CN101421421A

CN101421421A - 检测疱疹病毒的方法和微阵列

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Publication number: CN101421421A
Application number: CNA2007800122187A
Authority: CN
Inventors: 安妮·J·加斯克兰尼; 荷利·皮帕里尼; 麦加·拉帕兰尼; 安蒂·瓦赫利
Original assignee: Licentia Oy
Current assignee: Licentia Oy
Priority date: 2006-03-31
Filing date: 2007-04-02
Publication date: 2009-04-29
Also published as: DK2007910T3; EP2007910A2; WO2007113388A2; AU2007233621A1; ES2608952T3; JP2009531048A; CA2647785A1; WO2007113388A3; HUE031322T2; PL2007910T3; EP2007910B1; PT2007910T; WO2007113388A8

Abstract

本发明涉及了检测疱疹病毒的方法和微阵列。本发明提供了检测疱疹病毒、特别是选自HSV－1、HSV－2、CMV、EBV、VZV、HHV－6A、HHV－6B和HHV－7的疱疹病毒的新的引物和寡核苷酸。通过使用本发明的方法，可以同时检测同样的生物学样品中几种不同的疱疹病毒。

Description

检测疱疹病毒的方法和微阵列

本发明涉及检测疱疹病毒的方法和微阵列。

疱疹病毒引起了许多临床重要的人类疾病。特别是在免疫受损的患者中，中枢神经系统(CNS)的疾病和并发症可以是1型或2型单纯疱疹病毒(HSV-1、HSV-2)、巨细胞病毒(CMV)、Epstein-Barr病毒(EBV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)或人类疱疹病毒6(HHV-6)感染或再活化的结果(Aurelius等，1991；Koskiniemi等，2002；Piiparinen等，2002；Aalto等，2003)。除了HHV-6之外，已经报道人类疱疹病毒7(HHV-7)是幼儿急疹的病原体，并已经记录在移植接受者中导致了严重的并发症(Tanaka等，1994；Suga等，1997)。病毒分离、核酸检测和各种不同的血清学方法目前被用于检测疱疹病毒感染(Chiu等，1998；Pitkaranta等，2000；Espy等，2000；Read等，2001；Ihira等，2002)。已经开发了多重PCR分析以满足快速检测疱疹病毒的需要(Read和Kurtz，1999；Aberle和Puchhammer-Stockl，2002；Druce等，2002；Hudnall等，2004)。同时扩增不同的疱疹病毒的单管PCR分析被公开在Yamamoto和Nakamura(2000)中，通过实时PCR区分和定量人类疱疹病毒被公开在Safronetz等，(2003)中。US 2004/0110195公开了人类疱疹病毒检测和分型的方法，包括使用多重PCR分析和保守引物扩增疱疹病毒DNA的保守区。US 20040053264公开了使用DNA芯片同时检测病原生物体包括疱疹病毒的方法。US 20030228599公开了筛选疱疹病毒的多重分析技术。US 20030143571和Foldes-Papp等(2004)公开了使用微阵列同时检测多种疱疹病毒的方法。Striebel等(2004)公开了关于使用树状聚体(dendrimers)以DNA微阵列诊断人类疱疹病毒的研究。在Boriskin等(2004)的文章中，微阵列被用于CNS感染，使用长探针检测13种不同的病原体，包括几种疱疹病毒。

尽管在现有技术中已经公开了几种检测不同疱疹病毒的方法，但对于能够改进检测疱疹病毒的效能和速度的新方法仍然有需求。另外，仅仅有很少的方法有可能从同样的生物样品中同时检测几种疱疹病毒。特别是，仅仅有一些文献报道了可以区分HHV-6A和HHV-6B病毒的方法。

用于扩增一些疱疹病毒的引物可以从US 6,897,057、JP 6253900和Vesanen等(1996)、Yamamoto和Nakamura(2000)、Akhtar等(1996)、Van den Veyver等(1998)、WO 9325707、US 20040110195和Saffronetz等(2003)中了解到。用于扩增特定核酸的T3RNA聚合酶的启动子序列可以从JP2001095590、EP 510085和US 2004/0125774中了解到。

发明简述

本发明的目的是提供检测疱疹病毒的新的和改进的方法。

具体来说，本发明的目的是提供有效的、快速的方法，用于从同样的生物样品和/或不同的生物样品中检测一种或多种疱疹病毒。更具体来说，本发明的目的是提供一种方法，其使得有效、快速地同时检测几种疱疹病毒成为可能。

本发明的另一个目的是提供有效快速地检测疱疹病毒的微阵列。

这些以及其它目的、及其超过已知的方法和微阵列的优势，通过本发明得到了实现，正如在后文中描述和所要求的权利的那样。

本发明的方法基于微阵列技术。按照该方法可以从同样的和/或不同的生物样品中同时检测几种不同的疱疹病毒。通过该方法也可以同时研究几个样品。在同样的反应中确定病毒的基因型也是可能的。

根据本发明的实施方案，本发明的方法包括下面的步骤：

-从生物样品提取DNA；

-扩增提取到的DNA；

-将扩增的DNA翻译成ssRNA；

-将ssRNAs与微阵列板上的寡核苷酸序列杂交，所述寡核苷酸序列对应于每种待测的疱疹病毒；

-通过引物延伸方法在可检测的核苷酸存在下延伸被杂交的ssRNA，和

-通过适当的方法检测来自可检测的核苷酸的信号。

更具体来说，本方法的特征被陈述在权利要求1、22和45中。

根据本发明的另一个实施方案，检测疱疹病毒的微阵列包含：

-包含至少一个阵列的固相支持物；以及

-所述阵列包含特异性针对至少一种疱疹病毒的寡核苷酸。

更具体来说，微阵列的特征陈述于权利要求13和34中，制备检测疱疹病毒的微阵列的方法的特征陈述于权利要求19和41中。

微阵列试剂盒的特征陈述于权利要求20和43中，寡核苷酸的特征陈述于权利要求21和44中。

诊断PCR通常在一个时间只对一种疱疹病毒进行，这增加了几种疱疹病毒的检测时间。使用PCR时可能会漏掉双重和三重感染，但是通过微阵列，在一天之内可以检测多种感染。同时检测几种疱疹病毒有极大的优势。根据本发明的一个优选实施方案，在适当的条件下，本发明的微阵列的特异性被发现高达100％。基于微阵列的检测为诊断和研究目的提供了快速方便地检测几种疱疹病毒的方案。该方法特别适用于疱疹病毒的定性检测。

附图说明

图1、通过基于微阵列的方法，用成像鉴定8种疱疹病毒。所有的疱疹病毒特异性寡核苷酸在每个阵列上点上2x三份平行样，非特异性的寡核苷酸每个阵列上点上两份。每个阵列含有60个点(5x12矩阵)。没有观察到来自非特异性寡核苷酸的信号。这些HSV-1、HSV-2、CMV、EBV、HHV-7和VZV的图像来自病毒DNA对照的平均水平(范围面积1000-5000拷贝或VP)。在HHV-6A和-6B图像中，在低水平的病毒DNA下没有观察到交叉反应(图像中的水平分别为290拷贝和220VP)。

发明具体说明

“疱疹病毒”属于疱疹病毒(Herpesviridae)科。它们由在二十面体衣壳内的双链DNA核心和磷脂双层构成。

在超过100种已知的疱疹病毒中，有8种感染人类。人类疱疹病毒根据病毒复制周期的长度和宿主组织范围分成3个亚科——α-、β-和γ-疱疹病毒。单纯疱疹病毒1(HSV-1)、单纯性疱疹病毒2(HSV-2)和水痘带状疱疹病毒(VZV)属于α亚科，巨细胞病毒(CMV)、疱疹病毒6(HHV-6)和疱疹病毒7(HHV-7)属于β亚科，Epstein-Barr病毒(EBV)和疱疹病毒8(HHV-8)属于γ亚科的疱疹病毒。人类感染非常常见，患者可以被一种或多种疱疹病毒、例如HSV-1和HSV-2同时感染。

通过本发明的方法，在生物样品中检测多种疱疹病毒的一种或多种是可能的。优选病毒选自HSV-1、HSV-2、巨细胞病毒(CMV)、Epstein-Barr病毒(EBV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、人类疱疹病毒6(HHV-6A和HHV-6B)和人类疱疹病毒7(HHV-7)。特别是，通过本发明的方法可以区分HHV-6A和HHV-6B。

更具体来说，通过本感染(present infection)的方法，从同样的样品中同时检测至少两种、优选至少三种、更优选至少四种不同的疱疹病毒是可能的。

按照本发明的一个优选实施方案，通过本发明的方法同时检测了被分类为同一个亚科—α-、β-或γ—的疱疹病毒。

按照本发明的另一个优选实施方案，通过本发明的方法同时检测了通常在患者中引起双重或三重感染的疱疹病毒。

此外，通常与疱疹病毒同时引起感染的其它病原体也可以被同时检测。

“生物样品”本文中是指任何生物学来源的样品。特别是样品是来自对象的临床样品，优选来自人类对象。样品可以包括全血、血浆、脑脊液(CSF)样品、活检、尿液、粪便、痰液、粘液、骨髓、皮肤、毛发、指甲、损伤或溃疡的拭子、宫颈/阴道拭子、鼻咽拭子、支气管肺泡拭子、气管内吸出物或任何其它临床样品。优选临床样品是血浆、全血和脑脊液(CSF)样品。

本发明的方法包括从待研究的生物样品中提取的DNA。DNA可以通过使用众所周知的DNA提取方法从生物样品中提取。在提取中可以使用例如可商购的试剂盒，如MagNA Pure LC仪器和总核酸试剂盒(Total Nucleic Acid Kit)(Roche Diagnostics，Basel，瑞士)、高纯度病毒核酸试剂盒(High Pure Viral Nucleic Acid Kit)(RocheDiagnostics)，或氯仿-苯酚抽提。

然后可以使用适合的方法将提取的DNA进行扩增。优选扩增的方法是PCR(聚合酶链反应)方法。PCR是指不需要克隆或纯化在DNA混合物中增加靶序列的片段的浓度的方法。该扩增靶序列的方法由以下构成：在含有靶序列的DNA混合物中引入大大过量的两种寡核苷酸引物，然后在DNA聚合酶存在下进行次序精确的热循环。两种引物与双链靶序列中它们对应的链互补。在这种情况下，靶序列是待测的疱疹病毒序列。它也可以是待测的另一种病原体的序列。因为靶序列的所需扩增片段在混合物中变成了优势序列(根据浓度)，它们被称为被“PCR扩增”。

PCR的引物可以按照本技术领域众所周知的方法以及描述在例如Sambrook，J.Fritsch，E.F.，和Maniatis，T.(1989)的《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)中的方法来制备。引物对一般由对应于待测疱疹病毒特定区域的正向引物(正义)和反向引物(反义)组成。引物对可以使用帮助引物设计的商购软件来设计，例如Primer3软件(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi；Rozen and Skaletsky，2000)和DNA mfold软件(http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/old/dna/；Zuker，2003)。

样品DNA的扩增可以在一个或几个PCR扩增反应中进行。如果在PCR中使用了一对以上的引物，该方法被称为多重PCR。在一个或多个多重PCR中扩增DNA是可能的。例如本文公开了在一个多重PCR中扩增两种或多种疱疹病毒引物对，以及在另一个多重PCR中扩增两种或多种其它的疱疹病毒引物对。如果在一个以上的PCR反应中已经扩增了来自一个样品的DNA，则在进行其他步骤之前可以将来自不同反应的PCR产物进行合并。

这里公开了被设计用于每种待测疱疹病毒的引物对。引物对包含引物A和引物B，其中在有利的是

A是SEQ ID NO：1，和B是SEQ ID NO：3；

A是SEQ ID NO：6，和B是SEQ ID NO：7；

A是SEQ ID NO：9，和B是SEQ ID NO：10；

A是SEQ ID NO：12，和B是SEQ ID NO：13；

A是SEQ ID NO：15，和B是SEQ ID NO：16；或

A是SEQ ID NO：19，和B是SEQ ID NO：20。

按照本发明的优选实施方案，可以用SEQ ID NO：22代替SEQ IDNO：1，可以用SEQ ID NO：23代替SEQ ID NO：22。除了原始序列之外，这些序列也可以使用。

引物A优选为正向引物，引物B优选为反向引物。

应该理解的是，等价的引物序列包括与上述的引物对序列A或B具有至少90％同一性、优选至少95％、更优选至少97％同一性的序列。更优选该序列与所述序列具有至少99％的同一性、最优选100％的同一性。具体来说，在引物的5′末端可以有差别。

“序列基本相同的引物序列”是指引物序列与引物序列SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQID NO：16、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22或SEQ IDNO：23相比，在核苷酸序列中缺失了一个核苷酸、添加了一个核苷酸或改变了一个核苷酸。如果在引物中存在核酸变异，例如T/C，也可能是有利的(两种引物在同样的混合物中交替可用)。

本文中使用的引物是指具有10到50个核苷酸、优选20到40个、更优选20到30个核苷酸的连续序列的引物。用于进行PCR反应的引物包含了具有足够长度和适当序列的核苷酸序列，以便在核酸分子上提供聚合的起点。

具体来说。引物对SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3被设计用于扩增HSV-1和HSV-2，引物对SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7被设计用于扩增VZV，引物对SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10被设计用于扩增CMV，引物对SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13被设计用于扩增EBV，引物对SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16被设计用于扩增HHV-6，引物对SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20被设计用于扩增HHV-7。根据本发明的可选的、优选的实施方案，引物对SEQ ID NO：22和SEQ IDNO：23被设计用于扩增HSV-1和HSV-2。

PCR扩增反应在适合反应混合物中DNA聚合酶的功能的条件下进行。反应混合物包括DNA聚合酶、所有四种核苷三磷酸(NTP)、适合的缓冲剂和任选的盐或其它试剂。扩增可以由例如下列组成：在大约95℃变性10分钟，然后进行40个循环的93-97℃优选96℃ 10秒、50-60℃优选55℃ 20秒和大约69-74℃优选72℃ 20秒，最后在69-74℃、优选72℃延伸5分钟。

或者，扩增也可以由例如下列组成：在大约95℃变性10分钟，然后进行30个循环的93-97℃优选96℃ 10秒、40-70℃优选65℃ 20秒(每个循环降低0.5℃)和大约69-74℃优选72℃ 20秒，进行10个循环的93-97℃优选96℃ 10秒，55-65℃优选60℃ 20秒，最后在69-74℃、优选72℃延伸5分钟。

被扩增的DNA(扩增子)的长度优选在150到250bp之间，更优选在170到230bp之间。

一旦样品DNA被扩增，优选将产物转变为单链核酸，优选转录成单链RNA。为了便于程序的该步骤，引物对中的引物之一可以包括在反应中使用的聚合酶的聚合酶启动子。根据本公开，T3 RNA聚合酶的启动子包括在反向引物中。如果聚合酶的启动子包括在引物中，引物的长度可能加倍。根据本公开，T3RNA聚合酶启动子的引物优选包含SEQ ID NO：2。转录反应可以使用可商购的试剂盒来进行，例如AmpliScribe^TM T3高产率转录试剂盒(Epicentre，Madison，WI)或者可选AmpliScribe^TM T3-Flash^TM转录试剂盒(Epicentre，Madison，WI)。

单链RNA在适当的条件下与微阵列板上的寡核苷酸序列杂交，所述寡核苷酸序列对应于每种待测疱疹病毒。

本文中使用的“微阵列”是指含有在基体例如玻璃载玻片、硅、塑料、聚合物基质或任何其它适合的固相支持物上合成的不同的寡核苷酸的阵列。微阵列可以按照本技术领域的专业人员所熟知的方法制备和使用。固相支持物可以是例如显微镜的玻璃载玻片或硅烷包被的玻璃。玻璃载玻片优选用异硫氰酸酯包被，以便胺化的DNA-寡核苷酸可以共价结合在玻璃上(Lindroos等，2001)。

用于疱疹病毒的寡核苷酸可以使用适合的软件来设计，例如Primer3软件(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3www.cgi；Rozen和Skaletsky，2000)和DNAmfold软件(http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/old/dna/；Zuker)。寡核苷酸通过适当的方法连接到固相支持物上。寡核苷酸可以被例如修饰以在其5′末端含有氨基，氨基可以与固相支持物上的硅烷-异硫氰酸酯层共价结合。寡核苷酸可以借助于其5′末端通过形成共价键与3′-氨基-丙基三甲氧基硅烷+1，4-亚苯基二-异硫氰酸酯包被的玻璃表面结合。寡核苷酸优选在它们5′末端特定寡核苷酸序列之前还含有聚(T)引物(T间隔区)。T间隔区的长度可以为6到12个、优选8-10个、典型为9个核苷酸。也可以使用具有适合的化学表面的可商购的微阵列玻璃载玻片，例如Asper Biotech的SAL-1微阵列载玻片。

本文中使用的寡核苷酸是指具有长度为大约10到50个核苷酸、优选大约15-30个、通常短于30个核苷酸的连续序列的寡核苷酸。更优选寡核苷酸长度为大约15-25个核苷酸，最优选16到23个。通常它们长度可以为大约20个核苷酸。

结合到微阵列上的寡核苷酸包括具有足够长度和适当序列的核苷酸序列，以便提供样品中被测试的疱疹病毒的ssRNA杂交。

寡核苷酸可以通过适当的方法点在固相支持物上，例如通过可商购的微阵列仪例如

，GeneMachines，Huntingdon，UK。阵列可以由包含用于待测疱疹病毒的寡核苷酸的基质组成。阵列也可以由具有对病毒非特异性的序列的寡核苷酸作为对照组成。此外，阵列还可以由具有对疱疹病毒之外的其它病原体特异的序列的寡核苷酸组成。固相支持物可以含有1到80个、优选10到60个阵列。这意味着在同样的固相支持物上可以同时研究多达80个样品。

阵列上斑点的数量是4到200个、优选为10到100个、更优选为20到50个、典型为30到40个。斑点可以由双份或三份寡核苷酸组成。它们可以由例如10到25种、典型15到20种寡核苷酸双份组成。

每个斑点的寡核苷酸量可以是0.5到1.5pmol，典型为大约1pmol。

在每个阵列上大约有200个斑点，每个固相支持物例如载玻片上的斑点数量可以是大约16,000个。

ssRNA与寡核苷酸杂交，并在适当的条件下进行引物延伸反应。杂交温度可以是40到45℃，优选大约42℃。杂交时间可以是大约15到30分钟。杂交可以在不同的盐浓度下进行，例如不同的NaCl的量下进行。

引物延伸反应在存在逆转录酶和核苷三磷酸、任选适合的缓冲剂、盐和其它试剂下进行。反应可以在至少42℃、优选49到55℃、更优选大约52℃的温度下进行。反应可以进行15到30分钟，优选大约20分钟。优选反应混合物含有可检测的核苷酸，例如荧光核苷酸，其信号可以通过适当的方法检测。

可检测的核苷酸可以包含任何可检测的报告或信号部分，包括但不限于放射性同位素、酶、抗原、抗体、分光光度试剂、化学发光试剂、荧光和任何其它发光化学物质。

微阵列可以通过适当的方法进行分析，例如ScanArray Express扫描仪、ScanArray^TM和QuantArray^TM软件(PerkinElmer，Wellesley，MA)。寡核苷酸斑点的信号(减去当地背景信号)可以与非特异性寡核苷酸的信号相比较。信号的水平或量对阳性和阴性结果进行调整。根据本公开，至少高出三倍的信号才被认为是阳性的。

寡核苷酸优选含有选自序列SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：21的核苷酸序列。根据本发明的优选实施方案，可以使用SEQ ID NO：24代替序列SEQ ID NO：4，可以使用SEQ ID NO：25或通用寡核苷酸序列SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：27或它们中的几个代替序列SEQ ID NO：5，可以使用SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29或它们二者代替序列SEQ ID NO：8。除了原始的寡核苷酸序列(与其一起)，还可以使用可选的寡核苷酸序列。

应该理解的是，等价的寡核苷酸序列包括与序列SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29具有至少90％同一性、优选至少95％、更优选至少97％同一性的序列。更优选序列与提到的序列具有至少99％的同一性，最优选100％的同一性。如果在序列中有区别，区别可优选在寡核苷酸的5′末端中。

“序列基本相同的寡核苷酸序列”是指与序列SEQ ID NO：4、SEQID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29相比，在核苷酸序列中含有缺失一个核苷酸、添加一个核苷酸或有一个核苷酸变化的序列的寡核苷酸序列。

其它的核苷酸可以添加到上面定义的寡核苷酸序列的任何一端。但是，这可能导致二级结构，可能引起不太成功的杂交。寡核苷酸可以设计得使它们的熔解温度Tm为49到54℃。根据温度，在寡核苷酸的5′末端将存在或多或少数目的游离核苷酸。根据本公开，5′末端含有T间隔区。寡核苷酸的5′末端除了T间隔区之外还可以含有1个或2个附加的核苷酸。但是，如果5′末端不含有任何附加的核苷酸，是有利的。5′末端也可以缺失1或2个核苷酸。但是，如果5′末端不缺失任何核苷酸，也是有利的。

根据本发明的优选实施方案，微阵列含有对应于至少两种、优选至少三种不同疱疹病毒、更优选至少四种不同疱疹病毒的寡核苷酸。根据本发明的优选实施方案，微阵列含有对应于2到8种不同疱疹病毒的寡核苷酸。根据最优选的实施方案，微阵列含有对应于至少5种、优选至少6种、更优选至少7种或至少8种不同疱疹病毒的寡核苷酸。仅仅有几个文献描述的方法对于检测7或8种不同的疱疹病毒是可能的。极少有方法可能检测HHV-6A和HHV-6B病毒。所有提到的8种疱疹病毒可以同时从同样的生物样品中检测，这是尤为有利的。

根据本发明的一个优选实施方案，至少包含了选自SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的序列的寡核苷酸，或至少包含了选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：8的序列的寡核苷酸，被用于同时检测疱疹病毒。

或者，至少包含了选自SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ IDNO：26和SEQ ID NO：27的序列的寡核苷酸，或至少包含了选自SEQ IDNO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29的序列的寡核苷酸。

根据本发明的另一个优选实施方案，至少包含了选自SEQ IDNO：11和SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的序列的寡核苷酸，或至少包含了选自SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ IDNO 21的序列的寡核苷酸，被用于同时检测疱疹病毒。

根据本发明的另一个优选实施方案，通过本发明的方法同时检测了包含通常在患者中引起双重或三重感染的疱疹病毒的检测序列的寡核苷酸。

根据本发明的另一个优选实施方案，方法包括检测同样的生物样品中的其它病原体或其它病毒。其它的病原体或病毒可以是通常与疱疹病毒同时引起感染的病原体或病毒。或者，其它的病原体或病毒可以是引起中枢神经系统病障或免疫缺陷疾病的病原体或病毒。可能的其它病原体的例子是肠道病毒或引起疏螺旋体的病原体(borreliacausing pathogens)。

本发明还提供了微阵列试剂盒，它含有微阵列和任选的在反应中需要的试剂。这样的试剂是例如酶、核苷三磷酸(NTP)和缓冲剂。

本文中“qPCR”是指定量PCR。

本文中“定性PCR”这里是指诊断PCR。

在这里，通过指明用于检测8种疱疹病毒的微阵列对本发明的方法进行举例。基于微阵列的检测与日常的诊断PCR进行比较。日常的诊断PCR通过制备两个多重PCR来举例。

临床样本代表真实的患者病例。来自诊断PCR和微阵列的结果具有89％的一致性。在4个病例中微阵列给出了阳性结果，而诊断PCR保持阴性。

在通过微阵列检测的CMV阳性血浆样本中，有两例双重感染(CMV-EBV)。这些样本来自肾脏和骨髓移植的患者。这两个患者对于EBV和CMV都是血清反应阳性的。在EBV阳性的样本中，我们用微阵列检测到了两例双重感染(EBV-CMV和EBV-HHV-7)。EBV-CMV共感染的是骨髓移植的患者，他对于EBV是血清反应阳性的，并具有CMV IgM和IgG抗体。在EBV-HHV-7感染病例中，来自肾脏移植患者的样品对于HHV-7是血清反应阴性的。

两个VZV阳性的CSF样品通过微阵列检测是VZV-HHV-6B和VZV-EBV阳性。较早的研究已经显示出VZV-HHV-6B阳性的患者也有针对VZV和HHV-6的鞘内抗体。在可能的VZV-EBV共感染中，血清中的VZV IgG被证实了。通过微阵列发现了一个可能的三重感染(HSV-2、HHV-7和HHV-6B)。样品对于HHV-7是血清反应阴性的，通过诊断PCR测试为对HSV-1和-2阴性。

只有3个VZV阳性和1个HSV-2阳性(可能的三重感染)患者的CSF细胞计数、蛋白和葡萄糖值可以获得。在其中的两个中，发现结果是正常的，但是其它两个显示出了升高的白细胞和红细胞计数、正常的葡萄糖值和升高的蛋白水平。HSV-2阳性的患者在CSF中也有HSV-IgM抗体。

在诊断中，通过PCR没有从临床样本中测试到HHV-7。4个通过微阵列检测为HHV-7阳性的样本，在取样时对HHV-7是血清反应阴性的。因此，不能排除急性感染。HHV-7在例如移植患者中是相当常见的(Dockrell等，2001)。

诊断PCR通常在一个时间针对一种疱疹病毒进行，对于几种疱疹病毒来说，这就增加了检测时间。使用PCR可能会漏掉双重或三重感染，但是通过微阵列，在一天中可以检测多重感染。我们的结论是，基于微阵列的检测为诊断和研究目的提供了快速方便地检测几种疱疹病毒的方案。

实施例

实施例1

病毒DNA和临床样本

在建立多重PCR和微阵列中，使用了商业化病毒DNA对照(从一百万拷贝或病毒粒子开始)和细胞培养上清液的连续10倍稀释液(表I)。

表I、用于优化和测试多重PCR和微阵列的商业化病毒DNA对照(Autogen Bioclear，Wiltshire，UK)和细胞上清液列表。

^*临床分离物用作家庭对照。

从预检过的临床材料总共收集了116份临床样本，包括血浆(73份)、全血(10份)、脑脊液(CSF)样品(23份)和能力验证样品(proficiency testing specimens)(10份)(QCMD，Glasgow，Scotland，UK)。血浆、全血和CSF样品从实体器官和骨髓移植患者以及患有神经症状的患者收集。在能力验证样品中，10份中的4份来源于VZV，10份中的6份来自2004年HSV能力验证项目(表II)。为了研究微阵列的特异性，我们测试了来自患者(疑似流行性肾病)的70份血清、30份对HSV、EBV、CMV、VZV、HHV-6和-7DNA测试阴性的CSF和来自2004年肠道病毒能力验证项目的11份样品(表II)。

表II、用于测试微阵列的能力验证样品的病毒能力验证项目、毒株、病毒DNA载量和调查对象格式。

GEq/ml，每ml的基因组当量；neg，阴性；EV，肠道病毒。所有的能力验证样品用无菌水(1ml)稀释。

^*11份肠道病毒能力验证样品包含肠道病毒(8/11)、鼻病毒(1/11)和2份阴性。

DNA提取

根据在诊断中使用的方案，使用MagNA Pure LC仪器和总核酸试剂盒(Roche Diagnostics，Basel，瑞士)、高纯度病毒核酸试剂盒(RocheDiagnostics)或氯仿-苯酚抽提法提取DNA。

多重PCR引物和寡核苷酸

用于HSV-1和-2的引物对(多重PCR1)从发表的引物(Piiparinen和Vaheri，1991)修改而来。用于CMV、EBV、VZV、HHV-6A、-6B和HHV-7的寡核苷酸和引物(多重PCR2)使用Primer3软件(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3www.cgi；Rozen和Skaletsky，2000)和DNAmfold软件(http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/old/dna/；Zuker，2003)设计。T3 RNA聚合酶启动子序列包含在反向多重PCR引物中(表III和IV)。

或者，用于HSV-1、HSV-2、CMV、EBV、VZV、HHV-6A、-6B和HHV-7的寡核苷酸和引物(多重PCR1和2)使用Primer3软件(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3www.cgi；Rozen和Skaletsky，2000)和DNAmfold软件(http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/old/dna/；Zuker，2003)来设计。表III中的可选序列是SEQ ID NO：22到26。表IV中的可选序列是SEQ ID NO：28和29。

表III、用于多重PCR1的引物和微阵列上的寡核苷酸。

属，GenBank 寡核苷酸基因名称序列(5’→3’) 位置登记号

HSV-1， HSV-FW DNA pol.， AAGGAGGCGCCCAAGCGCCCG(SEQ ID NO：1) 64750-64768X14112 UL30AGCGAATTCGAGATGCTG(T/C)T(SEQ ID NO：22) 64130-64149HSV-RV AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA(SEQ ID NO：2)TGGGGTACAGGCTGGCAAAGT(SEQ ID NO：3) 64976-64956CCTT(T/G)ATCTTGCTGCGCTTC(SEQ ID NO：23) 64355-64336HSV-1-T3 Am-TTTTTTTTTGTCCTTGACCCCACTT(间隔区+ 64907-64922SEQ ID NO：4)64237-64252Am-TTTTTTTTTCAAGCTGACGGACATT(间隔区+SEQ ID NO：24)HSV-2， HSV-FW DNA pol.， AAGGAGGCGCCCAAGCGCCCG(SEQ ID NO：1) 65209-65229Z86099 UL30AGCGAATTCGAGATGCTG(T/C)T(SEQ ID NO：22) 64591-64610HSV-RV AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA(SEQ ID NO：2)TGGGGTACAGGCTGGCAAAGT(SEQ ID NO：3) 65449-65429CCTT(T/G)ATCTTGCTGCGCTTC(SEQ ID NO： 2364816-64797HSV-2-T3 Am-TTTTTTTTTAGGATAAGGACGACGAC(SEQ 65279-65295ID NO：5)64698-64713Am-TTTTTTTTTCAAGCTGACGGAGATC(SEQID NO：25)HSV(HSV- HSV-GEN1-T3 Am-TTTTTTTTTGGTACAACATCATCAACTTC HSV-1：64197-1，X14112； (SEQ ID NO：26) 64216；HSV-2：HSV-2， 64658-64677Z86099)HSV-GEN2-T3 Am-TTTTTTTTTGGGACATAGGCCAGAG(SEQ ID HSV-1：64311-NO：27) 64326；HSV-2：64722-64787

FW，正向引物(正义)；RV，反向引物(反义，在病毒序列前有T3RNA聚合酶启动子序列AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA)；T3，寡核苷酸(正义，在序列前有9 x T间隔区臂)；Am，氨基连接。在括号中的核酸对例如Hsv-fw(T/C)，表示在引物中有核酸变化，即在同一个混合物中有两种可选的引物可用。GEN，通用(用于两种HSV的寡核苷酸)。

表IV、用于多重PCR2的引物和微阵列上的寡核苷酸。

属，寡聚核基因GenBank 序列(5’→3’) 位置苷酸名称登记号

VZV， VZV-FW DNA pol.，CCATTTTCTCGCCGATTTTA(SEQ ID NO：6) 48508-48527AY548171 ORF28VZV-RV AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA(SEQ ID NO：2)GCCGCATTTGAACGTTTTAT(SEQ ID NO：7) 48670-48651VZV-T3 Am-TTTTTTTTTACCTCGTACGCTTTTTG(间隔区+ 48597-48613SEQ ID NO：8)VZV1-T3 Am-TTTTTTTTTAGAATCCGTATCTCCATATA(SEQ 48569-48588ID NO：28VZV2-T3 ^-Am-TTTTTTTTTCAGAATCCGTATCTCCATAT(SEQ 48568-48587ID NO：29CMV， CMV-FW DNA pol.，GTACAACAGCGTGTCGTGCT(SEQ ID NO：9) 57044-57063AY446894 UL44CMV-RV AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA(SEQ ID NO：2)CACCGGCCATCAAGTTTATC(SEQ ID NO：10) 57240-57221CMV-T3 Am-TTTTTTTTTGTAGAAGTTCTTCAGCTGC(间隔区 57122-57140+SEQ ID NO：11)EBV， EBV-FW DNA pol.，CGTAGATGACTCGAAGCTG(SEQ ID NO：12) 154029-154047AJ507799 BALF5EBV-RVAATT AACCCTCACTAAAGGGAGA(SEQ ID NO：2)ACCATCCTCGACAAGCAG(SEQ ID NO：13) 154278-154261EBV-T3 Am-TTTTTTTTTGAGAGGCAGGGAAAGAGG 154184-154201(间隔区+SEQ ID NO：14)HHV-6A， HHV-6-FW DNApol.， CTCGATCGAATCCGTAAACA(SEQ ID NO：15) 59289-59308X83413 U38HHV-6-RV AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA(SEQ ID NO：2)59444-59424CCGCGTATGTTTTATCGAGAC(SEQ ID NO：16)HHV-6A-T3 Am-TTTTTTTTTATCCTTGGACCGAGCTA(间隔区+ 59361-59377SEQ ID NO：17)HHV-6B， HHV-6-FW DNApol.，CTCGATCGAATCCGTAAACA(SEQ ID NO：15) 60409-60428AF157706 U38HHV-6-RV AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA(SEQ ID NO：2)CCGCGTATGTTTTATCGAGAC(SEQ ID NO：16) 60564-60544HHV-6B-T3 Am-TTTTTTTTTATCCTTGGACCGAACTC(间隔区+ 60481-60497(SEQ ID NO：18)HHV-7， HHV-7-FW DNApol.， AGGTCCAACATGCACAGTGA(SEQ ID NO：19) 56787-56806AF037218 U38HHV-7-RV AATTAACCCTCACTAAAGGAGA(SEQ ID NO：2)GGCAAAGAAAATGTGGGCTA(SEQ ID NO：20) 56993-56974HHV-7-T3 Am-TTTTTTTTTGGATACAAACTTTGGAA(间隔区+ 56893-56909(SEQ ID NO：21)

FW，正向引物(正义)；RV，反向引物(反义，在病毒序列前有T3RNA聚合酶启动子序列AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA)；T3，寡核苷酸(正义，在序列前有9 x T间隔区臂)；Am，氨基连接。

多重PCR扩增

多重PCR1被用于鉴定产生264-bp扩增子的HSV，在可选方法中产生249-bp扩增子。多重PCR2含有用于扩增CMV、EBV、VZV、HHV-6A、-6B和-7的引物对，分别产生220bp、273bp、186bp、179bp(HHV-6A和-6B都是)和230bp的扩增子。对每个样品都进行了这两种多重PCRs。

多重PCR1在终体积50μl中进行，其中含有50mM KCl、10mMTris-HCl(pH 8.3)、0.01％(w/vol)明胶、0.2mM dNTP混合物(Finnzymes，Espoo，芬兰)、0.6μM引物、12.5U AmpliTaq Gold聚合酶(Applied Biosystems，Foster City，CA)和2mM MgCl₂。

多重PCR2在终体积53μl中进行，其中含有47.2mM KCl、9.4mMTris-HCl(pH 8.3)、0.009％(w/vol)明胶、0.19mM dNTP混合物(Finnzymes)、0.56μM每种引物、12.5U AmpliTaq Gold聚合酶(AppliedBiosystems)和1.9mM MgCl₂。扩增的组成为在95℃变性10分钟，然后进行40个循环的96℃ 10秒、55℃ 20秒和72℃ 20秒，最后在72℃延伸5分钟。

日常诊断中的PCR

在我们的日常诊断中，对CMV和EBV使用两种实时定量PCR(qPCR)，对HSV、HHV-6和VZV使用三种定性PCR。将这些PCR之一和基于微阵列的方法平行地用于临床样本，使用来自相同提取的DNA，并对结果进行定性比较。所用的诊断PCR根据最初的诊断测试结果和临床信息来选择。

用于CMV和EBV的qPCR分别按照Piiparinen等(2004)和Aalto等的修改(2003)进行。在后者中，使用了EBV引物和Kimura等(1999)设计的探针。对HSV的PCR按照Piiparinen等(1991)使用Vesanen等(1996)报道的探针来进行。对HHV-6的PCR使用Gopal(1990)设计的引物和Pitkaranta等(2000)报道的HHV-6探针来进行。对VZV的PCR按照Echevarria等(1994)和Koskiniemi等(1997)来进行。带发光检测的微孔板杂交(Vesanen等，1996)被用于检测定性PCR产物。

微阵列的制备

显微镜的玻璃载玻片按照Guo等(1994)的描述使用Pastinen等(2000)的修改来活化。使用微阵列仪(

，GeneMachines，Huntingdon，UK)将NH₂-修饰的寡核苷酸(Proligo，Paris，法国)点在载玻片上。阵列由5 x 12矩阵组成，包括8种针对疱疹病毒的寡核苷酸(表III和IV)和6种序列对病毒非特异性的寡核苷酸。包被的载玻片含有50个阵列，其中每个阵列上疱疹病毒特异的寡核苷酸被点上2x三份平行样，用作阴性杂交对照的非特异性的寡核苷酸被点上两份平行样。点样溶液含有20μM寡核苷酸和0.3M碳酸钠缓冲液(pH 9.0)，或者商业化的1 x微阵列点样溶液(MSS，Arraylt，TelechemInternational，Sunnyvale，CA)，终体积为10μl。点样在室温和50％湿度下进行。载玻片使用前在室温储存过夜。

体外RNA转录和微阵列反应

两种多重PCR产物被合并，然后使用AmpliScribe^TM T3高产率转录试剂盒(Epicentre，Madison，WI)或者AmpliScribe^TM T3快速转录试剂盒按照制造商的说明书在42℃反应1小时转录成ssRNA。包含了提取物的阴性对照、多重PCR和PCR。

使用小划圈笔(Mini Pap Pen)(Zymed，South Francisco，CA)围绕住阵列区域。含有6μl ssRNA和1.5mM NaCl、终体积为8.5μl的ssRNA溶液在95℃加热1.5分钟，使其与阵列在42℃反应20分钟。或者，将6μl ssRNA在96℃加热2分钟。加热后，含有6μl ssRNA和1.5mM NaCl、终体积为8.5μl的ssRNA溶液与阵列在42℃反应20分钟。孵育后，用阵列清洗缓冲液[0.5xTE(5mM Tris，0.5mM EDTA)，0.3M NaCl和0.1％ Triton X-100(YA Kemia，Helsinki，芬兰)]和无菌水清洗微阵列。

加入终体积为4.5μl的引物延伸溶液，在52℃反应20分钟，该引物延伸溶液中含有55mM Tris-HCl、11mM MgCl₂、83mM KCl、11mM DTT(Epicentre)、0.6μM dATP、dGTP、ddATP、ddGTP、dUTP-CY5和dCTP-CY5(Amersham Bioscience，Little Chalfont，UK)、5U MMLV逆转录酶(Epicentre)和0.5M海藻糖(Sigma-Aldrich)以及8.3％甘油(MP Biomedicals，Irvine，CA)。在扫描荧光之前，用阵列清洗缓冲液清洗微阵列并干燥。

微阵列的扫描和分析

使用ScanArray快速扫描仪、ScanArray^TM和QuantArray^TM软件(PerkinElmer，Wellesley，MA)分析微阵列。对于每个阵列单独确定分析截止值。将寡核苷酸点的信号(减去当地背景信号)与非特异性寡核苷酸的信号进行比较。至少高出3倍的信号被认为是阳性的。微阵列被执行双份。经过定量的信号数量与样本中病毒的数量不相关。

分析的灵敏度

多重PCR提供了良好的分析灵敏度(表V)，这是通过研究每种病毒的商业化对照物的稀释液最少3次而得到的。提取物和多种PCR的水对照用微阵列是阴性的。除了HHV-6A和-6B之间，没有观察到其它的交叉反应。在超过10,000个HHV-6B拷贝/反应中，观察到了基因型特异性寡核苷酸之间的交叉反应。但是，在高浓度的HHV-6A中没有检测到交叉反应。商业化对照物在检测中工作良好(图1)，并且更显示了杂交的准确性。

表V、使用商业化病毒DNA对照物的多重PCR和微阵列的灵敏度。

VP，病毒粒子。多重PCRs的灵敏度通过2％凝胶电泳确定，它的灵敏度比杂交方法低。*表示通过可选的方法、寡核苷酸和/或引物得到的结果。

临床样本的分析和特异性

使用诊断PCR之一和微阵列同时测试了总共116个样本。对于73份血浆进行针对CMV或EBV的qPCR，对于10份全血样品进行定性HHV-6-PCR(表VI)。对23份CSF进行定性HSV-或VZV-PCR(表VII)。使用定性HSV-和VZV-PCR测试10份能力验证样本(表VIII)。对于116份临床样本中的103份(89％)，PCR和微阵列给出了一致的定性结果。

表VI、血浆和全血样本的日常诊断PCR和微阵列结果。

neg，阴性。样本储存在-70℃。

^*全血样本

1通过微阵列检测的多重PCR。

在32份PCR阴性的血浆样本中，微阵列在28份中为阴性(表VI)。4份最初阴性的血浆样本用微阵列显示出阳性结果。在26份CMV阳性的血浆样本中，有24份qPCR和微阵列给出了一致的结果。两份CMV-qPCR阳性样品，每毫升1280和810基因组当量(Geq)，微阵列检测保持为阴性。在CMV阳性病例中观察到了2例CMV和EBV双重感染(分别为CMV 5420 GEq/ml和EBV 6280 GEq/ml，以及CMV4200 GEq/ml和EBV 4130 GEq/ml)。

在15份EBV-PCR阳性样品中，除了一份之外用微阵列都检测到了EBV。失误的样本在qPCR中给出了860GEq/ml。用微阵列检测出了2例双重感染(EBV-CMV和EBV-HHV-7)。所述样本在qPCR中对于EBV分别有15 x 10⁶和990GEq/ml。

对于10份HHV-6-PCR阳性样本中的9份通过微阵列检测到了HHV-6B。微阵列也检测出了4例双重感染，两例是HHV-6B-EBV，另两例是HHV-6B-HHV-7感染。

在总共23份CSF样品中，通过PCR检测到10份为阴性，13份为阳性。所有PCR阴性的CSF在微阵列中也是阴性的。在3份HSV阳性样本中微阵列对一份HSV-2阳性样品有失误。通过微阵列观察到了一例三重感染(HSV-2、HHV-7和HHV-6B)。两份HHV-6阳性样品都保持为阴性，而所有8份VZV阳性样品用微阵列也是阳性的(表VII)。

表VII、CSF样本*的日常诊断PCR和微阵列结果。

neg，阴性。样本被储存在-70℃。

10份能力验证样本中有2份用PCR和微阵列检测为阴性。在8份PCR阳性样本中，两份为HSV-1阳性，两份为HSV-2阳性，四份为VZV阳性，正如以前QCMD所通知的那样。在HSV-1和-2PCR阳性样本中有一份微阵列保持阴性，其它的结果都一致。在一份VZV阳性样品中，除了VZV信号之外还观察到了非常弱的HHV-6B微阵列信号(表VII-)。

在多重PCR和微阵列中，疱疹病毒阴性组(70份血清、30份CSF和11份能力验证样本)。因此得出的特异性是100％(结果未包含在表中)。

表VIII、QCMD样本的日常诊断PCR和微阵列结果。

neg，阴性。

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序列表

<110>利琴蒂亚有限公司

<120>检测疱疹病毒的方法和微阵列

<130>SCT084183-00

<150>60/788,307

<151>2006-03-31

<160>29

<170>PatentIn version 3.4

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Claims

1.在生物样品中检测一种或多种疱疹病毒的方法，其包括下列步骤：

-从生物样品提取DNA；

-扩增所提取的DNA；

-将扩增的DNA翻译成ssRNA；

-将ssRNA与微阵列上的寡核苷酸序列杂交，所述寡核苷酸序列对应于每种待测疱疹病毒；

-通过引物延伸方法在可检测的核苷酸存在下延伸杂交的ssRNA；

-通过适当的方法检测来自可检测的核苷酸的信号；

其中所述寡核苷酸序列的长度小于50个核苷酸，并且所述序列从5’到3’方向含有选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQID NO：11、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ IDNO：21的序列，或与任何提到的序列具有基本上同样序列的序列。

2.权利要求1的方法，其中所述微阵列包含对应于至少两种不同的疱疹病毒的寡核苷酸。

3.权利要求1或2的方法，其中所述微阵列包含对应于至少三种不同疱疹病毒的寡核苷酸。

4.权利要求1到3任一项的方法，其中所述微阵列包含对应于选自HSV-1、HSV-2、CMV、EBV、VZV、HHV-6A、HHV-6B和HHV-7的疱疹病毒的寡核苷酸。

5.权利要求1到4任一项的方法，其中不同疱疹病毒的检测是同时的。

6.权利要求1到5任一项的方法，其中所述方法还包括检测其它病原体，优选为病毒。

7.权利要求1到6任一项的方法，其中所述方法还包括检测中枢神经系统(CNS)的疾病或免疫缺陷疾病。

8.权利要求1到7任一项的方法，其中所述方法还包括检测肠道病毒或疏螺旋体。

9.权利要求1到8任一项的方法，其中不同疱疹病毒和其它病原体的检测是同时的。

10.权利要求1到9任一项的方法，其中DNA的扩增是通过使用包含引物A和引物B的引物对进行的，引物对选自：

A是SEQ ID NO：1，和B是SEQ ID NO：3；

A是SEQ ID NO：6，和B是SEQ ID NO：7；

A是SEQ ID NO：9，和B是SEQ ID NO：10；

A是SEQ ID NO：12，和B是SEQ ID NO：13；

A是SEQ ID NO：15，和B是SEQ ID NO：16；以及

A是SEQ ID NO：19，和B是SEQ ID NO：20，

或与提到的序列具有至少90％同一性的序列。

11.权利要求1到10任一项的方法，其中DNA的扩增是通过多重PCR在两个反应中进行的。

12.权利要求11的方法，其中HSV-1和HSV-2在一个反应中扩增，而CMV、EBV、VZV、HHV-6A、HHV-6B和HHV-7在另一个反应中扩增。

13.用于检测疱疹病毒的微阵列，其包含：

-包含了至少一个阵列的固相支持物；

-所述阵列包含对至少一种疱疹病毒特异的寡核苷酸，

其中所述寡核苷酸序列的长度小于50个核苷酸，并且所述序列从5’到3’方向包含选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQID NO：11、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ IDNO：21的序列，或与任何提到的序列具有基本上同样序列的序列。

14.权利要求13的微阵列，其中固相支持物上阵列的数量是1到80个，优选10到60个。

15.权利要求13或14的微阵列，其中所述微阵列上寡核苷酸斑点的数量是4到200个，优选10到100个。

16.权利要求13到15任一项的微阵列，其中所述微阵列被用于检测选自HSV-1、HSV-2、CMV、EBV、VZV、HHV-6A、HHV-6B和HHV-7的疱疹病毒。.

17.权利要求13到16任一项的微阵列，其中所述微阵列包含用于检测由疱疹病毒引起的其它疾病的寡核苷酸。

18.权利要求13到17任一项的微阵列，其中所述微阵列包含用于检测其它病原体、例如肠道病毒或引起疏螺旋体的病原体的寡核苷酸。

19.制备用于检测疱疹病毒的微阵列的方法，其包括：

-将对应于至少一种疱疹病毒的寡核苷酸连接在阵列中；

-将多个阵列放置在载玻片上，阵列的数量对应于待分析的样品的数量，

其中寡核苷酸序列的长度小于50个核苷酸，并且所述序列从5’到3’方向包含选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：21的序列，或与任何提到的序列具有基本上同样序列的序列。

20.试剂盒，其包含权利要求13到18任一项的微阵列以及任选包含引物、缓冲液、酶和/或核苷酸。

21.寡核苷酸，包含选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：21的序列，其中所述寡核苷酸序列的长度小于50个核苷酸，并且序列在5’到3’方向上包含所述的序列。

22.用于在生物样品中检测一种或多种疱疹病毒的方法，其包括下面的步骤：

-从生物样品提取DNA；

-扩增提取到的DNA；

-将扩增的DNA翻译成ssRNA；

-将ssRNA与微阵列上的寡核苷酸序列杂交，所述寡核苷酸序列对应于每种待测的疱疹病毒；

-通过适当的方法检测来自可检测的核苷酸的信号；

其中所述寡核苷酸序列的长度小于50个核苷酸，并且所述序列从5’到3’方向包含选自SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29的序列，或与任何提到的序列具有基本上同样序列的序列。

23.权利要求22的方法，其中所述微阵列还包含一个或多个寡核苷酸，其中所述寡核苷酸序列的长度小于50个核苷酸，并且所述寡核苷酸序列从5’到3’方向包含选自SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14、SEQID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：21的序列。

24.权利要求22或23的方法，其中所述微阵列包含对应于至少两种不同疱疹病毒的寡核苷酸。

25.权利要求22到24任一项的方法，其中所述微阵列包含对应于选自HSV-1、HSV-2、CMV、EBV、VZV、HHV-6A、HHV-6B和HHV-7的疱疹病毒的寡核苷酸。

26.权利要求22到25任一项的方法，其中不同疱疹病毒的检测是同时的。

27.权利要求22到26任一项的方法，其中所述方法还包括检测其它病原体，优选为病毒。

28.权利要求22到27任一项的方法，其中所述方法还包括检测中枢神经系统(CNS)的疾病或免疫缺陷疾病。

29.权利要求22到28任一项的方法，其中所述方法还包括检测肠道病毒或疏螺旋体。

30.权利要求22到29任一项的方法，其中不同疱疹病毒和其它病原体的检测是同时的。

31.权利要求22到30任一项的方法，其中DNA的扩增是通过使用包含引物A和引物B的引物对进行的，引物对选自：

A是SEQ ID NO：22，和B是SEQ ID NO：23；

A是SEQ ID NO：6，和B是SEQ ID NO：7；

A是SEQ ID NO：9，和B是SEQ ID NO：10；

A是SEQ ID NO：12，和B是SEQ ID NO：13；

A是SEQ ID NO：15，和B是SEQ ID NO：16；以及

A是SEQ ID NO：19，和B是SEQ ID NO：20，

或与提到的序列具有至少90％同一性的序列。

32.权利要求22到31任一项的方法，其中DNA的扩增是通过多重PCR在两个反应中进行的。

33.权利要求32的方法，其中HSV-1和HSV-2在一个反应中扩增，而CMV、EBV、VZV、HHV-6A、HHV-6B和HHV-7在另一个反应中扩增。

34.用于检测疱疹病毒的微阵列，其包含：

-包含至少一个阵列的固相支持物；

-所述阵列包含对至少一种疱疹病毒特异的寡核苷酸，

其中寡核苷酸序列的长度小于50个核苷酸，并且所述序列从5’到3’方向包含选自SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29的序列，或与任何提到的序列具有基本上同样序列的序列。

35.权利要求34的微阵列，其中微阵列还包含一种或多种寡核苷酸，其中所述寡核苷酸序列的长度小于50个核苷酸，并且所述序列从5’到3’方向包含选自SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：21的序列。

36.权利要求34或35的微阵列，其中固相支持物上阵列的数量是1到80个，优选10到60个。

37.权利要求34或36的微阵列，其中所述微阵列上寡核苷酸斑点的数量是4到200个，优选10到100个。

38.权利要求34到37任一项的微阵列，其中所述微阵列被用于检测选自HSV-1、HSV-2、CMV、EBV、VZV、HHV-6A、HHV-6B和HHV-7的疱疹病毒。

39.权利要求34到38任一项的微阵列，其中所述微阵列包含用于检测疱疹病毒引起的其它疾病的寡核苷酸。

40.权利要求34到39任一项的微阵列，其中所述微阵列包含用于检测其它病原体、例如肠道病毒或引起疏螺旋体的病原体的寡核苷酸。

41.制备用于检测疱疹病毒的微阵列的方法，其包括：

-将对应于至少一种疱疹病毒的寡核苷酸连接在阵列中；

42.权利要求41的方法，其中所述阵列还包含一种或多种寡核苷酸，其中寡核苷酸序列的长度小于50个核苷酸，并且所述序列从5’到3’方向包含选自SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：17、SEQID NO：18和SEQ ID NO：21的序列。

43.试剂盒，其包含权利要求34到40任一项的微阵列以及任选包含引物、缓冲液、酶和/或核苷酸。

44.寡核苷酸，其包含选自SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29的序列，其中所述寡核苷酸序列的长度小于50个核苷酸，并且所述序列在5’到3’方向上包含所述的序列。

45.在生物样品中同时检测至少两种疱疹病毒的方法，其包括下列步骤：

-从生物样品提取DNA；

-扩增所提取的DNA；

-将扩增的DNA翻译成ssRNA；

-将ssRNA与微阵列板上的寡核苷酸序列杂交，所述寡核苷酸序列对应于通常引起同时感染的疱疹病毒；

-通过适当的方法检测来自可检测的核苷酸的信号。

46.引物，其选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：19和SEQ IDNO：20，或与提到的序列具有至少90％同一性的序列。

47.引物，其选自SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23或与提到的序列具有至少90％同一性的序列。