoury S，等人JVirol.1987 Oct 61(10)：3295-8；Sherman L，等人Int J Cancer.1992Feb 50(3)：356-64)。所有四种转录本是由恰恰位于E6 ORF第二个ATG上游的单一启动子(p97)所驱动转录的。在HPV16的情形中，术语“全长E6/E7转录本”是指包含E6 ORF第97-880位核苷酸的所有或基本上所有区域的转录本，包含第97位和880位的核苷酸在内。核苷酸的位置是根据标准HPV命名表(see Human PapillomavirusCompendium OnLine，available via the internet or in paper form fromHV Database，Mail Stop K710，Los Alamos National Laboratory，LosAlamos，NM 87545，USA)而编号的。
关于除HPV16之外的HPV类型，“全长”E6/E7转录本可能认为包含含有与HPV16 E6/E7的上述转录本同源的序列的转录本，而不包括E6剪接变体。HPV类型的各种序列比对可从人乳头瘤病毒在线中公开获得。
对全长E6/E7 mRNA转录本的特异检测可以通过以下方式来实施，例如，使用特异于只出现在全长E6/E7转录本中而不出现剪接变体中的区域的引物或探针。
E6*I转录本显示缺失了226到409(在16型HPV中)位核苷酸之间的编码序列并且E*611转录本显示缺失了226到526(在16型HPV中)位核苷酸之间的编码序列。因此优选使用至少一种来自位于16型HPV的226和409位核苷酸之间的区域或来自18、31、33或45型HPV之一的同源区域的引物或探针。全长转录本的特异性可通过使用下述引物对来实现，所述引物对中一个引物特异对应于位于此区域内的序列并且另一个引物特异对应位于此区域之外的序列，或者两条引物都特异于此区域内的序列，优选地，与特异于位于此区域内序列的探针相连接。在其它实施方案中，可以组合使用两条引物都特异于位于此区域之外的序列的引物对，和特异于此区域内序列的探针，以赋予对编码全长E6的mRNA的特异性。
不同的HPV类型呈现不同的E6/E7 mRNA表达模式。可用于辅助设计用于探针或引物以检测全长E6/E7转录本的多种HPV类型(包括HPV16和31型)的转录图可通过人乳头瘤病毒(Human PapillomavirusCompendium)公开获得(参上)。
分析方法学
本发明的方法包括：在至少一种细胞或组织中，更具体地，在包含来自于至少一种细胞或组织的RNA的样品中，筛选E6/E7转录本的存在。此至少一种细胞或组织必须包括：至少一种怀疑感染了人乳头瘤病毒的子宫颈细胞，例如子宫颈上皮细胞。
这里公开的筛选方法可以在从含有受试者体内取出的宫颈细胞的临床样品或者活组织切片中分离出的核酸制备品上执行。可用作核酸来源的合适样品包括(但并不仅仅包括)子宫颈拭抹物、子宫颈活体检测物、子宫颈刮擦物、通过使用毛刷和棉塞移除的样品、皮肤活体检测物/瘤，也包括石蜡包埋的组织和福尔马林或甲醇固定的细胞。
使用本发明公开的方法制备用于筛选的核酸必须包含mRNA，然而它并不需要是纯化的poly A+mRNA制品，总RNA制品或包含RNA和基因组DNA的总核酸粗制品，甚至细胞裂解粗产物也适合成为NASBA反应的起始材料。本质上而言，本领域已知的任何用于分离包含mRNA的核酸制品的技术都可以用于从检验样品中分离核酸。优选的技术是US-A-5,234,809和EP-B-0389,063中描述的“Boom”分离方法。这种方法，其能用于分离包含RNA和DNA的核酸制品，其是以在离液剂硫氰酸酯胍(GuSCN)存在条件下核酸与二氧化硅颗粒的结合特点为基础的。
本方法以分析HPV基因组的转录活性为基础。本方法并不限于用于检测RNA表达的精密技术。本领域已知许多可用于检测特定mRNA序列的技术，它们都可以用于本发明中。例如，特异mRNA可以通过杂交、扩增或测序技术被检测。
最优选的是使用扩增技术检测mRNA表达，最优选的是如NASBA的等温扩增、转录调节扩增、信号调节RNA扩增技术、等温液相扩增等。所有这些方法都已是熟知的现有技术。更优选地，mRNA的表达是通过等温扩增组合扩增产物的实时检测来检测的。最优选的组合为通过NASBA的扩增，组合利用分子信标技术进行的对扩增产物的实时监测，如Leone等人在Nucleic Acids Research，1998，Vol 26，2150-2155所描述的。
使用NASBA技术在检验样品中检测HPV的方法总体上包括如以下步骤：
(a)配制反应介质，其包括合适的引物对、RNA指导的DNA聚合酶、水解RNA-DNA杂合体中RNA链且不会水解单链或双链RNA或DNA的核糖核酸酶、识别所述启动子的RNA聚合酶，和核糖核苷及三磷酸脱氧核糖核苷；
(b)将介质和分离自怀疑包含HPV的检验样品中的核酸制品在允许NASBA扩增反应的条件下进行温育；和
(c)检测和/或定量测量NASBA扩增反应的任何HPV特异性产物。
对NASBA反应的特异产物(例如目标RNA的正义和/或反义拷贝)的检测可以通过多种不同方法执行。在其中一种方法中，NASBA产物可以通过使用能特异性地退火到NASBA产物的HPV特异性杂交探针来检测。该杂交探针可以附着在示踪标记物上，例如荧光、发光、放射性或化学发光化合物，或酶标或本领域普通技术人员已知的其它任何标记物。标记物的具体性质并不重要，但它应该能够通过其自身或与一种或多种附加物质(例如酶的底物)联合产生可被外部设备检测到的信号。
优选的检测方法是能够允许在反应全程连续监测NASBA反应产物形成的所谓的“实时NASBA”。在一种优选的实施方案中，这可以通过使用“分子信标”探针而实现，所述探针包含能退火到NASBA产物的HPV特异性序列，形成双茎的寡核苷酸序列和一对荧光/淬灭部分，如本领域已知的和在此所述的。如果分子信标探针在扩增前加到反应混合物中它就可能实时监控NASBA产物的形成(Leone etal.，Nucleic Acids Research，1998，Vol 26，2150-2155)。进行实时NASBA的试剂盒和操作指南是商业可得的(例如NucliSens EasyQ system，fromOrganon Teknika)。
在另一种方法中，分子信标技术可以和引物2寡核苷酸合并，从而无需单独的杂交探针就可以实时监测NASBA反应。
在又一种方法中，可以通过使用能和引物2寡核苷酸5′端的核酸序列杂交的一般标记检测探针来监测NASBA反应的产物。这等同于Organon Teknika提供的“NucliSensTM”检测系统。在这个系统中，来源于目标HPV mRNA的NASBA产物的特异性可以通过使用下述HPV特异性的捕获探针来赋予，所述探针包含这里描述的、吸附在如磁性微珠一类的固体支持物上的探针寡核苷酸。最优选地，一般标记检测探针是Organon Teknika提供的ECL检测探针。NASBA扩增子可和HPV特异性的捕获探针及一般ECL探针杂交(通过引物2上的互补序列)。杂交之后微珠/扩增产物/ECL探针复合物可以在自动ECL读数机(例如Organon Teknika提供的NucliSens读数机)的磁性电极上被捕获。接下来，压脉冲引发了ECL反应。
本方法的优选实施方案依赖于：扩增出至少为主要的癌症相关的HPV类型16，18，31和33以及优选还有HPV45的E6/E7 mRNA。为了实现这一点有多种不同方法。
在一种实施方案中，特异对应于16、18、31和33优选45型HPV的单独引物对可以单个用来扩增来自每一种HPV类型的转录本。另外，在一个反应容器中的两种或多种引物对的混合物可用来实现扩增反应的多元复用。
在另一种实施方案中，能够扩增来自16、18、31和33型以及优选还有45型HPV的E6/E7基因区域的单一的引物对可以使用，其因此能够在一个扩增反应中扩增所有4(优选5)种类型。这能够，例如，通过使用一对简并引物或选择在各个HPV类型中高度保守的E6/E7mRNA区域而实现。
E6/E7引物对可以相应于E6/E7 mRNA的任何区域，并且可以扩增E7开放读码框和/或E6的开放读码框的所有或一部分。优选地，它能够扩增编码全长E6蛋白的全长转录本。
在另一种方法中，针对多种HPV类型的特异性可以通过使用简并寡核苷酸引物或者显示较小序列变异(优选对应于HPV基因型之间的序列变异)的多核苷酸的复杂混合物而实现。使用这样的简并引物或混合物的基本原理是混合物可以包含至少一种可以检测每一种HPV类型的引物对。
在又一种方法中，针对多种HPV类型的特异性可以通过在引物中，优选在HPV基因型之间的序列变异的位点上，将一个或多个次黄嘌呤核苷酸掺入而实现。
在WO 03/057914和WO 03/057927中可以找到可用于检测来源于多种HPV类型的E6/E7mRNA的合适引物和探针的清单。WO03/057914和WO 03/057927的全部内容通过引用并入本文。
本发明的方法优选地通过使用Pre-Tect HPV-ProoferTM检验和试剂盒而实施。然而，应该理解，本发明并不仅仅限于使用这种特定的检验。
本发明的方法对于真正组织学阴性的、来源于整个或部分子宫颈、尸体或/和宫颈癌的典型样品给出阴性结果。这将提供显著的特异性并使得PreTect HPV-ProoferTM成为已经发展起来的最有前途的初级筛选方法之一。
已证明单独使用PreTect HPV-ProoferTM来诊断处于发展宫颈癌风险中的女性的特异性是与年龄和工作无关，其特异性是单独使用商业化的基于DNA的检验的三倍。
对E6/E7转录本的检测具有无需重复检验就可鉴别哪种高危感染能够持续发展的潜力。E6/E7癌基因表达的发生率随着病变的严重程度增加。
本发明的方法可以和通过任何合适方法进行的HPV基因型分类一起实施。术语“HPV基因型分类”是指能够鉴别出现在给定个体中存在的HPV亚型的任何技术。通过检测E6/E7表达并结合HPV分型来评估HPV癌基因活性，将会成为针对高度病变的强大预报器。
参考以下实验性的实施例，本发明将得到进一步的理解。
Pre-Tect HPV ProoferTM检验
对涉及使用Pre-Tect HPVProoferTM试剂盒和检验的所有实验性实施例而言，检验是通过使用商业可得的试剂盒并依照提供的操作手册而实施的。关于实时检测HPV E6/E7 mRNA的检验操作的更多信息可以在WO 03/057914中找到，其全部内容通过引用并入本文。
下面的实验部分总结了使用Pre-Tect HPV-ProoferTM检验和试剂盒所获得的临床数据。
实施例1-从门诊病人群体中选出的4136例子宫颈样品中的致癌人乳头瘤病毒(HPV)的E6和E7 mRNA的表达
本研究的目的是鉴定经由组织学确认的细胞学HGSIL/CIN3样品中E6/E7 mRNA和DNA的存在。
材料和方法：
样品采集自经过仔细筛选的门诊病人群体，包括大于30岁的女性(n＝4136)。来自于每一种高风险HPV类型16、18、31、33和45的E6/E7转录本由基于实时多路NASBA的PreTect HPV-Proofer检验来检测(NorChip AS，Klokkarstua，Norway)。通过Gp5+/6+一致性PCR来研究HPV DNA的存在，并且继而将HPV DNA阳性样品用于针对16、18、31、33和45型HPV的类型特异PCR。具有细胞学HGSIL症状的女性是通过组织活体检测和组织学检测而确定的。
组织学上确认的病例已登记在挪威癌症登记中心(NorwegianCancer Registry)。在挪威，细胞学HGSIL可以分为HGSIL/AGUS，HGSIL/ASC-H，HGSIL/CIN2和HGSIL/CIN3。
结果：
25例细胞学HGSIL病例中，14例是组织学上确认为CIN2+的。两例组织学CIN2+病例通过细胞学诊断为HGSIL/ASC-H和HGSIL/CIN2。PreTect HPV Proofer检测到了52％(13/25)的细胞学HGSIL病例、86％(12/14)的组织学CIN2+病例，以及组织学未验证的9％(1/11)的细胞学HGSIL病例。Gp5+/6+PCR的数值分别是64％(16/25)，93％(13/14)和27％(3/11)。有一例经过一致性PCR检验为阳性，而经PreTect HPV-Proofer检测为阴性的组织学CIN2+样品被证明是HPV 35。HGSIL/CIN3的流行率是0.29％(12/4136)，而组织学CIN2+的流行率是56％(14/25)。PreTect HPV-Proofer和一致性PCR的敏感性、特异性和阳性与阴性预期值在表1中示出。
表1：
  总的(n＝4136)终点细胞学HGSIL/CIN3   细胞学HGSIL(n＝25)终点细胞学CIN2+
  HPVProofer   一致性PCR   HPVProofer   一致性PCR
  敏感性   75.0％   83.3％   85.7％   92.9％
  特异性   97.2％   89.9％   90.9％   72.7％
  PPV   7.3％   2.3％   92.3％   81.3％
  NPV   97.2％   99.9％   83.3％   88.9％
PPV＝阳性预期值
NPV＝阴性预期值
讨论和结论：
细胞学HGSIL/CIN3和组织CIN2+病例之间有很好的一致性，只有仅仅一例细胞学HGSIL/CIN3没有被组织学鉴定为CIN2+。组织学上验证出的CIN2+病例中，针对HPV DNA和mRNA的检测等级都是高的，并且几乎等同。在未被组织学验证的细胞学HGSIL病例中，用于PreTect HPV-Proofer的检测等级低于用于一致性PCR的。合起来，细胞学HGSIL/CIN3和PreTect HPV-Proofer检测到了所有的组织学CIN2+。
总之，来自于五种最经常发现的致癌HPV类型，HPV 16、18、31、33和45的HPV E6/E7转录本，看起来存在于几乎所有组织学CIN2+病例中。PreTect HPV-Proofer的高特异性和阳性预期值在HPV诊断中是一个有利条件，并且因此mRNA检测是对细胞学和组织学的合适补充。
实施例2-HPV检测在瑞典妇科学筛选程序中作为低度病变的继续追查
在瑞典，每年大约有40000例细胞学病例显示出了异常状况并需要继续追查。大部分病例自然地恢复了但有些病例如果不处理则会继续发展。继续追查程序中也存在细胞学低灵敏度的问题。在对癌症前期病变的检测中，当HPV检验是在对细胞学ASCUS或CIN I的检测完成后再实施时，就会发现特异性和灵敏度有飞跃性的提高。
主要的目的是在瑞典筛选程序中，评价HPV RNA和DNA检验相对于细胞学和组织学的各自的作用。另一个重要的目的是评估在具有CIN I或ASCUS但呈现HPV RNA或DNA检验阴性的女性中缺失CINII+的风险。
测试材料来自对瑞典中部地区常规筛选程序之后的15000名女性。细胞学上呈ASCUS或CIN I阳性的所有女性被选出用于进一步的研究。所有的细胞学或组织学材料都由有经验的病理学者进行盲式(blindly)重新评估。对ASCUS和CIN I阳性样品(N＝240)使用PreTect HPV-Proofer(N＝240)进行评估，并且四个月后将一组随机选择的样品用于杂交捕获II(HCII)与细胞学(N＝127)检验和单独的细胞学检验。将其与7个月后用组织学进行的LEEP活体组织检测(N＝126)，和12个月后使用PreTect HPV-Proofer(N＝240)、HCII和细胞学进行的检测相比较(表2)。检验了所有ASCUS和CIN I样品的mRNA。阴道镜(Coloposcopy)定位的LEEP活体组织检测(N＝126)被用作为对所有具有异常细胞学症状和/或阳性HPV DNA检验结果(4个月后)的女性进行的继续追查的一部分。使用HCII分析(Digene，Gatesburg，MD，USA)来检测HPV DNA。对来自于HPV 16、18、31、33和45的E6/E7mRNA转录本的鉴定和个体分类是通过使用PreTectHPV-Proofer分析(NorChip AS，Klokkarstua，Norway)来进行的。
结果
HPV检验的结果已经与细胞学阳性诊断4个月和12个月后的细胞学检验结果以及7个月后的进行的组织学诊断结果进行了比较。HPV类型的频率和分布状态在表3中显示。在19％的病例中发现了细胞学和组织学检测结果之间的一致性。在组织学的良性和低度病变中细胞学和DNA检验比RNA检验有更普遍的阳性机率。组织学作为“黄金标准”的情况下，和DNA检测(分别是31％和51％)相比，RNA检验显示出了更高的阳性预期值和更高的特异性(分别是46％和85.3％)。然而DNA检验(91％)显示出了比RNA检验(81％)更高的敏感性。通过LEEP宫颈锥形切除术治疗的病例中的19％在治疗5个月后显示出异常的细胞学特征，0.5％的发现是CIN II+。在这些病例的24％中检测到了HPV DNA，并且6％检测到了HPV RNA.(表2)
表2：全部的结果
  0月   4月   7月   12月
  细胞学   240/240(100％)   93/217(43％)   未分析   30/160(19％)
  HCII   未分析   64/113(57％)   未分析   41/169(24％)
  Pretect   未分析   56/240   未分析   14/231
  HPV-Proofer   (23％)   (6％)
  组织学   未分析   未分析   100/118(85％)   未分析
表3：组织学结果与HPV DNA、RNA和细胞学结果的对比
  细胞学诊断   ASCUS   CIN I   CIN II   CIN III-ASCUS-H
  HPV 16   6   4   4   2
  HPV 18   2   1   0   3
  HPV 31   0   2   1   1
  HPV 33   3   2   1   2
  HPV 45   3   0   0   1
  HPV-Proofer总数   14/49(29％)   9/27(33％)   5/8(63％)   6/6(100％)
  HCII   20/26(77％)   11/15(73％)   3/3(100％)   2/2(100％)
  组织学CIN II+仅cyt   3/23(13％)   3/12(25％)   4/5(80％)   3/4(75％)
  组织学CIN II+cyt& HCII   7/20(35％)   1/11(9％)   3/3(100％)   2/2(100％)
  组织学CIN II+所有样品   12/45(27％)   4/27(14％)   7/8(88％)   5/6(83％)
讨论和结论：
与基于DNA的方法相比，基于RNA的方法具有较高的阳性预期值和较高的特异性，这可以用下述事实来解释：E6/E7癌基因的表达是恶性表型的维持和发展所需要的。具有CIN I或ASCUS但呈现HPVRNA或DNA检验阴性的女性中缺失CIN II+的风险非常之低(0.2％)，这证实了在细胞学ASCUS或CIN I中HPV检验的附加价值。
实施例3-在年龄小于30岁的女性中不伴随癌基因表达的高危HPV感染
人乳头瘤病毒(HPV)是女性中常见的病毒感染，特别是在年轻群体中，虽然大部分感染是暂时的和没有症状的。在斯堪的纳维亚国家中，HPV在30岁以上女性人群中的流行率在5到15％之间变化，在年轻的女性中HPV流行率可能高达30-40％。并且，70-80％性活跃的女性会在她们一生中某个阶段获得HPV感染。然而，大很多的感染会自然地清除，只有一小部分会持续并发展成宫颈上皮细胞病变(CIN)。
本研究的目的是在年龄小于30岁的女性中比较对E6/E7转录本的检测和对HPV DNA的检测。
材料和方法：
总共检测了282例30岁以下(平均年龄26.9岁)女性的子宫颈样品。使用NucliSens Extractor提取RNA和DNA，并使用PreTectHPV-Proofer检验(NorChip AS，Klokkarstua，Norway)来检测16、18、31、33，和45型致癌HPV的E6/E7 mRNA表达。通过Gp5+/6+一致性PCR检查HPV DNA的存在，然后对HPV DNA阳性的样品进行针对同样5种HPV类型的特异PCR。
结果：
通过Gp5+/6+PCR检测占总数32.6％(n＝92)的样品是HPV DNA阳性的，并且发现24.8％(n＝70)的是类型16、18、31、33和45。仅仅在15.2％(n＝43)的病例中观察到来自于同样五种HPV类型的E6/E7mRNA。
五种致癌HPV类型16、18、31、33和45占据了HPV DNA阳性样品中的76％(70/92)，同时在这些病例中有61％(43/70)检测到了E6/E7 mRNA表达。
在282例里的8例(2.8％)中获得了细胞学阳性的结果，其中8例里的5例观察到了ASCUS，并且8例里的3例观察到了HPV扁平湿疣。对ASCUS病例而言，在5例里的4例中通过Gp5+/6+一致性PCR和类型特异性PCR检测到了HPV DNA，然而只发现一例样品包含HPVmRNA。然而，对HPV扁平湿疣的病例而言，通过Gp5+/6+一致性PCR在所有样品(n＝3)中都检测到了HPV DNA，并且通过类型特异PCR检测到3例中的两例有HPV DNA，而通过PreTect HPV Proofer只在1例中检测到了HPV E6/E7 mRNA的表达。
讨论：
在30岁以下女性中HPV存在率高于年长的女性。和其它类型相比，5种致癌HPV类型16、18、31、33和45的流行率也是同样的规律。缺少E6/E7转录本可能反映出了病毒的游离体状态以及由此的、对转录过程的受控调节。这些感染更可能被清除。然而，病毒的整合可能会打断E2基因，并因此也扰乱了E2基因作为E6/E7转录调节子的功能。
结论：
在这一年轻的门诊病人群体中，在少于50％的一致性PCR阳性样品中检测到了伴随癌基因表达的HPV感染。因此，监测针对16、18、31、33和45型HPV的E6/E7基因表达可以成为除细胞学检测之外的有价值的诊断检验。mRNA检测可能对年轻女性的进展性疾病更具分辨能力。
实施例4-基于DNA的HPV检验方法和基于RNA的HPV检验方法的比较
本研究的目的是验证针对HPV检验的两种商业可得的分析方法，以调查在细胞学上呈阴性和阳性的女性中高危HPV感染的流行率，并且在与细胞学及组织学检验相对比的情况下对基于DNA和基于RNA检验的结果进行评估。
材料和方法
本研究的群体选自门诊部门和妇科医生的私人实践。在本研究中包括了628名女性，她们具有40岁的平均年龄(范围，19-85岁)。首先进行了传统Pap涂片检测，并且将剩余的材料转移到PreservCytTM管(Cytyc Corporation)中。通过使用杂交捕获II分析(DigeneCorporation)技术、经过Pre Tect HPV-Proofer分析(NorChip AS)对来自16、18、31、33和45型HPV的E6/E7 mRNA进行专门鉴别的技术以及实时NASBA技术来实施对高危HPV DNA(类型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68)的检测。
当HPV检验为阳性或者细胞学显示为HSIL的时候进行活体组织检测。组织学被认为是“黄金标准”。
结果：
在53％的病例中发现了细胞学和组织学的一致性。在61％的具有良性或低度细胞学症状的女性中检测出了高度组织学症状(CIN 2+)。Kappa值是0.31。在17％(109/628)的病例中两个检验具有不同结果(表4)。
表4：在两种HPV检验结果不同的病例中进行的与组织学相关的HPV检验
           组织学
  HPV测试  ＜CIN 2  ≥CIN 2   总数
  DNA+/RNA-  40  59   99
  RNA+/DNA-  1  9   10
  总数  41  68   109
两种HPV检验都显示出了和病变等级的显著相关(p＜0.001)。在良性和低度病变中DNA检验阳性比例更高。和RNA检验相比，DNA检验显示出更高的灵敏度但具有更低的特异性(表5)。
表5：用于检测在组织学确定的CIN 2+的HPV检验的性能表现
    敏感性(％)     特异性(％)
  DNA   RNA   DNA   RNA
  年龄
  ＜30年(n＝102)   98   82   20   70
  ≥30年(n＝281)   93   76   40   81
  细胞学
  正常的(n＝105)   89   62   79   87
  低级(n＝73)   96   72   22   72
  高级(n＝182)   96   83   67   50
结论
和DNA检验相比，RNA检验显示出了更高的预后性症状价值和特异性。
实施例5-HPV类型特异性的DNA和RNA持续
在使用线性阵列检验的HPV基因分型所确认的呈HPV阳性但并没有任何细胞学疾病的54名女性中，分析HPV感染的过程和持续。
通过在两年后重复HPV基因分型检测和细胞学评估来监测HPV感染对宫颈细胞异常(核异常)发展的影响。使用HPV-Proofer检验对已知HPV癌基因E6和E7的HPV转录检测是在两个时间点上都进行的。
材料和方法：
设计用来评估HPV持续性(基线)的正在进行中的研究的一部分涉及超过3000名的女性，从其中2000人中获得了基于液体的细胞学(LBC)样品。LBC涉及在包含细胞维持溶液的管中漂洗子宫颈样品，而不是像在实施传统帕帕尼古拉乌涂片检测时将其直接沉积在载玻片上那样。初级护理人员进行标本收集，通过ThinPreps程序制造平层载玻片，并且根据英国临床细胞学指南协会(British Society for ClinicalCytology guidelines)来实施细胞学分级。在基准日挑选出了54名女性的群体，这是基于具有细胞学正常结果但同时针对至少一种的下列高危HPV类型：16、18、31、33和45(考虑到在欧洲最普遍发现的高危类型以及在超过90％的癌症中涉及到的)呈现HPV DNA阳性来选择的。在实施细胞学评估和HPV的DNA及RNA检验的基准日两年之后，重新召回这些女性进行LBC涂片检测追查。
经过细胞学检验之后，LBC样品中的剩余细胞在3,500rpm条件下离心10分钟，并在提取核酸并进行HPV检测之前在-70℃条件下将其储藏为分开的细胞团粒。通过使用由QIAamp96 DNA SwabBioRobotTM试剂盒提供的试剂，使用BioRobot 9604(QIAGEN Ltd.，Crawley，UK)进行自动的DNA提取，而根据制造商的指示书，依照针对从动物细胞中进行分离的操作手册，应用RNeasy柱(QIAGEN Ltd.)进行RNA的提取。核酸在进行HPV检测前储藏在-70℃条件下。
使用线性阵列杂交分析(LA)进行HPV DNA基因分型检测，其中LA涉及由PGMY引物组产生的450个核苷酸长短的PCR复制子与包含固定探针的尼龙条带[Gravitt等人，2000；Coutlee等人，2002]的杂交。此条带包括两种水平的β-珠蛋白控制引物、18种高危HPV(HR-HPV)探针：16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、55、56、58、59、68、73、82、83，和9种低危HPV(LR-HPV)探针：6、11、40、42、53、54、57、66、84。PCR试剂、探针条带和进展试剂由洛希分子系统(Roche Molecular Systems)，Inc.(Alameda)提供。任何检验出β-珠蛋白阴性的样品将从分析中排除。经过等温NASBA扩增获得RNA扩增产品，并使用直接针对16、18、31、33、45型HPV的全长E6/E7 mRNA的分子信标探针实施类型特异性检测。所有用于NASBA扩增和HPV检测的试剂作为PreTects HPV-ProoferKit(NorChip，Klokkarstua，Norway)的一部分提供。通过使用NucliSensEasyQ Analyzer实时地进行mRNA聚集产物的荧光检测，并且使用PreTect分析软件(PAS，NorChip)分析荧光特征。
结果：
经过DNA分型检测的监测，两年后54名女性中的11例(20％)发展为核异常，54名女性中的31例和54名女性中的23例分别显示出了暂时的和持续的感染。和那些显示出暂时感染的女性相比，维持类型特异性持续HPV感染的女性更可能发展为核异常(P＜0.001)。HPVmRNA E6-E7转录本的存在对于后续过程中检测疾病而言具有较低的灵敏度而较高的特异性。另外，和在基准日仅检测到阳性DNA的女性相比，在基准日同时具有阳性mRNA转录本和DNA的女性非常可能获有持续的感染(P＜0.013)。这一研究突显了检测持续类型特异性HPV感染对于鉴别那些具有发展为宫颈异常的更高风险的女性的重要性。检测编码全长E6蛋白的E6/E7转录本具有鉴别哪些高危HPV感染可能会持续的潜能，即使此检测只在一个单一时间点上进行且没有重复检验。E6/E7 mRNA转录本的检测鉴别出了哪些感染更可能持续。
表6.利用DNA分型检测和HPV转录本检测进行追查时，从具有
和不具有核异常并发证据的个体中可检测到的持续HPV感染的比例
  追查时的细胞学评价   病例数   持续感染数(DNA)   持续感染数(RNA)   持续感染数(DNA或RNA)
  异常   11   10(90.1)   6(54.5)   10(90.1)
  正常   43   13(30.2)   5(11.6)   15(34.8)
表7.在对11例核异常的检测中DNA分型检测和RNA转录本检测的比较
  检测方法           敏感性           特异性
  DNA   10/11   90.9％   19/43   44.2％
  RNA   8/11   72.7％   35/43   81.4％
实施例6
下面的表格总结了在来自于非洲门诊群体的样品中使用PreTectHPV-Proofer检测全长E6/E7 mRNA转录本与使用一致性及类型特异性PCR检测HPV DNA的比较。组织学上分为(+)的样品是在组织学基础上被评估为CIN II+的。
                   组织学
  组织学   +   -   Tot
  +   10   3   13
- 16 312 328
  Tot   26   315   341
                   HPV-DNA
组织学   +   -   Tot
+ 13 0 13
  -   93   237   328
  Tot   106   237   341
                 HPV-DNA高风险
  组织学   +   -   Tot
  +   13   0   13
  -   69   259   328
  Tot   82   259   341
  HPVProofer
  敏感性   77％
  特异性   95％
  PPV   46％
  NPV   100％
  HPV-DNA
  敏感性   100％
  特异性   72％
  PPV   12％
  NPV   100％
  HPV-DNA高风险
  敏感性   100％
  特异性   79％
  PPV   16％
  NPV   100％
本研究的结果说明了检验方法针对显示出细胞异常并基于组织学被分类为CIN II+的样品的特异性，该鉴定方法基于对编码来自于16、18、31、33或45型HPV的全长E6蛋白的E6/E7转录本的检测。RNA鉴定具有和组织学相似的特异性，但具有更高的灵敏度。

Claims (12)

1.一种针对至少一种细胞或组织中人乳头瘤病毒的存在筛选人类受试者的体外方法，其中人乳头瘤病毒显示出了E6/E7 mRNA表达调控的缺失以及编码全长E6蛋白的稳定前mRNA的复制和/或表达的缺失，该方法包括：在包含来源于细胞或组织的mRNA的检验样品中检测编码全长E6蛋白的人乳头瘤病毒E6/E7基因的mRNA转录本的存在，其中在所述样品中存在所述E6/E7 mRNA转录本被认为是代表了对下述人乳头瘤病毒存在的指示，所述病毒在组织和细胞中具有E6/E7mRNA表达调控的缺失以及编码全长E6蛋白的稳定前mRNA的复制和/或表达缺失。
2.一种针对至少一种细胞或组织中以增大的细胞核和细胞非整倍性为特征的细胞变化的存在来筛选人类受试者的体外方法，该方法包括：在包含来源于细胞或组织的mRNA的检验样品中检测编码全长E6蛋白的人乳头瘤病毒E6/E7基因的mRNA转录本的存在，其中在所述样品中所述E6/E7 mRNA转录本的存在被认为是受试细胞或组织显示出细胞变化的指示。
3.一种针对至少一种细胞或组织中人乳头瘤病毒持续转化感染的存在来筛选人类受试者的体外方法，该方法包括：在包含来源于细胞或组织的mRNA的检验样品中针对编码全长E6蛋白的人乳头瘤病毒E6/E7基因的mRNA转录本的表达筛选受试者，其中对所述人乳头瘤病毒E6/E7基因mRNA转录本表达为阳性的受试者被认为在细胞或组织中具有人乳头瘤病毒的持续转化感染。
4.一种根据权利要求1至3任意一项的方法，其包含：使用能够检测至少一种癌症相关的HPV类型的E6/E7 mRNA的技术，来检测人乳头瘤病毒E6/E7基因mRNA转录本的存在。
5.一种根据权利要求4的方法，其包含使用能够检测来自于HPV类型16、18、31、33，以及优选45的E6/E7 mRNA的技术来检测人乳头瘤病毒E6/E7基因mRNA转录本的存在。
6.一种根据权利要求4的方法，其包含检测来自于HPV类型16、18、31、33或45中的任意一种或者两种或更多种的任意组合的E6/E7基因mRNA转录本的表达，其中在所述样品中存在来自于任意一种检验的HPV类型的人乳头瘤病毒E6/E7基因mRNA转录本被认为是阳性的结果。
7.一种根据权利要求1至6任意一项的方法，其中对E6/E7基因mRNA转录本的表达的检测是利用一个扩增反应以扩增该mRNA的一段区域、并结合对扩增反应产物的实时检测而实现的。
8.一种根据权利要求7的方法，其中对E6/E7基因mRNA转录本的表达的检测是利用实时NASBA而实现的。
9.一种根据权利要求8的方法，其中对mRNA转录本的表达的检测是利用Pre-Tect HPV ProoferTM分析试剂盒而实现的。
10.一种根据权利要求1至9任意一项的方法，其中人类受试者是预先鉴定为被人乳头瘤病毒DNA感染的受试者，优选地，在用于检验的细胞或组织中。
11.一种根据权利要求1至10任意一项的方法，其中人类受试者是具有预先诊断为ASCUS、CIN 1病变或扁平湿疣的受试者。
12.一种根据权利要求1至10任意一项的方法，其用于：对不具有细胞学上子宫颈异常的预先诊断的个体进行初级筛选。
CNA2005800132724A 2004-02-26 2005-02-28 人乳头瘤病毒的检测 Pending CN1946858A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0404315.4 2004-02-26
GBGB0404315.4A GB0404315D0 (en) 2004-02-26 2004-02-26 Improved detection of human papillomavirus

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1946858A true CN1946858A (zh) 2007-04-11

Family

ID=32050932

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2005800132724A Pending CN1946858A (zh) 2004-02-26 2005-02-28 人乳头瘤病毒的检测

Country Status (16)

Country Link
US (2) US20070292841A1 (zh)
EP (1) EP1718774B1 (zh)
JP (1) JP2007524421A (zh)
CN (1) CN1946858A (zh)
AT (1) ATE545715T1 (zh)
AU (2) AU2005216414A1 (zh)
CA (1) CA2557519A1 (zh)
DK (1) DK1718774T3 (zh)
EA (1) EA010500B1 (zh)
GB (1) GB0404315D0 (zh)
HK (1) HK1090956A1 (zh)
IL (1) IL177705A0 (zh)
MX (1) MXPA06009644A (zh)
NZ (1) NZ549456A (zh)
WO (1) WO2005083129A1 (zh)
ZA (1) ZA200607103B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105209572A (zh) * 2013-03-29 2015-12-30 堺化学工业株式会社 应力发光材料和其应用、应力发光材料用原料组合物、以及应力发光材料的制造方法
CN106048014A (zh) * 2016-06-07 2016-10-26 博奥生物集团有限公司 一种用于实时检测nasba产物的高特异探针
WO2018059581A1 (zh) * 2016-09-30 2018-04-05 广州易活生物科技有限公司 一种基于efirm技术的hpv病毒分型检测的探针、试剂盒及应用

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2913407T3 (en) * 2002-01-07 2018-01-15 Pretect As Method for detecting human papillomavirus mRNA
GB0404315D0 (en) * 2004-02-26 2004-03-31 Norchip As Improved detection of human papillomavirus
WO2008071998A2 (en) * 2006-12-15 2008-06-19 Oncomethylome Sciences Sa Diagnostic methods for diseases caused by a hpv infection comprising determining the methylation status of the hpv genome
US20110275698A1 (en) * 2010-05-10 2011-11-10 Norchip A/S "test and treat" strategy for treating transforming hpv infection
US20120214152A1 (en) * 2011-01-28 2012-08-23 Xiao-Jun Ma Rnascope® hpv assay for determining hpv status in head and neck cancers and cervical lesions
US20140357509A1 (en) * 2013-03-28 2014-12-04 Advanced Cell Diagnostics, Inc. Differentiation between transient and persistent high-risk hpv infection by in situ hybridization
WO2014201138A1 (en) * 2013-06-11 2014-12-18 Stelling James R Method for detection of fetal abnormalities
GB201310933D0 (en) 2013-06-19 2013-07-31 Norchip As A method of cervical screening

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5639871A (en) * 1988-09-09 1997-06-17 Roche Molecular Systems, Inc. Detection of human papillomavirus by the polymerase chain reaction
DE3838269A1 (de) * 1988-11-11 1990-05-17 Behringwerke Ag Nachweis humaner papillomavirus dna und ihrer expression in zervix-abstrichen
US5580970A (en) * 1989-12-01 1996-12-03 Amoco Corporation Detection of HPV transcripts
US5506105A (en) * 1991-12-10 1996-04-09 Dade International Inc. In situ assay of amplified intracellular mRNA targets
US6174668B1 (en) * 1993-05-14 2001-01-16 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Diagnostic compositions, elements, methods and test kits for amplification and detection of two or more target DNA's using primers having matched melting temperatures
DE19506561C1 (de) * 1995-02-24 1996-10-10 Deutsches Krebsforsch Verfahren zur Früherkennung von HPV-assoziierten Karzinomen bzw. von hochgradigen, durch HPV-verursachten Dysplasien
US7439016B1 (en) * 2000-06-15 2008-10-21 Digene Corporation Detection of nucleic acids by type-specific hybrid capture method
DK2913407T3 (en) * 2002-01-07 2018-01-15 Pretect As Method for detecting human papillomavirus mRNA
GB0404315D0 (en) * 2004-02-26 2004-03-31 Norchip As Improved detection of human papillomavirus

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105209572A (zh) * 2013-03-29 2015-12-30 堺化学工业株式会社 应力发光材料和其应用、应力发光材料用原料组合物、以及应力发光材料的制造方法
CN105209572B (zh) * 2013-03-29 2018-06-19 堺化学工业株式会社 应力发光材料和其应用、应力发光材料用原料组合物、以及应力发光材料的制造方法
CN106048014A (zh) * 2016-06-07 2016-10-26 博奥生物集团有限公司 一种用于实时检测nasba产物的高特异探针
CN106048014B (zh) * 2016-06-07 2019-12-10 博奥生物集团有限公司 一种用于实时检测nasba产物的高特异探针
WO2018059581A1 (zh) * 2016-09-30 2018-04-05 广州易活生物科技有限公司 一种基于efirm技术的hpv病毒分型检测的探针、试剂盒及应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2005083129A1 (en) 2005-09-09
AU2010200955B2 (en) 2012-05-17
CA2557519A1 (en) 2005-09-09
US20070292841A1 (en) 2007-12-20
AU2010200955A1 (en) 2010-04-01
US20100330550A1 (en) 2010-12-30
JP2007524421A (ja) 2007-08-30
AU2005216414A1 (en) 2005-09-09
GB0404315D0 (en) 2004-03-31
MXPA06009644A (es) 2007-03-21
ATE545715T1 (de) 2012-03-15
DK1718774T3 (da) 2012-05-14
HK1090956A1 (en) 2007-01-05
EA010500B1 (ru) 2008-10-30
EP1718774B1 (en) 2012-02-15
ZA200607103B (en) 2008-07-30
IL177705A0 (en) 2006-12-31
WO2005083129A8 (en) 2006-10-26
EP1718774A1 (en) 2006-11-08
NZ549456A (en) 2009-02-28
EA200601559A1 (ru) 2007-02-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1946858A (zh) 人乳头瘤病毒的检测
Cuzick et al. Type-specific human papillomavirus DNA in abnormal smears as a predictor of high-grade cervical intraepithelial neoplasia
JP5204132B2 (ja) ヒトパピローマウイルスｍＲＮＡを検出するための方法
Tilston Anal human papillomavirus and anal cancer.
US20090029346A1 (en) Detection of human papilloma virus
CN105755169B (zh) 一种高危型人乳头瘤病毒的检测和分型试剂盒及其应用
Doorn et al. Molecular detection and genotyping of human papillomavirus
CN105803110B (zh) 同时对多种人乳头瘤病毒进行分型及检测的试剂盒及其应用
Bian et al. Evaluation of the detection of 14 high-risk human papillomaviruses with HPV 16 and HPV 18 genotyping for cervical cancer screening
CN112575123B (zh) 引物组合、探针组合以及人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒
Rakoczy et al. Time trends in the prevalence of human papillomavirus infections in archival Papanicolaou smears: analysis by cytology, DNA hybridization, and polymerase chain reaction
Carestiato et al. Prevalence of human papillomavirus infection in the genital tract determined by hybrid capture assay
Lee et al. Comparison of human papillomavirus detection and typing by hybrid capture 2, linear array, DNA chip, and cycle sequencing in cervical swab samples
KR101401940B1 (ko) 고위험군 인유두종바이러스 유전자 분석용 키트 및 그 분석방법
Chranioti et al. Performance evaluation of manual and automated (MagNA pure) nucleic acid isolation in HPV detection and genotyping using Roche Linear Array HPV Test
CN111593140B (zh) 一种高危型人乳头瘤病毒的检测和分型试剂盒
CN114891922A (zh) 用于23种人乳头瘤病毒基因分型检测的引物探针组合物、试剂盒及检测方法
Lorincz et al. Developing and standardizing human papillomavirus tests
Backe et al. Prevalence of human papillomavirus DNA in cervical tissue. Retrospective analysis of 855 cervical biopsies
Basiletti et al. Human papillomavirus genotyping using next generation sequencing (NGS) in cervical lesions: Genotypes by histologic grade and their relative proportion in multiple infections
JP3600616B2 (ja) ヒトパピローマウイルスを検出するためのプライマーセット、検出方法および検出用ｄｎａアレイ
Bartholoma et al. Evaluation of two commercially available nucleic acid hybridization assays for the detection and typing of human papillomavirus in clinical specimens
US20070238100A1 (en) Integrated methodologies for the detection and genotyping of human papillomaviruses
US20110300178A1 (en) Hpv types and variants associated with cervical cancer and the uses thereof
CN118360437A (zh) 一种用于hpv相关肿瘤的早筛和监测试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Open date: 20070411