CN106119424B - 同步检测人类疱疹病毒6、7、8型的引物、探针及试剂盒 - Google Patents

同步检测人类疱疹病毒6、7、8型的引物、探针及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种同步检测人类疱疹病毒6、7、8型的引物、探针及试剂盒。本发明通过选定新的靶基因，并重新设计了引物和探针，优化反应体系，大幅度降低了人类疱疹病毒临床同步检测的假阳性率，灵敏度高，特异性好且检测用时更短，使该技术能够实现临床上的应用与推广。

Description

同步检测人类疱疹病毒6、7、8型的引物、探针及试剂盒
技术领域
本发明涉及疱疹病毒检测技术领域，具体地指一种同步检测人类疱疹病毒6、7、8型的引物、探针及试剂盒。
背景技术
现有研究证实人类疱疹病毒(human herpesvirus，HHV)-6，-7，-8，能通过输血传播，并在初次感染人体后入侵人类的外周血单个有核细胞的CD4+T细胞，随后进入潜伏状态，引起持续性感染，在免疫功能低下和神经系统疾病的个体中活化而致病。
针对疱疹病毒6、7、8型，现有技术中提供了一种多重荧光定量PCR方法，选定U67、U36、ORF65分别作为HHV-6、HHV-7、HHV-8的靶基因，该方法可以对上述三种病毒进行一次性检出，灵敏度较高，但是其存在的缺陷是在使用中假阳性率高，特别是针对HHV-6、HHV-7型的疱疹病毒案例会有超过10％的假阳性，影响了该技术临床应用中的推广。
发明内容
本发明的目的在于克服现有疱疹病毒检测方法假阳性率较高的缺陷，提供一种高灵敏度且高特异性的同步检测人类疱疹病毒6、7、8型的引物、探针及试剂盒。
为实现上述目的，本发明所设计的用于同步检测人类疱疹病毒6、7、8型的引物及荧光探针组如下：
(1)正向引物HHV6-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
反向引物HHV6-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
荧光探针HHV6-P，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
(2)正向引物HHV7-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
反向引物HHV7-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
荧光探针HHV7-P，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
(3)正向引物HHV8-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
反向引物HHV8-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
荧光探针HHV8-P，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
本发明还提供了一种用于同步检测人类疱疹病毒6、7、8型的荧光定量PCR试剂盒，由如下组分组成：
DNA提取液、荧光定量PCR反应液、HHV6标准阳性模板、HHV7标准阳性模板、HHV8标准阳性模板和阴性质控标准品；
所述荧光定量PCR反应液包含以下组分：
(1)正向引物HHV6-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
反向引物HHV6-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
荧光探针HHV6-P，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
(2)正向引物HHV7-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
反向引物HHV7-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
荧光探针HHV7-P，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
(3)正向引物HHV8-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
反向引物HHV8-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
荧光探针HHV8-P，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
(4)PCR 10×buffer、MgCl2、dNTPs含dUTP、DNA聚合酶、UNG酶、无菌双蒸水。
在上述方案中，所述试剂盒的荧光定量PCR扩增条件为50℃2min，95℃5min，95℃15s、62℃30s、40个循环，62℃开始收集荧光信号。
本发明的发明人通过大量的试验，在尝试过多种靶基因的组合之后，确定以U69、U63、ORF73分别作为HHV-6、HHV-7、HHV-8的靶基因；
HHV-6的U69产物长度154bp序列如下：
GTGTCATTTCGGCTTTCATAGCTGGTGTCATCCGTGCAAAATCAGGAGCCGACTTATTATCTCACGAGTGTGTTATTAATAACCTATTGATTTCAAATTCCGTTTGTATGAGTCATAAAGTGTCTTTGTCACGTACTTATGATATTGATCTCCA
HHV-7的U63产物长度74bp序列如下：
AGCCTATTCACATACCTGTATGGAACCTACTGAAGAGCCAAATATGGAGACCGTTAATGTAGTTGTAGTGCTGT
HHV-8的ORF73产物长度173bp序列如下：
CTGACTTTCCTTGCTAATCTCGTTGTCCCCATTATCCTCGCCAGCCTGATTATTTTCGGAACATTCTTTTTCATTCTTGGATGCTTCTTCTGCAATCTCCGCAAGGAGCACCAACATGGCTGTGTCATCACCCCAGGATCCCTCAGACGGGGATGATGATCCTATGGAGATGG
以上述三种靶基因为目标设计出的引物，结合优化的扩增体系及扩增条件，在多重PCR扩增过程中，交互影响较小，能够获得较好的特异性，灵敏度高。
本发明的有益效果：通过选定新的靶基因，并重新设计了引物和探针，优化反应体系，大幅度降低了人类疱疹病毒临床同步检测的假阳性率，灵敏度高，特异性好且检测用时更短，使该技术能够实现临床上的应用与推广。
附图说明
图1为多重荧光定量PCR检测HHV-6、HHV-7、HHV-8的标准曲线。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种用于同步检测人类疱疹病毒6、7、8型的引物及荧光探针组，改组含有三对引物及三条探针，序列如下：
(1)正向引物HHV6-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
反向引物HHV6-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
荧光探针HHV6-P，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，荧光探针5′端标记FAM，3′端淬灭基团BHQ；
(2)正向引物HHV7-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
反向引物HHV7-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
荧光探针HHV7-P，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，荧光探针5′端标记JOE，3′端淬灭基团BHQ；
(3)正向引物HHV8-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
反向引物HHV8-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
荧光探针HHV8-P，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，荧光探针5′端标记Cy5，3′端淬灭基团BHQ。
上述引物及探针均委托上海生工生物人工合成。
实施例2
本实施例提供了一种用于同步检测人类疱疹病毒6、7、8型的荧光定量PCR试剂盒
一、试剂盒组成与配制
1)引物及荧光探针组
同实施例1
2)DNA提取液
DNA提取液可以采用市售DNA提取试剂盒，也可以自行配制。
本实施例中DNA提取液配方：配制200mmol/L NaCl，100mmol/L Tris-HCl，1％SDS，50mmol/L EDTA，调pH到8.5，3mg/ml蛋白酶K(临用前加入)。
3)多重荧光定量PCR的反应体系如下：
Figure BDA0001119120220000041
Figure BDA0001119120220000051
4)阴性质控标准品：含有HSV1、HSV2的无菌双蒸水。
5)阳性定量标准品：
HHV-6(A型U1102株、B型Z29株)，浓度为1×109Copies/L；
HHV-7(RK株)，浓度为1×109Copies/L；
HHV-8(GK株)，浓度为1×109Copies/L。
使用上述试剂盒时，多重荧光定量PCR的反应程序为：50℃2min，95℃5min，95℃15s、62℃30s、40个循环，62℃开始收集荧光信号。
试验例1
将实施例2中的荧光定量PCR试剂盒，针对70例疑似HHV患者的全血样本DNA多重荧光定量PCR。
(1)多重荧光定量PCR标准曲线构建
将HHV-6、HHV-7、HHV-8的阳性定量标准品稀释为5.0×108Copies/ml、5.0×107Copies/ml、5.0×106Copies/ml、5.0×105Copies/ml、5.0×104Copies/ml、5.0×103Copies/ml、5.0×102Copies/ml。
将上述稀释品利用多重荧光定量PCR的反应体系扩增，扩增条件为50℃2min，95℃5min，95℃15s、62℃30s、40个循环，62℃开始收集荧光信号。
然后根据质粒模板拷贝数及Ct值构建标准曲线。
(2)针对每个疑似HHV患者样本进行多重荧光定量PCR扩增。
分别对每个疑似HHV患者全血样本进行DNA提取，然后对每个DNA样本重复三次多重荧光定量PCR扩增，扩增条件同上，每次试验均需构建标准曲线并同时扩增阴性对照(HSV1、HSV2)。
试验例2
同样将实施例2中的荧光定量PCR试剂盒，针对70例疑似HHV患者的全血样本DNA多重荧光定量PCR，试验过程与试验例1相同，不同点仅在于多重荧光定量PCR的扩增条件为50℃2min，95℃5min，95℃15s、58℃40s、40个循环，58℃结束开始收集荧光信号。
结果
1、多重荧光定量PCR的灵敏度、线性范围和特异性
图1显示多重荧光定量PCR检测HHV-6、HHV-7、HHV-8的标准曲线，其动力学范围包括7个数量级(5.0×102～5.0×108Copies/ml)，相关系数分别为0.9911，0.9932和0.9923，平均斜率为-3.4(HHV-6为-3.43，HHV-7为-3.39，HHV-8为-3.37)符合标准曲线的要求。HHV-6、HHV-7、HHV-8有近似的敏感性，灵敏度达到5.0×102Copies/ml。每次实验中HHV-6、HHV-7、HHV-8的标准株均有扩增曲线，HSV1、HSV2均无扩增曲线，表明方法有很好的特异性。
1、试验例1的多重荧光定量PCR的临床评价
以DNA测序方法作为金标准，与试验例1多重荧光定量PCR进行70例患者血样结果进行比较，结果检测出的HHV-6，HHV-7，HHV-8的阳性率分别为41.4％、72.8％和2.8％，经过与测序结果比对，多重荧光定量PCR检测HHV-6，HHV-7，HHV-8的灵敏度均达到100％，特异性分别为96.3％、98.5％和100％，见表1，表明方法的灵敏度和特异性均符合临床应用的要求。
表1.临床样本中多重PCR与测序结果的比较
Figure BDA0001119120220000071
2、试验例2的多重荧光定量PCR的临床评价
以DNA测序方法作为金标准，与试验例2多重荧光定量PCR进行70例患者血样结果进行比较，见表2。
表2.临床样本中多重PCR与测序结果的比较
Figure BDA0001119120220000072
对比表1和表2，反应体系及扩增程序的选择对结果有显著影响，试验例1通过对上述条件的优化可以达到较佳效果。
Figure IDA0001119120280000011
Figure IDA0001119120280000021

Claims (3)

1.一种用于同步检测人类疱疹病毒6、7、8型的引物及荧光探针组，其特征在于：
包括如下引物及荧光探针：
(1)正向引物HHV6-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
反向引物HHV6-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
荧光探针HHV6-P，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
(2)正向引物HHV7-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
反向引物HHV7-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
荧光探针HHV7-P，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
(3)正向引物HHV8-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
反向引物HHV8-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
荧光探针HHV8-P，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
2.一种用于同步检测人类疱疹病毒6、7、8型的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：
所述试剂盒由如下组分组成：
DNA提取液、荧光定量PCR反应液、HHV6标准阳性模板、HHV7标准阳性模板、HHV8标准阳性模板和阴性质控标准品；
所述荧光定量PCR反应液包含以下组分：
(1)正向引物HHV6-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
反向引物HHV6-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
荧光探针HHV6-P，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
(2)正向引物HHV7-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
反向引物HHV7-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
荧光探针HHV7-P，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
(3)正向引物HHV8-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
反向引物HHV8-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
荧光探针HHV8-P，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
(4)PCR 10×buffer、MgCl2、dNTPs含dUTP、DNA聚合酶、UNG酶、无菌双蒸水。
3.根据权利要求2所述的用于同步检测人类疱疹病毒6、7、8型的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的荧光定量PCR扩增条件为50℃2min，95℃5min，95℃15s、62℃30s、40个循环，62℃开始收集荧光信号。
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