CN107362361B - 一种与喉鳞癌相关的生物标志物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与喉鳞癌相关的生物标志物，所述生物标志物为KLHDC7B。本发明通过实验证明，KLHDC7B在喉鳞癌患者中表达上调，通过沉默KLHDC7B基因，可以抑制喉鳞癌细胞的增殖和侵袭，说明KLHDC7B可作为诊断和/或治疗靶标应用于临床喉鳞癌的诊疗中。

Description

一种与喉鳞癌相关的生物标志物

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种与喉鳞癌相关的生物标志物，具体的所述生物标志物为KLHDC7B。

背景技术

喉鳞状细胞癌(简称喉鳞癌，laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)是耳鼻咽喉科最常见的恶性肿瘤之一，占耳鼻咽喉恶性肿瘤的7.9％-35％，占全身恶性肿瘤的5.7％-7.6％，随着空气污染的加重和吸烟等多种致癌因素暴露的增加，发病率呈现上升趋势。我国的喉癌发病率有地区差异性，以东北地区最高，约为1.5～3.4万/10万人。喉部恶性肿瘤中约90％为鳞状细胞癌。目前，喉鳞癌仍采取以手术为主，放化疗为辅的综合治疗模式。近年来尽管出现了肿瘤生物治疗等新的治疗手段，但喉鳞癌患者的五年生存率仍没有明显提高，因此，喉鳞癌的早期诊断及治疗是改善患者预后的关键。

肿瘤的形成与进展与基因重组、基因突变、基因修饰及基因的表达调控密切相关，是遗传因素和环境因素共同作用的结果。表观遗传学改变在个体发育和细胞增殖过程中能稳定传递，但多数表观遗传改变是可逆的，这就为疾病的治疗提供了乐观的前景。随着生物学技术的发展，人们对喉鳞癌在基因水平有了全新的认识，但是其发病机制有待进一步研究。寻找喉鳞癌新的有效的分子生物标志物和信号通路，进一步阐明喉鳞癌的发生发展机制，对实现喉鳞癌的个体化精准治疗具有重要的意义。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与喉鳞癌发生发展相关的生物标志物。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种KLHDC7B基因的用途，用于制备预防或治疗喉鳞癌的药物组合物。

进一步，所述药物组合物包括KLHDC7B功能性表达的抑制剂。所述抑制剂选自：以KLHDC7B或其转录本为靶序列、且能够抑制KLHDC7B基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物；或特异性与KLHDC7B编码的蛋白结合的结合分子(如能够抑制KLHDC7B蛋白活性的抗体或配体)。

进一步，所述的抑制剂为siRNA。

进一步，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。

本发明提供了一种用于预防或治疗喉鳞癌的药物组合物，所述药物组合物包括KLHDC7B功能性表达的抑制剂，和

药学上可接受的载体。

进一步，所述抑制剂选自：

核酸抑制物，蛋白抑制剂，蛋白水解酶，蛋白结合分子，其能够在蛋白或基因水平上下调KLHDC7B基因或其编码的蛋白的表达或活性。

在本发明中，所述KLHDC7B的抑制剂还可用于抑制喉鳞癌细胞的侵袭和增殖。

本发明提供了一种KLHDC7B基因的用途，用于筛选预防或治疗喉鳞癌的候选化合物。

进一步，筛选预防或治疗喉鳞癌的候选化合物的步骤包括：

测试组中，在细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察所述测试组的细胞中KLHDC7B的表达量和/或活性；在对照组中，在相同细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察对照组的所述细胞中KLHDC7B的表达量和/或活性；

其中，如果测试组中细胞的KLHDC7B的表达量和/或活性低于对照组，就表明该测试化合物是对KLHDC7B的表达和/或活性有抑制作用的治疗癌症的候选化合物。

在本发明中，所述的步骤还包括：对获得的候选化合物进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选化合物中进一步选择和确定对于预防、缓解或治疗喉鳞癌有用的物质。

在本发明中，筛选预防或治疗喉鳞癌的候选化合物的体系不限于细胞体系，还包括细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系等，所述体系不局限于上述形式，只要所述体系可以检测测试化合物可以降低KLHDC7B的表达和/活性即可。

所述候选化合物包括但不限于：针对KLHDC7B基因或其编码的蛋白或其上游或下游基因或蛋白设计的干扰分子、核酸抑制物、结合分子(如抗体或配体)、小分子化合物等。

本发明提供了一种检测KLHDC7B基因表达水平的试剂在制备诊断喉鳞癌的产品中的应用。所述产品包括(但不限于)芯片、制剂或试剂盒。

进一步，所述试剂选自：

特异性识别KLHDC7B的探针；或

特异性扩增KLHDC7B的引物；或

特异性结合KLHDC7B编码的蛋白的抗体或配体。

在本发明中，可以采用任何方法检测KLHDC7B的表达水平。

在本发明的具体实施方式中，所述的特异性扩增KLHDC7B基因的引物是引物对，序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

附图说明

图1是利用QPCR检测KLHDC7B基因在喉鳞癌组织中的表达情况图；

图2是利用western blot检测KLHDC7B蛋白在喉鳞癌组织中的表达情况图；

图3是利用QPCR检测siRNA转染对喉鳞癌细胞中KLHDC7B基因表达的影响图；

图4是利用western blot检测siRNA转染对喉鳞癌细胞中KLHDC7B蛋白表达的影响图；

图5是用MTT法检测KLHDC7B基因对喉鳞癌细胞增殖的影响图；

图6是用流式细胞仪检测KLHDC7B基因对喉鳞癌细胞凋亡的影响图；

图7是利用细胞划痕实验检测KLHDC7B对喉鳞癌细胞迁移的影响图；

图8是利用Transwell小室检测KLHDC7B对喉鳞癌细胞侵袭的影响图。

具体的实施方式

本发明经过广泛而深入的研究，通过高通量方法，采用目前覆盖数据库最广的基因芯片，检测喉鳞癌标本中基因在肿瘤组织和癌旁组织的表达，发现其中具有明显表达差异的基因片段，探讨其与喉鳞癌的发生之间的关系，从而为喉鳞癌的早期检测及靶向治疗寻找更好的途径和方法。通过筛选，本发明首次发现了喉鳞癌中KLHDC7B显著性上调。实验证明，通过降低KLHDC7B的表达水平，能够有效地抑制喉鳞癌细胞的生长和侵袭，提示检测KLHDC7B基因的表达水平可成为喉鳞癌早期诊断的辅助诊断指标之一，干扰KLHDC7B基因表达可成为预防或治疗喉鳞癌或喉鳞癌转移的新途径。

标志物

标志物(单独使用或与其他定性术语组合例如喉鳞癌标志物、喉鳞癌特异性标志物、对照标志物、外源标志物、内源标志物)指可测量、可计算或可以其他方式获得的，与任何分子或分子组合相关，可用作生物和/或化学状态的指示物的参数。在本发明中，“标志物”指与一个或多个生物分子相关的参数(即“生物标志物”)例如天然或人工合成产生的核酸(即个体基因，以及编码和非编码DNA和RNA)和蛋白(例如肽、多肽)。本发明中的“标志物”还包括指可通过考虑来自两个或多个不同标志物的表达数据计算或以其他方式获得的单个参数。

喉鳞癌标志物指可以用作(单独或与其他标志物组合)受试者中喉鳞癌指示物的特定类型的标志物，在本发明的具体实施方式中，喉鳞癌标志物可用于提供(单独或与其他标志物组合)受试者中喉鳞癌临床评估的标志物。

“内源标志物”指源自与待分析样品相同的受试者的标志物(例如核酸或多肽)。更具体地，“内源对照标志物”指可用作对照标志物(单独或与其他对照标志物组合)，与待分析样品源自相同受试者的标志物。在一个实施方案中，内源对照标志物可包括一个或多个内源基因(即“对照基因”或“参比基因”)，其表达相对稳定，例如在喉鳞癌与非喉鳞癌样品中，和/或在受试者之间。

“外源标志物”指源自与待分析样品不同的受试者的标志物(例如核酸或多肽)。更具体地，“外源对照标志物”指可用作对照标志物(单独或与其他对照标志物组合)，未源自与待分析样品相同的受试者的标志物。在本发明中，一方面该外源标志物或外源对照标志物看从不同的受试者分离，或可合成地生产，可添加至待分析的样品。另一方面，该外源对照标志物可以是添加或加标至待分析样品中用作内部阳性或阴性对照物的分子。外源对照标志物可与一个或多个喉鳞癌标志物的检测共同使用以区分“真阴性”结果(例如非喉鳞癌诊断)和“假阴性”或“不提供信息的”结果(例如由于扩增反应的问题)。

“对照标志物”或“参比标志物”指用于(单独或与其他对照标志物组合)对照可能的干扰因素和/或提供关于样品质量、有效样品制备和/或适当的反应组合/进行(例如RT-PCR反应)的一个或更多指标的具体类型的标志物。在一些实施方案中，对照标志物可以是如本文中所述的内源对照标志物、外源对照标志物和/或喉鳞癌特异性对照标志物。对照标志物可与本发明的喉鳞癌标志物共检测或分别检测。对照标志物可以是一个或多个内源基因，例如管家基因或喉鳞癌特异性对照标志物或基因的组合。

KLHDC7B基因

KLHDC7B是位于人22号染色体长臂1区3带上，本发明中的KLHDC7B包括野生型、突变型或其片段。一种代表性的KLHDC7B基因具有数据库GeneBank中NM_138433所表示的核苷酸序列或氨基酸序列。

本发明的人KLHDC7B核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

本领域技术人员将认识到，本发明的实用性并不局限于对本发明的靶标基因的任何特定变体的基因表达进行定量。如果当核酸或其片段与其它核酸(或其互补链)最佳比对时(具有适当的核苷酸插入或缺失)，在至少大约60％的核苷酸碱基、通常至少大约70％、更通常至少大约80％、优选至少大约90％、及更优选至少大约95-98％核苷酸碱基中存在核苷酸序列相同性，则这两个序列是“基本同源的”(或者基本相似的)。

或者，当核酸或其片段与另一核酸(或其互补链)、一条链或其互补序列在选择性杂交条件下杂交时，则其间存在基本同源或(相同性)。当杂交比特异性整体丧失发生更具选择性时，存在杂交选择性。典型地，当在至少大约14个核苷酸的一段序列存在至少大约55％相同性、优选至少大约65％、更优选至少大约75％及最优选至少大约90％相同性时，发生选择性杂交。如本文所述，同源对比的长度可以是较长的序列节段，在某些实施方案中通常为至少大约20个核苷酸，更通常为至少大约24个核苷酸，典型为至少大约28个核苷酸，更典型为至少大约32个核苷酸，及优选至少大约36或更多个核苷酸。

抑制剂和药物组合物

基于本发明人的发现，本发明提供了一种KLHDC7B的抑制剂的用途，用于制备抑制喉鳞癌的药物组合物。如本文所用，所述的KLHDC7B的抑制剂包括但不限于抑制剂、拮抗剂、阻滞剂、阻断剂、核酸抑制物等。

所述的KLHDC7B基因或蛋白的抑制剂是指任何可降低KLHDC7B蛋白的活性、降低KLHDC7B基因或蛋白的稳定性、下调KLHDC7B蛋白的表达、减少KLHDC7B蛋白有效作用时间、或抑制KLHDC7B基因的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调KLHDC7B有用的物质，从而可用于预防或治疗喉鳞癌。例如，所述的抑制剂是：核酸抑制物，蛋白抑制剂，抗体，配体，蛋白水解酶，蛋白结合分子，只要其能够在蛋白或基因水平上下调KLHDC7B蛋白或其编码基因的表达。

作为本发明的一种选择方式，所述的KLHDC7B的抑制剂是一种特异性与KLHDC7B结合的抗体。所述的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。可用KLHDC7B蛋白免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等来生产多克隆抗体；多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。与之相似的，表达KLHDC7B或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。所述的抗体也可以是单克隆抗体，此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。抗体的“特异性”是指抗体能结合于KLHDC7B基因产物或片段。较佳地，指那些能与KLHDC7B基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)²片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。抗KLHDC7B蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的KLHDC7B蛋白含量，还可以作为用于预防肝癌转移和侵袭的特异性治疗剂。血样或尿液中的KLHDC7B蛋白的直接测定可以作为肿瘤的辅助诊断和愈后的观察指标，也可作为肿瘤早期诊断的依据。抗体可以通过ELISA、Western Blot印迹分析，或者与检测基团偶联，通过化学发光、同位素示踪等方法来检测。

作为本发明的一种优选方式，所述KLHDC7B的抑制剂是一种KLHDC7B特异性的小干扰RNA分子。如本文所用，所述的“小干扰RNA”是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰(RNA interference)过程。小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链RNA复合物。

在筛选有效的siRNA序列时，本发明人通过大量的比对分析，从而找出最佳的有效片段。本发明人设计合成了多种siRNA序列，并将它们分别通过转染试剂转染喉鳞癌细胞系进行验证，选出干扰效果最佳的siRNA，它们分别具有SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的序列，进一步地在细胞水平实验，结果证明对于细胞试验而言抑制效率非常高。

作为本发明的一种可选方式，所述的KLHDC7B的抑制剂也可以是一种“小发夹RNA(Small hairpin RNA，shRNA)”，其是能够形成发夹结构的非编码小RNA分子，小发夹RNA能够通过RNA干扰途径来抑制基因的表达。如上述，shRNA可以由双链DNA模板来表达。双链DNA模板被插进一个载体，例如质粒或病毒载体，然后在体外或体内连接到一个启动子进行表达。shRNA在真核细胞内DICER酶的作用下，可被切割成小干扰RNA分子，从而进入RNAi途径。“shRNA表达载体”是指一些本领域常规用于构建shRNA结构的质粒，通常该质粒上存在“间隔序列”以及位于“间隔序列”两边的多克隆位点或供替换序列，从而人们可以将shRNA(或类似物)相应的DNA序列通过正向和反向的方式插入多克隆位点或替换其上的供替换序列，该DNA序列转录后的RNA可形成shRNA(Short Hairpin)结构。所述的“shRNA表达载体”目前已经完全可以通过商购的途径购买获得，例如一些病毒载体。

本发明的核酸抑制物如siRNA可以化学合成，也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成单链RNA之后进行制备。siRNA等核酸抑制物，可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。

药物组合物

本发明还提供了一种药物组合物，它含有有效量的所述的KLHDC7B的抑制剂，以及药学上可接受的载体。所述的组合物可用于抑制喉鳞癌。任何前述的KLHDC7B的抑制剂均可用于组合物的制备。

如本文所用，所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。抑制剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的KLHDC7B基因的抑制剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。

所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞(宿主细胞)转染试剂。

本发明可以采用用本领域熟知的多种方法来将所述的抑制剂或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物。包括但不限于：皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予等；优选的，所述给药方式是非肠道给予的。

优选的，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将KLHDC7B的抑制剂通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带KLHDC7B的抑制剂的表达单位(比如表达载体或病毒等，或siRNA或shRNA)递送到靶点上，并使之表达活性的KLHDC7B抑制剂，具体情况需视所述的抑制剂的类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。

术语“宿主细胞”可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、或293细胞的动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

本发明中的药物组合物包括KLHDC7B的抑制剂、和/或与所述抑制剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

本发明的药物组合物还可与其他治疗喉鳞癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。

本发明的药物组合物还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要成分的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。在治疗过程中，可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本发明药物组合物的剂量。

药物筛选

本发明提供了一种筛选预防或治疗喉鳞癌药物的方法，即：

在实验组中，向细胞培养体系中加入待测化合物，并测定KLHDC7B的表达水平；在对照组中，向同样的培养体系中不加入待测化合物，并测定KLHDC7B的表达水平；其中，如果实验组中KLHDC7B的表达水平大于对照组，则说明该候选化合物为KLHDC7B的抑制剂。

在本发明中，所述的方法还包括：对上面步骤获得的候选化合物进一步测试其抑制喉鳞癌的效果，若测试化合物对喉鳞癌有显著的抑制效果，则说明该化合物为预防或治疗喉鳞癌的潜在物质。

检测方法

本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。本领域已知的定量样品中RNA表达的示例性方法包括但不限于Southern印迹、Northern印迹、微阵列、聚合酶链式反应(PCR)、NASBA和TMA。

在本发明中，术语“上调”或“过表达”指在癌组织(例如在喉鳞癌组织)中以相对于其他相应的组织中的水平高的表达(例如RNA和/或蛋白表达)基因。在癌中上调的基因以比其他相应的组织(例如正常或非癌性喉组织)中的表达水平高至少10％，优选地至少25％，更优选地至少50％，更优选地至少100％，更优选地至少200％，最优选地至少300％的水平表达。

芯片、试剂盒

本发明的所述的基因芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于KLHDC7B所示的部分或全部序列。

具体地，可根据本发明所述的基因，设计出适合的探针，固定在固相载体上，形成“寡核苷酸阵列”。所述的“寡核苷酸阵列”是指具有可寻址位置(即以区别性的，可访问的地址为特征的位置)的阵列，每个可寻址位置均含有一个与其相连的特征性寡核苷酸。根据需要，可将寡核苷酸阵列分成多个亚阵。

“探针”意欲包括在促进杂交的条件下与核酸或其补体中的靶标序列特异性杂交，从而允许检测靶标序列或其扩增的核酸的核酸寡聚体或适体。检测可以是直接(即由直接与靶标或扩增的序列杂交的探针产生)或间接(即由与连接探针和靶标或扩增的序列的中间分子结构杂交的探针产生)的。探针的“靶标”通常指扩增的核酸序列中与至少部分探针序列通过标准氢键或“碱基配对”特异性杂交的序列。“充分地互补”的序列允许探针序列与靶标序列稳定杂交，即使该两个序列不完全互补。探针可被标记或不标记。探针可通过具体DNA序列的分子克隆生产，也可被合成。本发明所属领域的技术人员可容易地确定可在本发明的背景下设计和使用的多种引物和探针。

“杂交”或“核酸杂交”或“杂交”通常指两个具有互补碱基序列，在适当条件下将形成热力学上稳定的双链结构的单链核酸分子的杂交。如本文所用的术语“杂交”可指在严格或非严格条件下的杂交。条件的设置在本领域技术人员的技术范围内，可根据本领域中说明的实验方案确定。术语“杂交序列”优选地指显示至少40％，优选地至少50％，更优选地至少60％，更优选地至少70％，特别优选地至少80％，更特别优选地至少90％，更特别优选地至少95％，和最优选地至少97％同一性的序列同一性的序列。。在杂交到硝化纤维素滤器(或其他此类支撑物例如尼龙)的情况下，例如众所周知的Southern印迹过程，硝化纤维素滤器可在代表所需严格度条件(高严格度60-65℃，中等严格度50-60℃，低严格度40-45℃)的温度下用溶于含高盐(6×SSC或5×SSPE)、5×Denhardt溶液、0.5％SDS和100μg/ml变性载体DNA(例如鲑鱼精子DNA)温育过夜的溶液中的经标记的探针。非特异性结合的探针可通过在0.2×SSC/0.1％SDS中在根据所需严格度选择的温度：室温(低严格度)、42℃(中严格度)或65℃(高严格度)下洗涤数次从滤器上洗脱。也可调整洗涤溶液的盐和SDS浓度以适应所需严格度。所选的温度和盐浓度基于DNA杂交物的熔化温度(Tm)。当然，RNA-DNA杂交物也可形成并被检测。在此类情况下，杂交和洗涤的条件可由本领域技术人员根据众所周知的方法改变。优选地使用严格条件。如本领域所熟知，也可使用利用了不同退火和洗涤溶液的其他实验方案或市售可得的杂交试剂盒(例如来自BD Biosciences Clonetech的ExpressHybTM)。众所周知，探针的长度和要确定的核酸的组成决定杂交条件的其他参数。值得注意的是，通过用于抑制杂交实验中背景的备选封闭试剂的加入和/或取代可实现上述条件的变型。常见的封闭试剂包括Denhardt试剂、BLOTTO、肝素、变性鲑鱼精子DNA和市售可得的专有制剂。由于相容性问题，加入具体封闭试剂可能需要修改上述杂交条件。杂交核酸分子也包括上述分子的片段。此外，与上述核酸分子的任何一个杂交的核酸分子也包括这些分子的互补片段、衍生物和等位基因变体。此外，杂交复合物指两个核酸序列之间依靠互补的G和C碱基之间和互补的A和T碱基之间形成氢键的复合物；这些氢键可通过碱基堆叠相互作用进一步稳定。两个互补核酸序列以反向平行的构型形成氢键。杂交复合物可在溶液(例如Cot或Rot分析)中，或在一个存在于溶液中的核酸序列和另一个固定于固体支撑物(例如，已经例如固定了细胞的膜、滤器、芯片、针脚或载玻片)上的核酸序列之间形成。

术语“互补的”或“互补”指多核苷酸在容许的盐和温度条件下通过碱基配对天然结合。例如，序列“A-G-T”与互补序列“T-C-A”结合。两个单链分子之间的互补可以是“部分的”，其中只有某些核苷酸结合，或者如果两个单链分子之间存在完全互补，互补可以是完全的。核酸链之间的互补程度对核酸链之间的杂交效率和强度有显著的影响。这在依赖核酸链之间结合的扩增反应中特别重要。所谓“充分地互补”表示能与另一序列通过在一系列互补碱基之间形成氢键而杂交的连续的核酸序列。互补碱基序列可通过使用标准碱基配对(例如G：C、A：T或A：U配对)在序列中的每个位点互补，或可含一个或多个不使用标准碱基配对互补，但允许整个序列与另一碱基序列在适当杂交条件下特异性杂交的残基(包括非碱性残基)。寡聚体的连续碱基优选地与该寡聚体特异性杂交的序列至少约80％(81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％)，更优选地至少约90％互补。

本发明中所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如包括但不限于塑料制品、微颗粒、膜载体等。所述塑料制品可通过非共价或物理吸附机制与抗体或蛋白抗原相结合，最常用的塑料制品为聚苯乙烯制成的小试管、小珠和微量反应板；所述微颗粒是由高分子单体聚合成的微球或颗粒，其直径多为微米，由于带有能与蛋白质结合的功能团，易与抗体(抗原)形成化学偶联，结合容量大；所述膜载体包括硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜及尼龙膜等微孔滤膜。

所述的KLHDC7B芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的基因芯片。

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测KLHDC7B基因或蛋白的表达。优选的，所述的制剂或试剂盒中还含有用于标记RNA样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取RNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。此外，所述的试剂盒中还包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。

试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。

本发明中，术语“样本”以其最广泛的含义使用。意欲包括任何源自活或死亡的人的组织或材料，其可包括本发明的标志物。在本发明的具体实施例中，样品可以是肿瘤或肺肿瘤组织，并且可包括例如含有来自其的与喉组织相关的细胞或标志物的任何组织或材料。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 筛选与喉鳞癌相关的基因标志物

1、样品收集

各收集6例喉鳞癌组织及对应的正常黏膜组织样本，组织样本的取得获得患者的知情同意，并且取得均通过组织伦理委员会的同意。

2、RNA样品的制备

1)加入液氮研磨组织至粉末，加入1ml TRIzol(Invitrogen)溶液，吹打混匀，使组织充分裂解，静置5min；

2)12000rpm 4℃离心5min，将上清液转移至1.5ml RNase free EP管中；

3)加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置15min；

4)4℃环境中12000g离15min，溶液离心为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管；

5)加入0.5ml异丙醇，轻柔充分混匀，室温静置10min；

6)4℃下，12000g离心10min，加入与RNAiso Plus等体积的75％乙醇沉淀RNA，7500g 4℃离心5min，去上清；

7)用75％乙醇洗涤两次，超净台风干；加入30μl DEPC水溶解沉淀。

8)RNA样品的质量分析

利用Nanodrop2000对所提取的RNA浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。浓度≥200ng/μl，OD260/280介于1.8～2.2之间。

3、去除rRNA

使用Ribo-Zero试剂盒除去总RNA中的核糖体RNA。

4、构建cDNA文库

利用利用Illumina的Truseq RNA sample Prep Kit进行cDNA文库的构建，具体操作按说明书进行。

5、上机测序

使用Hiseq4000测序平台对cDNA文库进行测序，具体操作按说明书进行。

6、高通量转录组测序数据分析

对测序结果进行生物信息学分析，利用TopHat v1.3.1进行RNA-seq读段定位，通过Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度，利用cuffdiff检测差异表达，当p值<0.001，|log2(Fold_change)normalized|>2时，认为mRNA显著差异表达。

7、结果

RNA-seq结果显示，在喉鳞癌患者中差异表达的基因有665个，上调的450个，下调的215个，其中基因KLHDC7B在喉鳞癌组织中的表达量显著高于正常癌旁黏膜组织中的表达量。

实施例2 QPCR测序验证KLHDC7B基因的差异表达

1、对KLHDC7B基因差异表达进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择喉鳞癌患者正常癌旁粘膜组织和喉鳞癌组织各50例。

2、RNA提取具体步骤如实施例1所述。

3、逆转录

3、逆转录：采用FastQuant cDNA第一链合成试剂盒(货号：KR106)进行mRNA反转录。具体步骤如下：

(1)加入5×gDNA Buffer 2.0μl，总RNA 1μg，加Rnase Free ddH₂O使总体积至10μl，水浴锅中42℃加热3min；

(2)构建20μl反应体系，10×Fast RT Buffer 2.0μL，RT Enzyme Mix 1.0μl，FQ-RT Primer Mix 2.0μl，RNase Free ddH₂O 5.0μl混合后加入(1)中的混合液中混匀；

(3)水浴锅中42℃加热15min，95℃加热3min，-20℃储存备用。

4、QPCR扩增

(1)引物设计

根据Genebank中KLHDC7B基因和管家基因GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由博迈德公司合成。其中扩增KLHDC7B基因的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示；扩增GAPDH基因的引物序列如SEQ ID NO.3～4所示。

(2)PCR反应体系：正向引物和反向引物各0.6μl，2×SuperReal PreMix Plus10μl，DNA模板2μl，ddH₂O 7.4μl，50×ROX Reference Dye^△2μl，灭菌蒸馏水4.8μl。

(3)PCR反应条件：95℃15min，(95℃10s，55℃30s，72℃32s)×40个循环，95℃15s，60℃60s，95℃15s。在ABI 7300型荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

5、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，癌与癌旁组织的配对比较采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

6、结果

结果如图1所示，与喉鳞癌癌旁组织相比，KLHDC7B在喉鳞癌组织中表达上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同高通量测序结果一致。

实施例3 蛋白免疫印记实验检测KLHDC7B蛋白的差异表达

1、组织总蛋白的提取

用剪刀剪碎组织后将其放入置于冰内的玻璃匀浆器内，RIPA裂解液和PMSF以100:1的比例混匀，按照每20mg组织标本加入100μl裂解液的比例加入相应量的RIPA裂解液，玻璃匀浆器碾碎组织直至其充分裂解，将裂解后的液体吸至EP管中，4℃下14000rpm离心5min，收集上清。

2、总蛋白浓度测定

按照BCA蛋白浓度测定试剂盒的说明书进行蛋白浓度的测定。

3、SDS-PAGE电泳

按照SDS-PAGE凝胶配制试剂盒的说明书配制8％的分离胶和5％的浓缩胶并进行电泳。

4、western检测

1)电转移

将PVDF膜放入甲醇溶液中激活5min，放入转膜缓冲液中平衡20min。取出PAGE胶放入转膜缓冲液中，切下相应的PAGE胶，按照由下到上依次为滤纸、PVDF膜、PAGE胶、滤纸的顺序放到半干转膜仪中，恒压25V转膜1.5h；

2)免疫杂交

取出PVDF膜，PBS冲洗后置于5％BSA溶液中室温下摇动封闭2h，将PVDF膜放入杂交袋中，加入一抗过夜，用TBST缓冲液洗涤PVDF膜，再加入相应的二抗，室温下孵育2h，TBST缓冲液洗涤。

3)DAB显色

PVDF膜稍干后滴加新鲜配制的DAB显色液，PVDF膜显色后扫描记录。以β-actin作为内参照，采用Quantity One凝胶成像分析系统对条带进行半定量灰度分析，实验重复3次，结果取平均灰度值；

5、统计学分析

采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示的，采用繁多样本均数的方差检验(ANOVA)进行分析，认为当P<0.05时具有统计学意义。

6、结果

结果如图2所示，KLHDC7B蛋白在喉鳞癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织。

实施例4 KLHDC7B基因的沉默

1、细胞培养

人喉鳞癌细胞株Hep2，以含10％胎牛血清和1％P/S的RPMI1640培养基在37℃、5％CO₂、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，细胞生长良好，呈单层贴壁生长。使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。

2、转染

1)转染前细胞的处理

转染前一天，6孔培养板上种3～5×10⁵个细胞/孔，在无抗生素培养基中培养一天，转染时细胞密度为30～50％，于转染前换成无血清培养基。

2)siRNA的设计

阴性对照siRNA序列(siRNA-NC)如SEQ ID NO.5～6所示；siRNA1的序列如SEQ IDNO.7～8所示；siRNA2的序列如SEQ ID NO.9～10所示；siRNA3的序列如SEQ ID NO.11～12所示。

将实验分为三组：对照组(Hep2)、阴性对照组(siRNA-NC)和实验组(siRNA1、siRNA2、siRNA3)，其中阴性对照组siRNA与KLHDC7B基因的序列无同源性。

3)转染

a.取浓度为50pmol的siRNA 3μl加入47μl的无血清培养基，轻轻混匀，室温孵育5min；

b.取1μl Lipofectamine 2000加入49μl无血清培养基。轻轻混匀，室温孵育5min；

c.将上述两种混合物混合(总体积100μl)，轻轻混匀，室温下孵育25min，以使复合体形成；

d.在6孔板中每孔加入100μl的复合物及适量培养基，轻轻混匀；

e.孵育48～96h后观察基因的沉默效应。

5、QPCR检测KLHDC7B基因的转录水平

5.1细胞总RNA的提取

采用Qiagen的细胞RNA提取试剂盒对细胞中的RNA进行提取，实验操作按照说明书进行。

5.2逆转录步骤同实施例2。

5.3QPCR扩增步骤同实施例2。

6、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，KLHDC7B基因实验组与对照组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

7、结果

结果如图3显示，与非转染组与转染siRNA-NC组相比，实验组中的KLHDC7B的表达水平降低，其中siRNA1的沉默效率最高，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例5 Western blot检测转染siRNA对KLHDC7B蛋白表达的影响

1、细胞培养和转染

步骤同实施例4

2、细胞总蛋白的提取

收集处于对数期的不同处理组的细胞，用预冷的PBS洗涤细胞。将RIPA细胞裂解液和PMSF以100:1的比例混匀，向细胞中加入上述裂解液150μl，冰上放置30min，使用细胞刮刀将裂解的细胞刮下来，使用移液器将裂解后的液体吸至EP管中，4℃下14000rpm离心5min。小心收集离心后的上清。

3、总蛋白浓度测定

按照BCA蛋白浓度测定试剂盒的说明书进行蛋白浓度的测定。

4、SDS-PAGE电泳

按照SDS-PAGE凝胶配制试剂盒的说明书配制8％的分离胶和5％的浓缩胶并进行电泳。

5、western检测

步骤详见实施例3。

6、统计学分析

采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示的，采用繁多样本均数的方差检验(ANOVA)进行分析，认为当P<0.05时具有统计学意义。

7、结果

结果如图4所示，相比对照组，转染siRNA1组的细胞中的KLHDC7B蛋白表达量显著下调。

实施例6 KLHDC7B基因对喉鳞癌细胞增殖的影响

采用MTT实验检测KLHDC7B基因对喉鳞癌细胞增殖能力影响。

1、取生长状况良好的细胞，常规消化成单细胞悬液后，计数细胞，将细胞稀释成合适浓度的细胞悬液；

2、于96孔培养板中，将稀释后的不同处理组细胞每孔接种2000细胞，至少设3个平行孔，37℃、5％CO₂培养24h；

3、于接种后1、2、3、4、5天每天取出3孔细胞以MTT法检测其490nm的OD值，进行计数，计算平均值；

4、检测前弃去上清液，培养液洗3次，每孔加入MTT无血清培养基溶液(0.2mg/ml)100μl，37℃培养箱中继续培养4h；

5、终止培养，小心吸弃上清液，每孔加入150μl DMSO，震荡10min，使结晶物充分溶解，在酶标仪上用波长为490nm测定光密度(OD)值，以时间为横轴，光密度值为纵轴绘制细胞生长曲线。

6、统计学分析

实验都是按照重复3次来完成的，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

7、结果

结果如图5所示，与对照相比，实验组在转染siRNA1后，细胞的增殖明显受到了抑制，差异具有统计学意义(P<0.05)说明KLHDC7B具有促进细胞增殖的作用。

实施例7 KLHDC7B基因对喉鳞癌细胞凋亡的影响

使用流式细胞仪检测KLHDC7B基因对细胞凋亡的影响。

1、细胞培养 步骤同实施例3。

2、细胞转染 步骤同实施例3。

3、步骤

1)将处于对数生长期的不同处理组的细胞经胰酶消化后吹打成细胞悬液并计数。取10⁶量的细胞悬液，1000rpm离心5min；

2)弃上清，加入195μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞；

3)加入5μl的Annexin V-FITC，轻柔混匀，室温下避光孵育10min；

4)1000rpm离心5min，弃上清，加入190μl的Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞；

5)加入10μl碘化丙啶(PI)染色液，轻柔混匀，冰浴避光放置，进行流式细胞仪检测细胞凋亡情况，所有实验均重复3次，结果取平均值。

4、统计学方法

采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示的，采用繁多样本均数的方差检验(ANOVA)进行分析，认为当P<0.05时具有统计学意义。

5、结果：

结果如图6所示，实验组与对照组相比，细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，该结果说明，KLHDC7B的过表达抑制喉鳞癌细胞的凋亡。

实施例8 细胞划痕实验

1、向6孔板中每孔加入1ml 50μg/ml的纤连蛋白，并置于4℃冰箱中过夜；

2、弃去剩余的纤连蛋白溶液，用无血清培养基清洗，将处于对数生长期的不同处理组细胞经胰酶消化重悬后，接种于铺有纤连蛋白的6孔板中，每组细胞设2个复孔，每孔5×10⁵个细胞；

3、置入37℃、5％CO₂培养箱中培养过夜；

4、待细胞长至约90％融合时，用10μl的Tip头划出一条无细胞的细痕，PBS溶液洗去脱落的细胞，加入无血清培养基继续培养；

5、分别于划痕后0h、48h观察细胞划痕处的愈合情况并拍照。实验重复3次，结果取平均值。

6、统计学方法

采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示的，采用繁多样本均数的方差检验(ANOVA)进行分析，认为当P<0.05时具有统计学意义。

7、结果

结果如图7所示，转染siRNA1组的细胞相对对照组而言，细胞体外划痕后的迁移距离明显降低，说明KLHDC7B过表达可以促进喉癌细胞的迁移。

实施例9 细胞侵袭实验

1、Transwell小室制备

将50mg/L的Matrigel胶用4℃预冷的无血清培养基以1:8的比例稀释、混匀，包被Transwell小室的底部膜的上室面，4℃风干。取60μl～80μl稀释的Matrigel胶(3.9μg/μl)置于孔径为8μm的Transwell上室的聚碳酸脂膜上，使膜上的所有的微孔均被Matrigel覆盖，置于37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。

2、配置细胞悬液

将处于对数生长期的不同处理组的细胞经胰酶消化，无血清培养基重悬后，调整细胞浓度为5×10⁴个/ml。

3、细胞接种

在Transwell上室加入2ml的细胞悬液，下室加入1ml的含10％胎牛血清的完全培养基，放置于配套的6孔板上，37℃、5％CO₂条件下培养20-24h；取出Transwell小室，棉签擦尽上室面的Matrigel胶和未穿透膜的细胞。

4、染色

细胞培养结束后，取出Transwell小室，棉签擦尽上室面的Matrigel胶和未穿透膜的细胞，下室面用95％酒精固定15min后，苏木素染色2min，倒置显微镜下随机取5个高倍镜视野观察、计数并拍照。计数小室下室面的细胞数即为穿透Matrigel胶的细胞数，取平均数作为实验结果，并以该细胞数代表肿瘤细胞的侵袭力，实验重复3次，每组细胞设3个复孔。

5、统计学方法

采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示的，采用繁多样本均数的方差检验(ANOVA)进行分析，认为当P<0.05时具有统计学意义。

6、结果

结果如图8所示，与对照组相比，实验组的细胞穿过Transwell小室聚碳酸酯膜的细胞数明显减少，而对照组之间无明显差异，结果说明KLHDC7B过表达可以促进喉鳞癌的侵袭。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京泱深生物信息技术有限公司

<120> 一种与喉鳞癌相关的生物标志物

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

cagcacttcc acacactc 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

cctgtacctg tccctatga 19

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ggagcgagat ccctccaaaa t 21

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ggctgttgtc atacttctca tgg 23

<210> 5

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工合成

<400> 5

uucuccgaac gugucacgu 19

<210> 6

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工合成

<400> 6

acgugacacg uucggagaa 19

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工合成

<400> 7

aaaguugucc agaaacaaga g 21

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工合成

<400> 8

cuuguuucug gacaacuuuc c 21

<210> 9

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工合成

<400> 9

uuauagacaa ggagaaaggg a 21

<210> 10

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工合成

<400> 10

ccuuucuccu ugucuauaaa a 21

<210> 11

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工合成

<400> 11

auguauucac uuuucuagca u 21

<210> 12

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工合成

<400> 12

gcuagaaaag ugaauacauc u 21

Claims (6)

1.KLHDC7B功能性表达的抑制剂在制备预防或治疗喉鳞癌的药物组合物中的用途，其特征在于，所述抑制剂为siRNA。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8所示。

3.一种KLHDC7B基因的用途，其特征在于，用于筛选预防或治疗喉鳞癌的候选化合物。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，筛选预防或治疗喉鳞癌的候选化合物的步骤包括：

测试组中，在细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察所述测试组的细胞中KLHDC7B的表达量和/或活性；在对照组中，在相同细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察对照组的所述细胞中KLHDC7B的表达量和/或活性；

其中，如果测试组中细胞的KLHDC7B的表达量和/或活性低于对照组，就表明该测试化合物是对KLHDC7B的表达和/或活性有抑制作用的治疗癌症的候选化合物。

5.检测KLHDC7B基因表达水平的试剂在制备诊断喉鳞癌的产品中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述试剂选自：

特异性识别KLHDC7B的探针；或

特异性扩增KLHDC7B的引物；或

特异性结合KLHDC7B编码的蛋白的抗体或配体。

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