CN116676427A

CN116676427A - 特异性检测HHV-7病毒DNA的引物及定量qPCR方法

Info

Publication number: CN116676427A
Application number: CN202310888664.5A
Authority: CN
Inventors: 高歌; 周安宇
Original assignee: Ixcell Biotechnology Co ltd
Current assignee: Ixcell Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-07-19
Filing date: 2023-07-19
Publication date: 2023-09-01

Abstract

本发明公开了特异性检测HHV‑7病毒DNA的引物和荧光探针，以及检测样本中HHV‑7病毒DNA的TaqMan qPCR方法，可用于定性或定量检测样本中的HHV‑7病毒DNA。

Description

特异性检测HHV-7病毒DNA的引物及定量qPCR方法

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，更具体涉及对HHV-7病毒DNA的检测。

背景技术

人类疱疹病毒7(HHV-7)属于疱疹病毒乙亚科玫瑰疱疹病毒属，是1990年从成人外周血单核细胞(PBMC)分离的新型人类疱疹病毒，与HHV-6具有基因相似性(1)。HHV-7具有嗜淋巴细胞和嗜神经组织特性，常与高热惊厥、脑炎、皮疹等疾病的发病有关(2)。与HHV-6B相似，HHV-7在人群中普遍存在，90％左右的健康成人具有此病毒的感染(3)。HHV-7在感染细胞或器官中可以长期潜伏存在，并能在适当条件下被激活，但在临床上通常表现出无症状或不严重的症状。HHV-7的初次感染通常发生在幼儿期，目前还不能确定与某种疾病直接相关，它可能协同HHV-6引起儿童玫瑰疹，或者激活HHV-6病毒从而引起相关的疾病，但HHV-7的感染一般是无症状的。据报导指出，在肝炎病人和慢性疲劳综合征病人的血液和组织中检测到HHV-7病毒DNA；另外，在一些免疫缺陷病人如艾滋病病人体内也可以检测到HHV-7的激活，但它们之间的相互关系还需进一步研究。因此，HHV-7临床表现的多样性、初次感染的高度普遍性以及长期潜伏性使得精确判断病毒的致病原因和作用机制相当困难。

与HHV-6不同的是，HHV-7长期潜伏的作用机制目前尚未得知。但研究发现，HHV-7具有和HHV-6相似的基因组序列，氨基酸序列一致性在50％左右。除此之外，它们具有相同的病毒构造：二十面体的病毒衣壳、150～200nm的病毒直径、线性双链DNA构造基因组等。类似的是，HHV-6和HHV-7的基因组都具有末端直接重复序列(terminal directrepeats，DR)。HHV-6的DR上含有与脊椎动物染色体端粒重复序列(TRS)相关的序列：GGGTTA碱基重复序列，使得HHV-6病毒感染后可以整合到宿主细胞端粒上并长期潜伏于细胞中，这也是其潜伏的机制。但HHV-7的TRS表现出多样化，其潜伏机制可能以与HHV-6相似的整合方式、但不同的碱基序列，将HHV-7病毒基因潜伏于宿主细胞内(4)。

不同亚型的HHV感染的细胞类型不同，HHV6可以感染多种细胞如：T细胞、单核巨噬细胞、造血细胞、上皮细胞和胶质细胞等。然而HHV-7选择性地感染CD4⁺T细胞，并在初次感染后潜伏其中，在一些皮肤、唾液腺和其它器官中也有HHV-7病毒的发现(5)。另外，在肺、皮肤、乳腺、肝脏、肾脏和扁桃体等部位可以检测出形态和表型区别于T细胞、但表达HHV-7结构抗原的细胞。分离HHV-7最好采用纯化血液中CD4⁺T细胞的方式。但由于HHV-7不会诱发任何细胞病变反应并且能够适应淋巴细胞系的改变，使得HHV-7病毒的培养变得困难，诊断激活的HHV-7需耗费大量时间。而且，由于HHV-7在人群中普遍存在，婴儿出生3年后大部分群体中HHV-7抗体为阳性，而且该抗体与HHV-6病毒有交叉反应，这为HHV-7的检测带来了很大的困难。

由于人类是其唯一的天然宿主，HHV-7病毒广泛地存在于人群中。HHV-7传播方式主要为唾液，尤其在生命的早期。研究发现，对HHV-6传播无任何作用的哺乳也是HHV-7病毒传播的潜在途径(6)。虽然HHV-6和HHV-7都在生命的早期发生感染，但HHV-6B的初次感染通常发生在婴幼儿出生后6月～3年内，而HHV-7和HHV-6A的初次感染时间要稍后一些，因此HHV-7的血清转换和血清学检测都要在后期进行。而且由于初次感染后通常是无症状表现，对HHV-7病毒的检测带来了很大的困难。

初次感染后的病毒通常潜伏于宿主细胞内。在一份对200位健康人血液的检测报告中指出，全血中HHV-6B、HHV-6A及HHV-7病毒DNA检出率分别为8％、0％和51％。研究发现，HHV-7病毒的激活在一些具有免疫缺陷的病人身上更容易发生，虽然临床表现较少，但一些接受移植的病人更容易感染HHV-7。例如，接受造血干细胞移植的病人在1周内通常会激活HHV-7病毒，这比HHV-6的激活更早发生(7,8)；器官移植(SOT)后2～4周通常可以观察到HHV-7的激活，大约40％SOT病人的血液中可以检测到HHV-7病毒的DNA(9,10)。基于这些临床发现，我们可以选择性地对目标人群进行HHV-7病毒激活的检测。

常用的病毒诊断方法可分为直接诊断和间接诊断，其中间接诊断方法依赖于特异性血清抗体的检测，通常采用免疫荧光技术测定免疫球蛋白G和M(IgG和IgM)的含量。但这种病毒血清学检测方法受到抗体交叉反应的影响，因此需要使用抗体补体免疫荧光试验加以鉴别。直接诊断方法基于对病毒和病毒组分的检测，主要为受感染细胞所释放的病毒颗粒(11)，可分为病毒分离、病毒抗原以及病毒基因组DNA检测。最先使用的参考方法为从淋巴细胞中分离病毒(1,12)，但由于培养技术缺乏敏感性，需耗费大量时间、人员和试剂，以及病毒生产过程中存在危险，这种实验方法目前主要用于研究。通过使用免疫荧光或免疫组化技术可以直接检测感染细胞或组织中的HHV-7病毒抗原(13)，但由于此技术的低敏感性以及受限于功能性抗体的获得，使得检测病毒抗原的方法主要应用于生物医学研究。

通过聚合酶链式反应(PCR)检测病毒基因组DNA是目前常用的技术，具有简便、特异和敏感性高等特点。定量PCR技术，尤其是实时荧光定量PCR(Real-time qPCR)技术可以降低污染的风险，并提供精确的病毒载量值(14,15)。使用RT-PCR技术检测并定量病毒信使RNA(mRNA)含量可以很好地区分病毒感染的潜伏或激活状态，但此技术的灵敏性需要提高才能被广泛使用(16)。另外，数字PCR、二代测序技术等可以帮助定量样本中病毒DNA含量或者分析不同的病毒亚型(17,18)。这些方法都需要基于精确的标准去直接定量样本中HHV-7的含量，但目前并没有一套国际标准可以实施。

发明内容

本发明设计并合成HHV-7病毒特异性的引物/标记探针，并开发了可用于检测HHV-7病毒DNA的TaqMan qPCR方法。此方法适用于检测患者是否感染HHV-7，并为判断其是否处于激活状态提供指标；并可以广泛地检测全血、血浆、唾液或其它疑似HHV-7感染的组织中的HHV-7病毒。

本发明涉及可以定量检测样本中HHV-7病毒DNA的TaqMan qPCR方法。此方法以HHV-7基因组高度保守的U38基因为靶序列设计并合成引物和标记探针，并以此靶序列构建标准品质粒，高度敏感性地定量检测标本中的HHV-7病毒DNA含量。虽然研究数据表明潜伏和激活状态的HHV-7并没有严格的阈值，但激活感染的HHV-7病毒拷贝数(copy number)通常大于1000copy/mL全血(19,20)。因此，本发明的方法可以检测患者体内HHV-7病毒DNA的精确拷贝数，可以为判断患者是否激活了HHV-7的感染提供临床参考。

术语“HHV-7”是人类疱疹病毒7型，属于疱疹病毒乙亚科玫瑰疱疹病毒属，是一种双链DNA病毒，基因组长145kb。HHV-7与HHV-6的DNA同源性达50％-60，氨基酸序列同源性达53.4％。

本发明一方面提供特异性检测HHV-7病毒DNA的引物对，所述引物对包括正向引物5’-tctgtcacatgtcttgggcg-3’(SEQ ID NO:1)和反向引物5’-caccgcgtgtcaatccaaat-3’(SEQ ID NO:2)。

本发明的另一方面提供特异性检测HHV-7病毒DNA的引物和探针组合，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中正向引物是5’-tctgtcacatgtcttgggcg-3’(SEQ ID NO:1)，所述反向引物是5’-caccgcgtgtcaatccaaat-3’(SEQ ID NO:2)；所述探针的序列为5’-acgttgacagcgccatgtattcgga-3’(SEQ ID NO:3)，该探针的5’端标记报告荧光基团，3’端标记淬灭基团。

在一些实施方案中，所述荧光探针的5’端标记的报告荧光基团为FAM，3’端标记的淬灭基团为NFQ-MGB或TAMRA。

本发明的另一方面提供上述引物对或引物和探针组合在检测样本中HHV-7病毒DNA中的应用。

本发明的另一方面提供上述引物对或引物和探针组合在制备用于检测样本中HHV-7病毒DNA的试剂中的应用。

在一些实施方案中，所述检测是通过qPCR检测或通过数字PCR检测。

如本领域技术人员所知，qPCR又称实时定量PCR(Real-time Quantitative PCR)，是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测PCR进程，最后可以通过标准曲线对未知模板进行定量分析。在qPCR检测中，Ct值表示循环阈值，即每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。由于每个模板的Ct值与该模板的起始含量的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用连续稀释的已知起始含量的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始含量的对数，纵坐标代表Ct值，或者纵坐标代表起始含量的对数，横坐标代表Ct值。只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的含量。qPCR在本领域中属于成熟技术，利用现有的仪器进行qPCR检测时，可以直接从仪器的输出结果中获得样本的Ct值。

在qPCR检测中，可以使用荧光探针或荧光染料获取荧光信号。常见的荧光探针例如可以是TaqMan荧光探针，其中PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。在一些实施方案中，报告荧光基团可以是例如FAM，淬灭基团可以是例如NFQ-MGB或TAMRA。本领域技术人员知道其它报告荧光基因和相应的淬灭荧光基团也可以用于本发明。

在qPCR检测中，还可以使用荧光染料获取荧光信号，例如可以在PCR反应体系中，加入过量荧光染料，荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。常用的荧光染料例如可以是SYBR荧光染料、磺酰罗丹明(Texas Red)、异硫氰酸荧光素(FITC)、羟基荧光素(FAM)、四氯荧光素(TET)、JOE、VIC、ROX和NED等。

数字PCR检测也是本领域技术人员公知的，简言之，数字PCR(也可称单分子PCR)包括PCR扩增和荧光信号分析，在PCR扩增阶段，将样品稀释到单分子水平并平均分配到几十至几万个单元中进行反应，在扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集。最后通过直接计数或泊松分布公式计算得到样品的原始浓度或含量。本领域技术人员熟知如何进行数字PCR检测。

本发明的另一方面提供特异性检测样本中HHV-7病毒DNA的试剂盒，该试剂盒包括上述引物对，或包括上述引物和探针组合。

在一些实施方案中，所述试剂盒中还包括进行qPCR检测所需要的任意一种或更多种试剂。

在一些实施方案中，所述进行qPCR检测所需要的任意一种或更多种试剂包括选自下述组分的一种或更多中组分：qPCR反应液(例如qPCR Master Mix(2×)，其中包括qPCR反应所需要的酶等必须成分)、水(例如无核酸酶高纯水)、对照品。其中对照品可以是阳性对照品和/或阴性对照品。其中阳性对照品例如可以是含HHV-7病毒DNA的质粒DNA、HHV-7病毒基因组DNA或含HHV-7病毒DNA或细胞或细胞基因组DNA。其中阴性对照品可以是无HHV-7病毒DNA的质粒DNA、基因组DNA、组织、细胞或水(例如无DNase/RNase的水)。所述试剂盒中还可以包含HHV-7病毒DNA标准品。本发明中，包含HHV-7病毒DNA标准品例如可以是含HHV-7病毒DNA片段的质粒DNA。所述含HHV-7病毒DNA片段的质粒DNA例如可以是含有HHV-7U38基因中200bp的DNA片段的质粒DNA，该200bp的DNA片段为Genbank GI号3289496的序列中核苷酸位置2031-2230的片段。

本发明的另一方面提供检测样本中HHV-7病毒DNA的方法，包括使用上述的引物和探针组合，对从样本提取的DNA进行qPCR检测，根据qPCR检测结果定性检测或定量检测样本中是否存在HHV-7病毒DNA。所述样本例如可以是样本例如可以是器官、组织、全血、血浆、细胞、唾液或体液样品或生物制品。

本发明的另一方面提供检测样本中HHV-7病毒DNA的方法，包括以下步骤：

(1)提取样本中的DNA；

(2)使用特异性扩增HHV-7病毒DNA的引物和探针组合，例如上述的引物和探针组合，对HHV-7病毒DNA标准品和样本DNA进行qPCR检测，其中HHV-7病毒DNA标准品是用含有HHV-7病毒DNA片段的DNA配制的不同给定浓度的样品；

(3)用HHV-7病毒DNA标准品的qPCR检测结果制作标准曲线，拟合线性方程，其中R²≥0.99；且各标准品浓度的准确度(RE％)为-75％～150％，确定可稳定检测到的浓度最低点；

(4)结果判定：如果样本DNA的qPCR结果中出现明显的扩增曲线；且样本DNA的qPCR的Ct值小于浓度最低点的Ct值，则为阳性结果，即样本中存在HHV-7病毒DNA；如果无明显扩增曲线，或者有明显扩增曲线，但Ct值大于标准曲线浓度最低点的Ct值，则为阴性结果，即样本中不存在HHV-7病毒DNA。在一些实施方案中，在步骤(4)中，当样本DNA的qPCR结果中出现明显的扩增曲线，但Ct值大于标准曲线浓度最低点的Ct值时，也可以不判定为阴性结果，而是增加样本DNA含量，重复上述实验，并根据上述标准进行结果的判定。

在一些实施方案中，所提取的是样本中的基因组DNA。所述样本DNA可以是样本基因组DNA。从样本中提取基因组DNA的方法是本领域公知的，例如可以用DNA提取试剂盒提取基因组DNA。

在一些实施方案中，上述步骤(3)中制作标准曲线时，以HHV-7病毒DNA标准品的Ct值为纵坐标(Y)，以HHV-7病毒DNA标准品的DNA浓度的对数为横坐标(X)，拟合线性方程。

在一些实施方案中，上述HHV-7病毒DNA标准品包含至少6个用含有HHV-7病毒DNA片段的DNA配制的不同给定浓度的样品。HHV-7病毒DNA标准品的数量可以是6个、7个、8个或更多个。HHV-7病毒DNA标准品例如可以是用含有HHV-7病毒DNA片段的质粒DNA配制的不同给定浓度的样品，例如可以用含HHV-7病毒DNA片段的质粒DNA与水混合配制而成。所述含HHV-7病毒DNA片段的质粒DNA例如可以是含有HHV-7U38基因中200bp的DNA片段的质粒DNA，该200bp的DNA片段为Genbank GI号3289496的序列中核苷酸位置2031-2230的片段。

拟合标准曲线时，如R²和各标准品浓度的准确度不满足以上要求，可以通过重复实验，或重新制备DNA标准品、或换用不同浓度的DNA标准品，来获得满意的拟合结果。标准曲线的拟合以及获得满意拟合结果的方法属于本领域技术人员的公知技术。

浓度最高点是指用上述方法可稳定检测到的浓度的最高限，在本发明中也可称为检测上限或定量上限。可稳定检测到的浓度的最低限即为浓度最低点，在本发明中也可称为检测下限或定量下限。

判断是否出现明显扩增曲线的方法是本领域技术人员公知的，例如当ΔRn vsCycle模式下的曲线为S形时，可确定出现明显扩增曲线。

在一些实施方案中，qPCR的反应体系为PCR Master Mix(2×)10μL，特异性扩增HHV-7病毒DNA的引物/探针(20×)1μL，DNA样品+无核酸酶高纯水9μL。其中DNA样品可以是样本DNA、DNA标准品、或其它阳性对照品、阴性对照品或质控品。

在一些实施方案中，qPCR反应的程序为首先50℃，2min以激活UDG；然后95℃，10min激活DNA聚合酶；然后按下列参数进行40个循环：95℃，15秒；60℃，1min。在一些实施方案中，在Applied Biosystems ABI 7500Real Time PCR仪上完成qPCR反应。

在一些实施方案中，所述结果判定也可以是定量检测样品中的HHV-7病毒DNA，或者可以进一步包括定量检测样品中的HHV-7病毒DNA。所述定量检测可以包括例如根据样本DNA的Ct值和拟合的标准曲线，确定样本DNA中HHV-7病毒DNA的浓度。

本发明中，样本例如可以是器官、组织、全血、血浆、细胞、唾液或体液样品或生物制品。

本发明中，样本例如可以来源于人或任何动物，例如猴、小鼠、大鼠、兔、猴等动物，或者任何其他途径。

在一些实施方案中，本发明的方法是在体外进行的。

在一些实施方案中，本发明的方法是非诊断性的，例如可以用于确定生物制品，例如疫苗是否受到HHV-7污染。

本发明所提供的引物和标记探针可用于HHV-7病毒DNA在HHV-7感染者中的定量分析，或者对有疑似HHV-7感染症状的免疫缺陷患者进行精确诊断，对判断是否激活体内HHV-7病毒具有指导意义。本发明所使用的引物和标记探针可特异性扩增HHV-7，既不会与正常人、猴、兔、大鼠和小鼠的基因组DNA发生交叉反应，也不会与其它相关病毒基因组发生交叉反应，对HHV-7核酸药物在动物模型上的研发具有重要作用。本发明不仅制备过程简单、耗时少，而且对待测样本的处理也方便，检测的灵敏性高、准确度好。本发明的引物/探针、试剂盒和检测方法可以在HHV-7病毒临床检验中发挥重要作用。

附图说明

图1是HHV-7引物/探针灵敏性验证扩增曲线图。

图2是HHV-7引物/探针标准曲线线性图。

图3是HHV-7引物/探针精密度和准确度验证扩增曲线图。

图4是HHV-7引物/探针特异性验证扩增曲线图。

图5是HHV-7引物/探针线性验证扩增曲线图。

实施例

下面通过实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步详细的说明，但本发明不限于下面的实施例。

如无特别说明，下述实施例中的PCR实验方法均为TaqMan qPCR方法，提及的序列均以从5’端到3’端的方式表示。

1.实验方法

1.1标准品质粒的准备和标准曲线制作

将HHV-7U38基因中200bp的DNA片段(GI：3289496；核苷酸位置：2031-2230)使用双酶切法克隆至pUC57载体，转化后挑取质粒DNA，并经EcoR I和Hind III酶切消化进行鉴定以及去内毒素纯化。纯化后的质粒经Nanodrop测定浓度和纯度后作为标准品使用。

使用无DNase/RNase水对质粒标准品进行梯度稀释后制作标准曲线，并根据质粒含量和拷贝数之间的换算关系计算拷贝数。根据质粒大小，100pg质粒DNA为3.13×10⁷copy。标准曲线用于定量PCR实验过程中样本中HHV-7病毒DNA的含量，且每个梯度均设置两个复孔用于平衡或计算由于其它因素导致的误差。

1.2样本和DNA的提取

实验中的阳性样本由标准品质粒稀释而成，阴性样本为不同动物来源的组织或细胞，用于特异性验证。其中人源性细胞来源于正常人脐带组织，为间充质干细胞，为分离获得并经各种无菌和病毒检测；肝脏组织样本来源于正常动物如食蟹猴、新西兰兔、SD大鼠、小鼠，从国家上海新药安全评价研究中心获得。

DNA样品使用DNeasy Blood&Tissue Kit试剂盒(Qiagen，Duesseldorf，Germany)按照标准操作程序进行提取。提取的DNA样品经Nanodrop测定浓度后于-80℃条件保存。

1.3引物/标记探针的设计

HHV-7特异性引物/标记探针设计在保守的U38基因(GI：3289496)。按照引物/标记探针设计的基本原则，如避免引物二聚体形成以及溶解温度(Tm)最好为60℃等，设计正反向引物及标记探针，并进行Nucleotide blast功能验证。所使用的上游引物序列为：tctgtcacatgtcttgggcg(SEQ ID NO:1)；下游引物序列为：caccgcgtgtcaatccaaat(SEQ IDNO:2)；荧光探针序列为：acgttgacagcgccatgtattcgga(SEQ ID NO:3)。其中探针5’端标记FAM荧光基团，3’端标记NFQ-MGB淬灭基团，扩增产物长度为109bp。本实施例中的TaqManqPCR检测均使用该引物和探针进行。

1.4TaqMan qPCR反应

反应体系包含10μL的Universal PCR Master Mix(2×，AppliedBiosystems)、1μL的HHV-7引物/探针(20×，Thermofisher)、4μL的无DNase/RNase水以及5μL的待测样本(浓度一般为100ng/5μL)。另外，在Mix液中含有的尿嘧啶糖苷酶(UDG)可以消除PCR遗留(carry-over)污染(21)。扩增反应使用ABI PRISM7500(Applied Biosystems)检测仪器，按照如下程序进行：50℃反应2min激活UDG，95℃反应10min以彻底激活DNA聚合酶，然后95℃，15sec和60℃，1min经40次循环扩增模板DNA。

PCR扩增过程中对荧光信号实时监控，并以循环阈值(Ct值)来反应待测样本中HHV-7DNA的含量(或拷贝数)。对于每一个PCR反应，用梯度稀释的质粒样品制作标准曲线，对待测样本进行精确定量。

本实施例中的TaqMan qPCR检测均使用该反应条件进行。

1.5特异性、线性和精密度及准确度验证

引物的特异性首先通过NCBI的blast功能验证其是否与其它病毒、微生物和物种具有交叉反应，然后通过TaqMan qPCR实验进一步验证其与人、食蟹猴、新西兰兔、SD大鼠和小鼠的基因组DNA是否有交叉反应。

引物的线性验证即将标准品质粒(100pg或3.13×10⁷copy)进行连续4次20倍稀释，经TaqMan qPCR反应检测后，将稀释后样品根据标准曲线进行定量，对组内和组间结果进行线性分析。

引物的精密度(CV％)及准确度(RE％)验证即将高、中、低不同拷贝数的标准品质粒由两人进行实验，每人进行2组实验，每组实验组内重复3次，经TaqMan qPCR反应检测后，将4组实验数据进行组内和组间准确度和精密度分析。

1.6数据分析

实验中所有PCR测定结果都由ABI 7500仪器完成，使用7500Software v2.4采集，并由7500Software v2.4和Microsoft Excel 2007软件进行数据处理。实验中样本的精密度(CV％)和准确度(RE％)分别按照公式：CV％＝标准偏差/平均数*100％和RE％＝(实际值-理论值)/理论值*100％计算，并进行统计学比较，以表格或图注形式呈现数值结果。

2.实验结果

2.1 HHV-7 TaqMan qPCR方法具有高度敏感性

由于HHV-7病毒的普遍流行性，精确检测患者体内HHV-7的含量是必要的。我们首先通过梯度稀释标准品质粒，质粒DNA以100pg(3.13×10⁷copy)质粒DNA为起始浓度，进行样品的梯度稀释，稀释后样品拷贝数分别为3.13×10⁶copy、3.13×10⁴copy、3.13×10²copy、3.9copy。用前述实验方法部分所述的引物、探针和TaqMan qPCR反应条件进行检测，以确定HHV-7TaqMan方法的最低检测限，其扩增曲线图如图1所示。PCR扩增结束后，各稀释样本的Ct值和初始质粒的拷贝数用于绘制标准曲线，并可以反映待测样本中的病毒含量。实验中可以检测到的标准品质粒最低稀释含量为3.9copy，在多次重复实验中可以检出的频率为100％。但由于低含量(3.9copy)的质粒检测存有变异性，因此线性度较好的标准曲线可以检测至7.8copy。

2.2 HHV-7 TaqMan qPCR方法的建立

以HHV-7特异性引物/探针、Universal PCR Master Mix(2×)和HHV-7标准品质粒DNA建立TaqMan qPCR反应体系。体系中标准曲线样本由HHV-7标准品质粒稀释而成，根据前述2.1中的定量范围检测结果，各标准浓度点的拷贝数分别为3.13×10⁷copy、3.13×10⁶copy、3.13×10⁵copy、3.13×10⁴copy、3.13×10³copy、3.13×10²copy、31.3copy、7.8copy，扩增结束后数值结果以Ct值为纵坐标(Y)，以拷贝数的对数为横坐标(X)拟合标准曲线(标准曲线线性图的横坐标仍以标准品原值标示)，并进行待测样本中HHV-7病毒DNA含量的计算。阳性对照的扩增效率为90％，表明本方法具有高效性。在实验中，以Ct值为纵坐标，以质粒拷贝数的对数为横坐标，拟合线性方程，其线性图如图2所示，拟合后的标准曲线线性回归方程为：y＝-3.379x+37.14；相关系数R²＝0.999，表明标准曲线具有很好的线性度。

2.3 HHV-7 TaqMan qPCR方法具有高精密度和准确度

根据标准曲线的定量范围，我们选择了5个不同的质粒浓度，用于检测TaqManqPCR方法中的精密度与准确度。质粒浓度从高至低分别为3.13×10⁷copy、2.5×10⁷copy、3.13×10⁴copy、15.7copy及7.8copy。扩增曲线图如图3所示。qPCR结果如表1所示，发现HHV-7引物可以稳定并准确地检测到每个浓度梯度的样本，且各浓度样本复孔间的变异度小，表明此检测方法准确可靠。

表1 HHV-7引物/探针精密度和准确度验证数值结果

2.4HHV-7TaqMan qPCR方法具有高特异性

HHV-7qPCR反应的特异性分析使用来源于正常人和不同动物的基因组DNA样本。使用无DNase/RNase水将人、食蟹猴、新西兰兔、SD大鼠和小鼠基因组DNA稀释为100ng/5μL，将标准品质粒(785copy/5μL)与上述动物来源的基因组DNA等体积混合，分别将混合质粒的样本和未混合质粒的不同动物的基因组DNA样本进行TaqMan qPCR检测，每个样本设置2个重复，扩增曲线如图4所示，发现混合标准品质粒的动物样本可以检测出HHV-7的扩增，而未混合标准品的动物(包括人、食蟹猴、新西兰兔、SD大鼠和小鼠)基因组DNA均未检测出HHV-7的表达。实验结果如表2所示，其表明HHV-7qPCR反应体系具有高特异性，不会与其它物种的基因组发生交叉反应，可以准确可靠地检测出样本中的HHV-7病毒。

表2 HHV-7引物/探针特异性验证数值结果

2.5HHV-7TaqMan qPCR方法具有较好的稀释线性

为了验证HHV-7引物/探针及本qPCR反应体系的稀释线性，我们将HHV-7标准品质粒DNA(起始3.13×10⁷copy)分别进行20倍、400倍、8000倍和160000倍的梯度稀释，进行qPCR检测，每个样本设置2个复孔，qPCR检测重复2次，扩增曲线图如图5所示，对各稀释样本数值结果分析发现：实际测得浓度与样品的稀释倍数呈良好的线性关系。

2.6HHV-7TaqMan qPCR方法能够完全区分HHV-7和其它HHV病毒

为了验证HHV-7qPCR反应区别其它HHV的特异性，我们采用本方法分别检测了HHV-6、HHV-8阳性B淋巴细胞。样本制备与实验方法1.2所描述一致。简言之，B淋巴细胞DNA样品使用DNeasy Blood&Tissue Kit试剂盒(Qiagen，Duesseldorf，Germany)按照标准操作程序进行提取。提取的DNA样品经Nanodrop测定浓度后采用如实验方法部分所述的方法进行PCR扩增，每个PCR反应样本量为100ng。实验结果如表3所示，在11份确诊HHV-6阳性但HHV-7阴性的样本中，该方法HHV-7检出例数为0；在9份确诊HHV-8阳性但HHV-7阴性的样本中，该方法HHV-7检出例数仍然为0。因此，该HHV-7TaqMan qPCR方法不会与其它HHV亚型生交叉反应，能够完全区分HHV-7和其它HHV亚型病毒感染，可以准确可靠地检测出样本中的HHV-7病毒。

表3.HHV-7引物/探针检测HHV-6和HHV-8亚型病毒样本结果

3.讨论

本发明基于HHV-7病毒高度保守的U38基因核苷酸序列，开发了一种特异性检测患者体内HHV-7病毒DNA的TaqMan qPCR方法。此方法使用HHV-7标准品质粒制作标准曲线，可以精确检测并定量组织、细胞和体液等样本中的HHV-7病毒载量。

本发明中所使用的TaqMan qPCR方法基于MGB探针技术，在扩增过程中实时监控全程的荧光强度，具有简单易用、定量范围广、特异性强和污染概率低等优点。而且由于在扩增过程中使用标准品质粒制作标准曲线，可以精确定量样本中的病毒载量。与传统PCR技术相比，TaqMan qPCR方法具有更高的敏感性(22,23,24)，在本发明的方法学验证实验中可以检测出7.8copy的HHV-7病毒DNA，且重复实验也表明此TaqMan qPCR方法检测HHV-7具有组内和组间的低变异度，即高精密度。另外，特异性较强的荧光探针引物与其它相似病毒或不同亚型的HHV病毒不会发生任何交叉反应，也使得检测方法可以精确分辨出HHV-7的病毒DNA。

HHV-7作为一种广泛存在的病毒，人群中血清阳性率在90％以上，因此不易判断感染者是否患有HHV-7病症。研究发现，初始感染HHV-7病毒后，许多组织包括肺、皮肤、肝脏、肾脏等都含有HHV-7感染后期的细胞，表明HHV-7会存在持续感染而非真正的潜伏感染(25)。而且与其他疱疹病毒相似，HHV-7病毒的激活容易发生在免疫缺陷病人(如器官移植病人)身上，并且临床症状表现不明显。在这种前提下，HHV-7往往与一些巨细胞病毒(CMV)疾病、肺炎、脑膜炎或脑炎等疾病相关(26)。考虑到HHV-7初次感染的表现，一些实验室进行了HHV-7在皮肤病(27)、淋巴组织增生性疾病(28)中作用的研究。然而，由于这些研究使用了定性方法，无法获得病毒载量的数据，使得实验结果不具有可靠性。

定量检测HHV-7病毒DNA的方法是阐明HHV-7在流行病学和临床中作用的可靠工具，本发明的HHV-7病毒检测技术可以在1.5h内高效地检出患者体内HHV-7病毒载量，为HHV-7病毒的预防和临床诊断提供了准确数据。

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Claims

1.特异性检测HHV-7病毒DNA的引物对，所述引物对包括正向引物5’-tctgtcacatgtcttgggcg-3’(SEQ ID NO:1)和反向引物5’-caccgcgtgtcaatccaaat-3’(SEQID NO:2)。

2.特异性检测HHV-7病毒DNA的引物和探针组合，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中正向引物是5’-tctgtcacatgtcttgggcg-3’(SEQ ID NO:1)，所述反向引物是5’-caccgcgtgtcaatccaaat-3’(SEQ ID NO:2)；所述探针的序列为5’-acgttgacagcgccatgtattcgga-3’(SEQ ID NO:3)，该探针的5’端标记报告荧光基团，3’端标记淬灭基团。

3.根据权利要求2的引物和探针组合，其中所述荧光探针的5’端标记的报告荧光基团为FAM，3’端标记的淬灭基团为NFQ-MGB或TAMRA。

4.根据权利要求1的引物对或根据权利要求2或3的引物和探针组合在检测样本中HHV-7病毒DNA中的应用。

5.根据权利要求1的引物对或根据权利要求2或3的引物和探针组合在制备用于检测样本中HHV-7病毒DNA的试剂中的应用。

6.根据权利要求4或5的应用，其中所述检测是qPCR检测或数字PCR检测。

7.特异性检测HHV-7病毒DNA的试剂盒，该试剂盒包括根据权利要求1的引物对，或包括根据权利要求2或3的引物和探针组合。

8.根据权利要求7的试剂盒，所述试剂盒还包括选自qPCR反应液、水、HHV-7病毒DNA标准品、对照品中的任意一种或更多种试剂。

9.检测样本中HHV-7病毒DNA的方法，包括使用根据权利要求1的引物对，或使用根据权利要求2或3的引物和探针组合，对样本DNA进行qPCR检测，根据qPCR检测结果定性检测或定量检测样本中是否存在HHV-7病毒DNA。

10.检测样本中HHV-7病毒DNA的方法，包括以下步骤：

(1)提取样本DNA；

(2)使用根据权利要求1的引物对，或使用根据权利要求2或3的引物和探针组合，对HHV-7病毒DNA标准品和样本DNA进行qPCR检测，其中HHV-7病毒DNA标准品是用含有HHV-7病毒DNA片段的质粒DNA配制的不同给定浓度的样品；

(4)结果判定：如果样本DNA的qPCR结果中出现明显的扩增曲线；且样本DNA的qPCR的Ct值小于浓度最低点的Ct值，则为阳性结果，即样本中存在HHV-7病毒DNA；如果无明显扩增曲线，则为阴性结果，即样本中不存在HHV-7病毒DNA；若有明显扩增曲线，但Ct值大于标准曲线浓度最低点的Ct值，则增加样本DNA含量并重复上述步骤，再进行结果判定。

11.根据权利要求10的方法，其中步骤(4)进一步包括：根据样本DNA的Ct值和拟合的标准曲线，确定样本DNA中HHV-7病毒DNA的浓度。

12.检测样本中HHV-7病毒DNA的方法，包括以下步骤：

(1)提取样本DNA；

(4)结果判定：根据样本DNA的Ct值和拟合的标准曲线，确定样本DNA中HHV-7病毒DNA的浓度。

13.根据权利要求10-12任一项的方法，其中HHV-7病毒DNA标准品是用含有HHV-7病毒DNA片段的质粒配制的不同给定浓度的样品。

14.根据权利要求13的方法，其中所述HHV-7病毒DNA片段是HHV-7U38基因中200bp的DNA片段的质粒DNA，该200bp的DNA片段为GenbankGI号3289496的序列中核苷酸位置2031-2230的片段。