JP2006217844A - Dkk1の遺伝子、蛋白質及び抗体を用いた癌の診断・モニター方法及び治療方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 生体試料中の、配列番号1に記載される塩基配列を有するDKK1遺伝子、この遺伝子によりコードされるDKK1蛋白質、及びこの蛋白質を認識する抗体によりDKK1蛋白質又はそのフラグメントを検出することを特徴とする癌の診断・モニター方法。
【選択図】 なし
Description
また、本発明は、DKK1の蛋白質又はそのフラグメントを認識する抗体又は抗原結合性フラグメント、又は配列番号1に記載される塩基配列からなるポリヌクレオチド、これに相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド、又はこれらのポリヌクレオチドとストリンジエントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含有する癌の診断・モニター薬を提供するものである。
また、本発明は、DKK1の蛋白質又はそのフラグメントを認識する抗体又は抗原結合性フラグメント、又は配列番号1に記載される塩基配列からなるポリヌクレオチド、これに相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド、又はこれらのポリヌクレオチドとストリンジエントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする癌の治療方法を提供するものである。
さらに、本発明は、DKK1の蛋白質又はそのフラグメントを認識する抗体又は抗原結合性フラグメント、又は配列番号1に記載される塩基配列からなるポリヌクレオチド、これに相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド、又はこれらのポリヌクレオチドとストリンジエントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含有する癌の治療薬及び癌の診断・モニター用キットを提供するものである。
第一の観点においては、本発明は、配列番号1に記載されるDKK1遺伝子によりコードされる蛋白質またはそのフラグメントを提供する。本発明の蛋白質またはそのフラグメントは、癌の診断、治療、抗体作製の際の抗原として有用である。
本発明のDKK1の蛋白質は、所望の免疫原性を有する限り、配列番号2記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、又は配列番号2記載のアミノ酸配列において、1又は複数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加された変異体であってもよい。このような変異体は、好ましくは、上述のアミノ酸配列と、少なくとも80%、好ましくは90%またはそれ以上、より好ましくは95%またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、本発明の蛋白質を製造する際に用いることも可能である。
DNAアレイ法においては、被検者から調製したRNAを鋳型としてcDNA試料を調製し、本発明のオリゴヌクレオチドが固定された基板と接触させ、該cDNA試料と該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出することにより、該cDNA試料に含まれる本発明の遺伝子の発現量を測定する。次いで、測定された本発明の遺伝子の発現量を対照と比較する。
肺癌患者組織及び肺癌由来細胞株におけるDKK1遺伝子のGene Chipによる発現解析
肺癌組織及び正常肺組織から得たmRNAからcRNAを調製し、そこに含まれるDKK1遺伝子の発現量を解析した。まず、RNAはISOGEN(日本ジーン社)を用いて添付の方法に従い調製した。その後、Affymetrix社のプロトコールに従ってcRNA合成を行った。すなわち、SuperScript II(Invitrogen社)を用いて逆転写反応し、cDNAを合成した。このcDNAを鋳型としてDNAポリメラーゼを用いて二本鎖cDNAを合成し、この二本鎖cDNAを鋳型としてMegaScript(Ambion社)を用いてビオチンラベル化されたcRNA合成を行った。合成されたcRNAは福元らの方法(Shin-ichi Fukumotoら、クリニカル・キャンサー・リサーチ)によって、GeneChip U133 A、及びBチップ(アフィメトリックス社) に添加した。45℃、60 rpmで16時間ハイブリダイゼーションした後、蛍光ラベルしたアビジンを作用させ、スキャナーで蛍光強度を測定することでmRNAの発現量を測定した。それぞれの解析における全遺伝子の発現スコアの平均値を100とし、各遺伝子の発現量は相対値とした。
その結果、図1に示すように、肺の癌部では正常部に対してDKK1の遺伝子発現が亢進していることを見いだした。また、同様に肺癌に由来する細胞株A549でもDKK1遺伝子の発現の亢進が確認された。
膵癌患者組織及び膵癌由来細胞株におけるDKK1遺伝子のGene Chipによる発現解析
実施例1に示した方法で、膵癌組織及び正常膵臓組織から得たmRNAからcRNAを調製し、そこに含まれるDKK1遺伝子の発現量を解析した。結果は図2に示すように、膵臓の癌部では正常部に対してDKK1の遺伝子発現が亢進していた。また、同様に膵癌に由来する細胞株PK1、PK59、Capan1、KLN1、Panc1、PaCa2でもDKK1遺伝子の発現の亢進が確認された。
肝癌患者組織、および肝癌由来細胞株におけるDKK1遺伝子のGene Chipによる発現解析
実施例1に示した方法で、肝癌組織、肝硬変部位、および正常肝臓組織から得たmRNAからcRNAを調製し、そこに含まれるDKK1遺伝子の発現量を解析した結果を図3に示した。正常部及び肝硬変部位に比較して肝癌部位でDKK1遺伝子の発現が亢進していることが明らかになった。特に低分化型肝癌で発現亢進が著しい。肝癌由来細胞株HePG2、HLE、Huh6、Huh7でもDKK1遺伝子の高い発現が確認された。
大腸癌患者組織、および大腸癌由来細胞株におけるDKK1遺伝子のGene Chip発現解析
実施例1に示した方法で、大腸癌組織、および正常大腸組織から得たmRNAからcRNAを調製し、そこに含まれるDKK1遺伝子の発現量を解析した結果を図4に示した。正常部に比較して大腸癌部位でDKK1遺伝子の発現が亢進していることが明らかになった。大腸癌由来細胞株SW480、HCT116、CaCo2、HT29でもDKK1遺伝子の高い発現が確認された。
胃癌患者組織、および胃癌由来細胞株におけるDKK1遺伝子のGene Chipによる発現解析
実施例1に示した方法で、胃癌組織、および正常胃組織から得たmRNAからcRNAを調製し、そこに含まれるDKK1遺伝子の発現量を解析した結果を図5に示した。正常部に比較して胃癌部位でDKK1遺伝子の発現が亢進していることが明らかになった。胃癌由来細胞株2M、2MLNでもDKK1遺伝子の高い発現が確認された。
肝芽種患者組織におけるDKK1遺伝子のGene Chipによる発現解析
実施例1に示した方法で、肝芽種組織、および正常小児肝組織から得たmRNAからcRNAを調製し、そこに含まれるDKK1遺伝子の発現量を解析した結果を図6に示した。正常部に比較して肝芽種部位でDKK1遺伝子の発現が亢進していることが明らかになった。
肝芽種患者組織及び肝癌細胞株におけるDKK1遺伝子の定量的RT-PCRによる発現解析
肝芽種及び正常小児肝臓組織、肝癌由来細胞株より、実施例1に示した方法、すなわち、ISOGENによるRNA抽出、SuperScript IIによるcDNA合成を行い、これにより得られたcDNAを鋳型にした定量的RT-PCRを行った。定量的RT-PCRはcDNAの存在量を定量化する方法である。具体的には、SYBR GREENを添加したRT-PCRを行い、cDNAの増幅量をSYBR GREEN由来の蛍光量で測定した。用いたPCRプライマーは、DKK1(NM_012242)の633から828番の塩基を増幅させる配列番号3及び配列番号4に記載されたオリゴヌクレオチドである。これによって定量化されたDKK1遺伝子の発現量を図7に示す。正常部に比較して肝芽種および肝癌由来細胞株でDKK1遺伝子の発現亢進が確認された。この結果は、3及び実施例7のGeneChipによるDKK1遺伝子の発現解析の結果と相関していた。
DKK1遺伝子のサブクローニング
配列番号2に記載されたDKK1の蛋白質をコードする領域の遺伝子は、大腸癌細胞株CaCo2のcDNAから増幅させた。PCRプライマーには、制限酵素サイトBamHIが付加されたフォワードプライマー配列番号5及びSmaIサイトが付加された配列番号6からなるリバースプライマーのオリゴヌクレオチドを用いた。PCR用酵素及び試薬には、アドバンテージ2ポリメラーゼミックス(Advantage 2 Polymerase Mix;クロンテック社製)及びアドバンテージ2PCRバッファー(Advantage 2 PCR buffer)、200μM デオキシヌクレオチド三リン酸、0.2μMプライマーを用い、cDNA 1μLを鋳型にしたPCR(94℃30秒、68℃30秒、72℃2分、35サイクル)を行った。
PCR産物は0.8%のアガロースゲルで電気泳動を行った後、DKK1の遺伝子と長さが同一である部位を切り出し、キアクイック ゲル抽出キット(QIAquick gel extraction kit;キアゲン社製)を用いてゲルからPCR産物の溶出及び精製を行った。
精製されたPCR産物は、DNAライゲーションキット(タカラ社製)を用いてpGEM−Teasyベクター(プロメガ社製)に組み込みを行った。ゲルから精製を行ったPCR産物4μLに、ライゲーションバッファー 5μL及びpGEM−Teasyベクターを加え、16℃で30分間保温した。
PCR産物を組み込んだpGEM−T easyベクターはコンピテント細胞XL−1 Blue(ストラタジーン社製)へ形質転換し、5−ブロモ−4−クロロ−3−β−インドリルーガラクトピラノシド(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-Galactopyranoside;X-gal)を用いたカラーセレクションを行い、PCR産物が組み込まれたベクターのみを選出した。形質転換は、コンピテント細胞に10μLのライゲーション反応産物を加え、30分間氷冷後に、42℃のヒートショック45秒、続けて2分間氷冷して形質転換を起こさせた。さらに、抗生物質耐性遺伝子の発現を行うために抗生剤を含まないLB培地を900μL加え、37℃で30分間穏やかに撹拌した。遠心で菌体を回収し、20mg/mLのX−galを20μL散布させた、アンピシリンを含むLBプレートに菌体をまき込み、37℃で16時間培養した。プレート上で生育したコロニーのうち、発色をしていないコロニー(PCR産物がベクターに組み込まれていることが予想されるもの)を5個選択し、最終濃度が100μg/mLのアンピシリンを含む5mLのLB培地で37℃、16時間激しく撹拌し、菌体を増殖させた。
増殖した菌体の一部から、フェノール/クロロホルム抽出によってプラスミドDNAを回収し、EcoR I(8U/μL)を0.5μL、10×H バッファーを2μL、蒸留水を7.5μL加え、37℃で1時間消化を行った。0.8%のアガロースゲルを用いた電気泳動で消化物のサイズが目的のPCR産物のサイズと同一であることを確認した。
DKK1の遺伝子が組み込まれたと考えられるプラスミドDNAの回収はカンタムプレップ プラスミド ミニプレップキット(Quantum Prep Plasmid MiniPrep Kit (バイオラッド社製)を用いて行った。溶出は蒸留水で行った。
精製されたプラスミドに組み込まれたPCR産物の塩基配列の確認をキャピラリー電気泳動によるシーケンスで行った。シーケンスの反応は、ダイナミックETターミネーター サイクル シーケンス キット(DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit;アマシャムバイオサイエンス社製)を用い、各0.2μMのT7プライマー(配列番号7)及びSP6プライマー(配列番号8)を用いた。シーケンスによって得られたPCR産物の塩基配列は、UniGeneのデータから得られた野生型のDKK1配列(NM_012242)のコーディング領域と比較し、変異のないPCR産物をもつプラスミドDNAを選び出した。
大腸菌発現系ベクターの構築
シーケンスで野生型のDKK1と同一のアミノ酸配列(配列番号2)をコードすることが確認されたプラスミドDNAは、制限酵素(Bam HI及びSma I)で酵素消化(37℃、1時間)を行い、0.8%のアガロースゲルで電気泳動を行い、pGEM−T easyから遺伝子を単離、精製した。精製はキアクイック ゲル抽出キットを用いて行った。
pGEM−T easyによって増幅され、切り出されたフラグメントは、大腸菌蛋白質発現用ベクターであるpET41b(ノバジェン社製)に組み換えた。pET41に組み込まれた遺伝子は、GST融合蛋白質として翻訳される。
pET41を制限酵素(Bam HI及びSma I)で消化し、電気泳動を行い、キアクイック ゲル抽出キットで精製を行った。pGEM−T easyによって増幅したDKK1の配列をもつフラグメントはDNAライゲーションキットを用いてpET41bに組み込みを行った。
pGEM−T easyから精製を行ったDKK1フラグメント4μLに、ライゲーションバッファー5μL及びpET41bを1μL加え、16℃で30分間保温した。
ライゲーション反応の終了したプラスミドDNAはXL−1 Blueへ形質転換を行い、カナマイシンを含むLB培地で16時間振盪を行い、菌体を増殖させた。増殖させた大腸菌から、カンタムプレップ プラスミド ミニプレップキットを用いて、プラスミドの精製を行った。pET41へのDKK1の挿入を確認するために、pETがもつ配列に対するプライマー(配列番号9及び10)でシーケンスを行った。
pET41ベクターに組み込まれた配列番号1のDKK1は、T7プロモーターを持つコンピテント細胞BL21 Codon PLUS pLys(ノバジェン社製)に形質転換させた。
形質転換は、以下の手順で行った。100μLのBL21 Codon PLUS RILにpET‐DKK1‐FLを1μg/μL濃度で1μL加え5分間氷冷した。その後、42℃の恒温層に20秒間漬け、ヒートショックを与えた。さらに2分間氷冷した後、900μLの抗生剤無添加のLBを加え、37℃で10分間インキュベートした後に、遠心(1000×g、5分)を行った。
上清を廃棄した後コンピテント細胞を再懸濁させ、カナマイシンを含んだLBプレートにまきこんで37℃で16時間、選択培養を行った。
大腸菌発現系におけるGST融合DKK1蛋白質の調製
蛋白質合成は以下の手順で行った。プラスミドが導入されたと考えられるカナマイシン耐性のコロニーを、カナマイシンを含む5mLのLB培地の中でコンフルエントになるまで培養を行った。この培養液を500mLのカナマイシン入りLB培地に加え、旋回振とうさせながら37℃で培養を行った後に、菌体が増殖したことを確認した上で、蛋白質合成を誘導するIPTG(Isopropyl-Thio-β-D-Galactopyranoside)を500μMになるように加え、22℃で16時間、旋回振とう培養を行った。
GST融合蛋白質の精製は、GSTとグルタチオンの結合を利用したアフィニティー精製で行った。まず、培養液を6000×g、4℃で10分間遠心することで大腸菌の菌体を回収した。菌体溶解バッファー(50mM塩化ナトリウム、1mM EDTA、1mM ジチオスレイトール(DTT)、50mMトリスヒドロキシアミノメタン塩酸塩, pH8.0)を加え、氷上で超音波処理を行った。その後、最終濃度が1%になるようにTriton X‐100を添加し、13400×g、4℃で45分間遠心を行って上清を回収した。この上清にグルタチオンセファロース(アマシャムバイオサイエンス社製)を500μL加え、4℃で1時間転倒混和を行ない、GST‐DKK1融合蛋白質を吸着させた。
遠心(3000×g、4℃、5分)でグルタチオンセファロースを回収し、10mLのPBS‐T(0.5%Triton X‐100を含むPBS)で洗浄後、溶出バッファー(50mM還元型グルタチオン、200mM塩化ナトリウム1mM EDTA、1mMDTT、200mM Tris-HCl,pH8.0)を加えて4℃で1時間転倒混和し、GST融合蛋白質を溶出させた。遠心(3000×g、4℃、5分)によってグルタチオンセファロースを除去し、GST融合DKK1精製蛋白質を得た。この精製蛋白質は脱塩カラムであるPD‐10カラム(アマシャムバイオサイエンス社製)でPBS溶液とした。
さらに純度を高めるために、FPLCによるイオン交換クロマトグラフィーを行った。PD‐10カラム(アマシャムバイオサイエンス社製)でPBS溶液とし、用いたカラムはMonoQカラム、塩化カリウムの濃度勾配によって溶出を行った。
FPLC精製されたGST融合DKK1は、PD‐10カラムでPBS溶液とした。ブラッドフォード法によって蛋白質濃度を定量し、SDS‐PAGEによって純度を検定し、免疫に必要な蛋白質の量及び純度を満たしていることを確認し、この蛋白質を以下に示すモノクローナル抗体作製のための免疫原とした。
哺乳類細胞発現系によるDKK1蛋白質の調製
哺乳類細胞発現系に用いるベクターを作製した。実施例8によってサブクローニングされたDKK1遺伝子を鋳型に、制限酵素サイトHindIIIが付加された配列番号11のフォワードプライマー、及びポリヒスチジンタグをコードする配列と制限酵素サイトBamHIの配列が付加された配列番号12のリバースプライマーを用いたPCRを行った。増幅されたPCR産物は、実施例9と同様の手法で精製を行った後、HindIIIおよびBamHIサイトにて切断したフラグメントをphCMVベクター(ストラタジーン社)への挿入を行った。
TransIT(TaKaRa社)のプロトコールに準じて、トランスフェクションを行った。前日に6ウェルデイッシュに、10万個のチャイニーズハムスター卵巣由来のCHO細胞を播種し一晩培養を行った。翌日に8μgの発現ベクターphCMV-DKK1-Hisと16μLのTransIt reagentを無血清DMEM培地100μLに混合し、20分間の室温におけるインキュベーションを行った後、細胞培養液に加えトランスフェクションを行った。トランスフェクション翌日に限外希釈法および選択試薬であるG418を用いてクローニングを開始した。各クローンの培養上清のサンプリングを行い培養上清中のDKK1の発現量の検定を行った結果、約5-10μg/mLのDKK1-His融合蛋白質を発現する恒常的クローンが存在し、これらを選択した。
選択した恒常的発現クローンを150cm2のフラスコ、無血清培地S-SFM-II(Invitrogen社)20mLにて培養を48時間行い、培養上清を回収した。得られた培養上清からTARON Hisタグ精製レジン(BD Bioscience社)を用いて添付マニュアルに従いDKK1- His 融合蛋白質の精製を行った。精製された融合蛋白質はPBSに対し透析を行いSDS-PAGEによる純度検定の後、免疫用抗原およびELISA測定における標準品として用いた。
抗DKK1モノクローナル抗体の作製
実施例10の方法で調製したGST融合DKK1蛋白質、または実施例11の方法で調製したDKK1-His抗原100μg/0.1mLと、フロイント完全アジュバント0.1mLを混合してエマルジョンを形成させ、BALB/cマウスに腹腔内投与することにより、初回免疫を行った。2週間後に、GST融合DKK1蛋白質、またはDKK1-His抗原100μg/0.1mLと、フロイント不完全アジュバント0.1mLを混合してエマルジョンを形成させ、BALB/cマウスに腹腔内投与して2回目の免疫を行った。さらに2週間後に、GST融合DKK1蛋白質、またはDKK1-His抗原25μg/0.1mLを静脈注射して投与し、最終免疫を行った。最終免疫後にこのマウスから脾臓細胞を調製し、通常のポリエチレングリコールを使用する方法によってマウスNS-1細胞との細胞融合を行った。
抗体産生細胞のスクリーニングは、GST融合DKK1蛋白質、またはDKK1-His抗原を固相したELISAで行い、特異的に結合する抗体の選別を行った。DKK1のみを特異的に認識する細胞、すなわち、GSTあるいはHisを認識せず、DKK1蛋白質を認識する細胞のみを選択し、DKK1に対する特異性の高いモノクローナル抗体を多数作製することに成功した。このモノクローナル抗体、PPMX0301はウエスタンブロティングによるDKK1測定に利用可能であったことから、特許微生物寄託センターにFERM P−20317として寄託した。
抗DKK1ポリクローナル抗体の作製
精製DKK1-Hisを用いて、ウサギポリクローナル抗体の作製を行った。作製には、公知の方法を用いた。精製DKK1-Hisを、アジュバントを用いてエマルジョン化したものを皮下に投与し、免疫を行った。これを数回繰り返し、抗体価が上昇したのを確認した後、採血を行い、血清を得た。次いで、Protein Gを固定化したセファロースビーズ(アマシャムバイオサイエンス社製)により精製後、さらにDKK1-Hisを固定化したSepharose 4Bにて精製し、精製ポリクローナル抗体を取得した。
哺乳類細胞における一過性発現に用いるDKK1発現ベクターの構築
実施例9によってサブクローニングされたDKK1遺伝子を鋳型に、Bam HIの配列が付加された配列番号13、およびXho Iが付加された配列番号14のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCR(94℃30秒、68℃30秒、72℃2分、35サイクル)を行った。このPCR産物を実施例9で実施した方法と同様の手法で、あらかじめ、Bam HI及びXho Iで切断されたpcDNA4 MycHis A(インビトロジェン社)に組み換えを行った。
哺乳類細胞におけるDKK1の一過性発現及びウェスタンブロッティング
実施例14で作製したDKK1をコードする遺伝子を組み込んだpcDNA4 Myc-Hisを、FuGENE6(ロシュ・ダイアグノスティクス社)を用いてミドリザル腎臓由来のCOS7細胞に導入した。導入後、48時間後の細胞内蛋白質および培養上清を回収した。細胞内蛋白質は、培養細胞をPBSで3回洗浄した後にRIPAバッファー(150mM塩化ナトリウム,1%NP-40,0.5%デオキシコール酸, 0.1%SDS,50mMTris-HCl pH8.0)によって抽出した。各々の蛋白質抽出液の蛋白質濃度をブラッドフォード法で定量し、5 mg/mLとなるように調製した後、SDS-サンプルバッファーと等量混合し(最終濃度、SDS 2%,2-メルカプトエタノール5%)、95℃で5分間加熱処理を行った。10μgの蛋白質抽出液について12%ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS-PAGEを行った。分離された蛋白質は渡辺らの方法(Akira Watanabeら、キャンサー・リサーチ、63巻8629頁(2003年))によってウェスタンブロッティングを行った。すなわち、Hybond-P(アマシャムバイオサイエンス社製)膜に100Vで60min転写し、転写膜を2%スキムミルクで25℃ 1hブロッキングした後、50mM Tris buffered saline(以下TBS)で3回洗浄した。抗Myc抗体(サンタクルーズ社、最終濃度1μg/ml)もしくは抗DKK1モノクローナル抗体(PPMX0301;最終濃度10μg/ml)を、室温で1時間反応させた後、TBSで3回洗浄を行った。HRP標識抗マウスIgG抗体(アマシャムバイオサイエンス社製)の5000倍希釈液5mLをアプライし、室温で1時間反応させた後TBSで3回洗浄を行った。ECL plus検出試薬(アマシャムバイオサイエンス社製)を2mLアプライし、得られた化学発光シグナルをX腺フィルムに5min感光させた。このようにして実施したウェスタンブロッティングの結果を図8に示す。陰性コントロールとしてDKK1遺伝子の導入していないCOS7細胞の抽出液を用いた。抗Myc抗体、及び抗DKK1モノクローナル抗体を用いた細胞質抽出液に対するウェスタンブロッティングでは、2種類の抗体で、ともに37kダルトン付近にバンドが検出された。培養上清に対するウェスタンブロッティングでは、2種類の抗体でともに、37kダルトンから50kダルトンの間にバンドが検出された。このことは細胞質に存在するDKK1蛋白質と培養上清に分泌されるDKK1蛋白質の分子量が異なっていることを示している。これは、例えば、糖鎖修飾等による翻訳後修飾の可能性もあるし、立体構造の変化による可能性もある。
各種癌細胞株抽出液中DKK1のウエスタンブロッティングによる検出
実施例1、2、3、4、5および6にて、各種癌組織および癌由来細胞株におけるDKK1遺伝子の発現亢進が確認できたことから、蛋白質レベルでの産生亢進を確認する目的で、各種癌細胞株Panc1(膵臓癌細胞株)、Caco2(大腸癌細胞株)、Huh-6(肝癌細胞株)、MDA-MB-231(乳癌細胞株)、KatoIII(胃癌細胞株)、PC3(前立腺癌細胞株)、H157(
肺癌細胞株)、A549(肺癌細胞株)の抽出液について、ウエスタンブロッティングを行いDKK1の検出を試みた。標準品として、精製DKK1−Hisを用いた。抽出液は、各培養細胞をPBSで3回洗浄した後にRIPA buffer(150mM塩化ナトリウム,1%NP-40,0.5%デオキシコール酸, 0.1%SDS,50mMTris-HCl pH8.0)を添加することで得た。各抽出液2.0μLを還元状態でSDS-PAGEし、泳動後のゲルをPVDF膜に転写した。転写した膜上のDKK1を抗DKK1ポリクローナル抗体と反応させた。その後、抗DKK1ポリクローナル抗体は HRP標識抗ウサギIgG抗体と反応させ、DKK1のバンドを検出した。その結果を図9に示した。5つの細胞株Panc1、Caco2、Huh-6、MDA-MB-231、PC3、A549の抽出液で、標準品DKK1-Hisとほぼ同一位置にバンドが確認できたことから、膵臓、大腸、肝臓、乳、前立腺および肺の組織上の癌化した細胞内にDKK1蛋白質が存在することが予測され、癌組織を用いた癌の確定診断への利用が示唆された。
各種癌細胞株培養液中DKK1のウエスタンブロッティングによる検出
各種癌細胞株培養液中にDKK1蛋白質が存在するか否かを調べるため、各種癌細胞株Panc1、Caco2、Huh-6、MDA-MB-231、KatoIII、PC3、H157、A549の培養上清について、ウエ
スタンブロットにて検討した。各レーンに細胞培養上清4.0μLをアプライした。還元状態でSDS-PAGEを行い、抗DKK1ポリクローナル抗体で、膜上のDKK1と反応させた。その後、抗DKK1ポリクローナル抗体は HRP標識抗ウサギIgG抗体と反応させ、DKK1のバンドの検出を試みた。尚、陽性コントロールには精製DKK1-Hisを用いた。その結果、図10に示すように5つの細胞株Panc1、Caco2、Huh-6、MDA-MB-231、PC3、A549の培養液で、標準品DKK1-Hisとほぼ同一位置にバンドが確認できたことから、膵癌、大腸癌、肝癌、乳癌、前立腺癌および肺癌患者血清において蛋白質レベルでのDKK1蛋白質が存在することが予測され、癌組織を用いた癌の診断・モニターへの利用の可能性が示唆された。
ELISA測定系の構築
実施例13にて作製した抗DKK1ポリクローナル抗体をPIERCE社のNHS-LC-BIOTINを用いてビオチン標識した。NUNC社のMaxi sorp 96穴プレートに抗DKK1抗体5μg/mL 100μL/wellを添加し、4℃ 一晩吸着させた。0.05%Tween-20を含むPBS(以後wash液)にてプレートを洗浄し、ABi biotechnologies社のImmunoassay stabilizer 150μL/wellにて室温下、1時間プレート上の未吸着部分をブロッキングさせた。Wash液で洗浄後、各濃度のDKK1-His 100μL/wellを室温下、1時間反応させた。Wash液で洗浄後、ビオチン標識した抗DKK1抗体 0.1μg/mL、100μL/wellで室温下、1時間反応させた。Wash液で洗浄後、Vector社のストレプタビジンー西洋ワサビペルオキシダーゼ1.0μg/mL、110μL/wellで室温下、1時間反応させた。Wash液で洗浄後、TMB試薬で暗所にて室温、30分間反応させたのち、STOP液にて反応を停止させた。その後、ELISAプレートにて450nmの吸光度を測定した。測定条件検討の結果、血清検体の希釈を40%BA/ TBS/ 0.1%NaN3にて実施することにした。
各種癌細胞株培養液中DKK1のELISAによる定量
実施例18で作製したELISA系にて、実施例17で使用した各種癌由来細胞株培養液中DKK1蛋白質濃度を測定した。先ず、各濃度のDKK1とその測定値からブランクの測定値を差し引いた値(NET)より図11の検量線を作成した。次いで、各種癌細胞株の培養上清を2から1000倍に希釈した溶液について測定し、元の培養上清中のDKK1濃度を求めた。結果は、図12に示すように実施例8のウエスタンブロッティングの結果とほぼ同様であったことから、本ELISA測定系がDKK1測定に使用可能であり、癌患者血清を用いた癌の診断・モニターへの利用の可能性が示唆された。
膵癌患者および健常者血清中のDKK1の検出
膵癌由来細胞株培養上清にDKK1蛋白質が検出されたことから、膵癌患者37例および健常者47名について実施例18で作製したELISA系を用いて測定した。血清検体を10倍希釈して血清中に含まれるDKK1濃度を先の検量線から算出した。得られたDKK1濃度の分布を図13に示した。その結果、健常者47名の測定値は0.92から5.97ng/mL、平均で1.58 ng/mLであるのに対し、膵癌患者血清では5.05から21.72 ng/mL、平均で8.96 ng/mLであった。この結果から、DKK1蛋白質を測定することで膵癌を診断できることが明らかとなった。
大腸癌、肝癌、胆嚢癌、胆管癌および胃癌患者血清中のDKK1の検出
多くの癌由来細胞株培養上清にDKK1蛋白質が検出されたことから、大腸癌患者20例、肝癌患者12例、胆嚢癌患者9例、胆管癌患者13例および胃癌患者14例について、膵癌患者血清と同様に血清中のDKK1濃度を測定した。得られたDKK1濃度の分布を図14に示す。その結果、大腸癌患者血清 2.92から9.57、平均 5.49、肝癌患者血清 3.80から7.85、平均 5.03、胆嚢癌患者血清 5.97から21.38、平均で10.46、胆管癌患者血清 3.76から11.29、平均で6.91、胃癌患者血清 3.15から10.38、平均 6.40であった。これらの癌患者群においても、健常者群に比べ高いDKK1濃度を示した。この結果から、DKK1蛋白質を測定することで大腸癌、肝癌、胆嚢癌、胆管癌および胃癌を診断できることが明らかとなった。
Claims (20)
- 生体試料中の、配列番号1に記載される塩基配列を有するDKK1遺伝子、蛋白質又はそのフラグメントを検出することを特徴とする癌の診断・モニター方法。
- 生体試料が、組織又は血液である請求項1記載の診断・モニター方法。
- 癌が、ミエローマ、乳癌及び前立腺癌を除く癌である請求項1又は2記載の診断・モニター方法。
- 検出が、免疫学的手法又は遺伝子検出手法によるものである請求項1〜3のいずれか1項に記載の診断・モニター方法。
- 検出が、DKK1の蛋白質又はそのフラグメントを認識する抗体又は抗原結合性フラグメントを用いる免疫学的検出である請求項1〜3のいずれか1項に記載の診断・モニター方法。
- 以下の工程:
(a)被験者から試料を採取する工程;
(b)採取された試料中のDKK1の蛋白質を検出する工程
を含む癌の診断・モニター方法。 - 生体試料中の、DKK1の蛋白質又はそのフラグメントを認識する抗体又は抗原結合性フラグメントを含有する癌の診断・モニター薬。
- 配列番号1に記載される塩基配列からなるポリヌクレオチド、これに相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド、又はこれらのポリヌクレオチドとストリンジエントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含有する癌の診断・モニター薬。
- 組織又は血液を試料とするものである請求項7又は8記載の診断・モニター薬。
- 癌が、ミエローマ、乳癌及び前立腺癌を除く癌である請求項7〜9のいずれか1項に記載の診断・モニター薬。
- DKK1の蛋白質又はそのフラグメントを認識する抗体又は抗原結合性フラグメントを用いることを特徴とする癌の治療方法。
- 配列番号1に記載される塩基配列からなるポリヌクレオチド、これに相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド、又はこれらのポリヌクレオチドとストリンジエントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする癌の治療方法。
- 癌が、ミエローマ、乳癌及び前立腺癌を除く癌である請求項11又は12記載の治療方法。
- DKK1の蛋白質又はそのフラグメントを認識する抗体又は抗原結合性フラグメントを含有する癌の治療薬。
- 配列番号1に記載される塩基配列からなるポリヌクレオチド、これに相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド、又はこれらのポリヌクレオチドとストリンジエントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含有する癌の治療薬。
- 癌が、ミエローマ、乳癌及び前立腺癌を除く癌である請求項14又は15記載の治療薬。
- DKK1の蛋白質又はそのフラグメントを認識する抗体又は抗原結合性フラグメントを含有する癌の診断・モニター用キット。
- 配列番号1に記載される塩基配列からなるポリヌクレオチド、これに相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド、又はこれらのポリヌクレオチドとストリンジエントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含有する癌の診断・モニター用キット。
- 癌が、ミエローマ、乳癌及び前立腺癌を除く癌である請求項17又は18記載のキット。
- 配列番号1に記載される塩基配列を有するDKK1遺伝子の発現量を測定することによる、抗癌活性を有する化合物の選定方法。
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