WO2004039981A1 - マスト細胞由来の膜タンパク質 - Google Patents

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WO2004039981A1
WO2004039981A1 PCT/JP2003/013921 JP0313921W WO2004039981A1 WO 2004039981 A1 WO2004039981 A1 WO 2004039981A1 JP 0313921 W JP0313921 W JP 0313921W WO 2004039981 A1 WO2004039981 A1 WO 2004039981A1
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WO
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protein
dna
present
antibody
cells
Prior art date
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PCT/JP2003/013921
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English (en)
French (fr)
Inventor
Toshio Kitamura
Hidetoshi Kumagai
Original Assignee
Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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Priority to US12/501,821 priority patent/US20090275082A1/en

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents

Definitions

  • the present invention relates to a novel membrane protein derived from a mast cell and a gene thereof, and their production and use.
  • Mast cells are known to act as effector cells that release inflammatory-related substances such as histamine upon antigen stimulation in allergic diseases such as atopic dermatitis, rhinitis and asthma.
  • drugs for treating these allergic diseases drugs that suppress the production or release of inflammatory-related substances from mast cells, such as antihistamines and steroids, or drugs that antagonize the action are used.
  • antihistamines and steroids drugs that suppress the production or release of inflammatory-related substances from mast cells.
  • drugs that antagonize the action are used.
  • highly selective and effective drugs is desired.
  • Fcr RI IB, gp49B, SIRP ⁇ ; and others have been known as candidate membrane proteins involved in the control of mast cell signaling pathways, but they control antigen stimulation responses involved in allergic diseases. The full picture of the mechanism is not disclosed. Disclosure of the invention
  • the present invention provides novel membrane proteins derived from mast cells and considered to be involved in the control of signal transduction pathways of mast cells, genes thereof, and their production and use.
  • This membrane protein can be used to elucidate the regulatory mechanism of antigen stimulation response or survival / proliferation signaling in mast cells.
  • the present inventors prepared a cDNA library from mouse marrow-derived cultured mast cells, which is a well-characterized model of mast cells, An efficient signal sequence trap method uniquely developed using a retrovirus-mediated expression cloning system (Kitamura, T. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 9146-9150). (SST-REX method) Using (Kojima, T. and Kitamura, T. (1999) Nature Biotechnol. 17, 487-490), a signal peptide (von Heijne, (1985) J. Mol. Biol) 184, 99-105).
  • a library that expresses a fusion protein with the constitutively active cytokine receptor MPL is screened to search for a cDNA encoding a protein capable of expressing MPL on the cell surface.
  • the target clone can be easily selected because the expression of the autonomic proliferation ability to an IL-3-dependent cell line due to the expression of MPL on the cell surface is used as an index.
  • the present inventors screened 2.0 ⁇ 10 6 clones and found that they encode a type I membrane protein, have one immunoglobulin domain in the extracellular domain, and have an inhibitory signal in the cell.
  • a gene with a transmitting motif was identified. It was named MC-P IR1 (later renamed LMIR1).
  • MC-PIR2 later renamed LMIR2
  • MC-PIR1 is phosphorylated by cross-linking, and the phosphotyrosine phosphatases SHP-1 and SHP-2, which are adaptase proteins involved in the control of signal transduction pathways, and phosphoinositide dephosphorylation It showed binding to the enzyme SHIP.
  • MC-PIR2 was associated with signaling molecules DAP10, DAP12, and FcRr having ITAM. Therefore, these proteins are thought to be membrane proteins involved in the control of mast cell signaling pathways.
  • MC-PIR1 and MC-PIR2 are mouse-derived genes
  • a gene search based on these nucleotide sequences revealed the presence of human genes CMRF-35H, IRp60, and CMRF-35A that are homologous to them.
  • CMRF-35H, IRp60, and CMRF-35A that are homologous to them.
  • CMRF-35H, IRp60, and CMRF-35A that are homologous to them.
  • CMRF-35A that are homologous to them.
  • These human genes are the signal of mast cells. It is not known to be involved in the control of the null transmission pathway, and the findings obtained using MC-PIR1 and MC-PIR2 provide new ways to utilize these human gene products.
  • the natural ligands of MC-PIRK MC-PIR2 and their human homologs are unknown, but the use of these gene expression products makes it possible to discover the natural ligands. It can also be used for screening compounds or antibodies that mimic the action of natural ligands. The compound or antibody obtained as a result of this screening may inhibit mast cell activation signal transduction, and may be an antiallergic agent with a novel mechanism of action.
  • the present invention relates to mast cell-derived membrane proteins, their genes, and their functionally equivalent molecules, and their production and use.
  • a polynucleotide comprising at least 15 nucleotides complementary to thigh A or a complementary strand thereof comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3,
  • (10) Inhibits the binding of the protein described in (3) to a protein selected from the group consisting of SHP-1 protein, SHP-2 protein, SHIP protein, DAP10 protein, DAP12 protein, and FcR ⁇ protein.
  • a method for screening a compound comprising:
  • test sample selected from the group consisting of the protein described in (3) and the SHP-1 protein, SHP-2 protein, SHIP protein, DAP10 protein, DAP12 protein, or FcR protein Contacting with a protein,
  • the present invention provides a gene encoding a novel membrane protein derived from a mast cell and thought to be involved in the control of a signal transduction pathway of the mast cell.
  • the present inventors have searched a cDNA library prepared from cultured mast cells derived from mouse bone marrow by a recently established novel signal sequence trap method (SST-REX method) to encode a type I membrane protein, We identified two genes that have one immunoglobulin domain in the extracellular domain and a motif that transduces inhibitory signals into the cell.
  • SST-REX method novel signal sequence trap method
  • MC-PIR2 The nucleotide sequence of a gene designated as MC-PIR2, which has about 90% homology at the amino acid level with the immunoglobulin domain of MC-PIR1, is represented by SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence of the protein encoded by the gene Is shown in SEQ ID NO: 4. These genes showed a specific expression distribution in mast cells.
  • MC-PIR1 is phosphorylated by antigen stimulation and binds to the phosphotyrosine phosphatases SHP-1 and SHP_2, which are adapter proteins involved in the control of signal transduction pathways, and the phosphoinositide phosphatase SHIP. Indicated.
  • MC-P IR2 was associated with signaling molecules DAP 10, DAP 12, and FcRr having ITAM. These proteins are thought to be membrane proteins involved in the control of mast cell signaling pathways.For example, an anti-allergic agent with a novel mechanism of action that inhibits mast cell activation signaling. It is expected to be used for development.
  • the present invention also includes a protein functionally equivalent to the DNA encoding the MC-PIR1 and MC-PIR2 proteins (DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3).
  • proteins include, for example, mutants of these proteins, homologs of organisms other than mice, and the like.
  • “functionally equivalent” means that the target protein has the same biological or biochemical activity as MC-PIR1 and MC-PIR2 proteins.
  • Such activities include, for example, phosphotyrosine phosphatases SHP-1 and SHP-2, which are adapter proteins involved in the control of signal transduction pathways, which are phosphorylated by antigen stimulation, and phosphoinositide phosphatase Illustrates the activity to bind to SHIP and the activity to bind to signaling molecules DAP10, DAP12 and FCRT with ITAM can do.
  • SHP-1 and SHP-2 which are adapter proteins involved in the control of signal transduction pathways, which are phosphorylated by antigen stimulation
  • phosphoinositide phosphatase Illustrates the activity to bind to SHIP and the activity to bind to signaling molecules DAP10, DAP12 and FCRT with ITAM can do.
  • a method for introducing a mutation into a protein is known.
  • those skilled in the art can use site-directed mutagenesis (Hashimoto-Got oh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100, 468-500, Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer W, and Fri tz HJ (1987) Methods. Enzymol.
  • MC-PIR1 protein and MC-PIR2 protein SEQ ID NO: 2
  • a protein functionally equivalent to the protein can be prepared by appropriately introducing a mutation into an amino acid of (a protein consisting of the amino acid sequence described in 4). Amino acid mutations can also occur in nature.
  • a protein having an amino acid sequence in which one or more amino acids are mutated in the amino acid sequence of the MC-PIR1 protein or the MC-PIR2 protein and functionally equivalent to the protein is also included in the protein of the present invention.
  • the number of amino acids to be mutated in such a mutant is usually within 50 amino acids, preferably within 30 amino acids, and more preferably within 10 amino acids (for example, within 5 amino acids).
  • the amino acid residue to be mutated is desirably mutated to another amino acid that preserves the properties of the amino acid side chain.
  • the properties of amino acid side chains include hydrophobic amino acids (A, I, M, F, P, W, Y, V) and hydrophilic amino acids (R, D, N, E, Q, G, H, K , S, T), an amino acid having an aliphatic side chain (G, A, V, L, I, P), an amino acid having a hydroxyl group-containing side chain (S, ⁇ , ⁇ ), and a sulfur atom-containing side chain.
  • Amino acids ( ⁇ , F, Y, W) can be mentioned (all brackets indicate one letter of amino acids). It is already known that a protein having an amino acid sequence modified by deletion, addition and / or substitution of one or more amino acid residues with respect to a certain amino acid sequence maintains its biological activity. (Mark, DF et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666, Zoller, M, J. & Smith, M.
  • Proteins in which a plurality of amino acid residues are added to the amino acid sequence of the MC-PIRl protein or MC-PIR2 protein include fusion proteins containing these proteins.
  • the fusion protein is a fusion of these proteins with another peptide or protein, and is included in the present invention.
  • the method for producing the fusion protein is to frame the DNA encoding the MC-PIR1 protein or the MC-PIR2 protein (protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4) with the DNA encoding the other peptide or protein. It is sufficient that they are ligated so as to match each other, introduced into an expression vector, and expressed in a host, and a method known to those skilled in the art can be used.
  • Other peptides or proteins to be fused with the protein of the present invention are not particularly limited.
  • peptides to be fused with the protein of the present invention include, for example, FLAG (Hop, TP et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210), and six His (histidine) residues. Consisting of 6 XHis, 10 x His, influenza agglutinin (HA), human c-myc fragment, VSV-GP fragment, pl8HIV fragment, T7-tag, HSV-tag, E-tag, SV40T antigen fragment, Known peptides such as lck tag, ⁇ -tubulin fragment, B-tag, and Protein C fragment can be used.
  • proteins to be fused with the protein of the present invention include, for example, GST (Daruyu Thion-1 S-transferase), HA (influenza agglutinin), immunoglobulin constant region, j3-galactosidase And MBP (maltose binding protein).
  • GST Dynamic Hossion Inactivation Protein
  • HA influenza agglutinin
  • immunoglobulin constant region immunoglobulin constant region
  • j3-galactosidase And MBP maltose binding protein
  • the present invention includes proteins encoded by DNAs that hybridize with DNAs encoding MC-PIR1 protein or MC-PIR2 protein and functionally equivalent to MC-PIR1 protein or MC-PIR2 protein.
  • proteins include, for example, homologues of mouse and other mammals (eg, proteins encoded by humans, rats, rabbits, rabbits, etc.).
  • Hybridization conditions for isolating DNA encoding a protein functionally equivalent to the MC-PIR1 protein or MC-PIR2 protein can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • conditions for the hybridization are low stringency conditions.
  • Low stringency conditions are, for example, 42 ° C, 0.1X SSC, 0.1% SDS, preferably 50 ° C, 0.1% SDS in post-hybridization washes.
  • More preferable hybridization conditions include stringent conditions. Highly stringent conditions are, for example, conditions of 65 ° C., 5 ⁇ SSC and 0.1% SDS. Under these conditions, it can be expected that DNA with higher homology can be efficiently obtained as the temperature is increased.
  • a gene amplification method using primers synthesized based on the sequence information of DNA (SEQ ID NOS: 1 and 3) encoding MC-PIR1 protein or MC-PIR2 protein instead of hybridization can be isolated using the polymerase chain reaction (PCR) method.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Proteins functionally equivalent to the MC-PIR1 protein or MC-PIR2 protein which are encoded by DNA isolated by these hybridization techniques or gene amplification techniques, are usually those proteins (SEQ ID NO: 2 or 4). Protein consisting of amino acid sequence) and amino acid sequence.
  • the protein of the present invention also includes a protein that is functionally equivalent to the MC-PIR1 protein or the MC-PIR2 protein and has high homology to the amino acid sequence of the protein. High homology usually means at least 50% identity, preferably at least 75% identity, more preferably at least 85% identity, more preferably at least 95% (96%) at the amino acid level. % Or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more). To determine protein homology, the algorithm described in the literature (Wilbur, WJ and Lipman, DJ Pro Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-730) may be used. .
  • the protein of the present invention may differ in amino acid sequence, molecular weight, isoelectric point, presence / absence and form of sugar chains, etc., depending on the cell, host, or purification method for producing the protein described below. However, as long as the obtained protein has a function equivalent to that of the MC-PIR1 protein or MC-PIR2 protein, it is included in the present invention. For example, when the protein of the present invention is expressed in prokaryotic cells, for example, Escherichia coli, a methionine residue is added to the N-terminal of the amino acid sequence of the original protein.
  • the protein of the present invention also includes such a protein.
  • the protein of the present invention can be prepared as a recombinant protein or a natural protein by methods known to those skilled in the art.
  • a DNA encoding the protein of the present invention for example, a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3
  • the antibody can be purified and prepared by subjecting the antibody to the protein of the present invention to affinity chromatography immobilized on a column, or by further combining a plurality of these columns. .
  • the protein of the present invention is expressed in a host cell (for example, an animal cell or Escherichia coli) as a fusion protein with a dalhithione-S-transferase protein or as a recombinant protein to which a plurality of histidines are added
  • a host cell for example, an animal cell or Escherichia coli
  • the expressed recombinant protein can be purified using a daltathione column or a nickel column.
  • a region other than the target protein in the fusion protein can be cleaved with thrombin or Factor-1Xa and removed.
  • the protein is a natural protein, a method known to those skilled in the art, for example, an affinity in which an antibody that binds to the protein of the present invention described below is bound to an extract of a tissue or a cell expressing the protein of the present invention, which will be described later. Isolation can be achieved by purifying the reaction with one column.
  • the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the present invention also includes partial peptides of the protein of the present invention.
  • the partial peptide of the present invention has an amino acid sequence of at least 7 amino acids or more, preferably 8 or more amino acids, and more preferably 9 or more amino acids.
  • the partial peptide can be used, for example, for preparing an antibody against the protein of the present invention, for screening a compound binding to the protein of the present invention, and for screening for a promoter or inhibitor of the protein of the present invention. Further, it can be an antagonist of the protein of the present invention or a competitive inhibitor.
  • the partial peptide of the present invention can be produced by a genetic engineering technique, a known peptide synthesis method, or by cleaving the protein of the present invention with an appropriate peptidase.
  • the peptide may be synthesized by, for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method.
  • the DNA encoding the protein of the present invention is used for the production of the protein of the present invention as described above // in vivo or in vivo, and for example, encodes the protein of the present invention.
  • Application to gene therapy of a disease caused by a genetic abnormality or a disease treatable by the protein of the present invention or gene diagnosis is also conceivable.
  • the DNA of the present invention may be in any form as long as it can encode the protein of the present invention. That is, it does not matter whether it is cDNA synthesized from mRNA, genomic DNA, chemically synthesized DNA, or the like. Further, as long as it can encode the protein of the present invention, a DNA having an arbitrary base sequence based on the degeneracy of the genetic code is included.
  • the DNA of the present invention can be prepared by a method known to those skilled in the art.
  • a cDNA library is prepared from cells expressing the protein of the present invention, and hybridization is performed using a part of the DNA sequence of the present invention (for example, SEQ ID NO: 1 or 3) as a probe.
  • a part of the DNA sequence of the present invention for example, SEQ ID NO: 1 or 3
  • One of the cDNA libraries is
  • It can also be prepared by synthesizing oligo DNA based on 1) or 3), performing a PCR reaction using this as a primer, and amplifying cDNA encoding the protein of the present invention.
  • Genomic DNA can be isolated by screening the genomic DNA library using the obtained cDNA as a probe.
  • mRNA is isolated from cells, tissues, and organs that express the protein of the present invention (for example, mast cells or tissues that have been expressed by RT-PCR in this example).
  • mRNA can be isolated by known methods, for example, guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, JM et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), AGPC method (Chomczynski, P. and Sacchi, N., Anal. . Bioc em. (1987) 162, 156-1 Prepare total RNA according to 59) and purify mRNA from total RNA using mRNA Purification Kit (Pharmacia). Alternatively, mRNA can be directly prepared by using QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia).
  • CDNA is synthesized from the obtained mRNA using reverse transcriptase.
  • cDNA synthesis can also be performed using AMY Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (Seikagaku).
  • 5′-Ampli FINDER RACE Kit manufactured by Clontech
  • 5′-RACE method polymerase chain react ion; PCR
  • a target DNA fragment is prepared from the obtained PCR product, and ligated to the vector DNA. Further, a recombinant vector is prepared from this, introduced into E. coli, etc., and a colony is selected to prepare a desired recombinant vector.
  • the base sequence of the target DNA can be confirmed by a known method, for example, the dideoxynucleotide chain termination method.
  • a nucleotide sequence with higher expression efficiency can be designed in consideration of the codon usage of the host used for expression (Grantham, R. et al., Numeric Acids Research ( 1981) 9, 43-74).
  • the DNA of the present invention can be modified by a commercially available kit or a known method. Modifications include, for example, digestion with restriction enzymes, insertion of synthetic oligonucleotides or appropriate DNA fragments, addition of a linker, insertion of an initiation codon (ATG) and / or termination codon (TAA, TGA, or TAG). No.
  • the DNA of the present invention is a DNA consisting of a base sequence from base a at position 148 to base g at position 1101 in the base sequence of SEQ ID NO: 1, Includes DNA consisting of a base sequence from base a to base g at position 684.
  • the DNA of the present invention is a DNA that hybridizes with a DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3, and includes a DNA that encodes a protein functionally equivalent to the above-described protein of the present invention.
  • the conditions for hybridization can be appropriately selected by those skilled in the art, and specifically, the conditions described above can be used. Under these conditions, DNA with higher homology can be obtained as the temperature is increased.
  • the hybridizing DNA is preferably a naturally occurring DNA, for example, cDNA or chromosomal DNA.
  • the present invention also provides a vector into which the DNA of the present invention has been inserted.
  • the vector of the present invention is useful for retaining the DNA of the present invention in a host cell or expressing the protein of the present invention.
  • Escherichia coli when Escherichia coli is used as a host, the vector is amplified in Escherichia coli (for example, JM109, DH5a, HBIOK XLlBlue), etc. There is no particular limitation as long as it further has a transformed gene for selection of Escherichia coli (eg, a drug resistance gene that can be identified by any drug (ampicillin, tetracycline, kanamycin, chloramphenicol)).
  • a transformed gene for selection of Escherichia coli eg, a drug resistance gene that can be identified by any drug (ampicillin, tetracycline, kanamycin, chloramphenicol)
  • vectors include M13-based vectors, pUC-based vectors, BR322, pBluescript, pCR-Script, and the like.
  • an expression vector is particularly useful.
  • the host may be JM109, DH5a, HBIOK XLl-Blue, etc.
  • a promoter that can be efficiently expressed in Escherichia coli such as the lacZ promoter (Ward et al., Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427) It is essential to have the araB promoter (Better et al., Science (198 8) 240, 1041-1043), or the T7 promoter. is there.
  • Such vectors include pGEX-5X-1 (Pharmacia), QIAexpress systemj (Qiagen), pEGFP, or pET (in this case, the host is T7 RNA polymerase) in addition to the vector described above. BL21 that is expressed is preferred).
  • the vector may include a signal sequence for polypeptide secretion.
  • a signal sequence for protein secretion a pelB signal sequence (Lei, SP et al., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) may be used for production in E. coli periplasm.
  • the introduction of the vector into the host cell can be performed, for example, using a chloride solution method or an electroporation method.
  • a mammalian expression vector for example, pcDM3 (manufactured by Invitrogen) or pEG F-BOS (Nucleic Acids. Res.
  • insect vector-derived expression vectors eg, Bac-to-BAC baculovairus express ion system (manufactured by Gibco BRL), pBacPAK8), plant-derived expression vectors
  • An expression vector derived from an animal virus eg, pHSV, pMV, pAdexLcw
  • an expression vector derived from a retrovirus eg, pZIPneo
  • an expression vector derived from yeast eg, HPicliia Express
  • pNVlI Bacillus subtilis
  • SP-Q01 Bacillus subtilis
  • promoters required for expression in cells such as the SV40 promoter (Mulligan et al., Nature (1979) 277, 108) ), MMLV-LTR promoter overnight, EFla promoter-(Mizusliima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), it is essential to have a CMV promoter, etc. It is more preferable to have a gene (for example, a drug-resistant gene that can be distinguished by a drug (neomycin, G418, etc.)) for selecting Cp.
  • a gene for example, a drug-resistant gene that can be distinguished by a drug (neomycin, G418, etc.
  • a vector having such properties examples include pMAM, pDR2 pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, p0P13, and the like.
  • a vector having a DHFR gene complementing the nucleic acid synthesis pathway-deficient CH0 cell is used. (E.g., pCHOI) and then amplify it with methotrexate (MTX).
  • MTX methotrexate
  • the gene expressing the SV40 T antigen is placed on the chromosome.
  • One method is to use a COS cell that has the SV40 origin of replication to transform with a vector (such as pcD).
  • a vector such as pcD
  • the origin of replication those derived from poliovirus, adenovirus, pipapi-mavirus (BPV) and the like can also be used.
  • the expression vector is selected as a selection marker to amplify the gene copy number in the host cell system, such as aminoglycoside transferase (APH) gene, thymidine kinase (TK) gene, and Escherichia coli xanthinguanine phospholiposyl transferase (Ecogpt). Gene, dihydrofolate reductase (dhfr) gene and the like.
  • the DNA of the present invention is incorporated into an appropriate vector, for example, by a retrovirus method, ribosome method, catonic ribosome method, adenovirus method, or the like.
  • a retrovirus method for example, a retrovirus vector, ribosome method, catonic ribosome method, adenovirus method, or the like.
  • a method for introduction into the body This makes it possible to perform gene therapy for a disease caused by mutation of the gene encoding the protein of the present invention.
  • the vector used include, but are not limited to, an adenovirus vector (for example, pAdexl cw) and a retrovirus vector (for example, pZIPneo).
  • General genetic manipulation such as insertion of the DNA of the present invention into a vector can be performed according to a conventional method (Molecular Cloning, 5.61-5.63).
  • Administration into a living body may be performed by the exra method or by the in / ra method.
  • the present invention also provides a host cell into which the vector of the present invention has been introduced.
  • the host cell into which the vector of the present invention is introduced is not particularly limited, and for example, Escherichia coli and various animal cells can be used.
  • the host cell of the present invention can be used, for example, as a production system for producing or expressing the protein of the present invention.
  • Protein Production systems for quality production include in vitro and ⁇ in r / ra 'production systems. Examples of the in vitro production system include a production system using eukaryotic cells and a production system using prokaryotic cells.
  • animal cells for example, animal cells, plant cells, and fungal cells can be used as hosts.
  • animal cells mammalian cells, for example, CHO (J. Exp. Med. (1995) 108, 945), COS, 3T3, myeloma, BHK (baby hams ter kidney), He La, Vero, amphibian cells, for example, Africa Olive cells of the clawed frog (Val le, et al., Nature (1981) 291, 358-340), or insect cells such as Sf9, Sf21, and Tn5 are known.
  • Examples of CH0 cells include dhfr-CHO (Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the vector can be introduced into a host cell by, for example, the calcium phosphate method, the DEAE dextran method, the method using the Cationic Ribosome D0TAP (Boehringer Mannheim), the electro-boration method, the Lipofexion method, etc. It is.
  • yeast for example, Saccharomyces genus Waccharoinyces, for example, Saccharomyces cerevisia, filamentous fungi, for example, Aspergillus genus, for example, Aspergillus niger (known as Aspergillus niger). I have.
  • bacterial cells When prokaryotic cells are used, there are production systems using bacterial cells.
  • bacterial cells include Escherichia coli (coll), for example, JM109, DH5a, HB101, and the like, and Bacillus subtilis.
  • the protein can be obtained by culturing at-1 1-.
  • the culture can be performed according to a known method.
  • DMEM, MEM, RPMI 1640, and IMM can be used as a culture solution of animal cells.
  • a serum replacement solution such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination, or serum-free culture may be performed.
  • FCS fetal calf serum
  • the pH during culturing is preferably about 6-8. Culture is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 15 to 200 hours, and the medium is replaced, aerated, and agitated as necessary.
  • examples of a system for producing a protein in vivo include a production system using animals and a production system using plants.
  • the desired DNA is introduced into these animals or plants, and proteins are produced and recovered in the animals or plants.
  • the “host” in the present invention includes these animals and plants.
  • mice When using animals, there are production systems using mammals and insects. Goats, pigs, sheep, mice, and mice can be used as mammals (Vicki Glasser, SPECTRUM Biotechnology Applicat ions, 1993). When a mammal is used, a transgenic animal can be used.
  • the DNA of interest is prepared as a fusion gene with a gene encoding a protein that is specifically produced in milk, such as goat; 6 casein.
  • a DNA fragment containing the fusion gene is injected into a goat embryo, and the embryo is transplanted into a female goat.
  • the target protein can be obtained from milk produced by the transgenic goat born from the goat that has received the embryo or its progeny. Hormones may optionally be used in transgenic goats to increase the amount of milk containing proteins produced by the transgenic goats (Ebert, KM et al., Bio / Technology (1994) 12, 699-702).
  • silkworms can be used as insects, for example.
  • the target protein can be obtained from the body fluid of the silkworm by infecting the silkworm with a baculovirus into which DNA encoding the target protein has been inserted (Su SUM, ⁇ ⁇ et al., Nature (1985) 315, 592-594).
  • tobacco can be used. When using tobacco, insert the DNA encoding the protein of interest into a plant expression vector, e.g.!) M0N 530, and introduce this vector into bacteria such as Agrobacterium tumefaciens. I do.
  • the bacterium is infected with bacterium such as Nicotiana tapacum (cotiana tabacum), and the desired polypeptide can be obtained from bacco leaves in the evening (Julian K. -C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138).
  • the protein of the present invention thus obtained can be isolated from the inside or outside of the host cell (such as a medium) and purified as a substantially pure and homogeneous protein.
  • the separation and purification of the protein may be carried out by using the separation and purification methods used in ordinary protein purification, and is not limited in any way. For example, chromatography column, filter, ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, solvent extraction, distillation, immunoprecipitation, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, dialysis, recrystallization, etc. When combined, proteins can be separated and purified.
  • chromatography examples include affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reverse phase chromatography, and adsorption chromatography (St rategies for Protein in Purif icat). Ion and Character i zat ion: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). These chromatographys can be performed using liquid phase chromatography, for example, liquid phase chromatography such as HPL FPLC. The present invention also encompasses highly purified proteins using these purification methods.
  • the protein can be arbitrarily modified or partially removed by reacting the protein with an appropriate protein modifying enzyme before or after purification.
  • an appropriate protein modifying enzyme for example, trypsin, chymotrypsin, lysyl endopeptidase, protein kinase, dalcosidase and the like are used.
  • the present invention also provides an antibody that binds to the protein of the present invention.
  • the form of the antibody of the present invention is not particularly limited, and includes a monoclonal antibody in addition to a polyclonal antibody. Also included are antisera obtained by immunizing immunized animals such as rabbits with the protein of the present invention, polyclonal antibodies and monoclonal antibodies of all classes, as well as human antibodies and humanized antibodies obtained by genetic recombination.
  • the protein of the present invention used as a sensitizing antigen for obtaining an antibody is not limited to the animal species from which it is derived, but is preferably a protein derived from a mammal, such as a human, a mouse or a rat, and particularly preferably a protein derived from a human. .
  • Human-derived proteins can be obtained using the gene sequences or amino acid sequences disclosed herein.
  • the protein used as the sensitizing antigen may be a complete protein or a partial peptide of the protein.
  • the partial peptide of a protein include an amino group (N) terminal fragment and a carboxy (C) terminal fragment of a protein.
  • antibody refers to an antibody that reacts with the full length or fragment of a protein.
  • a gene encoding the protein of the present invention or a fragment thereof is inserted into a known expression vector system, and the vector is used to transform the host cell described in the present specification. May be obtained by a known method, and these may be used as a sensitizing antigen. Further, a cell expressing the protein, a lysate thereof, or a chemically synthesized protein of the present invention may be used as the sensitizing antigen. It is preferable that the short peptide is appropriately bound to a carrier protein such as keyhole limpet hemosinin, pepsin serum albumin, and ovalbumin to form an antigen.
  • a carrier protein such as keyhole limpet hemosinin, pepsin serum albumin, and ovalbumin to form an antigen.
  • the mammal to be immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, but is preferably selected in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion. In general, rodents Eyes, egrets, and primates are used.
  • mice for example, mice, rats, hamsters and the like are used.
  • egrets animals such as egrets are used.
  • monkeys are used.
  • monkeys of the lower nose are used (Old World Sal), for example, cynomolgus monkeys, rhesus monkeys, baboons, and chimpanzees.
  • Immunization of an animal with a sensitizing antigen is performed according to a known method.
  • a sensitizing antigen is injected intraperitoneally or subcutaneously into a mammal.
  • the sensitizing antigen is diluted and suspended in a suitable amount with PBS (Phosphate-Buffered Saline) or physiological saline, and then, if desired, a normal adjuvant, for example, Freund's complete adjuvant is added in an appropriate amount.
  • a normal adjuvant for example, Freund's complete adjuvant is added in an appropriate amount.
  • the mixture is administered to mammals. Thereafter, it is preferable to administer the sensitizing antigen mixed with an appropriate amount of incomplete Freund's adjuvant several times every 4 to 21 days.
  • an appropriate carrier can be used at the time of immunization with the sensitizing antigen. Immunization is performed in this manner, and it is confirmed by a conventional method that the level of the desired antibody in the serum is increased.
  • the blood of a mammal sensitized with the antigen is taken out.
  • the serum is separated from this blood by a known method.
  • a serum containing the polyclonal antibody may be used, or if necessary, a fraction containing the polyclonal antibody may be further isolated from this serum and used.
  • an affinity column to which the protein of the present invention is coupled a fraction that recognizes only the protein of the present invention is obtained, and this fraction is further purified by using a protein A or protein G column. Immunoglobulin G or M can be prepared.
  • immune cells may be removed from the mammal and subjected to cell fusion.
  • preferred immune cells used for cell fusion include spleen cells.
  • the other parent cell to be fused with the immune cell is preferably a mammalian myeloma cell, and more preferably, a fused cell selection by a drug. Myeloma cells that have acquired the properties for.
  • the cell fusion of the immune cells and myeloma cells is basically performed by a known method, for example, the method of Milstein et al. (Gal ire, G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (198 1) 73, 3-46). ) And the like.
  • the hybridoma obtained by cell fusion is selected by culturing it in a normal selective culture solution, for example, a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Culturing in the HAT culture solution is carried out for a time sufficient to kill cells other than the target hybridoma (non-fused cells), usually for several days to several weeks. Next, a conventional limiting dilution method is performed to screen and clone a hybridoma that produces the desired antibody.
  • a normal selective culture solution for example, a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Culturing in the HAT culture solution is carried out for a time sufficient to kill cells other than the target hybridoma (non-fused cells), usually for several days to several weeks.
  • a conventional limiting dilution method is performed to screen and clone a hybridoma that produces the desired antibody.
  • human lymphocytes for example, human lymphocytes infected with the EB virus, are expressed as proteins, protein-expressing cells or lysates thereof by W7 / O.
  • the sensitized lymphocytes can be fused with human-derived myeloma cells capable of permanent division, for example, U266, to obtain a hybridoma that produces a desired human antibody having protein binding activity ( Japanese Unexamined Patent Publication No. Sho 63-17688).
  • the obtained hybridoma was transplanted into the peritoneal cavity of a mouse, ascites was recovered from the mouse, and the obtained monoclonal antibody was subjected to, for example, ammonium sulfate precipitation, protein A, protein G column, DEAE ion exchange chromatography, It can be prepared by purifying the protein of the present invention using a coupled affinity column or the like.
  • the antibody of the present invention is used for purification and detection of the protein of the present invention, and is also a candidate for an agonist and an agonist of the protein of the present invention. It is also conceivable to apply this antibody to antibody therapy for diseases involving the protein of the present invention.
  • a human antibody or a humanized antibody is preferable in order to reduce immunogenicity.
  • anti-transgenic animals with a repertoire of human antibody genes An antibody-producing cell is obtained by immunizing the original protein, a protein-expressing cell or a lysate thereof, and a human antibody against the protein can be obtained using a hybridoma obtained by fusing the antibody-producing cell with myeloma cells (International Publication No. W092- 03918, W093-2227, W094-02602, W094-25585, W096-33735 and W096-34096).
  • cells in which immune cells such as sensitized lymphocytes producing antibodies are immortalized by oncogenes may be used.
  • the monoclonal antibody thus obtained can also be obtained as a recombinant antibody produced using genetic recombination technology (for example, Borrebaeck, CAK and Larrick, JW, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the See United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990).
  • Recombinant antibodies are produced by cloning the DNA encoding them from immunized cells such as hybridomas or sensitized lymphocytes producing the antibodies, incorporating them into an appropriate vector, and introducing them into a host to produce them.
  • the present invention includes this recombinant antibody.
  • the antibody of the present invention may be a modified antibody fragment thereof as long as it binds to the protein of the present invention.
  • Fab, F (ab ') 2, Fv or a single chain Fv (scFv) in which Hv and L chain Fv are linked by an appropriate linker Huston, JS et al, Pro Natl Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879-5883.
  • the antibody is treated with an enzyme such as papain or pepsin to generate an antibody fragment, or a gene encoding these antibody fragments is constructed and introduced into an expression vector. Expressed in cells (for example, Co, MS et al., J. Immunol.
  • modified antibody an antibody bound to various molecules such as polyethylene glycol (PEG) can be used.
  • PEG polyethylene glycol
  • Such a modified antibody can be obtained by subjecting the obtained antibody to chemical modification.
  • the antibody of the present invention can be prepared by using a chimeric antibody composed of a variable region derived from a non-human antibody and a constant region derived from a human antibody or a CDR derived from a non-human antibody (complementarity determining region) using a known technique. It can be obtained as a humanized antibody consisting of antibody-derived FR (framework region) and constant region.
  • the antibody obtained as described above can be purified to homogeneity.
  • the separation and purification of the antibody used in the present invention may be performed by the separation and purification methods used for ordinary proteins.
  • antibodies can be separated by appropriately selecting and combining chromatographic columns such as affinity chromatography, filtration, ultrafiltration, salting out, dialysis, SDS polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, etc.
  • the ability to purify (Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), but is not limited thereto.
  • the measurement can be performed by measurement of absorbance, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), or the like.
  • Columns used for affinity chromatography include a protein A column and a protein G column.
  • columns using a protein A column include Hyper D, P0R0S, Sepharose FF (Pharmacia) and the like.
  • Chromatography other than affinity chromatography includes, for example, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reverse phase chromatography, adsorption chromatography, etc. (Strategies for Protein in Purif icat ion and Character izat ion: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). These chromatography methods use liquid phase chromatography such as HPLC and FPLC. It can be carried out.
  • Methods for measuring the antigen-binding activity of the antibody of the present invention include, for example, measurement of absorbance, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), EIA (enzyme-linked immunosorbent assay), and RIA (radioimmunoassay). Immunoassay) or a fluorescent antibody method can be used.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • EIA enzyme-linked immunosorbent assay
  • RIA radioimmunoassay
  • a secondary antibody that recognizes an enzyme for example, an antibody labeled with alkaline phosphatase, etc.
  • an enzyme substrate such as P-nitrophenyl phosphate
  • BIAcore Pharmacia
  • the antibody of the present invention is brought into contact with the sample contained in the sample which is expected to contain the protein of the present invention, and an immune complex of the antibody and the protein is detected or measured.
  • the method for detecting or measuring a protein of the present invention can be carried out. Since the protein detection or measurement method of the present invention can specifically detect or measure a protein, it is useful for various experiments and the like using proteins.
  • the present invention also relates to a polypeptide comprising at least 15 nucleotides complementary to thigh A (DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3) encoding MC-PIR1 protein or MC-PIR2 protein or a complementary strand thereof. Provide nucleotides.
  • the “complementary strand” refers to one strand of a double-stranded nucleic acid consisting of A: T ( ⁇ ⁇ ⁇ in the case of RNA) and G: C base pairs with respect to the other strand.
  • the term “complementary” is not limited to a completely complementary sequence in at least 15 contiguous nucleotide regions, and is at least 70%, preferably at least 80%, more preferably 90%, Preferably, it should have at least 95% nucleotide sequence homology. Keys for determining homology The algorithm described in this specification may be used.
  • nucleic acids include probes and primers used for detection and amplification of DNA encoding the protein of the present invention, probes and primers for detecting expression of the DNA, and nucleotides for controlling the expression of the protein of the present invention.
  • nucleotide derivatives eg, antisense oligonucleotides and lipozymes, or DNAs encoding them.
  • Such a nucleic acid can also be used for producing a DNA chip.
  • the region on the 3 ′ side is complementary, and a restriction enzyme recognition sequence, evening DNA, etc. can be added to the 5 ′ side.
  • the antisense oligonucleotide includes, for example, an antisense oligonucleotide that hybridizes at any position in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3.
  • the antisense oligonucleotide is preferably an antisense oligonucleotide corresponding to at least 15 or more consecutive nucleotides in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3. More preferably, it is an antisense oligonucleotide in which at least 15 consecutive nucleotides contain a translation initiation codon.
  • the antisense oligonucleotide derivatives and modifications thereof can be used.
  • the modified product include a modified lower alkylphosphonate such as a methylphosphonate type or an ethylphosphonate type, a phosphorothioate modified product or a phosphoroamidate modified product.
  • Antisense oligonucleotides include not only those whose nucleotides corresponding to nucleotides constituting a predetermined region of DNA or mRNA are all complementary sequences, but also those having DNA or mRNA and an oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 1 or 3. As long as it can specifically hybridize to the nucleotide sequence, it includes one in which one or more nucleotide mismatches exist.
  • the antisense oligonucleotide derivative of the present invention is used for producing the protein of the present invention.
  • the antisense oligonucleotide derivative of the present invention can be used as an external preparation such as a liniment or a poultice by mixing with a suitable base material which is inactive against them.
  • excipients may be added to tablets, splinters, granules, capsules, ribosome capsules, It can be a lyophilized agent such as a propellant, a liquid, a nasal drop, and the like. These can be prepared according to a conventional method.
  • the antisense oligonucleotide derivative of the present invention is applied to a patient so as to be able to reach the affected area as a result of the force applied directly to the affected area of the patient or intravascular administration.
  • an antisense-encapsulated material that enhances durability and membrane permeability can be used.
  • ribosome, poly-L-lysine, lipid, cholesterol, lipofectin or a derivative thereof can be mentioned.
  • the dose of the antisense oligonucleotide derivative of the present invention can be appropriately adjusted according to the condition of the patient, and a preferable amount can be used. For example, it can be administered in the range of 0.1 to 100 mg / kg, preferably 0.1 to 50 mg / kg.
  • the antisense oligonucleotide of the present invention inhibits the expression of the protein of the present invention, and is therefore useful in suppressing the biological activity of the protein of the present invention. Further, an expression inhibitor containing the antisense oligonucleotide of the present invention is useful in that it can suppress the biological activity of the protein of the present invention.
  • the protein of the present invention is useful for screening for a compound that binds to the protein. That is, the protein of the present invention is brought into contact with a test sample expected to contain a compound that binds to the protein, and a compound having an activity of binding to the protein of the present invention is selected. Screening for compounds that bind to the protein of the present invention Used in law.
  • the protein of the present invention used for the screening may be a recombinant protein or a protein of natural origin. It may be a partial peptide. It may be in a form expressed on the cell surface or in a form as a membrane fraction.
  • the test sample is not particularly limited, and includes, for example, cell extract, cell culture supernatant, fermented microorganism product, marine organism extract, plant extract, purified or crude protein, peptide, non-peptide compound, and synthetic. Low molecular weight compounds and natural compounds.
  • the protein of the present invention which is brought into contact with a test sample, may be, for example, a purified protein, a soluble protein, a form bound to a carrier, a fusion protein with another protein, or a form expressed on a cell membrane.
  • the sample can be brought into contact with a test sample as a membrane fraction.
  • a method for screening a protein that binds to the protein using the protein of the present invention for example, many methods known to those skilled in the art can be used. Such screening can be performed, for example, by immunoprecipitation. Specifically, it can be performed as follows.
  • the gene encoding the protein of the present invention is introduced into a vector for expressing a foreign gene such as pSV2neo, pcDNA I, or pCD8, so that the gene is expressed in animal cells or the like.
  • a promoter used for expression is SV40 early promoter (Rigby In Williamson (ed.), Genetic Engineering, Vol.
  • SV40 late promoter Gheysen and Fiers J. Mol. Ap pl. Genet. 1, .385-394 (1982)
  • Adenovirus late promoter Kaufman et al. Mol. Cell Biol. 9, p. 946 (1989)
  • any commonly used promoter such as the HSV TK promoter may be used.
  • the protein of the present invention is expressed as a fusion protein having the recognition site of the monoclonal antibody by introducing a recognition site (epitope) of the monoclonal antibody of which specificity is known into the N-terminal or C-terminal of the protein of the present invention. Can be done.
  • a commercially available Boo antibody system can be used (Experimental Medicine 13, 85-90 (1995)).
  • Vectors capable of expressing a fusion protein with ⁇ -galactosidase, maltose binding protein, daltathione-S-transferase, green fluorescent protein (GFP), etc. via a multicloning site are commercially available. .
  • polyhistidine His-tag
  • influenza agglutinin M human c-myc, FLAG, Vesicules to matitis virus glycoprotein (VSV-GP), T7 genelO protein (T7-tag), human simple Epitopes such as herpesvirus glycoprotein (HSV-tag) and E-tag (epitopes on monoclonal phages) and monoclonal antibodies recognizing them
  • VSV-GP Vesicules to matitis virus glycoprotein
  • T7 genelO protein T7 genelO protein
  • HSV-tag herpesvirus glycoprotein
  • E-tag epitope-binding proteins that bind to the protein of the present invention.
  • an immunocomplex is formed by adding these antibodies to a cell lysate prepared using an appropriate surfactant.
  • This immune complex comprises the protein of the present invention, a protein capable of binding thereto, and an antibody.
  • immunoprecipitation can also be performed using antibodies against the protein of the present invention.
  • Antibodies against the protein of the present invention include, for example, a gene encoding the protein of the present invention introduced into an appropriate E. coli expression vector, expressed in E. coli, and the expressed protein is purified. It can be prepared by immunizing goats and chickens. Alternatively, it can be prepared by immunizing the above animal with the synthesized partial peptide of the protein of the present invention.
  • the immune complex can be precipitated using Protein in A Sepharose or Protein G Sepharose.
  • the protein of the present invention is prepared as a fusion protein with, for example, an epitope such as GST, the protein of the present invention is prepared using a substance that specifically binds to these epitopes such as daltathione-Sepharose 4B.
  • An immune complex can be formed as in the case of using the above antibody.
  • SDS-PAGE is generally used for the analysis of immunoprecipitated proteins, and by using a gel of an appropriate concentration, it is possible to analyze proteins bound by the molecular weight of the protein.
  • SDS-polyacrylamide The desired protein can be purified from the protein and its sequence can be determined.
  • Examples of a method for isolating a protein that binds to the protein using the protein of the present invention include, for example, a West Western blotting method (Skolnik, EY et al., Cell (1991) 65, 83). -90). That is, a phage vector is obtained from a cell, tissue, or organ (for example, an adipocyte or a tissue in which expression was confirmed by Northern blotting in Examples) which is expected to express a protein that binds to the protein of the present invention. (Agtll, ZAP, etc.) to produce a cDNA library, express it on LB-agarose, fix the expressed protein on a filter, purify and label the protein of the present invention and the above-mentioned filter.
  • a West Western blotting method Skolnik, EY et al., Cell (1991) 65, 83).
  • a phage vector is obtained from a cell, tissue, or organ (for example, an adipocyte or a tissue
  • the plaque expressing the protein bound to the protein of the present invention may be detected by labeling.
  • the method for labeling the protein of the present invention include a method using the binding property of biotin and avidin, and a method for specifically binding to the protein of the present invention or a peptide or polypeptide fused to the protein of the present invention (eg, GST).
  • the method include a method using an antibody that emits light, a method using a radioisotope, and a method using fluorescence.
  • the protein of the present invention or a partial peptide thereof is fused with an SRF DNA-binding region or GAL4 DNA-binding region and expressed in yeast cells, and the protein of the present invention and VP 16 or less than cells that are expected to express the binding protein Will prepare a cDNA library, as expressed in the form fused with GAL4 transcriptional activation region, which in the yeast cells Introduce and isolate cDNA from the library from the detected positive clones.
  • the protein encoded by the cDNA can be obtained by introducing the isolated cDNA into Escherichia coli and expressing it. This makes it possible to prepare a protein that binds to the protein of the present invention or its gene.
  • Reporter genes used in the 2_Hybrid system include, for example, HIS3 gene, Ade2 gene, LacZ gene, CAT gene, reluciferer gene, PAI-1 (Plasminogen act ivator inhibitor typel) gene, etc. But not limited to these. Screening by the two-hybrid method can be performed using mammalian cells in addition to yeast.
  • Screening for a compound that binds to the protein of the present invention can also be performed using affinity chromatography.
  • the protein of the present invention is immobilized on a carrier of an affinity column, and a test sample which is expected to express a protein that binds to the protein of the present invention is applied here.
  • the test sample includes, for example, a cell extract, a cell lysate, and the like. After applying the test sample, the column is washed to prepare a protein bound to the protein of the present invention.
  • the obtained protein is analyzed for its amino acid sequence, oligo DNA is synthesized based on the amino acid sequence, and a DNA library is screened using the DNA as a probe to obtain a DNA encoding the protein. .
  • a biosensor utilizing a surface plasmon resonance phenomenon can be used as a means for detecting or measuring the bound compound.
  • a biosensor utilizing the surface plasmon resonance phenomenon observes the interaction between the protein of the present invention and a test compound in real time as a surface plasmon resonance signal using a small amount of protein and without labeling.
  • BIAcore BIAcore, from Pharmacia. Therefore, it is possible to evaluate the binding between the protein of the present invention and a test compound by using a biosensor such as BIAcore.
  • the method for isolating not only proteins but also compounds that bind to the protein of the present invention includes, for example, synthetic compounds,
  • a method for screening a molecule that binds to the protein of the present invention by using a natural product bank or a random phage peptide display library, or a screening method using high throughput by combinatorial chemistry technology (Wrighton NC; Farrell FX ; Chang R; Kashyap AK; Bar bone FP; Mulcahy LS; Johnson DL; Barrett RW; Jolliffe LK; Dower WJ., Sma 11 peptides as potent mimetics of the protein hormone erythropoietin, Science (UNITED STATES) Jul 26 1996, 273 p458-64, Verdine GL.,
  • the present inventors have shown that the protein of the present invention binds to SHP-1, SHP-2, SHIP, DAP10, DAP12, or FcR protein. Therefore, the protein of the present invention, SHP-1 protein, SHP-2 protein, SHIP protein, DAP10 protein, DAP12 protein in the presence of a test sample, Alternatively, drug candidate compounds can be screened by detecting the binding ability to the FcRr protein and selecting a compound that reduces these binding ability. That is, the present invention also comprises contacting the protein of the present invention with a protein selected from the group consisting of SHP-1 protein, SHP-2 protein, and SHIP protein in the presence of a test sample, and binding these proteins.
  • Another object of the present invention is to provide a screening method comprising detecting the activity and selecting a compound that reduces the binding activity of these proteins, as compared to the case where the activity is detected in the absence of a test sample.
  • the compound that can be isolated by the screening of the present invention is a candidate for a drug for regulating the activity of the protein of the present invention, and is used to evaluate the disease caused by abnormal expression or function of the protein of the present invention and the activity of the protein of the present invention.
  • Cure of diseases curable by control Application to medical treatment is conceivable. Examples of such a disease include diseases related to mast cell signal transduction, for example, allergic diseases such as atopic dermatitis, rhinitis, and asthma.
  • Substances that can be partly converted by addition, deletion and / or substitution of the structure of a compound that can be isolated using the screening method of the present invention are also included in the compounds that bind to the protein of the present invention.
  • the protein of the present invention is prepared from a human mammal, for example, a mouse, rat, guinea pig, rabbit, chicken, cat, dog, sheep, pig, pig, monkey,
  • a human mammal for example, a mouse, rat, guinea pig, rabbit, chicken, cat, dog, sheep, pig, pig, monkey
  • a known pharmaceutical method for example, sterile solutions or suspensions in tablets, capsules, elixirs, and microcapsules, orally coated with sugar or water or other pharmaceutically acceptable liquids, as appropriate. It can be used parenterally in the form of liquid injections.
  • pharmacologically acceptable carriers or vehicles such as sterile water or saline, vegetable oils, emulsifiers, suspending agents, surfactants, stabilizers, flavoring agents, excipients, vehicles, Formulation may be made by combining with preservatives, binders and the like as appropriate and mixing in the unit dosage form required for accepted pharmaceutical practice.
  • the amount of the active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose in the specified range can be obtained.
  • Additives that can be incorporated into tablets and capsules include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth gum, and acacia, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid. Suitable leavening agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cellulose are used.
  • the unit dosage form is a capsule, the above materials may further contain a liquid carrier such as an oil or fat.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice using a vehicle such as distilled water for injection.
  • Aqueous injection solutions include, for example, saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants, such as D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, and sodium chloride. It may be used in combination with a solubilizing agent, for example, alcohol, specifically, ethanol, polyalcohol, for example, propylene glycol, polyethylene glycol, a nonionic surfactant, for example, polysorbate 80 (TM), or HCO-50.
  • TM polysorbate 80
  • HCO-50 nonionic surfactant
  • oily liquid include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with benzyl benzoate or benzyl alcohol as a solubilizing agent.
  • a buffer for example, a phosphate buffer, a sodium acetate buffer, a soothing agent, for example, proforce hydrochloride, a stabilizer, for example, benzyl alcohol, phenol, or an antioxidant.
  • a buffer for example, a phosphate buffer, a sodium acetate buffer
  • a soothing agent for example, proforce hydrochloride
  • a stabilizer for example, benzyl alcohol, phenol, or an antioxidant.
  • the prepared injection solution is usually filled into an appropriate ampoule.
  • Administration to a patient can be performed, for example, by intraarterial injection, intravenous injection, subcutaneous injection, etc., or intranasally, transbronchially, intramuscularly, transdermally, or orally by a method known to those skilled in the art. Can do better.
  • the dose varies depending on the weight and age of the patient, the administration method, and the like, but those skilled in the art can appropriately select an appropriate dose.
  • the compound can be encoded by DNA, the DNA may be incorporated into a vector for gene therapy to perform gene therapy.
  • the dose and the administration method vary depending on the patient's body weight, age, symptoms and the like, but can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the dose of the protein of the present invention may vary depending on the administration subject, target organ, symptoms, and administration method.
  • the dose is usually daily for an adult (assuming a body weight of 60 kg). It is considered to be 20 nig from about lOO g.
  • the dose of the compound that binds to the protein of the present invention or the compound that modulates the activity of the protein of the present invention varies depending on the symptoms. It is believed to be about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per.
  • the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, and administration method.
  • an injection usually an adult (assuming a body weight of 60 kg)
  • the dose can be administered in terms of the amount converted per 60 kg body weight or the amount converted per body surface area.
  • FIG. 1 shows the cDNA sequence of MC-PIR1 and the translated amino acid sequence.
  • the underlined dotted line in the DNA sequence is the DNA fragment recovered by SST-REX.
  • the poly A signal is underlined. Signal sequences are shown in lower case.
  • Bold underlines indicate transmembrane domains.
  • Double underlining indicates the ITIM sequence.
  • the cysteine that forms the SS bond is indicated by a box.
  • the binding sequence of the asparagine-linked sugar chain is indicated by a box.
  • FIG. 2 is a diagram showing an open reading frame of MC-PIR2.
  • the signal sequence is shown in lower case.
  • Bold underlines indicate transmembrane domains. Lysines in the transmembrane domain that are important for binding to other conjugate molecules having an ITAM sequence are indicated by boxes.
  • the cysteine that forms the SS bond is indicated by a box.
  • the binding sequence of the asparagine-linked sugar chain is indicated by a box.
  • FIG. 3 is an electrophoretic photograph showing the results of expression analysis of MC-PIR1 and MC-PIR2 in various organs. GAPDH was used as a control.
  • FIG. 4 is an electrophoresis photograph showing the results of RT-PCR expression analysis of MC-PIR1 and MC-PIR2 in various cells. GAPDH was used as a control.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of FACS analysis showing that MC-PIR1 and MC-PIR2 are present on the mast cell surface.
  • FIG. 6 is an electrophoretic photograph showing the results of tyrosine phosphorylation by cross-linking of the chimeric protein with an anti-mouse IgG antibody.
  • FIG. 7 is an electrophoretic photograph showing the results of association with phosphotyrosine phosphatase, SHP-1 and SHP-2 and phosphoinositide phosphatase, and SHIP.
  • FIG. 8 is an electrophoretic photograph showing that MC-PIR2 associates with a signaling molecule having ITAM, DAP10, DAP12, or FcRr.
  • FIG. 9 is a diagram showing the signal transduction of Fc ⁇ and the inhibitory effect of MC-PIR1. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • CDNA was synthesized from poly (A) + RNA by random hexamer using the Superscript CHOICE system (Invitrogen) and inserted into the BstXI site of the pMX-SST vector using a BsI adapter. (Invitrogen).
  • the ligated DNA was amplified with DH10B cells (Elect Mouth Max, Invitrogen) and used with the Qiagen Plasmid Kit (Qiagen, Inc., Valencia, Calif.). Then, library DNA was prepared. The size of the cDNA library was 2.0 ⁇ 10 6 clones.
  • a quasivalent retrovirus displaying the SST-REX library was produced using the packaged cell line Plat-E (Morita, S. et al. (2000) Gene Therapy, 7, 1063-1066). Ba / F3 cells were infected as described. After infection day, cells were washed 3 times, IL using a 96-well multi-tie evening first plate (10 3 / Ueru) - Clones were selected in the absence of 3.
  • genomic DNA was extracted from factor-independent Ba / F3 clones and submitted for genomic PCR.
  • the incorporated cDNA was recovered using the vector primer (GGGGGTGGAC CATCCTCTA / SEQ ID NO: 5, and CGCGCAGCTGTAAACGGTAGZ SEQ ID NO: 6).
  • GeneAmp PCR System 480 Perkin-Elmer, Norwalk, Conn.
  • LA TaQ Polymerase Yukara, Kyoto, Japan
  • the resulting PCR fragments were sequenced using the TaQ Dye Terminator One Cycle Sequencing Kit (Arabid Biosystems, Inc., Foss Yuichi City, CA) to obtain an automated sequencer (377 Gene Analyzer). Analyzed by Aplied Biosystems, Inc.
  • the mouse marrow-derived cultured mast cells used in the experiment were prepared as follows. Bone marrow cells prepared from the femoral bone of CBA / JN mice, 10% FCS, 100 units of / ml penicillin, 100 ig / ml streptomycin, and 5% in RPMI 1640 containing 10 ng / ml mouse IL- 3 C0 2 At 37 ° C. The cells were subcultured every few days at a density of 5 ⁇ 10 5 cells and maintained for 4 weeks to differentiate the cells. Ba / F3, a mouse IL-3-dependent pro-B cell line, was cultured in an R PMI 1640 medium containing 10% FCS and 1 ng / ml mouse IL-3 (R & D Systems).
  • mast cells were sensitized with 0.5 g / ml anti-DNP-IgE antibody (Sigma) and stimulated with 100 ng / ml DNP-BSA (Cosmo Bio) for 2 hours on the following day.
  • a cDNA library using oligo d-T primers was constructed.
  • CDNA was synthesized from poly (A) + RNA using oligo d-T primers using Superscript-Chiyois TM System (Invitrogen), and PME18S vector was synthesized using BstXI adapter. It was inserted into the BstXI site in the evening (Invitrogen).
  • ligated MA was amplified into DH10B cells and library DNA was prepared using a plasmid purification kit (Qiagen, Inc., Valencia, CA). The size of one cDNA library was 1.5 ⁇ 10 8 clones.
  • cDNA Full-length cDNA was isolated by hybridization using RecA (Daiichi Pure Chemicals, Tokyo, Japan). A PCR reaction was performed using the previously isolated cDNA fragment as type III, and a probe of about 500 bp into which biotin 21-dUTP (Clontech) was incorporated was synthesized. This probe was hybridized with the Oligo d-TcDNA library in the presence of RecA. DNA recovered with streptavidin-magnetic beads (Promega) was amplified in DH10B cells (Elect Mouth Max, Invitrogen) to obtain an E. coli clone.
  • the obtained Escherichia coli clone was mass-cultured, and DNA was prepared using a Qiagen-plasmid kit (Qiagen Inc.). Automated sequencer (377 Gene Analyzer, Applied Biosystems) by sequencing using TaQ Dynaminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Inc., Foster City, Calif.) ' ⁇ Ink).
  • Qiagen-plasmid kit Qiagen Inc.
  • Automated sequencer (377 Gene Analyzer, Applied Biosystems) by sequencing using TaQ Dynaminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Inc., Foster City, Calif.) ' ⁇ Ink).
  • the obtained cDNA had a total length of 1752 base pairs, and 957 residues were an open reading frame.
  • the 3 'side had 648 residues and had a poly A addition signal.
  • the translated amino acid sequence has 318 residues, a signal sequence of 27 residues, an extracellular domain of 156 residues, a transmembrane domain of 23 residues, and an intracellular domain of 112 residues.
  • the intracellular domain had four ITIM-like sequences (FIG. 1). This gene was designated as MC-PIR1.
  • CMRF-35-H9 CMR F-35H
  • IRp60 Cantoni, C. et al., Eur. J. Immunol. 29, 3148-3159, 1999, Accession No. AJ224864
  • CM RF-35H and IRp60 are expressed in mast cells.
  • MC-PIR1 a gene sequence having approximately 90% homology to the imnoglobulin domain of MC-PIR1 was obtained (Accession # BC006801). . Primers were prepared based on the obtained sequence information. RT-PCR was performed using total RNA prepared from mast cells, and expression of the same gene product was observed. Further, DNA fragments were recovered and sequenced.
  • MC-PIR2 A gene almost identical to the sequence registered in the Gene De Bank overnight (two bases differed from Accession No. BC006801 and two amino acid substitutions were found) was obtained and named MC-PIR2. 2). Later, MC-PIR2 was found to encode exactly the same protein as DlgRl (Luo, K. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 287, 35-41, 2001; Accession No. AY048685). Was. Further, as a human gene showing homology to the mouse-derived gene, CMRF-35A (Clark, GJ et al., T issue Antigens 57, 415-423, 2001, Accession No. BC022279) exists. However, it is not known that DlgRl or CMRF-35A is expressed in mast cells, and its function is unknown.
  • the DNA fragment was transformed into a ⁇ type using Qiagen (Qiagen), and the gene fragment was amplified by PCR.
  • the amplified DNA fragment was separated on 1% agarose-agar.
  • MC-PIR1 and MC-PIR2 were highly expressed in spleen and liver. In both cases, amplification of specific DNA fragments was performed using mouse bone marrow-derived cultured mast cells (BW C). No amplification was seen with MC-PIRl in other cell lines, Ba / F3, A20, EL4, CTLL-2, FDC-P1, LG, 32Dcl3 J774.1, P815. MC-PIR2 was also expressed in J774.1, FDC-PI ( Figures 3 and 4). The above experimental results suggest that MC-PIR1 and MC-PIR2 are closely involved in the regulation of mast cell function.
  • a chimeric gene of FcaRI IB and MC-PIR1 was prepared. Gene fragments encoding the extracellular domain and transmembrane domain of FC TRIIB were amplified by PCR. Similarly, a gene fragment encoding the intracellular domain of MC-PI R1 was amplified by PCR. The mixture of both gene fragments was converted into type II, and the genetic fragment was again amplified by PCR to produce a chimeric gene. Thereafter, the chimeric gene fragment was digested with EcoRI and Notl, and inserted into pMX-IRES-puro vector to prepare pMX-IRES-puro-Fc-PIR1.
  • a high titer retrovirus presenting pMX-IRES-puro-Fc-PIRl was produced using the packaging cell line Plat-E, and as described FcRI IB-deficient cells ⁇ 1.6 cells (Jones, B. et al. (1986) J. Immunol., 136, 348-356).
  • One day after infection 1 / ig / ml puromycin (Clontech) was added to the medium, and the cells were further cultured for 1 week to obtain a chimeric gene-expressing cell line.
  • B-cell receptors expressed on the cell surface of the cell line expressing the chimeric gene, and cells obtained by cross-linking the chimera gene with an anti-mouse IgG antibody (Zymed) were collected over time and lysed with a cell lysis buffer.
  • a 2.4G monoclonal antibody (Becton Dickinson) and anti-rat IgG antibody-Sepharose were added to the cell lysate to precipitate immune complexes.
  • the resulting precipitate was digested with peptide N-glycosidase-F (Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.) and subjected to 10% polyacrylamide electrophoresis.
  • the immunocomplex separated by polyacrylamide electrophoresis was electrotransferred to Immobilon-P membrane (Millipore). After blocking the membrane with a buffer containing 10% FCS, the membrane was incubated with a 4G10 monoclonal antibody (Upstate Biotechnology), followed by an HRP-conjugated anti-mouse immunoglobulin antibody (Sigma). Thereafter, detection was performed with a chemiluminescence reagent (Pharmacia).
  • a membrane was prepared in the same manner.
  • the membrane was reacted with an anti-SHP-1 antibody (Santa Cruz), an anti-SHP-2 antibody (Santa Cruz), or an anti-SHIP antibody. Subsequent detection was performed similarly.
  • Tyrosine phosphorylation of the chimeric protein was detected 0.5 minutes after crosslinking.
  • SHP-1, SHP-2, and SHIP were contained in the immune complex containing the chimeric protein. These associations occurred depending on tyrosine phosphorylation of the chimeric protein (FIGS. 6 and 7).
  • MC-PIR2 was amplified by PCR.
  • the obtained gene fragment was digested with EcoRI and Notl, and then inserted into a pMKIT vector to prepare pMKIT-MC-PIR2-HA.
  • pMKIT-MC-PIR2-HA and pMKIT mock vector were transfected into C0S1 cells. Two days later, cells were collected and lysed with a cell lysis buffer. Anti-HA monoclonal antibody (12CA5, Roche Diagnostics) and Protein A Sepharose were added to the cell lysate to precipitate immunocomplexes. The obtained precipitate was subjected to 15 polyacrylamide electrophoresis. Immune complexes separated by polyacrylamide electrophoresis were electrically transferred to Immobilon-P Memplan (Millipore).
  • the membrane was incubated with anti-FLAG-M2 monoclonal antibody (Sigma), followed by HRP-conjugated anti-mouse immunoglobulin antibody (Sigma). Thereafter, detection was performed using a chemiluminescence reagent (Pharmacia).
  • MC-PIR2 is a signaling molecule having ITAM, DAP 10 (Wu, J. et al. (1999), Science 285, 730-732), DAP 12 (Lanier, LL et al. (1998), Nature 391, 703-707) or FcRr (Vivier, E. et al. (1992), Int. Immunol. 4, 13 13-1323) (Fig. 8). These results indicate that MC-PIR2 is involved in controlling activation signaling.
  • ITAM ITAM
  • a gene encoding a novel membrane protein derived from a mast cell and considered to be involved in the control of a signal transduction pathway of the mast cell is provided. Expression properties of these gene products and their binding to proteins involved in signal transduction Therefore, these are considered to suppress or activate signal transduction after mast cell antigen stimulation according to the following working hypothesis.
  • MC-PIR2 associates with the signaling molecules DAP10, DAP12 and FcRr having ITAM
  • MC-PIR2 causes activation through a phosphorylating enzyme such as Src family kinase or PI3 kinase (Wu, J. et al. (1999), Science 285, 730-732, Lanier, LL et al. (1998), Nature 391, 703-707, Vivier, E. et al. (1992), Int. Immunol. 4, 1313- 1323). Therefore, for example, inhibiting the association between MC-PIR2 and a signaling molecule having these ITAMs is expected to be able to suppress activation signaling. That is, MC-PIR2 itself may be a target molecule of a mast cell activation signal transduction inhibitor.
  • the gene expression products of MC-PIRK MC-PIR2, and their human homologs can be used for screening natural ligands, compounds that mimic their effects, or antibodies.
  • Ligands, compounds or antibodies obtained by screening using these expression products may inhibit mast cell activation signal transduction and become an anti-allergic agent with a novel mechanism of action.

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Abstract

独自に開発した効率的なシグナル配列トラップ法を用い、マウス骨髄由来培養マスト細胞cDNAライブラリのスクリーニングを行なった結果、I型の膜蛋白質をコードし、細胞外ドメインに一つのイムノグロブリンドメインを有し、細胞内に抑制性シグナルを伝達するモチーフを有する遺伝子を同定することに成功した。

Description

明細書 マスト細胞由来の膜タンパク質 技術分野
本発明は、 マスト細胞に由来する、 新規な膜蛋白質およびその遺伝子、 並びに それらの製造および用途に関する。 背景技術
マスト細胞は、 アトピー性皮膚炎、 鼻炎、 喘息などのアレルギー疾患において、 抗原刺激によりヒスタミン等の炎症関連物質を放出するエフェクター細胞として 働くことが知られている。 現在、 これらのアレルギー疾患の治療薬としては、 抗 ヒスタミン剤ゃステロイドなどのマスト細胞からの炎症関連物質の生成あるいは 遊離を抑制する薬剤、 あるいはその作用に拮抗する薬剤が使用されているが、 よ り選択性の高い有効な薬剤の出現が望まれている。
これまでマスト細胞のシグナル伝達経路の制御に関与する膜タンパクの候補と して、 Fc r RI IB、 gp49B、 SIRP ο;等が知られているが、 アレルギー疾患に関与す る抗原刺激応答を制御するメカニズムの全体像は明らかにされていない。 発明の開示
本発明は、 マスト細胞に由来し、 マスト細胞のシグナル伝達経路の制御に関与 すると考えられる新規な膜タンパク質およびその遺伝子、 並びにそれらの製造お よび用途を提供する。 本膜タンパク質は、 マスト細胞における抗原刺激応答ある いは生存 ·増殖シグナル伝達の制御メカニズムの解明に利用可能である。
本発明者等は、 上記課題を解決するために、 マスト細胞に関してよく特徴付け されたモデルであるマウス骨髄由来培養マスト細胞から cDNAライブラリを調製し、 レトロウイルス媒介発現クローニングシステム （Ki tamura, T. et al. (1995) Pro c. Nat l. Acad. Sci. USA 92, 9146-9150) を用いて独自に開発した効率的なシ グナル配列トラップ法 （SST-REX法） (Koj ima, T. and Ki tamura, T. (1999) Natur e Biotechnol. 17, 487-490) を用い、 シグナルペプチド (von Hei j ne, (1985) J. Mol. Biol. 184, 99-105) を有する分子のスクリーニングを行なった。 SST- REX法で は恒常的活性型サイトカインレセプター MPLとの融合蛋白質を発現するライブラ リーをスクリーニングすることによって、 MPLを細胞表面に発現させることがで きる蛋白質をコードする cDNAを探索する。 この方法では、 MPLの細胞表面への発 現による、 IL-3依存性の細胞株への自律増殖能の賦与を指標とするため、 簡便に 目的のクローンを選別できる。
本発明者等は、 2. 0 X 106のクローンをスクリーニングした結果、 I型の膜蛋白 質をコードし、 細胞外ドメインに一つのィムノグロブリンドメインを有し、 細胞 内に抑制性シグナルを伝達するモチーフを有する遺伝子を同定した。 それを MC-P IR1と命名した （その後 LMIR1と改名） 。 また、 MC- PIR1のィムノグロブリンドメ インとアミノ酸レベルでおよそ 90%相同性を有する分子も同じ遺伝子ライブラリ —から見出し、 MC- PIR2と命名した （その後 LMIR2と改名） 。
これらの遺伝子は、 マスト細胞に特異的な発現分布を示した。 また、 MC-PIR1 は、 架橋することによりリン酸化を受け、 シグナル伝達経路の制御に関与するァ ダプタ一タンパクであるホスホチロシン脱リン酸化酵素 SHP-1および SHP- 2、 およ びホスホイノシチド脱リン酸化酵素 SHIPとの結合性を示した。 また、 MC- PIR2は、 ITAMを有するシグナル伝達分子 DAP10、 DAP12, FcR rと会合した。 従って、 これ らのタンパク質はマスト細胞のシグナル伝達経路の制御に関与する膜タンパクで あると考えられる。
MC-PIR1および MC-PIR2はマウス由来の遺伝子であるが、 これらの塩基配列を基 に遺伝子検索を行った結果、 これらと相同性を示すヒト遺伝子 CMRF-35H、 IRp60、 及び CMRF-35Aの存在が明らかになった。 これらのヒト遺伝子がマスト細胞のシグ ナル伝達経路の制御に関与することは知られておらず、 MC - PIR1および MC-PIR2を 利用して得られた知見は、 これらのヒト遺伝子産物の新たな利用方法を提供する。
MC-PIRK MC-PIR2, 及びこれらのヒトホモログの天然リガンドは不明であるが、 これらの遺伝子発現産物を利用すればその天然リガンドの発見が可能である。 ま た、 同様に天然リガンドの作用をミミックする化合物あるいは抗体のスクリ一二 ングにも利用可能である。 このスクリ一ニングの結果得られる化合物もしくは抗 体は、 肥満細胞の活性化シグナル伝達を阻害し、 新規な作用メカニズムをもった 抗ァレルギ一剤となる可能性が考えられる。
本発明は、 マスト細胞に由来する膜タンパク質、 その遺伝子、 およびそれらと 機能的に同等な分子、 並びにそれらの製造および用途に関し、 より具体的には、
(1) 下記 （a) から （d) のいずれかに記載の DNA、
(a) 配列番号： 2または 4に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコー ドする DNA。
(b) 配列番号： 1または 3に記載の塩基配列のコード領域を含む DNA。
(c) 配列番号： 2または 4に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複 数のアミノ酸が置換、 欠失、 挿入、 および/または付加したアミ ノ酸配列を有する蛋白質をコードする DNA。
(d) 配列番号： 1または 3に記載の塩基配列からなる DNAとストリンジェ ントな条件下でハイプリダイズする DNA。
(2) SHP- 1蛋白質、 SHP- 2蛋白質、 SHIP蛋白質、 DAP10蛋白質、 DAP12蛋白質、 または FcRT蛋白質からなる群より選択される蛋白質と結合する蛋白質を コードする、 （1) に記載の DNA、
(3) (1) に記載の DNAによりコードされる蛋白質、
(4) (1) に記載の DNAが挿入されたベクター、
(5) (1) に記載の DNAまたは （4) に記載のベクターを保持する宿主細胞、
(6) (5) に記載の宿主細胞を培養し、 該宿主細胞またはその培養上清から 発現させた蛋白質を回収する工程を含む、 （3) に記載の蛋白質の製造方 法、
(7) (3) .に記載の蛋白質に結合する抗体、
( 8 ) 配列番号： 1または 3に記載の塩基配列からなる腿 Aまたはその相補鎖 に相補的な少なくとも 15ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、
(9) (3) 記載の蛋白質に結合する化合物のスクリーニング方法であって、
(a) 該蛋白質に被検試料を接触させる工程、
(b) 該蛋白質と被検試料との結合活性を検出する工程、
(c) 該蛋白質に結合する活性を有する化合物を選択する工程、
を含む方法、
(1 0) (3) に記載の蛋白質と SHP- 1蛋白質、 SHP- 2蛋白質、 SHIP蛋白質、 DA P10蛋白質、 DAP12蛋白質、 または FcRァ蛋白質からなる群より選択され る蛋白質との結合を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、
(a) 被検試料の存在下で （3) に記載の蛋白質と SHP-1蛋白質、 SHP- 2蛋 白質、 SHIP蛋白質、 DAP10蛋白質、 DAP12蛋白質、 または FcRァ蛋白 質からなる群より選択される蛋白質とを接触させる工程、
(b) これら蛋白質の結合活性を検出する工程、
(c) 被検試料非存在下で検出した場合と比較して、 これら蛋白質の結合 活性を低下させる化合物を選択する工程、
を含む方法。
(1 1) 抗アレルギー剤の製造方法であって、 （7) に記載の抗体または
(9) 若しくは （1 0) に記載の方法により得られた化合物と薬理学上 許容される担体若しくは媒体とを混合することを含む方法、
を提供するものである。
本発明は、 マスト細胞に由来し、 マスト細胞のシグナル伝達経路の制御に関与 すると考えられる新規な膜タンパク質をコードする遺伝子を提供する。 本発明者等は、 マウス骨髄由来培養マスト細胞から調製した cDNAライブラリを、 最近確立された新規シグナル配列トラップ法 （SST- REX法） によって検索するこ とにより、 I型の膜蛋白質をコードし、 細胞外ドメインに一つのィムノグロプリ ンドメインを有し、 細胞内に抑制性シグナルを伝達するモチ一フを有する 2つの 遺伝子を同定した。 MC- PIR1と命名した遺伝子の塩基配列を配列番号： 1に、 該 遺伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列を配列番号： 2に示す。 また、 MC- PIR 1のィムノグロブリンドメインとアミノ酸レベルでおよそ 90%相同性を有する、 M C - PIR2と命名した遺伝子の塩基配列を配列番号： 3に、 該遺伝子がコードする蛋 白質のアミノ酸配列を配列番号： 4に示す。 これらの遺伝子は、 マスト細胞に特 異的な発現分布を示した。 また、 MC- PIR1は、 抗原刺激によりリン酸化を受け、 シグナル伝達経路の制御に関与するアダプタータンパクであるホスホチロシン脱 リン酸化酵素 SHP-1および SHP_2、 およびホスホイノシチド脱リン酸化酵素 SHIPと の結合性を示した。 また、 MC-P IR2は、 ITAMを有するシグナル伝達分子 DAP 10、 DA P 12、 FcR rと会合した。 これらのタンパク質はマスト細胞のシグナル伝達経路の 制御に関与する膜タンパクであると考えられ、 例えば、 肥満細胞の活性化シグナ ル伝達を阻害する新規な作用メ力ニズムをもった抗ァレルギ一剤の開発などへの 利用が期待される。
本発明は、 また、 MC-PIR1、 MC- PIR2蛋白質をコードする DNA (配列番号： 1ま たは 3に記載の塩基配列からなる DNA) と機能的に同等な蛋白質を包含する。 こ のような蛋白質には、 例えば、 これら蛋白質の変異体、 マウス以外の生物のホモ ログ等が含まれる。 ここで 「機能的に同等」 とは、 対象となる蛋白質が MC- PIR1、 MC - P IR2蛋白質と同様の生物学的あるいは生化学的活性を有することを指す。 こ のような活性としては、 例えば、 抗原刺激によりリン酸化を受け、 シグナル伝達 経路の制御に関与するアダプタ一タンパクであるホスホチロシン脱リン酸化酵素 SHP-1および SHP-2、 およびホスホイノシチド脱リン酸化酵素 SHIPと結合する活性 や、 ITAMを有するシグナル伝達分子 DAP 10、 DAP 12, FCR Tと結合する活性を例示 することができる。
ある蛋白質と機能的に同等な蛋白質を調製するための、 当業者によく知られた 方法としては、 蛋白質に変異を導入する方法が知られている。 例えば、 当業者で あれば、 部位特異的変異誘発法 (Hashimoto-Got oh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275, Zol ler, MJ, and Smi th, M. (1983) Methods Enzymol. 100, 468 - 500、 Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer W, and Fri tz HJ (1987) Methods. Enzymol. 154, 350—367、 Kunkel, TA (1985) Proc Nat 1 Acad Sci USA. 82, 488-492、 Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-276 6) などを用いて、 MC- PIR1蛋白質や MC-PIR2蛋白質 （配列番号： 2または 4に記 載のアミノ酸配列からなる蛋白質） のアミノ酸に適宜変異を導入することにより、 該蛋白質と機能的に同等な蛋白質を調製することができる。 また、 アミノ酸の変 異は自然界においても生じうる。 このように、 MC-PIR1蛋白質や MC-PIR2蛋白質の アミノ酸配列において 1もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を有し、 該蛋白質と機能的に同等な蛋白質もまた本発明の蛋白質に含まれる。 このような 変異体における、 変異するアミノ酸数は、 通常、 50アミノ酸以内であり、 好まし くは 30アミノ酸以内であり、 さらに好ましくは 10アミノ酸以内 （例えば、 5アミ ノ酸以内） であると考えられる。
変異するアミノ酸残基においては、 アミノ酸側鎖の性質が保存されている別の アミノ酸に変異されることが望ましい。 例えばアミノ酸側鎖の性質としては、 疎 水性アミノ酸 （A、 I、 し M、 F、 P、 W、 Y、 V) 、 親水性アミノ酸 （R、 D、 N、 E、 Q、 G、 H、 K、 S、 T) 、 脂肪族側鎖を有するアミノ酸 （G、 A、 V、 L、 I、 P) 、 水酸 基含有側鎖を有するアミノ酸 （S、 Τ、 Υ) 、 硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸 ( Μ) 、 カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸 （D、 N、 E、 Q) 、 塩 基含有側鎖を有するアミノ離 （R、 K、 Η) 、 芳香族含有側鎖を有するアミノ酸 （Η、 F、 Y、 W) を挙げることができる （括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表 す） 。 あるアミノ酸配列に対する 1又は複数個のアミノ酸残基の欠失、 付加及び/又 は他のアミノ酸による置換により修飾されたァミノ酸配列を有する蛋白質がその 生物学的活性を維持することはすでに知られている （Mark, D. F. et al. , Proc. Nat l. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666 、 Zol ler, M, J. & Smi th, M. N ucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500 、 Wang, A. et al. , Science 22 4, 1431-1433 、 Dalbadie - McFarland, G. et al. , Proc. Nat l. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413 ) 。
MC-PIRl蛋白質や MC-PIR2蛋白質のアミノ酸配列に複数個のアミノ酸残基が付加 された蛋白質には、 これら蛋白質を含む融合蛋白質が含まれる。 融合蛋白質は、 これら蛋白質と他のペプチド又は蛋白質とが融合したものであり、 本発明に含ま れる。 融合蛋白質を作製する方法は、 MC- PIR1蛋白質や MC-PIR2蛋白質 （配列番 号： 2または 4に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質） をコードする DNAと他の ペプチド又は蛋白質をコードする DNAをフレームが一致するように連結してこれ を発現べクタ一に導入し、 宿主で発現させればよく、 当業者に公知の手法を用い ることができる。 本発明の蛋白質との融合に付される他のペプチド又は蛋白質と しては、 特に限定されない。
本発明の蛋白質との融合に付される他のペプチドとしては、 例えば、 FLAG (Ho p, T. P. et al. , BioTechnology (1988) 6, 1204-1210 ) 、 6個の His (ヒスチ ジン） 残基からなる 6 XHis、 10 xHi s、 インフルエンザ凝集素 (HA) 、 ヒト c - myc の断片、 VSV- GPの断片、 pl8HIVの断片、 T7- tag、 HSV-tag 、 E-tag 、 SV40T抗原 の断片、 lck tag 、 α -tubul inの断片、 B- tag 、 Protein C の断片等の公知のぺ プチドを使用することができる。 また、 本発明の蛋白質との融合に付される他の 蛋白質としては、 例えば、 GST (ダル夕チオン一S—トランスフェラーゼ） 、 HA (インフルエンザ凝集素） 、 ィムノグロブリン定常領域、 j3—ガラクトシダ一ゼ、 MBP (マルト一ス結合蛋白質） 等が挙げられる。 市販されているこれらペプチド または蛋白質をコードする DNAを本発明の蛋白質をコードする DNAと融合させ、 こ れにより調製された融合 DNAを発現させることにより、 融合蛋白質を調製するこ とができる。
また、 ある蛋白質と機能的に同等な蛋白質を調製する当業者によく知られた他 の方法としては、 ハイブリダィゼ一シヨン技術 （Sambrook, J et al. , Molecular Cloning 2nd ed. , 9. 47-9. 58, Cold Spring Harbor Lab. press, 1989) を利用 する方法が挙げられる。 即ち、 当業者であれば、 MC- PIR1蛋白質や MC-PIR2蛋白質 をコードする DNA配列 （配列番号： 1と 3 ) もしくはその一部を基に、 これと相 同性の高い DNAを単離して、 該 DNAから MC-PIM蛋白質や MC-PIR2蛋白質と機能的に 同等な蛋白質を単離することも通常行いうることである。
本発明には、 MC-PIR1蛋白質や MC- PIR2蛋白質をコードする DNAとハイブリダィ ズする DNAがコードし、 MC- PIR1蛋白質や MC- PIR2蛋白質と機能的に同等な蛋白質 が含まれる。 このような蛋白質としては、 例えば、 マウスおよび他の哺乳動物の ホモログ （例えば、 ヒト、 ラット、 ゥサギ、 ゥシなどがコードする蛋白質） が挙 げられる。
MC-PIR1蛋白質や MC-PIR2蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードする DNAを単 離するためのハイブリダィゼーションの条件は、 当業者であれば適宜選択するこ とができる。 ハイプリダイゼーシヨンの条件としては、 例えば、 低ストリンジェ ントな条件が挙げられる。 低ストリンジェントな条件とは、 ハイブリダィゼーシ ヨン後の洗浄において、 例えば 42°C、 0. 1 X SSC、 0. 1 %SDSの条件であり、 好まし くは 50°C、 0. 1 X SSC 、 0. 1 %SDSの条件である。 より好ましいハイブリダィゼー シヨンの条件としては、 髙ストリンジェン卜な条件が挙げられる。 高ストリンジ ェントな条件とは、 例えば 65°C、 5 X SSC及び 0. 1 %SDSの条件である。 これらの条 件において、'温度を上げる程に高い相同性を有する DNAが効率的に得られること が期待できる。 但し、 ハイブリダィゼーシヨンのストリンジエンシーに影響する 要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、 当業者であればこれら要 素を適宜選択することで同様のストリンジエンシーを実現することが可能である。 また、 ハイブリダィゼーシヨンにかえて、 MC- PIR1蛋白質や MC-PIR2蛋白質をコ ードする DNA (配列番号： 1と 3 ) の配列情報を基に合成したプライマーを用い る遺伝子増幅法、 例えば、 ポリメラーゼ連鎖反応 （PCR) 法を利用して単離する ことも可能である。
これらハイプリダイゼーション技術や遺伝子増幅技術により単離される DNAが コードする、 MC-PIR1蛋白質や MC-PIR2蛋白質と機能的に同等な蛋白質は、 通常、 これら蛋白質 （配列番号： 2または 4に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質） と アミノ酸配列において高い相同性を有する。 本発明の蛋白質には MC-PIR1蛋白質 や MC- PIR2蛋白質と機能的に同等であり、 かつ該蛋白質のアミノ酸配列と高い相 同性を有する蛋白質も含まれる。 高い相同性とは、 アミノ酸レベルにおいて、 通 常、 少なくとも 50%以上の同一性、 好ましくは 75 %以上の同一性、 さらに好まし くは 85 %以上の同一性、 さらに好ましくは 95 %以上 （96%以上， 97%以上， 98% 以上， 99%以上) の同一性を指す。 蛋白質の相同性を決定するには、 文献 （Wi lb ur, W. J. and Lipman, D. J. Pro Nat l. Acad. Sc i. USA (1983) 80, 726-73 0) に記載のアルゴリズムにしたがえばよい。
本発明の蛋白質は、 後述するそれを産生する細胞や宿主あるいは精製方法によ り、 アミノ酸配列、 分子量、 等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。 し かしながら、 得られた蛋白質が、 MC-PIR1蛋白質や MC-PIR2蛋白質と同等の機能を 有している限り、 本発明に含まれる。 例えば、 本発明の蛋白質を原核細胞、 例え ば大腸菌で発現させた場合、 本来の蛋白質のアミノ酸配列の N末端にメチォニン 残基が付加される。 本発明の蛋白質はこのような蛋白質も包含する。
本発明の蛋白質は、 当業者に公知の方法により、 組み換え蛋白質として、 また 天然の蛋白質として調製することが可能である。 組み換え蛋白質であれば、 本発 明の蛋白質をコードする DNA (例えば、 配列番号： 1または 3に記載の塩基配列を 有する DNA)を、 適当な発現べクタ一に組み込み、 これを適当な宿主細胞に導入し て得た形質転換体を回収し、 抽出物を得た後、 イオン交換、 逆相、 ゲル濾過など のクロマトグラフィー、 あるいは本発明の蛋白質に対する抗体をカラムに固定し たァフィ二ティ一クロマトグラフィーにかけることにより、 または、 さらにこれ らのカラムを複数組み合わせることにより精製し、 調製することが可能である。 また、 本発明の蛋白質をダル夕チオン- S-トランスフェラーゼ蛋白質との融合 蛋白質として、 あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換え蛋白質として宿主 細胞 （例えば、 動物細胞や大腸菌など） 内で発現させた場合には、 発現させた組 み換え蛋白質はダルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製するこ とができる。 融合蛋白質の精製後、 必要に応じて融合蛋白質のうち、 目的の蛋白 質以外の領域を、 トロンビンまたはファクタ一 Xaなどにより切断し、 除去するこ とも可能である。
天然の蛋白質であれば、 当業者に周知の方法、 例えば、 本発明の蛋白質を発現 している組織や細胞の抽出物に対し、 後述する本発明の蛋白質に結合する抗体が 結合したァフィ二ティ一カラムを作用させて精製することにより単離することが できる。 抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であつてもよ い。
本発明は、 また、 本発明の蛋白質の部分ペプチドを包含する。 本発明の部分べ プチドは、 少なくとも 7アミノ酸以上、 好ましくは 8アミノ酸以上、 さらに好ま しくは 9アミノ酸以上のアミノ酸配列からなる。 該部分ペプチドは、 例えば、 本 発明の蛋白質に対する抗体の作製、 本発明の蛋白質に結合する化合物のスクリ一 ニングゃ、 本発明の蛋白質の促進剤や阻害剤のスクリーニングに利用し得る。 ま た、 本発明の蛋白質のアン夕ゴニストや競合阻害剤になり得る。 本発明の部分ぺ プチドは、 遺伝子工学的手法、 公知のペプチド合成法、 あるいは本発明の蛋白質 を適切なぺプチダーゼで切断することによって製造することができる。 ぺプチド の合成は、 例えば、 固相合成法、 液相合成法のいずれによってもよい。
本発明の蛋白質をコードする DNAは、 上述したような本発明の蛋白質の//? vivo や in Γ 7 における生産に利用される他、 例えば、 本発明の蛋白質をコードする 遺伝子の異常に起因する疾患や本発明の蛋白質により治療可能な疾患の遺伝子治 療、 あるいは遺伝子診断などへの応用も考えられる。 本発明の DNAは、 本発明の 蛋白質をコードしうるものであればいかなる形態でもよい。 即ち、 mRNAから合成 された cDNAであるか、 ゲノム DNAであるか、 化学合成 DNAであるかなどを問わない。 また、 本発明の蛋白質をコードしうる限り、 遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基 配列を有する DNAが含まれる。
本発明の DNAは、 当業者に公知の方法により調製することができる。 例えば、 本発明の蛋白質を発現している細胞より cDNAライブラリーを作製し、 本発明の DN Aの酉己列 （例えば、 配列番号： 1または 3 ) の一部をプローブにしてハイブリダ ィゼーシヨンを行うことにより調製できる。 cDNAライブラリ一は、 例えば、 文献
(Sambrook, J. et al. , Molecular Clonings Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ) に記載の方法により調製してもよいし、 市販の MAライブラリー を用いてもよい。 また、 本発明の蛋白質を発現している細胞より RNAを調製し、 逆転写酵素により cDNAを合成した後、 本発明の DNAの配列 （例えば、 配列番号：
1または 3 ) に基づいてオリゴ DNAを合成し、 これをプライマーとして用いて PCR 反応を行い、 本発明の蛋白質をコードする cDNAを増幅させることにより調製する ことも可能である。
また、 得られた cDNAの塩基配列を決定することにより、 それがコードする翻訳 領域を決定でき、 本発明の蛋白質のアミノ酸配列を得ることができる。 また、 得 られた cDNAをプローブとしてゲノム DNAライブラリ一をスクリ一二ングすること により、 ゲノム DNAを単離することができる。
具体的には、 次のようにすればよい。 まず、 本発明の蛋白質を発現する細胞、 組織、 臓器 (例えば、 マスト細胞や本実施例における RT-PCRにより発現が認めら れた組織） から、 mRNAを単離する。 mRNAの単離は、 公知の方法、 例えば、 グァニ ジン超遠心法（Chirgwin, J. M. et al. , Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) 、 AGPC法 （Chomczynski, P. and Sacchi, N. , Anal. Bioc em. (1987) 162, 156-1 59) 等により全 RNAを調製し、 mRNA Pur i f icat ion Ki t (Pharmacia) 等を使用し て全 RNAから mRNAを精製する。 また、 QuickPrep mRNA Puri f icat ion Ki t (Pharma c ia) を用いることにより mRNAを直接調製することもできる。
得られた mRNAから逆転写酵素を用いて cDNAを合成する。 cDNAの合成は、 AMY R everse Transcriptase First-strand cDNA Synthes i s Ki t (生化学工業）等を用 いて行うこともできる。 また、 本明細書に記載されたプライマー等を用いて、 5 ' -Ampl i FINDER RACE Ki t (Clontech製）およびポリメラーゼ連鎖反応 (polymera se chain react ion ； PCR)を用いた 5' - RACE法（Frokian, M. A. et al. , Proc. N at l. Acad. Sci. U. S. A. (1988) 85， 8998-9002 ； Belyavsky, A. et al. , Nucl e ic Ac ids Res. (1989) 17, 2919-2932) に従い、 cDNAの合成および増幅を行う ことができる。
得られた PCR産物から目的とする DNA断片を調製し、 ベクタ一 DNAと連結する。 さらに、 これより組換えべクタ一を作製し、 大腸菌等に導入してコロニーを選択 して所望の組換えべクタ一を調製する。 目的とする DNAの塩基配列は、 公知の方 法、 例えば、 ジデォキシヌクレオチドチェインターミネーション法により確認す ることができる。
また、 本発明の DNAにおいては、 発現に使用する宿主のコドン使用頻度を考慮 して、 より発現効率の高い塩基配列を設計することができる （Grantham, R. et al. , Nucel ic Acids Research (1981) 9, 43-74 ) 。 また、 本発明の DNAは、 巿 販のキットや公知の方法によって改変することができる。 改変としては、 例えば、 制限酵素による消化、 合成オリゴヌクレオチドや適当な DNAフラグメントの挿入、 リンカ一の付加、 開始コドン （ATG) 及び/又は終止コドン （TAA、 TGA、 又は TA G) の挿入等が挙げられる。
本発明の DNAは、 具体的には、 配列番号： 1の塩基配列において 148位の塩基 aか ら 1101位の塩基 gまでの塩基配列からなる DNA、 配列番号： 3の塩基配列において 1 位の塩基 aから 684位の塩基 gまでの塩基配列からなる DNAを包含する。 本発明の DNAはまた、 配列番号： 1または 3に示す塩基配列からなる DNAとハイ ブリダィズする DNAであり、 且つ上記本発明の蛋白質と機能的に同等な蛋白質を コードする DNAを含む。 ハイブリダイゼーシヨンにおける条件は当業者であれば 適宜選択することができるが、 具体的には上記した条件を用いることができる。 これらの条件において、 温度を上げる程に高い相同性を有する DNAを得ることが できる。 上記のハイブリダィズする DNAは、 好ましくは天然由来の DNA、 例えば cD NA又は染色体 DNAである。
本発明は、 また、 本発明の DNAが挿入されたベクターを提供する。 本発明のベ クタ一としては、 宿主細胞内において本発明の DNAを保持したり、 本発明の蛋白 質を発現させるために有用である。
ベクターとしては、 例えば、 大腸菌を宿主とする場合には、 ベクターを大腸菌 (例えば、 JM109、 DH5 a , HBIOK XLlBlue) などで大量に増幅させ大量調製する ために、 大腸菌で増幅されるための 「ori」 をもち、 さらに形質転換された大腸 菌の選抜遺伝子 （例えば、 なんらかの薬剤 （アンピシリンやテトラサイクリン、 カナマイシン、 クロラムフエ二コール） により判別できるような薬剤耐性遺伝 子） を有すれば特に制限はない。 ベクターの例としては、 M13系ベクター、 pUC系 ベクター、 BR322, pBluescript, pCR - Scriptなどが挙げられる。 また、 cDNAの サブクローニング、 切り出しを目的とした場合、 上記ベクターの他に、 例えば、 pGEM_T、 pDI ECT, pT7などが挙げられる。 本発明の蛋白質を生産する目的におい てベクターを使用する場合には、 特に、 発現ベクターが有用である。 発現べクタ 一としては、 例えば、 大腸菌での発現を目的とした場合は、 ベクタ一が大腸菌で 増幅されるような上記特徴を持つほかに、 宿主を JM109、 DH5 a、 HBIOK XLl-Blu eなどの大腸菌とした場合においては、 大腸菌で効率よく発現できるようなプロ モーター、 例えば、 lacZプロモータ一 （Wardら， Nature (1989) 341, 544-546； FASEB J. (1992) 6, 2422-2427) 、 araBプロモーター （Bet terら， Science (198 8) 240, 1041-1043 ) 、 または T7プロモーターなどを持っていることが不可欠で ある。 このようなベクターとしては、 上記べクタ一の他に pGEX- 5X- 1 (フアルマ シァ社製） 、 「QIAexpress sys temj (キアゲン社製） 、 pEGFP、 または pET (この 場合、 宿主は T7 RNAポリメラーゼを発現している BL21が好ましい）などが挙げら れる。
また、 ベクターには、 ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていて もよい。 蛋白質分泌のためのシグナル配列としては、 大腸菌のペリブラズムに産 生させる場合、 pelBシグナル配列 (Lei, S. P. et al. , J. Bacteriol. (1987) 169, 4379 ) を使用すればよい。 宿主細胞へのベクタ一の導入は、 例えば塩化力 ルシゥム法、 エレクトロポレ一シヨン法を用いて行うことができる。
大腸菌以外にも、 例えば、 本発明の蛋白質を製造するためのベクターとしては、 哺乳動物由来の発現ベクター （例えば、 pcDM3 (インビトロゲン社製） や、 pEG F-BOS (Nucle ic Acids. Res. 1990, 18 (17) , p5322) , pEF、 pCDM8 ) 、 昆虫細胞 由来の発現べクタ一 （例えば Bac-to-BAC baculovairus express ion sys temj (ギブコ BRL社製） 、 pBacPAK8) 、 植物由来の発現べクタ一 （例えば ρΜΗ1、 pMH 2) 、 動物ウィルス由来の発現ベクター （例えば、 pHSV、 pMV、 pAdexLcw ) 、 レ トロウィルス由来の発現ベクター （例えば、 pZIPneo) 、 酵母由来の発現べクタ 一 （例えば、 HPicliia Express ion Ki t」 （インビトロゲン社製） 、 pNVl l 、 SP- Q01) 、 枯草菌由来の発現ベクター （例えば、 pPL608、 PKTH50) が挙げられる。
CH0細胞、 COS細胞、 NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、 細胞内で発現させるために必要なプロモーター、 例えば SV40プロモーター （Mul l iganら， Nature (1979) 277, 108) 、 MMLV- LTRプロモ一夕一、 EFl aプロモータ ― (Mizusliimaら， Nucle ic Acids Res. (1990) 18, 5322) 、 CMVプロモーターな どを持っていることが不可欠であり、 細胞への形質転換を選抜するための遺伝子 (例えば、 薬剤 （ネオマイシン、 G418など） により判別できるような薬剤耐性遺 伝子） を有すればさらに好ましい。 このような特性を有するベクターとしては、 例えば、 pMAM、 pDR2 pBK - RSV、 pBK-CMV, pOPRSV, p0P13などが挙げられる。 さらに、 遺伝子を安定的に発現させ、 かつ、 細胞内での遺伝子のコピー数の増 幅を目的とする場合には、 核酸合成経路を欠損した CH0細胞にそれを相補する DHF R遺伝子を有するベクター （例えば、 pCHOIなど） を導入し、 メトトレキセート (MTX) により増幅させる方法が挙げられ、 また、 遺伝子の一過性の発現を目的 とする場合には、 SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つ COS細胞を用い て SV40の複製起点を持つベクタ一 （pcDなど） で形質転換する方法が挙げられる。 複製開始点としては、 また、 ポリオ一マウィルス、 アデノウイルス、 ゥシパピ口 —マウィルス （BPV) 等の由来のものを用いることもできる。 さらに、 宿主細胞 系で遺伝子コピー数増幅のため、 発現ベクターは選択マ一カーとして、 アミノグ リコシドトランスフエラーゼ （APH) 遺伝子、 チミジンキナーゼ （TK) 遺伝子、 大腸菌キサンチングァニンホスホリポシルトランスフェラーゼ （Ecogpt) 遺伝子、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （dhf r) 遺伝子等を含むことができる。
一方、 動物の生体内で本発明の DNAを発現させる方法としては、 本発明の DNAを 適当なベクタ一に組み込み、 例えば、 レトロウイルス法、 リボソーム法、 カチォ ニックリボソーム法、 アデノウイルス法などにより生体内に導入する方法などが 挙げられる。 これにより、 本発明の蛋白質コードする遺伝子の変異に起因する疾 患に対する遺伝子治療を行うことが可能である。 用いられるベクタ一としては、 例えば、 アデノウイルスベクター （例えば pAdexl cw) やレトロウイルスベクター (例えば pZIPneo) などが挙げられるが、 これらに制限されない。 ベクターへの本 発明の DNAの挿入などの一般的な遺伝子操作は、 常法に従って行うことが可能で ある （Mol ecul ar Cloning , 5. 61-5. 63) 。 生体内への投与は、 ex ra法であつ て'も、 in /ra法であってもよい。
また、 本発明は、 本発明のベクターが導入された宿主細胞を提供する。 本発明 のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、 例えば、 大腸菌や 種々の動物細胞などを用いることが可能である。 本発明の宿主細胞は、 例えば、 本発明の蛋白質の製造や発現のための産生系として使用することができる。 蛋白 質製造のための産生系は、 in vitroお^ in r/ra'の産生系がある。 in vitroの 産生系としては、 真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げ られる。
真核細胞を使用する場合、 例えば、 動物細胞、 植物細胞、 真菌細胞を宿主に用 いることができる。 動物細胞としては、 哺乳類細胞、 例えば、 CHO (J. Exp. Med. (1995) 108, 945) 、 COS, 3T3、 ミエローマ、 BHK (baby hams ter kidney) 、 He La、 Vero、 両生類細胞、 例えばアフリカッメガエル卵母細胞 （Val l e, e t al. , Ν ature (1981) 291, 358-340) 、 あるいは昆虫細胞、 例えば、 Sf 9、 Sf 21、 Tn5が 知られている。 CH0細胞としては、 特に、 DHFR遺伝子を欠損した CH0細胞である dh f r-CHO (Proc. Nat l. Acad. Sc i. USA (1980) 77, 4216-4220) や CHO K-l (Proc. Nat l. Acad. Sc i. USA (1968) 60, 1275) を好適に使用することができる。 動 物細胞において、 大量発現を目的とする場合には特に CH0細胞が好ましい。 宿主 細胞へのベクターの導入は、 例えば、 リン酸カルシウム法、 DEAEデキストラン法、 カチォニックリボソーム D0TAP (ベーリンガーマンハイム社製） を用いた方法、 エレク卜ロボ一レーシヨン法、 リポフエクシヨンなどの方法で行うことが可能で ある。
植物細胞としては、 例えば、 ニコチアナ ·タパカム Nicotiana tabacua) 由 来の細胞が蛋白質生産系として知られており、 これをカルス培養すればよい。 真 菌細胞としては、 酵母、 例えば、 サッカロミセス Waccharoinyces 属、 例えば、 サッカロミセス ·セレピシェ ( accharomyces cerevisia ) 、 糸状菌、 例えば、 ァスペルギルス {Aspergillus) 属、 例えば、 ァスペルギルス ·二ガー (Aspergi llus niger) が知られている。
原核細胞を使用する場合、 細菌細胞を用いる産生系がある。 細菌細胞としては、 大腸菌 （ coll) 、 例えば、 JM109、 DH5 a、 HB 101等が挙げられ、 その他、 枯草 菌が知られている。
これらの細胞を目的とする DNAにより形質転換し、 形質転換された細胞を VI - 1 1 - で培養することにより蛋白質が得られる。 培養は、 公知の方法に従い行うこ とができる。 例えば、 動物細胞の培養液として、 例えば、 DMEM、 MEM, RPMI 1640、 IMMを使用することができる。 その際、 牛胎児血清 （FCS) 等の血清補液を併用 することもできるし、 無血清培養してもよい。 培養時の pHは、 約 6〜8であるのが 好ましい。 培養は、 通常、 約 30〜40°Cで約 15〜200時間行い、 必要に応じて培地 の交換、 通気、 攪拌を加える。
一方、 in で蛋白質を産生させる系としては、 例えば、 動物を使用する産 生系や植物を使用する産生系が挙げられる。 これらの動物又は植物に目的とする DNAを導入し、 動物又は植物の体内で蛋白質を産生させ、 回収する。 本発明にお ける 「宿主」 とは、 これらの動物、 植物を包含する。
動物を使用する場合、 哺乳類動物、 昆虫を用いる産生系がある。 哺乳類動物と しては、 ャギ、 ブタ、 ヒッジ、 マウス、 ゥシを用いることができる (Vicki Glas er， SPECTRUM Biotechnology Appl icat ions, 1993) 。 また、 哺乳類動物を用い る場合、 トランスジエニック動物を用いることができる。
例えば、 目的とする DNAを、 ャギ ;6カゼインのような乳汁中に固有に産生され る蛋白質をコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。 次いで、 この融合 遺伝子を含む DNA断片をャギの胚へ注入し、 この胚を雌のャギへ移植する。 胚を 受容したャギから生まれるトランスジエニックャギ又はその子孫が産生する乳汁 から、 目的の蛋白質を得ることができる。 トランスジエニックャギから産生され る蛋白質を含む乳汁量を増加させるために、 適宜ホルモンをトランスジエニック ャギに使用してもよい (Ebert, K. M. et al. , Bio/Technology (1994) 12, 699 - 702) 。
また、 昆虫としては、 例えばカイコを用いることができる。 カイコを用いる場 合、 目的の蛋白質をコードする DNAを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染 させることにより、 このカイコの体液から目的の蛋白質を得ることができる （Su SUM, Μ· et al. , Nature (1985) 315, 592-594) 。 さらに、 植物を使用する場合、 例えばタバコを用いることができる。 タバコを 用いる場合、 目的とする蛋白質をコードする DNAを植物発現用ベクター、 例えば!) M0N 530に挿入し、 このべクタ一をァグロバクテリウム ·ッメファシエンス < gr obacterium tumefaciens) のようなバクテリアに導入する。 このバクテリアを夕 バコ、 例えば、 ニコチアナ ·タパカム cotiana tabacum) に感染させ、 本夕 バコの葉より所望のポリペプチドを得ることができる （Jul ian K. -C. Ma e t al.， Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138) 。
これにより得られた本発明の蛋白質は、 宿主細胞内または細胞外 （培地など） から単離し、 実質的に純粋で均一な蛋白質として精製することができる。 蛋白質 の分離、 精製は、 通常の蛋白質の精製で使用されている分離、 精製方法を使用す ればよく、 何ら限定されるものではない。 例えば、 クロマトグラフィーカラム、 フィルター、 限外濾過、 塩析、 溶媒沈殿、 溶媒抽出、 蒸留、 免疫沈降、 SDS-ポリ アクリルアミドゲル電気泳動、 等電点電気泳動法、 透析、 再結晶等を適宜選択、 組み合わせれば蛋白質を分離、 精製することができる。
クロマトグラフィーとしては、 例えばァフィ二ティークロマ卜グラフィー、 ィ オン交換クロマトグラフィー、 疎水性クロマトグラフィー、 ゲル濾過、 逆相クロ マトグラフィー、 吸着クロマトグラフィ一等が挙げられる （St rategies for Pro te in Pur i f icat ion and Charac ter i zat ion : A Laboratory Course Manual. Ed D anie l R. Marshak e t al. , Cold Spr ing Harbor Laboratory Press, 1996) 。 こ れらのクロマトグラフィーは、 液相クロマトグラフィー、 例えば HPL FPLC等の 液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。 本発明は、 これらの精製方 法を用い、 高度に精製された蛋白質も包含する。
なお、 蛋白質を精製前又は精製後に適当な蛋白質修飾酵素を作用させることに より、 任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。 蛋白質 修飾酵素としては、 例えば、 トリプシン、 キモトリブシン、 リシルエンドべプチ ダーゼ、 プロテインキナーゼ、 ダルコシダ一ゼなどが用いられる。 本発明は、 また、 本発明の蛋白質と結合する抗体を提供する。 本発明の抗体の 形態には、 特に制限はなく、 ポリクローナル抗体の他、 モノクローナル抗体も含 まれる。 また、 ゥサギなどの免疫動物に本発明の蛋白質を免疫して得た抗血清、 すべてのクラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、 さらにヒト抗 体や遺伝子組み換えによるヒト型化抗体も含まれる。
抗体取得の感作抗原として使用される本発明の蛋白質は、 その由来となる動物 種に制限されないが哺乳動物、 例えばヒト、 マウス又はラット由来の蛋白質が好 ましく、 特にヒト由来の蛋白質が好ましい。 ヒト由来の蛋白質は、 本明細書に開 示される遺伝子配列又はアミノ酸配列を用いて得ることができる。
本発明において、 感作抗原として使用される蛋白質は、 完全な蛋白質であって もよいし、 また、 蛋白質の部分ペプチドであってもよい。 蛋白質の部分ペプチド としては、 例えば、 蛋白質のアミノ基 （N) 末端断片やカルポキシ （C) 末端断片 が挙げられる。 本明細書で述べる 「抗体」 とは蛋白質の全長又は断片に反応する 抗体を意味する。
本発明の蛋白質又はその断片をコードする遺伝子を公知の発現ベクター系に揷 入し、 該ベクタ一で本明細書で述べた宿主細胞を形質転換させ、 該宿主細胞内外 から目的の蛋白質又はその断片を公知の方法で得て、 これらを感作抗原として用 いればよい。 また、 蛋白質を発現する細胞又はその溶解物あるいは化学的に合成 した本発明の蛋白質を感作抗原として使用してもよい。 短いペプチドは、 キーホ —ルリンペットへモシァニン、 ゥシ血清アルブミン、 卵白アルブミンなどのキヤ リア蛋白質と適宜結合させて抗原とすることが好ましい。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、 特に限定されるものではないが、 細 胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、 一般的に は、 げっ歯目、 ゥサギ目、 霊長目の動物が使用される。
げっ歯目の動物としては、 例えば、 マウス、 ラット、 ハムスター等が使用され る。 ゥサギ目の動物としては、 例えば、 ゥサギが使用される。 霊長目の動物とし ては、 例えば、 サルが使用される。 サルとしては、 狭鼻下目のサル （旧世界ザ ル） 、 例えば、 力二クイザル、 ァカゲザル、 マントヒヒ、 チンパンジー等が使用 される。
感作抗原を動物に免疫するには、 公知の方法にしたがって行われる。 一般的方 法としては、 感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射する。 具体的には、 感 作抗原を PBS (Phosphate- Buf fered Sal ine)や生理食塩水等で適当量に希釈、 懸濁 したものに対し、 所望により通常のアジュバント、 例えば、 フロイント完全アジ ュバントを適量混合し、 乳化後、 哺乳動物に投与する。 さらに、 その後、 フロイ ント不完全アジュバントに適量混合した感作抗原を、 4〜21日毎に数回投与する ことが好ましい。 また、 感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。 このように免疫し、 血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを常法により確認す る。
ここで、 本発明の蛋白質に対するポリクローナル抗体を得るには、 血清中の所 望の抗体レベルが上昇したことを確認した後、 抗原を感作した哺乳動物の血液を 取り出す。 この血液から公知の方法により血清を分離する。 ポリクローナル抗体 としては、 ポリクローナル抗体を含む血清を使用してもよいし、 必要に応じこの 血清からポリクロ一ナル抗体を含む画分をさらに単離して、 これを使用してもよ レ^ 例えば、 本発明の蛋白質をカップリングさせたァフィ二ティーカラムを用い て、 本発明の蛋白質のみを認識する画分を得て、 さらにこの画分をプロテイン A あるいはプロテイン Gカラムを利用して精製することにより、 免疫グロブリン Gあ るいは Mを調製することができる。
モノクローナル抗体を得るには、 上記抗原を感作した哺乳動物の血清中に所望 の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、 哺乳動物から免疫細胞を取り出し、 細胞融合に付せばよい。 この際、 細胞融合に使用される好ましい免疫細胞として、 特に脾細胞が挙げられる。 前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としては、 好 ましくは哺乳動物のミエローマ細胞、 より好ましくは、 薬剤による融合細胞選別 のための特性を獲得したミエローマ細胞が挙げられる。
前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、 例えば、 ミルスティンらの方法（Gal ire, G. and Mi l stein, C. , Methods Enzymol. (198 1) 73, 3- 46)等に準じて行うことができる。
細胞融合により得られたハイプリドーマは、 通常の選択培養液、 例えば、 HAT 培養液 （ヒポキサンチン、 アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液） で培養 することにより選択される。 当該 HAT培養液での培養は、 目的とするハイブリド 一マ以外の細胞 （非融合細胞） が死滅するのに十分な時間、 通常、 数日〜数週間 継続して行う。 次いで、 通常の限界希釈法を実施し、 目的とする抗体を産生する ハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニングを行う。
また、 ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイプリドーマを得る他に、 ヒト リンパ球、 例えば EBウィルスに感染したヒトリンパ球を//? W7/Oで蛋白質、 蛋白 質発現細胞又はその溶解物で感作し、 感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有 するミエローマ細胞、 例えば U266と融合させ、 蛋白質への結合活性を有する所望 のヒト抗体を産生するハイプリドーマを得ることもできる （特開昭 63- 17688号公 報） 。
次いで、 得られたハイブリド一マをマウス腹腔内に移植し、 同マウスより腹水 を回収し、 得られたモノクローナル抗体を、 例えば、 硫安沈殿、 プロテイン A、 プロテイン Gカラム、 DEAEイオン交換クロマトグラフィー、 本発明の蛋白質を力 ップリングしたァフィ二ティーカラムなどにより精製することで調製することが 可能である。 本発明の抗体は、 本発明の蛋白質の精製、 検出に用いられる他、 本 発明の蛋白質のァゴニストやアン夕ゴニストの候補になる。 また、 この抗体を本 発明の蛋白質が関与する疾患の抗体治療へ応用することも考えられる。 得られた 抗体を人体に投与する目的 （抗体治療） で使用する場合には、 免疫原性を低下さ せるため、 ヒト抗体やヒト型抗体が好ましい。
例えば、 ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジエニック動物に抗 原となる蛋白質、 蛋白質発現細胞又はその溶解物を免疫して抗体産生細胞を取得 し、 これをミエローマ細胞と融合させたハイプリドーマを用いて蛋白質に対する ヒト抗体を取得することができる （国際公開番号 W092- 03918、 W093-2227, W094- 02602、 W094-25585, W096- 33735および W096- 34096参照） 。
ハイプリドーマを用いて抗体を産生する以外に、 抗体を産生する感作リンパ球 等の免疫細胞を癌遺伝子（oncogene)により不死化させた細胞を用いてもよい。 このように得られたモノクローナル抗体はまた、 遺伝子組換え技術を用いて産 生させた組換え型抗体として得ることができる （例えば、 Borrebaeck, C. A. K. and Larrick, J. W. , THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Publ ished in the Uni ted Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 参照）。 組換え型抗体は、 それをコ一ドする DNAをハイプリドーマ又は抗体を産生する感作リンパ球等の免 疫細胞からクローニングし、 適当なベクターに組み込んで、 これを宿主に導入し 産生させる。 本発明は、 この組換え型抗体を包含する。
さらに、 本発明の抗体は、 本発明の蛋白質に結合する限り、 その抗体断片ゃ抗 体修飾物であってよい。 例えば、 抗体断片としては、 Fab、 F (ab' ) 2、 Fv又は H鎖 と L鎖の Fvを適当なリンカ一で連結させたシングルチェイン Fv (scFv) (Huston, J. S. et al , Pro Nat l. Acad. Sci. U. S. A. (1988) 85, 5879- 5883)が挙げら れる。 具体的には、 抗体を酵素、 例えば、 パパイン、 ペプシンで処理し抗体断片 を生成させるか、 又は、 これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、 これを発 現ベクターに導入した後、 適当な宿主細胞で発現させる （例えば、 Co, M. S. et al. , J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976 ； Bet ter, M. and Horwi tz, A. H. , Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496 ； Pluckthun, A. and Skerra, A.， Me thods Enzymol. (1989) 178, 497-515 ； Lamoyi, E. , Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663 ； Rousseaux, J. et al.， Methods Enzymol. (1986) 121, 663-6 69 ； Bird, R. E. and Walker, B. W. , Trends Biotec nol. (1991) 9, 132-137 参照)。 抗体修飾物として、 ポリエチレングリコール （PEG) 等の各種分子と結合した 抗体を使用することもできる。 本発明の 「抗体」 にはこれらの抗体修飾物も包含 される。 このような抗体修飾物は、 得られた抗体に化学的な修飾を施すことによ つて得ることができる。 これらの方法はこの分野において既に確立されている。 また、 本発明の抗体は、 公知の技術を使用して非ヒト抗体由来の可変領域とヒ ト抗体由来の定常領域からなるキメラ抗体又は非ヒト抗体由来の CDR (相補性決 定領域） とヒト抗体由来の FR (フレームワーク領域） 及び定常領域からなるヒト 型化抗体として得ることができる。
前記のように得られた抗体は、 均一にまで精製することができる。 本発明で使 用される抗体の分離、 精製は通常の蛋白質で使用されている分離、 精製方法を使 用すればよい。 例えば、 ァフィ二ティークロマトグラフィー等のクロマトグラフ ィーカラム、 フィル夕一、 限外濾過、 塩析、 透析、 SDSポリアクリルアミドゲル 電気泳動、 等電点電気泳動等を適宜選択、 組み合わせれば、 抗体を分離、 精製す ること力 sできる (Ant ibodies ： A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lan e, Cold Spr ing Harbor Laboratory, 1988) が、 これらに限定されるものではな レ 上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又は酵素結合免疫吸着検定法 (Enzyme-l inked immunosorbent assay； ELISA)等により行うことができる。
ァフィ二ティ一クロマトグラフィ一に用いるカラムとしては、 プロティン A力 ラム、 プロテイン Gカラムが挙げられる。 例えば、 プロテイン Aカラムを用いた カラムとして、 Hyper D， P0R0S, Sepharose F. F. (Pharmac i a)等が挙げられる。 ァフィ二ティ一クロマトグラフィー以外のクロマトグラフィ一としては、 例え ば、 イオン交換クロマトグラフィー、 疎水性クロマトグラフィー、 ゲル濾過、 逆 相クロマトグラフィー、 吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Strategies fo r Prote in Pur i f icat ion and Character izat ion ： A Laboratory Course Manual. Ed Dani e l R. Marshak et al. , Cold Spr ing Harbor Laboratory Press, 1996)。 これらのクロマトグラフィーは HPLC、 FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて 行うことができる。
また、 本発明の抗体の抗原結合活性を測定する方法として、 例えば、 吸光度の 測定、 酵素結合免疫吸着検定法 (Enzyme- l inked immunosorbent assay； ELISA) 、 EIA (酵素免疫測定法） 、 RIA (放射免疫測定法） あるいは蛍光抗体法を用いるこ とができる。 ELISAを用いる場合、 本発明の抗体を固相化したプレートに本発明 の蛋白質を添加し、 次いで目的の抗体を含む試料、 例えば、 抗体産生細胞の培養 上清や精製抗体を加える。 酵素、 例えば、 アルカリフォスファターゼ等で標識し た抗体を認識する二次抗体を添加し、 プレートをィンキュベーシヨンし、 次いで 洗浄した後、 P-ニトロフエニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定するこ とで抗原結合活性を評価することができる。 蛋白質として蛋白質の断片、 例えば その C末端からなる断片を使用してもよい。 本発明の抗体の活性評価には、 BIAco re (Pharmac i a製）を使用することができる。
これらの手法を用いることにより、 本発明の抗体と試料中に含まれる本発明の 蛋白質が含まれると予想される試料とを接触せしめ、 該抗体と該蛋白質との免疫 複合体を検出又は測定することからなる、 本発明の蛋白質の検出又は測定方法を 実施することができる。 本発明の蛋白質の検出又は測定方法は、 蛋白質を特異的 に検出又は測定することができるため、 蛋白質を用いた種々の実験等に有用であ る。
本発明はまた、 MC- PIR1蛋白質や MC- PIR2蛋白質をコードする腿 A (配列番号： 1または 3に記載の塩基配列からなる DNA) またはその相補鎖に相補的な少なく とも 15ヌクレオチドを含むボリヌクレオチドを提供する。
ここで 「相補鎖」 とは、 A : T (ただし RNAの場合は ϋ) 、 G: Cの塩基対からなる 2 本鎖核酸の一方の鎖に対する他方の鎖を指す。 また、 「相補的」 とは、 少なくと も 15個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、 少 なくとも 70% 、 好ましくは少なくとも 80% 、 より好ましくは 90% 、 さらに好まし くは 95% 以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。 相同性を決定するためのァ ルゴリズムは本明細書に記載したものを使用すればよい。
このような核酸には、 本発明の蛋白質をコードする DNAの検出や増幅に用いる プローブやプライマー、 該 DNAの発現を検出するためのプローブやプライマー、 本発明の蛋白質の発現を制御するためのヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体 (例えば、 アンチセンスオリゴヌクレオチドやリポザィム、 またはこれらをコー ドする DNA等） が含まれる。 また、 このような核酸は、 DNAチップの作製に利用す ることもできる。
プライマーとして用いる場合、 3'側の領域は相補的とし、 5'側には制限酵素認 識配列や夕グなどを付加することができる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、 例えば、 配列番号： 1または 3の 塩基配列中のいずれかの箇所にハイブリダィズするアンチセンスオリゴヌクレオ チドが含まれる。 このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、 好ましくは配列番 号： 1または 3の塩基配列中の連続する少なくとも 15個以上のヌクレオチドに対 するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。 さらに好ましくは、 連続する少な くとも 15個以上のヌクレオチドが翻訳開始コドンを含むアンチセンスオリゴヌク レオチドである。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、 それらの誘導体や修飾体を使用す ることができる。 修飾体として、 例えばメチルホスホネート型又はェチルホスホ ネ一ト型のような低級アルキルホスホネート修飾体、 ホスホロチォエート修飾体 又はホスホロアミデート修飾体等が挙げられる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、 DNA又は mRNAの所定の領域を構成するヌ クレオチドに対応するヌクレオチドが全て相補配列であるもののみならず、 DNA または mRNAとオリゴヌクレオチドとが配列番号： 1または 3に示される塩基配列 に特異的にハイブリダィズできる限り、 1又は複数個のヌクレオチドのミスマツ チが存在しているものも含まれる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、 本発明の蛋白質の産生細 胞に作用して、 該蛋白質をコードする DNA又は mRNAに結合することにより、 その 転写又は翻訳を阻害したり、 mRNA の分解を促進したりして、 本発明の蛋白質の 発現を抑制することにより、 結果的に本発明の蛋白質の作用を抑制する効果を有 する。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、 それらに対して不活性な 適当な基剤と混和して塗布剤、 パップ剤等の外用剤とすることができる。
また、 必要に応じて、 賦形剤、 等張化剤、 溶解補助剤、 安定化剤、 防腐剤、 無 痛化剤等を加えて錠剤、 散財、 顆粒剤、 カプセル剤、 リボソームカプセル剤、 注 射剤、 液剤、 点鼻剤など、 さらに凍結乾燥剤とすることができる。 これらは常法 にしたがって調製することができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は患者の患部に直接適用する 力 又は血管内に投与するなどして結果的に患部に到達し得るように患者に適用 する。 さらには、 持続性、 膜透過性を高めるアンチセンス封入素材を用いること もできる。 例えば、 リボソーム、 ポリ- L-リジン、 リピッド、 コレステロール、 リポフエクチン又はこれらの誘導体が挙げられる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体の投与量は、 患者の状態に応 じて適宜調整し、 好ましい量を用いることができる。 例えば、 0. 1 〜100mg/kg、 好ましくは 0. l〜50mg/kgの範囲で投与することができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは本発明の蛋白質の発現を阻害し、 従って本発明の蛋白質の生物学的活性を抑制することにおいて有用である。 また、 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する発現阻害剤は、 本発明の蛋 白質の生物学的活性を抑制することが可能である点で有用である。
本発明の蛋白質は、 これに結合する化合物のスクリーニングに有用である。 す なわち、 本発明の蛋白質と、 該蛋白質に結合する化合物を含むと予想される被検 試料とを接触せしめ、 そして本発明の蛋白質に結合する活性を有する化合物を選 択する、 ことからなる本発明の蛋白質に結合する化合物をスクリーニングする方 法において使用される。
スクリーニングに用いられる本発明の蛋白質は組換え蛋白質であっても、 天然 由来の蛋白質であってもよい。 また部分ペプチドであってもよい。 また細胞表面 に発現させた形態、 または膜画分としての形態であってもよい。 被検試料として は特に制限はなく、 例えば、 細胞抽出物、 細胞培養上清、 発酵微生物産生物、 海 洋生物抽出物、 植物抽出物、 精製若しくは粗精製蛋白質、 ペプチド、 非ペプチド 性化合物、 合成低分子化合物、 天然化合物が挙げられる。 被検試料を接触させる 本発明の蛋白質は、 例えば、 精製した蛋白質として、 可溶型蛋白質として、 担体 に結合させた形態として、 他の蛋白質との融合蛋白質として、 細胞膜上に発現さ せた形態として、 膜画分として被検試料に接触させることができる。
本発明の蛋白質を用いて、 例えば該蛋白質に結合する蛋白質をスクリーニング する方法としては、 当業者に公知の多くの方法を用いることが可能である。 この ようなスクリーニングは、 例えば、 免疫沈降法により行うことができる。 具体的 には、 以下のように行うことができる。 本発明の蛋白質をコードする遺伝子を、 pSV2neo, pcDNA I， pCD8 などの外来遺伝子発現用のベクタ一に揷入することで 動物細胞などで当該遺伝子を発現させる。 発現に用いるプロモータ一としては S V40 early promoter (Rigby In Williamson (ed. ) , Genetic Engineering, Vol.
3. Academic Press, London, p.83-141 (1982)), EF-1 promoter (Kimら Gene 91, p.217-223 (1990)), CAG promoter (Niwa et al. Gene 108, p.193-200 (1 991)), RSV LTR promoter (Cullen Methods in Enzymology 152, p.684-704 (19 87), SR promoter (Takebe et al. Mol. Cell. Biol. 8, p.466 (1988)), CM V immediate early promoter (Seed and Aruffo Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8
4, p.3365-3369 (1987)), SV40 late promoter (Gheysen and Fiers J. Mol. Ap pl. Genet. 1, .385-394 (1982)) , Adenovirus late promoter (Kaufman et al. Mol. Cell. Biol. 9, p. 946 (1989)), HSV TK promoter 等の一般的に使用で きるプロモーターであれば何を用いてもよい。 動物細胞に遺伝子を導入することで外来遺伝子を発現させるためには、 エレク トロポレーシヨン法 （Chu, G. et al. Nucl. Acids Res. 15, 1311-1326 (198 7) )、 リン酸カルシウム法 （Chen, C and Okayama, H. Mol. Cel l. Biol. 7, 274 5-2752 (1987) )、 DEAEデキストラン法 (Lopata, M. A. et al. Nucl. Ac ids Res. 12, 5707-5717 (1984)； Sussman, D. J. and Mi lman, G. Mol. Cel l. Biol. 4， 1642-1643 (1985) )、 リポフエクチン法 (Derij ard, B. Cel l 7, 1025-1037 (19 94)； Lamb, B. T. et al. Nature Genet ics 5, 22-30 (1993)； Ra indran, S. K. et al. Science 259, 230-234 (1993) )等の方法があるが、 いずれの方法によつ てもよい。
特異性の明らかとなっているモノクローナル抗体の認識部位 （ェピトープ） を 本発明の蛋白質の N末または C末に導入することにより、 モノクローナル抗体の認 識部位を有する融合蛋白質として本発明の蛋白質を発現させることができる。 用 いるェピ] ブー抗体系としては市販されているものを利用することができる (実験医学 13, 85-90 (1995) ) 。 マルチクローニングサイトを介して、 β—ガ ラクトシダ一ゼ、 マル卜一ス結合蛋白質、 ダルタチオン- S-トランスフェラーゼ、 緑色蛍光蛋白質 （GFP) などとの融合蛋白質を発現することができるベクターが 市販されている。
融合蛋白質にすることにより本発明の蛋白質の性質をできるだけ変化させない ようにするために数個から十数個のアミノ酸からなる小さなェピトープ部分のみ を導入して、 融合蛋白質を調製する方法も報告されている。 例えば、 ポリヒスチ ジン (His- tag) 、 インフルエンザ凝集素 M、 ヒト c- myc、 FLAG, Ves icu l ar s to mat i t i s ウィルス糖蛋白質 (VSV-GP) 、 T7 genelO 蛋白質 (T7-tag) 、 ヒト単純 ヘルぺスウィルス糖蛋白質 （HSV-tag) 、 E-tag (モノクローナルファージ上のェ ピトープ） などのェピトープとそれを認識するモノクローナル抗体を、 本発明の 蛋白質に結合する蛋白質のスクリーニングのためのェピトープ一抗体系として利 用できる （実験医学 13, 85-90 (1995) ) 0 免疫沈降においては、 これらの抗体を、 適当な界面活性剤を利用して調製した 細胞溶解液に添加することにより免疫複合体を形成させる。 この免疫複合体は本 発明の蛋白質、 それと結合能を有する蛋白質、 および抗体からなる。 上記ェピト —プに対する抗体を用いる以外に、 本発明の蛋白質に対する抗体を利用して免疫 沈降を行うことも可能である。 本発明の蛋白質に対する抗体は、 例えば、 本発明 の蛋白質をコードする遺伝子を適当な大腸菌発現ベクターに導入して大腸菌内で 発現させ、 発現させた蛋白質を精製し、 これをゥサギやマウス、 ラット、 ャギ、 ニヮトリなどに免疫することで調製することができる。 また、 合成した本発明の 蛋白質の部分べプチドを上記の動物に免疫することによって調製することもでき る。
免疫複合体は、 例えば、 抗体がマウス IgG抗体であれば、 Prote in A Sepharos eや Protein G Sepharoseを用いて沈降させることができる。 また、 本発明の蛋白 質を、 例えば、 GSTなどのェピトープとの融合蛋白質として調製した場合には、 ダルタチオン -Sepharose 4Bなどのこれらェピトープに特異的に結合する物質を 利用して、 本発明の蛋白質の抗体を利用した場合と同様に、 免疫複合体を形成さ せることができる。
免疫沈降の一般的な方法については、 例えば、 文献 （Harlow, E. and Lane, D.： Ant ibodies, pp. 511-552, Cold Spring Harbor Laboratory publ icat ions, New York (1988) ) 記載の方法に従って、 または準じて行えばよい。
免疫沈降された蛋白質の解析には SDS- PAGEが一般的であり、 適当な濃度のゲル を用いることで蛋白質の分子量により結合していた蛋白質を解析することができ る。 また、 この際、 一般的には本発明の蛋白質に結合した蛋白質は、 クマシー染 色や銀染色といった蛋白質の通常の染色法では検出することは困難であるので、 放射性同位元素である35 S-メチォニンや35 S-システィンを含んだ培養液で細胞を 培養し、 該細胞内の蛋白質を標識して、 これを検出することで検出感度を向上さ せることができる。 蛋白質の分子量が判明すれば直接 SDS-ポリアクリルアミドゲ ルから目的の蛋白質を精製し、 その配列を決定することもできる。
また、 本発明の蛋白質を用いて、 該蛋白質に結合する蛋白質を単離する方法と しては、 例えば、 ウェストウエスタンブロッテイング法 （Skolnik, E. Y. et a 1. , Cel l (1991) 65, 83-90) を用いて行うことができる。 すなわち、 本発明の蛋 白質と結合する蛋白質を発現していることが予想される細胞、 組織、 臓器 (例え ば、 脂肪細胞や実施例におけるノザンブロッティングにより発現が認められた組 織） よりファージベクター （A gt l l, ZAPなど） を用いた cDNAライブラリーを作 製し、 これを LB -ァガロース上で発現させフィルターに発現させた蛋白質を固定 し、 精製して標識した本発明の蛋白質と上記フィル夕一とを反応させ、 本発明の 蛋白質と結合した蛋白質を発現するプラークを標識により検出すればよい。 本発 明の蛋白質を標識する方法としては、 ピオチンとアビジンの結合性を利用する方 法、 本発明の蛋白質又は本発明の蛋白質に融合したペプチド又はポリペプチド (例えば GSTなど） に特異的に結合する抗体を利用する方法、 ラジオァイソトー プを利用する方法又は蛍光を利用する方法等が挙げられる。
また、 本発明のスクリーニング方法の他の態様としては、 細胞を用いた 2_ハイ ブリツドシステム （Fields, S. , and Sternglanz, R. , Trends. Genet. (1994) 1 0, 286-292、 Dal ton S, and Tre isman R (1992) Characterizat ion of SAP- 1, a protein recrui ted by serum response f actor to the c-fos serum response e lement. Cel l 68, 597 - 612、 rMATCHMARKER Two-Hybrid SystemJ , 「Mammal ian MATCHMAKER Two-Hybr id Assay Ki t」 ， 「MATCHM ER One-Hybr id SystemJ (いず れもクロンテック社製）、 「Hybri ZAP Two- Hybrid Vec tor SystemJ (ストラタジ ーン社製）） を用いて行う方法が挙げられる。 2-ハイブリッドシステムにおいて は、 本発明の蛋白質またはその部分ペプチドを SRF DNA結合領域または GAL4 DNA 結合領域と融合させて酵母細胞の中で発現させ、 本発明の蛋白質と結合する蛋白 質を発現していることが予想される細胞より、 VP 16または GAL4転写活性化領域と 融合する形で発現するような cDNAライブラリーを作製し、 これを上記酵母細胞に 導入し、 検出された陽性クローンからライブラリー由来 cDNAを単離する （酵母細 胞内で本発明の蛋白質と結合する蛋白質が発現すると、 両者の結合によりレポ一 夕一遺伝子が活性化され、 陽性のクローンが確認できる） 。 単離した cDNAを大腸 菌に導入して発現させることにより、 該 cDNAがコードする蛋白質を得ることがで きる。 これにより本発明の蛋白質に結合する蛋白質またはその遺伝子を調製する ことが可能である。 2_ハイプリッドシステムにおいて用いられるレポーター遺伝 子としては、 例えば、 HIS3遺伝子の他、 Ade2遺伝子、 LacZ遺伝子、 CAT遺伝子、 リレシフェラー 遺伝子、 PAI-1 (Pl asminogen act ivator inhibi tor typel) 遺伝 子等が挙げられるが、 これらに制限されない。 2-ハイブリッド法によるスクリー ニングは、 酵母の他、 哺乳動物細胞などを使って行うこともできる。
本発明の蛋白質と結合する化合物のスクリーニングは、 ァフィ二ティクロマ卜 グラフィーを用いて行うこともできる。 例えば、 本発明の蛋白質をァフィ二ティ —カラムの担体に固定し、 ここに本発明の蛋白質と結合する蛋白質を発現してい ることが予想される被検試料を適用する。 この場合の被検試料としては、 例えば 細胞抽出物、 細胞溶解物等が挙げられる。 被検試料を適用した後、 カラムを洗浄 し、 本発明の蛋白質に結合した蛋白質を調製することができる。
得られた蛋白質は、 そのアミノ酸配列を分析し、 それを基にオリゴ DNAを合成 し、 該 DNAをプロ一ブとして cDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、 該蛋白質をコードする DNAを得ることができる。
本発明において、 結合した化合物を検出又は測定する手段として表面ブラズモ ン共鳴現象を利用したバイオセンサ一を使用することもできる。 表面プラズモン 共鳴現象を利用したバイオセンサ一は、 本発明の蛋白質と被検化合物との間の相 互作用を微量の蛋白質を用いてかつ標識することなく、 表面プラズモン共鳴シグ ナルとしてリアルタイムに観察することが可能である （例えば BIAcore、 Pharmac ia製） 。 したがって、 BIAcore等のバイオセンサ一を用いることにより本発明の 蛋白質と被検化合物との結合を評価することが可能である。 また、 蛋白質に限らず、 本発明の蛋白質に結合する化合物 （ァゴ二ストおよび アン夕ゴニス卜を含む） を単離する方法としては、 例えば、 固定した本発明の蛋 白質に、 合成化合物、 天然物バンク、 もしくはランダムファージペプチドデイス プレイライブラリーを作用させ、 本発明の蛋白質に結合する分子をスクリ一ニン グする方法や、 コンビナトリアルケミストリー技術によるハイスループットを用 いたスクリーニング方法 （Wrighton NC; Farrell FX; Chang R; Kashyap AK; Ba rbone FP; Mulcahy LS; Johnson DL; Barrett RW; Jolliffe LK; Dower WJ. , Sma 11 peptides as potent mimetics of the protein hormone erythropoietin, Sc ience (UNITED STATES) Jul 26 1996, 273 p458-64、 Verdine GL. , The combina torial chemistry of nature. Nature (ENGLAND) Nov 7 1996, 384 pi卜 13、 Hog an JC Jr. , Directed combinatorial chemistry. Nature (ENGLAND) Nov 7 1996， 384 pi 7-9) が当業者に公知である。
また、 本発明者らにより、 本発明の蛋白質が、 SHP- 1蛋白質、 SHP-2蛋白質、 SH IP蛋白質、 DAP10蛋白質、 DAP12蛋白質、 または FcRァ蛋白質と結合することが示 された。 従って、 上記免疫沈降や 2-ハイブリッドシステムなどを利用して、 被検 試料の存在下における、 本発明の蛋白質と、 SHP-1蛋白質、 SHP- 2蛋白質、 SHIP蛋 白質、 DAP10蛋白質、 DAP12蛋白質、 または FcRr蛋白質との結合能を検出し、 こ れら結合能を低下させるような化合物を選択することにより、 医薬品候補化合物 をスクリーニングすることも可能である。 すなわち、 本発明は、 また、 被検試料 の存在下で本発明の蛋白質と SHP-1蛋白質、 SHP-2蛋白質、 または SHIP蛋白質から なる群より選択される蛋白質とを接触させ、 これら蛋白質の結合活性を検出し、 被検試料非存在下で検出した場合と比較して、 これら蛋白質の結合活性を低下さ せる化合物を選択することを含む、 スクリーニング方法をも提供するものである。 本発明のスクリーニングにより単離しうる化合物は、 本発明の蛋白質の活性を 調節するための薬剤の候補となり、 本発明の蛋白質の発現異常や機能異常などに 起因する疾患や本発明の蛋白質の活性を制御することにより治療可能な疾患の治 療への応用が考えられる。 このような疾患としては、 マスト細胞のシグナル伝達 に関係する疾患、 例えば、 アトピー性皮膚炎、 鼻炎、 喘息などのアレルギー疾患 を例示することができる。 本発明のスクリ一ニング方法を用いて単離しうる化合 物の構造の一部を、 付加、 欠失及び/又は置換により変換される物質も、 本発明 の蛋白質に結合する化合物に含まれる。
本発明の蛋白質、 または本発明のスクリ一二ングにより単離しうる化合物をヒ トゃ哺乳動物、 例えばマウス、 ラット、 モルモット、 ゥサギ、 ニヮトリ、 ネコ、 ィヌ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 サル、 マントヒヒ、 チンパンジーの医薬として使用 する場合には、 蛋白質や単離された化合物自体を直接患者に投与する以外に、 公 知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。 例えば、 必要 に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤と して経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性 溶液、 又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。 例えば、 薬理学上許 容される担体もしくは媒体、 具体的には、 滅菌水や生理食塩水、 植物油、 乳化剤、 懸濁剤、 界面活性剤、 安定剤、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 結合剤など と適宜組み合わせて、 一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混 和することによつて製剤化することが考えられる。 これら製剤における有効成分 量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、 カプセル剤に混和することができる添加剤としては、 例えばゼラチン、 コーンスターチ、 トラガントガム、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル口 ースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸のような膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖又はサッカリンのよう な甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油又はチェリ一のような香味剤が用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 上記の材料にさらに油脂のような液状 担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のような べヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。 注射用の水溶液としては、 例えば生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含 む等張液、 例えば D-ソルビトール、 D -マンノース、 D-マンニト一ル、 塩化ナトリ ゥムが挙げられ、 適当な溶解補助剤、 例えばアルコール、 具体的にはエタノール、 ポリアルコール、 例えばプロピレングリコール、 ポリエチレングリコール、 非ィ オン性界面活性剤、 例えばポリソルベート 80 (TM) 、 HCO-50と併用してもよい。 油性液としてはゴマ油、 大豆油があげられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジ ル、 ベンジルアルコールと併用してもよい。 また、 緩衝剤、 例えばリン酸塩緩衝 液、 酢酸ナトリウム緩衝液、 無痛化剤、 例えば、 塩酸プロ力イン、 安定剤、 例え ばべンジルアルコール、 フエノール、 酸化防止剤と配合してもよい。 調製された 注射液は通常、 適当なアンプルに充填させる。
患者への投与は、 例えば、 動脈内注射、 静脈内注射、 皮下注射などのほか、 鼻 腔内的、 経気管支的、 筋内的、 経皮的、 または経口的に当業者に公知の方法によ り行いうる。 投与量は、 患者の体重や年齢、 投与方法などにより変動するが、 当 業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。 また、 該化合物が DNAによりコードされうるものであれば、 該 DNAを遺伝子治療用べクタ一に組込み、 遺伝子治療を行うことも考えられる。 投与量、 投与方法は、 患者の体重や年齢、 症状などにより変動するが、 当業者であれば適宜選択することが可能である。 本発明の蛋白質の投与量は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投 与方法によっても異なるが、 例えば注射剤の形では通常成人 （体重 60kgとして） においては、 1日あたり約 lOO gから 20nigであると考えられる。
本発明の蛋白質と結合する化合物や本発明の蛋白質の活性を調節する化合物の 投与量は、 症状により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に成人 （体重 60kg として） においては、 1日あたり約 0. 1から 100mg、 好ましくは約 1. 0から 50mg、 よ り好ましくは約 1. 0から 20mgであると考えられる。
非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投 与方法によっても異なるが、 例えば注射剤の形では通常成人 （体重 60kgとして） においては、 通常、 1日当り約 0. 01から 30mg、 好ましくは約 0. 1から 20mg、 より好 ましくは約 0. 1から 10mg程度を静脈注射により投与するのが好都合であると考え られる。 他の動物の場合も、 体重 60kg当たりに換算した量、 あるいは体表面積あ たりに換算した量を投与することができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 MC-PIR1の cDNA配列と翻訳されるアミノ酸配列を示す図である。 DNA配 列の下線点線は SST- REXで回収された DNA断片である。 ポリ Aシグナルを下線で示 す。 シグナル配列は小文字で示す。 太い下線は膜貫通ドメインを示す。 二重下線 は ITIM配列を示す。 SS結合をするシスティンをボックスで示す。 ァスパラギン結 合糖鎖の結合配列をボックスで示す。
図 2は、 MC-PIR2のオープンリーディングフレームを示す図である。 シグナル 配列は小文字で示す。 太い下線は膜貫通ドメインを示す。 ITAM配列を有する他の 共役分子との結合に重要な膜貫通ドメイン中のリジンをボックスで示す。 SS結合 をするシスティンをボックスで示す。 ァスパラギン結合糖鎖の結合配列をボック スで示す。
図 3は、 各種臓器における MC- PIR1および MC- PIR2の こよる発現解析の結果 を示す電気泳動写真である。 コントロールとして GAPDHを用いた。
図 4は、 各種細胞における MC-PIR1および MC- PIR2の RT- PCRによる発現解析の結 果を示す電気泳動写真である。 コントロールとして GAPDHを用いた。
図 5は、 MC-PIR1及び MC- PIR2がマスト細胞表面に存在することを示す FACSによ る解析結果を示す図である。
図 6は、 キメラタンパク質の抗マウス IgG抗体の架橋によるチロシンリン酸化 の結果を示す電気泳動写真である。
図 7は、 ホスホチロシン脱リン酸化酵素、 SHP- 1および SHP- 2およびホスホイノ シチド脱リン酸化酵素、 SHIPとの会合についての結果を示す電気泳動写真である。 図 8は、 MC- PIR2が ITAMを有するシグナル伝達分子 DAP10、 DAP 12, あるいは FcR rと会合することを示す電気泳動写真である。
図 9は、 Fc ε ΙΠのシグナル伝達と MC- PIR1の抑制作用について示す図である。 発明を実施するための最良の形態
以下に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、 本発明はこれら実施例 に制限されるものではない。
[実施例 1 ] cDNAライブラリの構築およびスクリ一二ング
レトロウイルスベクター pMX-SST (Koj ima, T. and Ki tamura, T. (1999) Nature Biotechnol. 17, 487-490) を用いて、 cDNAライブラリ構築および発現を行なった。 ファスト · トラック 2. 0 mRNA単離キット （インビトロゲン社、 カリフォルニア 州カールスバッド） を用いて、 製造元のプロトコールに従って、 抗原刺激をした マウス骨髄由来マスト細胞からポリ（A) +RNAを抽出した。
スーパースクリプト ·チヨイス ·システム （インビトロゲン社） を用いて、 cD NAをランダムへキサマーによってポリ（A) +RNAから合成し、 Bs Iアダプタ一を用 いて pMX- SSTベクタ一の BstXI部位に挿入した （インビトロゲン社） 。 SST- REXラ イブラリーを構築するために、 ライゲーシヨンした DNAを DH10B細胞 （エレクト口 マックス、 インビトロゲン社） で増幅して、 キアゲン ·プラスミドキット （キア ゲン 'インク、 バレンシア、 力リフォルニァ州) を用いて、 ライブラリー DNAを 調製した。 c DNAライブラリーの規模は 2. 0 X 106クローンであった。
SST-REXライブラリ一を提示する髙カ価レトロウイルスを、 パッケージングし た細胞株 Plat-E (Mori t a, S. et al. (2000) Gene Therapy, 7, 1063-1066) を用 いて産生し、 記述のように Ba/F3細胞に感染させた。 1日感染させた後、 細胞を 3回洗浄し、 96ウェルマルチタイ夕一プレート （103個/ゥエル） を用いて IL - 3 の非存在下でクローンを選択した。
12日後、 ゲノム DNAを因子非依存的 Ba/F3クローンから抽出し、 ゲノム PCRに供 し、 ベクタープライマ一を用いて、 組み入れられた cDNAを回収した （GGGGGTGGAC CATCCTCTA/配列番号： 5、 および CGCGCAGCTGTAAACGGTAGZ配列番号： 6) 。 ジ一 ンアンプ PCRシステム 480 (パーキン ·エルマ一、 ノーウォーク、 コネチカツ卜 州） および LA TaQポリメラ一ゼ （夕カラ、 京都、 日本） を用いて、 PCRを 30サイ クル （98°Cで変性 20秒、 68°Cでアニーリングおよび伸長 2分） 行った。 得られた PCR断片を、 TaQダイターミネータ一 ·サイクルシークェンシングキット （ァブラ イド ·バイオシステムズ ·インク、 フォス夕一シティ、 カリフォルニア州） を用 いてシークェンシングして、 自動シークェンサ一 (377 遺伝子アナライザー、 ァ プライド ·バイオシステムズ ·インク） によって分析した。
なお、 実験に用いた分化したマウス骨髄由来培養マスト細胞は、 以下のように して調製した。 CBA/JNマウスの大腿骨から調製した骨髄細胞を、 10%FCS、 100単 位/ mlペニシリン、 100 i g/mlストレプトマイシン、 および 10 n g/mlマウス IL- 3を含む RPMI 1640中で 5 %C02において 37°Cで培養した。 数日おきに 5 X 105細胞の 密度で継代培養し、 4週間維持し、 細胞を分化させた.。 マウス IL-3依存的前 B細 胞株である Ba/F3を 10%FCSおよび 1 ng/mlマウス IL- 3 (R&Dシステムズ） を含む R PMI 1640培地で培養した。
マスト細胞の抗原による刺激は、 以下のように行った （Kawakami, T. et al. (1992) J. Immunol. 148, 3513-3519) 。 マスト細胞を 0. 5 g/mlの抗 DNP-IgE抗 体 （シグマ） でー晚感作し、 翌日に 100ng/mlの DNP-BSA (コスモバイオ社） で 2時 間刺激した。
[実施例 2 ] 単離された cDNAクローンの分析
cDNAクローンの中でのシグナル配列を含み、 一つのィムノグロブリンドメイン をコードする遺伝子断片を単離した。
オリゴ d- Tプライマーを用いた cDNAライブラリ一を構築した。 スーパースクリ ブト ·チヨイス 'システム (インビトロゲン社) を用いて、 cDNAをオリゴ d - Tプ ライマーによってポリ （A) +RNAから合成し、 BstXIアダプターを用いて PME18Sべク 夕一の BstXI部位に挿入した （インビトロゲン社） 。 オリゴ d-Tライブラリーを 構築するために、 ライゲーシヨンした MAを DH10B細胞に増幅して、 プラスミド精 製キット (キアゲン ·インク、 バレンシア、 カリフォルニア州) を用いてライブ ラリ一 DNAを調製した。 cDNAライブラリ一の規模は 1. 5 X 108クローンであった。
RecA (第一化学薬品（株）、 東京、 日本） を用いたハイブリダィゼーシヨンによ り全長 cDNAを単離した。 先に単離した cDNA断片を铸型にして PCR反応を行い、 ビ ォチン 21- dUTP (クロ一ンテック社） を取り込ませたおよそ 500bpのプローブを合 成した。 このプローブを RecA存在下にォリゴ d-TcDNAライブラリーとハイブリダ ィゼーションさせた。 ストレプトアビジン-マグネチックビーズ （プロメガ社） で回収した DNAを DH10B細胞で増幅して （エレクト口マックス、 インビトロゲン 社） 大腸菌クローンを得た。 得られた大腸菌クローンを大量培養し、 キアゲン - プラスミドキット （キアゲン ·インク） を用いて DNAを調製した。 TaQダイ夕ーミ ネーター ·サイクルシークェンシングキット (アプライド ·バイオシステムズ · インク、 フォスターシティ、 力リフォルニァ州) を用いてシークェンシングして、 自動シークェンサ一 (377 遺伝子アナライザ一、 アプライド ·バイオシステム ズ ' ·インク) によって分析した。
得られた cDNAは全長 1752塩基対であり、 957残基がオープンリーディングフレ ームであった。 3 ' 側は 648残基であり、 ポリ A付加シグナルを有していた。 翻訳 されたアミノ酸配列は 318残基であり、 27残基のシグナルシ一クエンス、 156残基 の細胞外ドメイン、 23残基の細胞膜貫通ドメイン、 112残基の細胞内ドメインで
を一つ有していた。 細胞内ドメインは 4個の ITIM様配列を有していた （図 1 ) 。 この遺伝子を MC-PIR1と命名した。
このマウス由来の新規遺伝子に相同性を示す遺伝子として、 CMRF- 35-H9 (CMR F-35H) (Green, B. J. et al. , Int. Immunol. 10， 891-899, 1998、 ァクセシ ヨン No. AF020314) および IRp60 (Cantoni, C. et al. , Eur. J. Immunol. 29, 3148-3159, 1999、 ァクセシヨン No. AJ224864) が存在する。 しかしながら、 CM RF- 35Hおよび IRp60がマスト細胞に発現することは知られていない。 これらの遺 伝子は、 構造上の類似性から MC-PIR1のヒトホモログと考えられる。
MC - PIR1の配列を元に、 EMBL/GenBank/DDBJ遺伝子データーバンクを調べたとこ ろ MC-PIR1のィムノグロプリンドメインとおよそ 90%の相同性を有する遺伝子配列 が得られた （ァクセシヨン #BC006801) 。 得られた配列情報を元にプライマーを 作製した。 マスト細胞から調製した全 RNAを用いて RT-PCR法を行い、 同様の遺伝 子産物の発現が認められた。 更に、 DNA断片を回収して配列を調べた。
遺伝子デ一夕一バンクに登録されている配列とほぼ同じ遺伝子 （ァクセシヨン No. BC006801と 2ケ所の塩基が異なり、 2個のアミノ酸置換が見られる） が得られ、 MC- PIR2と命名した （図 2 ) 。 その後、 MC - PIR2は DlgRl (Luo, K. et al. , Bioch em. Biophys. Res. Commun. 287, 35-41, 2001；ァクセシヨン No. AY048685) と 全く同じタンパク質をコードすることが明らかになった。 また、 このマウス由来 の遺伝子に相同性を示すヒト遺伝子として、 CMRF - 35A (Clark, G. J. et al. , T issue Ant igens 57, 415-423, 2001、 ァクセシヨン No. BC022279) が存在する。 しかしながら、 DlgRlあるいは CMRF- 35Aがマスト細胞に発現することは知られて おらず、 その機能も不明である。
[実施例 3 ] MC- PIR1及び MC- PIR2の発現分布
PCR法により遺伝子発現パターンを解析した。 マウスの各種臓器由来の mRNAが 予め cDNA化された DNA (クロンテック社） を铸型にして、 PCR法により遺伝子断片 を増幅した。 また、 各種血球系細胞株から全 RNAをトリゾ一ル試薬 （インビトロ ゲン社） を用いて抽出した。 得られた全 RNAをリバ一ストランスクリプターゼ
(キアゲン社） を用いて c DNAィ匕したものを铸型にして、 PCR法により遺伝子断片 を増幅した。 増幅された DNA断片を 1%ァガ口一ス寒天により分離した。
MC- PIR1および MC- PIR2の発現は両者とも脾臓および肝臓で多くの発現が見られ た。 両者とも特異的な DNA断片の増幅は、 マウス骨髄由来培養マスト細胞 （B醒 C) で見られた。 MC - PIRlではその他の細胞株、 Ba/F3、 A20、 EL4、 CTLL- 2、 FDC-P 1、 L-G、 32Dcl3 J774. 1、 P815では増幅は見られなかった。 MC-PIR2は J774. 1、 F DC-PIでも発現が見られた （図 3、 図 4 ) 。 以上の実験事実は MC- PIR1および MC - P IR2はマスト細胞の機能調節に密接に関与していることを示唆している。
[実施例 4 ] マウス骨髄由来マスト細胞における MC-PIR1及び MC- PIR2の細胞表 面における発現
実施例 1で示した方法で調製したマスト細胞を PE標識抗 CD117モノクローナル 抗体 (BDファーミンジェン) と反応後、 抗 MC-PIR1マウスモノクローナル抗体 (R &Dシステムズに委託して作製） あるいは抗 MC-PIR2ゥサギポリクロ一ナル抗体 (シグマジエノシスに委託して作製） と反応させた。 細胞を洗浄後、 それぞれの 細胞を、 FITC標識抗マウスィムノグロブリン抗体 （BDファーミンジェン） あるい は FITC標識抗ゥサギィムノグロプリン抗体 （BDファーミンジェン） と反応させた。 細胞を洗浄後、 FACSCal ibur (べクトンデッキンソン） で解析した。
調製した細胞のおよそ 90%から 95%が CD117陽性細胞であり、 ほぼ全ての細胞が マスト細胞に誘導されていた。 CD117陽性細胞の内、 90%の細胞が MC-PIR1陽性で あり、 25%が MC- PIR2陽性であった （図 5 ) 。 これらの結果は、 MC- PIR1及び MC-PI R2がマスト細胞表面上に存在することを示すものである。
[実施例 5 ] MC-PIR1の細胞内ドメインの解析
Fcァ RI IBと MC- PIR1のキメラ遺伝子を作製した。 FC T RI IBの細胞外ドメインお よび膜貫通ドメインをコードする遺伝子断片を PCR法にて増幅した。 同様に MC-PI R1の細胞内ドメインをコ一ドする遺伝子断片を PCR法にて増幅した。 両遺伝子断 片を混合したものを铸型にし、 再度 PCR法にて遺伝断片を増幅しキメラ遺伝子を 作製した。 その後、 キメラ遺伝子断片を EcoRIおよび Not lにて消化し、 pMX- IRES- puroベクタ一に挿入し、 pMX- IRES-puro- Fc- PIR1を作製した。
pMX- IRES- puro- Fc- PIRlを提示する高力価レトロウイルスを、 パッケージング 細胞株 Plat- Eを用いて産生し、 記述のように Fc r RI IB欠損細胞である ΠΑ1. 6細胞 (Jones, B. et al. (1986) J. Immunol. , 136, 348-356) に感染させた。 感染 1日 後、 1 /i g/mlのピューロマイシン （クロンテック社） を培地に添加し、 更に 1週間 培養してキメラ遺伝子発現細胞株を得た。
キメラ遺伝子発現細胞株の細胞表面に発現している B細胞受容体、 およびキメ ラ遺伝子を抗マウス IgG抗体 （ザィメッド社） で架橋した細胞を経時的に採取し、 細胞溶解緩衝液で溶解した。 細胞溶解液に 2. 4Gモノクローナル抗体 （べクトンデ ッキンソン） および抗ラット I gG抗体-セファロースを添加し、 免疫複合体を沈降 させた。 得られた沈降物をペプチド N-グリコシダ -ゼ F (第一化学薬品 (株)） で消 化し、 10%ポリアクリルアミド電気泳動に供した。
ポリアクリルアミド電気泳動で分離した免疫複合体をィモビロン- Pメンブラン (ミリポア社） に電気的に転写した。 メンブランを 10%FCSを含む緩衝液でブロッ クした後、 4G10モノクローナル抗体 (アップステートバイオテクノロジー社） 続 いて HRP結合抗マウスィムノグロブリン抗体 (シグマ) とィンキュベ一シヨンし た。 その後ケミルミネッセンス試薬 (フアルマシア社) で検出した。
キメラ遺伝子発現細胞株を同様に架橋後、 以下同様にメンブランを調製した。 メンブランを抗 SHP- 1抗体 （サンタクルーズ社） 、 抗 SHP-2抗体 (サンタクルーズ 社） 、 あるいは抗 SHIP抗体と反応させた。 その後の検出は同様に行った。
キメラタンパク質は架橋後、 0. 5分でチロシンのリン酸化が検出された。 また、 キメラタンパク質を含む免疫複合体中には SHP-1、 SHP- 2、 SHIPが含まれていた。 これらの会合はキメラタンパク質のチロシンのリン酸化に依存して生じていた (図 6、 図 7 ) 。
[実施例 6 ] MC-PIR2と ITAMを有するシグナル伝達分子との会合
C末端側に HAタグを付加したプライマ一を用いて、 PCR法により MC-P I R2を増幅' した。 得られた遺伝子断片を EcoRIおよび Not lにて消化後、 pMKITベクタ一に揷入 し、 pMKIT- MC-PIR2-HAを作製した。
I TAM配列を有する DAP 10、 DAP 12および FcR rの成熟型タンパク質をコードする 遺伝子断片を PCR法により増幅した。 得られた遺伝子断片を Hindl l lおよび Not lで 消化し、 pMKIT-FLAGベクタ一の FLAG夕グ下流に挿入した。
pMKIT- MC- PIR2- HAおよび pMKITモックベクター、 あるいは FLAG- DAP 10ベクター、 あるいは FLAG-DAP 12ベクタ一、 あるいは FLAG-FcRァベクターを C0S1細胞にトラン スフエクシヨンをした。 2日後に細胞を回収し、 細胞溶解緩衝液で溶解した。 細 胞溶解液に抗 HAモノクローナル抗体 （12CA5、 ロシュダイァグノスティックス） およびプロテイン Aセファロースを添加し、 免疫複合体を沈降させた。 得られた 沈降物を 15 ポリアクリルアミド電気泳動に供した。 ポリアクリルアミド電気泳 動で分離した免疫複合体をィモビロン- Pメンプラン （ミリポア社） に電気的に転 写した。 メンブランを 10%FCSを含む緩衝液でブロックした後、 抗 FLAG-M2モノク ローナル抗体 (シグマ) 、 続いて HRP結合抗マウスィムノグロブリン抗体 （シグ マ） とインキュベーションした。 その後ケミルミネッセンス試薬 （フアルマシア 社） で検出した。
MC-PIR2と pMKITモックベクターを導入した場合には抗 FLAG抗体で検出されるバ ンドは見られなかった。 MC- PIR2と FLAG- DAP10、 あるいは FLAG-DAP 12、 あるいは F LAG-FCR Tを導入した場合には、 それぞれ抗 FLAG抗体でバンドが検出された。 従 つて、 MC-PIR2は、 ITAMを有するシグナル伝達分子 DAP 10 (Wu, J. et al. (1999) , Science 285, 730-732) 、 DAP 12 (Lanier, L. L. et al. (1998) , Nature 391, 703-707) 、 あるいは FcRr (Vivier, E. et al. (1992) , Int. Immunol. 4, 13 13-1323) と会合することが示された （図 8 ) 。 これらの結果は、 MC- PIR2が活性 化シグナル伝達の制御に関与することを示す。 産業上の利用の可能性
本発明により、 マスト細胞に由来し、 マスト細胞のシグナル伝達経路の制御に 関与すると考えられる新規な膜タンパク質をコードする遺伝子が提供された。 こ れらの遺伝子産物の発現特性及びシグナル伝達に関与するタンパク質への結合性 から、 これらは以下の作業仮説により、 マスト細胞の抗原刺激後のシグナル伝達 を抑制もしくは活性化すると考えられる。
即ち、 マスト細胞が IgEと抗原により Fc s RIが架橋をされると、 細胞内でプロ ティンキナーゼ活性の上昇に引き続き、 ホスファチジルイノシトールの代謝回転 が亢進され、 細胞内カルシウム濃度の上昇および脱顆粒が引き起こされる。 また、 PI3Kも活性化されることから細胞膜上では PIP3の上昇を引き起こし、 Btkなどが 活性化される（Kawakami, Y. et al. (1994) Mol. Cel l. Biol. , 14, 5108-5113) 。 一般に抑制性のシグナル伝達経路としては Fc r RI IBなどに見られる、 SHIP依 存性経路 (Muta, T. et al. (1994) Nature, 368, 70 - 73)と、 チロシン脱リン酸 化酵素により伝達される SHPに依存する経路 (Binstadt, B. A. et al. (1996) I丽 uni ty, 5, 629- 638)が知られているが、 MC- PIR1では两経路を同時に活性化でき るため、 Fc s RIからのシグナルをより強く抑制できると考えられる （図 9 ) 。
一方、 MC- PIR2は ITAMを有するシグナル伝達分子 DAP10、 DAP12及び FcR rと会合 することから、 Srcファミリーキナーゼあるいは PI3キナーゼ等のリン酸化酵素を 通じて活性化を引き起こすと考えられる （Wu, J. et al. (1999) , Science 285, 730-732, Lanier, L. L. et al. (1998) , Nature 391, 703—707、 Vivier, E. e t al. (1992) , Int. Immunol. 4, 1313-1323) 。 従って、 例えば MC - PIR2とこれ らの ITAMを有するシグナル伝達分子との会合を阻害すれば、 活性化シグナル伝達 を抑制することができるものと期待される。 即ち、 MC- PIR2自身がマスト細胞の 活性化シグナル伝達抑制物質の標的分子となる可能性が考えられる。
MC-PIRK MC-PIR2, 及びこれらのヒトホモログの遺伝子発現産物は天然リガン ド、 その作用をミミックする化合物、 あるいは抗体のスクリーニングに利用可能 である。 これらの発現産物を利用したスクリーニングによって得られたリガンド、 化合物もしくは抗体は、 マスト細胞の活性化シグナル伝達を阻害し、 新規な作用 メカニズムをもった抗ァレルギー剤となる可能性が考えられる。

Claims

請求の範囲
1. 下記 （a) から （d) のいずれかに記載の DNA。
(a) 配列番号： 2または 4に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコード する DNA。
(b) 配列番号： 1または 3に記載の塩基配列のコード領域を含む DNA。
(c) 配列番号： 2または 4に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数 のアミノ酸が置換、 欠失、 挿入、 および/または付加したアミノ酸配 列を有する蛋白質をコードする DNA。
(d) 配列番号： 1または 3に記載の塩基配列からなる DNAとストリンジェ ントな条件下でハイプリダイズする DNA。
2. SHP- 1蛋白質、 SHP- 2蛋白質、 SHIP蛋白質、 DAP10蛋白質、 DAP12蛋白質、 ま たは FcRr蛋白質からなる群より選択される蛋白質と結合する蛋白質をコ一 ドする、 請求項 1に記載の DNA。
3. 請求項 1に記載の DNAによりコードされる蛋白質。
4. 請求項 1に記載の DNAが挿入されたべクタ一。
5. 請求項 1に記載の DNAまたは請求項 4に記載のベクタ一を保持する宿主細 胞。
6. 請求項 5に記載の宿主細胞を培養し、 該宿主細胞またはその培養上清から 発現させた蛋白質を回収する工程を含む、 請求項 3に記載の蛋白質の製造方 法。
7. 請求項 3に記載の蛋白質に結合する抗体。
8. 配列番号： 1または 3に記載の塩基配列からなる DNAまたはその相補鎖に 相補的な少なくとも 15ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
9. 請求項 3に記載の蛋白質に結合する化合物のスクリーニング方法であって、 (a) 該蛋白質に被検試料を接触させる工程、 ( b ) 該蛋白質と被検試料との結合活性を検出する工程、
(c) 該蛋白質に結合する活性を有する化合物を選択する工程、
を含む方法。
. 請求項 3に記載の蛋白質と SHP-1蛋白質、 SHP- 2蛋白質、 SHIP蛋白質、 DA P10蛋白質、 DAP12蛋白質、 または FCRT蛋白質からなる群より選択される 蛋白質との結合を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、
(a) 被検試料の存在下で請求項 3に記載の蛋白質と SHP- 1蛋白質、 SHP- 2蛋 白質、 SHIP蛋白質、 DAP10蛋白質、 DAP12蛋白質、 または FCRT蛋白質 からなる群より選択される蛋白質とを接触させる工程、
(b) これら蛋白質の結合活性を検出する工程、
(c) 被検試料非存在下で検出した場合と比較して、 これら蛋白質の結合活 性を低下させる化合物を選択する工程、
を含む方法。
. 抗アレルギー剤の製造方法であって、 請求項 7に記載の抗体または請求 項 9若しくは 10に記載の方法により得られた化合物と薬理学上許容され る担体若しくは媒体とを混合することを含む方法。
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