JPWO2014073529A1 - アレルギー疾患に関連する、CD300a発現細胞の活性調節剤を含有する医薬品、ならびにCD300a遺伝子欠損マウスおよびCD300a発現細胞の活性調節剤の使用 - Google Patents
アレルギー疾患に関連する、CD300a発現細胞の活性調節剤を含有する医薬品、ならびにCD300a遺伝子欠損マウスおよびCD300a発現細胞の活性調節剤の使用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
(i)CD300aのリガンドは、ホスファチジルセリン(フォスファチジルセリン、ホスホファチジルセリン)(PS)である。
(ii)PSがマスト細胞等のCD300aへ結合すると、CD300aの抑制性シグナル伝達が亢進し、マスト細胞等の活性化も抑制される。
(iii)ホスファチジルセリン結合性物質またはCD300a結合性物質が共存することにより、マスト細胞等のCD300aとPSとの結合が阻害されると、CD300aの抑制性シグナル伝達が抑制され、マスト細胞等の活性化も維持される。
(iv)上記の活性化の抑制または維持を通じて、アレルギー疾患などを治療できる。
(v)CD300a遺伝子欠損マウスは、アレルギー疾患の病態解析や医薬品の有効成分のスクリーニングなどを行うためのツールとなり得る。
[1] CD300aとホスファチジルセリンの結合を阻害する物質を含有する、CD300aを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を抑制するための活性調節剤を有効成分として含有することを特徴とする、アレルギー疾患を治療または予防するための医薬品。
[3] 前記ホスファチジルセリン結合性物質が、MFG−E8、MFG−E8変異体(D89E MFG−E8)、T細胞免疫グロブリン、可溶型TIM−1、可溶型TIM−4、可溶型スタビリンおよび可溶型インテグリンαvβ3からなる群から選択される少なくとも1種類である、[2]に記載の医薬品。
[5] 前記CD300a結合性物質が、配列番号3で表されるアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対して1,2,3,4または5個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列からなるH鎖可変領域と、配列番号4で表されるアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対して1,2,3,4または5個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列からなるL鎖可変領域とを有する、抗ヒトCD300a抗体である、[4]に記載の医薬品。
[8] アレルギー疾患について、病態解析を行うための、またはその治療薬もしくは予防薬の有効成分となりうる候補物質をスクリーニングするための、CD300a遺伝子欠損マウスの使用であって、
前記CD300a遺伝子欠損マウスを、アレルギー疾患を誘導させる物質を投与したときにアレルギー疾患を誘発しにくいモデルマウスとして使用することを特徴とする、CD300a遺伝子欠損マウスの使用。
CD300aとホスファチジルセリンの結合を亢進する物質を含有する、CD300aを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を亢進するための活性調節剤の使用。
上記[1]に係る発明の別の側面として、CD300aとホスファチジルセリンの結合を阻害し、CD300aを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を抑制することを特徴とする、アレルギー疾患を治療または予防する方法が提供される。当該方法は、生体内(in vivo)、生体外(ex vivo, in vitro)を問わずに適用可能であり、また生体内で適用される場合、その生物種は、ヒトであるか、ヒト以外であるか(たとえばマウス等の哺乳類)であるかを問わない。
本発明における活性調節剤は、CD300aを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を、抑制するためのものと、亢進するためのものを包含する。
本発明による第1の活性調節剤は、CD300aを介した抑制性シグナル伝達を抑制する作用を有する成分を含有する。本発明ではそのような成分として、ホスファチジルセリンとCD300aとの結合を阻害する物質、すなわちホスファチジルセリン結合性物質およびCD300a結合性物質を用いることができる。第1の活性調節剤は、これらの何れか一方を含んでいてもよいし、これら両方を含んでいてもよい。
第1の活性調節剤の一つであるホスファチジルセリン結合性物質は、CD300aのリガンドであるホスファチジルセリン(PS)に結合して、ホスファチジルセリンとミエロイド系細胞に発現したCD300aとの相互作用(結合)を阻害するものである限り特に限定されない。
また、上記「可溶型蛋白質」とは、膜蛋白質など、後述するような希釈剤や体液に対して不溶性である、ネイティブの蛋白質において、公知の遺伝子組み換えの技術によって、疎水性ドメインを削除したり、親水性のペプチドを付加したりして、希釈剤や体液に対して可溶性になるように改変した蛋白質を指す。
第1の活性調節剤の一つであるCD300a結合性物質は、CD300aに結合して、ミエロイド系細胞に発現したCD300aとホスファチジルセリンとの相互作用(結合)を阻害するものである限り特に限定されない。
TX41は抗マウスCD300aモノクローナル抗体(ラットIgG2a)であり、TX49は抗ヒトCD300aモノクローナル抗体(マウスIgG1)である。どちらも後記実施例において作成、使用されたモノクローナル抗体であり、CD300aとホスファチジルセリンとの結合を阻害してシグナル伝達を抑制する機能に優れているため、本発明におけるCD300a結合性物質として好ましい。ただし、本発明に用いることのできる抗CD300a抗体は、TX41、TX49およびこれらに類する(同等のアミノ酸配列からなる可変領域を有する)抗体に限定されるものではない。
たとえば、ヒトの定常領域を利用することにより、ヒトキメラ抗体として抗ヒトCD300a抗体を作製することは、好ましい実施形態の一つである。このような抗CD300a抗体は、公知の手法により作製することが可能である。
また、CD300aの遺伝子配列(DDBJ/EMBL/GenBank=INSD等のDNAデータベースから入手可能)を元に設計されたsiRNAにより、罹患部位におけるミエロイド系細胞におけるCD300aの発現を抑制することで、CD300a遺伝子を欠損させた状態またはCD300aとホスファチジルセリンの結合を阻害した状態と同様に、上記の各種疾患に対する治療効果を得ることができる。換言すれば、CD300a遺伝子に対するsiRNAも、本発明におけるCD300aとホスファチジルセリンの結合を阻害する物質の一種といえる。
本発明における第1の活性調節剤は、CD300aを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を抑制するために使用することができる。この際、ミエロイド系細胞は、生体内にあるものであっても、生体外に分離されたものまたは生体外で培養されたものであってもよい。
第2の活性調節剤は、CD300aを介した抑制性シグナル伝達を亢進する(つまり、CD300aの活性シグナリングを抑制する)作用を有する成分を含有する。本発明ではそのような成分として、ホスファチジルセリンとCD300aとの結合を亢進する物質、特にCD300aのリガンドであるホスファチジルセリンを用いることができる。
ホスファチジルセリン(PS)は、ミエロイド系細胞に発現しているCD300aのリガンドであり、PSとCD300aとの相互作用(結合)によって、CD300a発現細胞の抑制性シグナリングが亢進する。たとえば、マスト細胞においては、この抑制性シグナリングを介して、ヒスタミンや、サイトカイン、ケモカインなどのケミカルメディエーターを放出するという、炎症反応に関連するマスト細胞の活性が抑制される。PSは工業的に生産されており、容易に入手することができる。
PSとマスト細胞におけるCD300aとの相互作用は、カルシウムイオンを必要とすることから、第2の活性調節剤は、電離によってカルシウムイオンを発生するカルシウム塩(たとえば、塩化カルシウム等)を含有することが好ましい。
本発明に係る第2の活性調節剤は、CD300aを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を亢進するために使用することができる。この際、ミエロイド系細胞は、生体内にあるものであっても、生体外に分離されたものまたは生体外で培養により生産したものであってもよい。
本発明に係る医薬品(医薬組成物)は、上述したような活性調節剤を有効成分として含有し、必要に応じて薬学的に許容される各種の添加剤(たとえば担体)をさらに含有していてもよい。
本発明に係る医薬品は、必要に応じて、薬学的に許容され得る担体を含んでいてもよい。
CD300a発現細胞に対するホスファチジルセリンの結合を阻害すると、好酸球性気道炎症を抑制し、総血清IgE濃度を低減することができる。したがって、第1の活性調節剤を有効成分として使用することにより、喘息に対する医薬品が得られる。
例えば、後記実施例に示すように、第1の活性調節剤の一つであるTX41の投与により、喘息患者における気道内圧と、気管支洗浄細胞の総細胞数およびこれに含まれる好酸球数を低下させて喘息の病態を軽減させることができるため、TX41を有効成分として使用することにより、喘息に対して有用な医薬品が得られる。
また、D89E MFG−E8の投与により炎症を抑制する制御性T細胞数が増加し、喘息の病態を軽減させることができるため、D89E MFG−E8も喘息治療用の医薬品の有効成分として有用である。
さらに、CD300aは、CD11b+CD11c+樹状細胞に強く発現するため、CD300aとともにCD11bおよび/またはCD11cを標的とするドラッグデリバリーシステム、たとえばTX41(抗CD300a抗体)と、抗CD11b抗体および/または抗CD11c抗体とが結合した親水性高分子(PEG等)を表面に有するリポソーム製剤も医薬品の一実施形態として挙げられる。
CD300a発現細胞に対するホスファチジルセリンの結合を阻害すると、好酸球、マスト細胞(真皮内の皮膚ランゲリン陽性樹状細胞と相互作用し、CD4陽性T細胞を活性化することが知られている)および単核球の細胞浸潤や、表皮(繊維芽細胞)の過形成を抑制し、総血清IgE濃度を低減することができる。したがって、第1の活性調節剤を有効成分として使用することにより、アトピー性皮膚炎に対する医薬品が得られる。例えば、第1の活性調節剤の一つであるD89E MFG−E8を有効成分とすることで制御性T細胞数の増加による炎症抑制効果が高い医薬品が得られる。
現状、アトピー性皮膚炎の治療剤としてステロイド剤が広く用いられているが、抗かゆみ作用は不十分といわれており、また、タクロリムス等の免疫抑制剤も用いられているが、これら既存の薬剤の副作用も問題となっている。上記医薬品は、抗かゆみ作用を有し、副作用が少ない、喘息やアトピー性皮膚炎等のアレルギー疾患の新たな治療薬として期待できる。
<喘息に関する用途>
本発明で得られた知見により、CD300a欠損マウスに対して、喘息を誘導する物質(ダニ抗原、鶏卵白アルブミン等)を投与して喘息を誘導させた場合、野生のマウスよりも喘息の症状、病態が軽度である。
例えば、後記実施例に示すように、鶏卵白アルブミン(OVA)で喘息を誘導した場合に、CD300a欠損マウスでは、野生型マウスに比べて、気道抵抗および気管支洗浄細胞(特に好酸球、樹状細胞、B細胞、T細胞)の数が減少するとともに、縦隔リンパ節の大きさ及び細胞数、免疫応答の抑制的制御(免疫寛容)を司る制御性T細胞(Treg)の数、IgG2bの量、およびIgG2cの量が有意に増加し、IgEと鶏卵白アルブミン(OVA)特異的IgG1が有意に減少する。そのようなCD300a欠損マウスに認められる、そのような喘息の症状の軽さを示す指標、あるいは喘息の症状の軽さとは一見関係性が不明な指標について、どのようなメカニズム(野生型マウスとの相違)によってもたらされているか、さらにそのようなメカニズムに関連している因子は何なのかといったことを解析することは有用である。
本発明で得られた知見により、CD300a遺伝子欠損マウスに対して、アトピー性皮膚炎を誘導する物質(ダニ抗原、鶏卵白アルブミン等)を投与した場合、野生のマウスよりもアトピー性皮膚炎の症状が緩和される。
本発明のCD300a遺伝子欠損マウスは、染色体上のCD300a遺伝子が不活性型CD300a遺伝子に置換されたことにより、CD300aタンパク質の機能が欠損したマウスである。
1.調製例
(1)CD300a−Fc融合タンパク質、MFG−E8およびD89E MFG−E8の調製
(1−1) ヒトIgGのFc部位を有するCD300aの融合タンパク質(CD300a−Fc)を、下記文献25に記載されているように、マウスまたはヒトCD300aの細胞外ドメイン全体をコードする遺伝子のcDNAとヒトIgG1Fcをコードする遺伝子のcDNAとを含むキメラcDNAから調製した。なお、上記融合タンパク質において、CD300aの細胞外ドメインが、マウス由来のものおよびヒト由来のものを、それぞれ「マウスCD300a−Fc」および「ヒトCD300a−Fc」と称する。
(1−3) D89E MFG−E8は、下記文献4に記載されているように、MFG−E8のRGDモチーフに部位特異的突然変異を導入して得られたMFG−E8の変異体である。
本実施例で使用されたノックアウトマウスは、以下のように作製あるいは提供されたものである。
野生型アレル中のCd300a遺伝子のエクソン1〜6を、細菌人工染色体(BAC)システムを用いて、ネオマイシン耐性遺伝子カセット(PGK−GB2−neo)で置き換え、標的化アレル(変異型アレル)を調製した(図3A)。次いで、常法に従い、キメラマウスを得、さらに該キメラマウスと野生型マウスとを交配させて、子マウス(ヘテロ接合体(+/−))を得、さらに子マウス同士を交配させて、孫マウスを得た。
さらにCD300a遺伝子欠損マウスに、CD300aが発現していないことを確認するために、CD300a遺伝子欠損マウス由来の細胞を抗CD300a抗体を用いたウエスタンブロット分析に供した。図3Cに示されるように、野生型マウスでは、約50kDaにCD300aに由来するバンドが示される一方で、CD300a遺伝子欠損マウスでは、このバンドは検出されなかった。
C57BL/6J−kitW-sh/W-shマウス(以下、「kitW-sh/W-shマウス」または「マスト細胞欠損マウス」)は、理研バイオリソースセンター(日本国つくば市)から提供されたものである。なお、該マウスは、マスト細胞を欠損したマウスであること(下記文献21)および、アポトーシス性のDNA断片化を経ずに、貪食細胞によってDNAが取り込まれた後に、貪食細胞内でDNAの分解が生じることが知られている(下記文献12)。
下記文献30の記載に基づき、クロドン酸リポソームおよびコントロール用PBSリポソーム(Encapsula NanoSciences)を調製した。次いで、CLP後24時間目に、これらのリポソーム0.5mLをマウス腹腔内に注入して、マクロファージを除去した。
なお、本実施例におけるマウスを用いた調製および評価試験の実施は何れも、筑波大学生命科学動物資源センター動物倫理員会作製のガイドラインを遵守したものである。
各種抗体の購入先および調製方法を下記表1に示す。
各種細胞は、以下のように調製されたものである。
(i)骨髄由来マスト細胞(BMMC)
マウス骨髄細胞2×108個を、10cmmディッシュにて、細胞増殖因子(SCF)(10ng/mL)、IL−3(4ng/mL)および仔牛血清(FBS)(10%)を含むコンプリートRPMI1649メディウム中で5週間以上培養して骨髄由来マスト細胞(BMMC)を調製した。BMMCは、毎週新しいメディウムで継代した。調製されたBMMCのうち、95%超は、フローサイトメトリー分析によって、c−Kit+FcεRI+細胞であることが示された。
マウス骨髄細胞2×106細胞を、10cmmディッシュにて、M−CSF(10ng/mL)および仔牛血清(FBS)(10%)を含むコンプリートRPMI1649メディウム中で1週間培養して骨髄由来マクロファージ(BMMφ)を調製した。
常法に基づいて、Flagタグ付きCD300aのcDNAまたはFlagタグ付きCD300dのcDNAを含むpMX−neoレトロウイルスベクタープラスミドを調製した。
以下に、評価方法の条件を記載する。なお、生存試験においては、カプラン・マイヤーログランク検定(Kaplan−Meier log−rank test)を用い、その他の評価試験においては、アンペアード・スチューデントt検定(unpaired Student's t test)を用いて統計学分析を行った。P<0.05を統計学的有意差とみなした。
(i)結合アッセイ
細胞を、2%FBSを含むリン酸緩衝液中、1mMCaCl2の存在下または非存在下でCD300aまたはコントロール用ヒトIgGを用いて30分間染色し、同一の緩衝液で2回洗浄して、FITC結合型のヤギ抗ヒトIgGのF(ab')2フラグメントとともにインキュベートした。次いで、アネキシンVで染色するために、細胞を、140mM NaClおよび2.5mMCaCl2を含む10mM HEPES−NaOH緩衝液中で、アネキシンVとともに15分室温でインキュベートした。
細胞を、マウスCD300aに対するモノクローナル抗体(TX41)、コントロール用アイソタイプの抗体またはMFG−E8とともに、30分間プレインキュベートした後、上記結合アッセイのように、CD300a−Fcで染色した。また、CD300a−Fcがリン脂質へ結合したか否かを分析するために、PIPストリップアッセイ(Echelon Biosciences社製)を製造元の取扱説明書に準拠して実施した。
マウスの腹膜灌流液の段階希釈液をプレーティングして、該希釈液をブレインハートインフュージョン(BHI)寒天を含むプレート上で、37℃、48時間培養した。次いで、好気性細菌のCFUを、下記文献27に記載されているように、腹膜灌流液1mL中のコロニー数を計測して算出した。
[参考例1A]
各種造血幹細胞系列細胞株または腫瘍細胞系列細胞株におけるマウスCD300aリガンドの発現を確認するために、以下のような試験を行った。
また、マウスCD300a−Fcの代わりにコントロール用ヒトIgG(1μg)を用いたこと以外は上記試験方法と同様にして、対照試験も実施した。
マウスCD300a−Fcが、死細胞の一種であるアポトーシス細胞に結合するか否かを検証するために、以下のような試験を行った。
また、塩化カルシウムを含むメディウムの代わりに塩化カルシウムを含まないメディウムを用いたこと以外は、上記試験条件と同様にして、フローサイトメトリーを用いた分析に供した(結果:図2B)。
本試験結果から、マウスCD300aは、カルシウムイオン依存的に、アポトーシス細胞に結合することが理解できる。
参考例1Bで得られたアポトーシス細胞(細胞数2X105)を、マウスCD300a−Fc(1μg)、APC結合型アネキシンV(BD Pharmingen社製)(1μl)、コントロール用ヒトIgG1(1μg)および塩化カルシウム(1mM)を含むメディウム(PBS)中で20℃、30分間インキュベートし、次いで、FITC結合型抗ヒトIgG抗体(0.1μg)およびヨウ化プロピジウム(PI)(1μg)を含む緩衝液を用いて染色した。
また、「MFG−E8」は、フォスファチジルセリン(PS)とαvβ3インテグリンとの両方に結合し、アポトーシス細胞とαvβ3インテグリンを発現する貪食細胞(phagocyte)とを架橋することが知られている(下記文献4)。
この点を鑑みると、マウスCD300a−Fcは、PSに対する結合性を有すること(CD300aのリガンドはPSであること)が示唆される。
ヒトCD300aも、マウスCD300aと同様に、アポトーシス細胞に結合するのか否かを検証すべく、以下の試験を行った。
メンブレン(PIP−strip(Echelon Bioscience社製))に、各種リン脂質(PS、PC、PE)(100 pmol)を含む液(試料液)をスポットして、該メンブレン上に各種リン脂質を吸着させた。
一部のPS結合性受容体は、貪食細胞において発現し、生理学的および病理的状況下で、アポトーシス細胞の除去に関与することが知られている(下記文献4〜9)。
CAD欠損マウスに由来する胸腺細胞を、参考例1Bと同様にして、アポトーシス胸腺細胞を調製した。
マスト細胞は、公知のPS受容体(TIM−1、TIM−4、スタビリン2、インテグリンαvβ3)を発現するか否かを検証するために、以下の試験を行った。
図5Aおよび図5Bを参照すると、マクロファージの場合とは異なって、マスト細胞は、CD300aおよびαvβ3インテグリンを発現するものの、貪食作用に関与するPS受容体であるTIM−1、TIM−4およびスタビリン2を低いレベルでしか発現していないことが分かる。
NIH3T3形質転換体(CD300a)(細胞数6X104)を、FITCで標識化した細胞(アポトーシス胸腺細胞または胸腺細胞(生細胞))とともに、2時間共培養し、PBSで洗浄した後、光学顕微鏡(Keyence社製、BZ−9000)で分析した(結果:図4B)。
参考例2A〜Cの結果から、CD300aは、マクロファージによるアポトーシス細胞の貪食作用に関与しないことが理解できる。
図5に示すように、マスト細胞は、CD300aを発現するものの、マクロファージとは異なって、PS受容体であるTIM−1、TIM−4、スタビリンを発現しない。
CD300a遺伝子欠損マウスの骨髄細胞(BM細胞)2×108個を10cmmディッシュにて、細胞増殖因子(SCF)(10ng/mL)、IL−3(4ng/mL)および仔牛血清(FBS)(10%)を含むコンプリートRPMI1649メディウム中で4週間培養して、CD300a遺伝子欠損マウスの骨髄由来のマスト細胞(BMMC)を調製した。なお、BMMCは、毎週新しいメディウムで継代した。
まず、対数増殖期における各BMMC1×105細胞〜2×105細胞を、ゼラチン(Sigma社製)でコートされた24穴プレート中で37℃、一昼夜培養し、ビオチン結合型マウス抗トリニトロフェノールIgE(0.5mg/mL)を含み、サプリメントを含まないメディウム中において、37℃、1時間インキュベートした。
すなわち、骨髄細胞からの分化やFceRI介在性の脱顆粒化には、CD300aは影響を与えるものではないことが分かる。
CD300a遺伝子欠損マウス由来のBMMCおよび、参考例1Bで得られたアポトーシス細胞(BMMC:アポトーシス細胞=10:1(細胞数比))を、塩化カルシウム(1mM)、APC結合型アネキシンV(1μl)、CD300a−Fc(1μg/mL)およびMFG−E8(5μg)を含むPBS中で20℃、30分間インキュベートし、次いで、FITC結合型抗ヒトIgG抗体(0.1μg/mL)およびヨウ化プロピジウム(PI)(1μg)を含む緩衝液を用いて染色した。
BMMCおよびアポトーシス細胞が共存する場合、LPS(リポポリサッカリド)の刺激によって、各種サイトカインの放出量が変化するか否かを検証すべく、以下のような試験を行った。
さらに、各BMMCの細胞内中の各種サイトカインおよびケモカインの増加率を検証すべく、以下の試験を行った。
D89E MFG−E8は、RGDモチーフにおいて点変異(D89E)を含むMFG−E8のバリアント(変異体)であり、PSに結合するが、αvβ3インテグリンに結合しないという結合特性を有する。
CD300a遺伝子欠損マウス由来のBMMCおよびアポトーシス細胞を含むメディウム中に、LPSとともにD89E MFG−E8(5μg/mL)を添加したこと以外は、参考例3Cと同様にして、TNF−α、IL−13、MCP−1およびIL−6を定量した(結果:図7C「CD300a-/-」)。
CD300aは、細胞内部位において免疫受容抑制性チロシンモチーフ(ITIM)を有し、抗CD300a抗体で架橋されると、SHP−1が誘導されることが知られている(下記文献14)。
この結果からも分かるように、BMMCがアポトーシス細胞と共培養された場合、LPS刺激に応答して、SHP−1を誘導(リクルート)することが分かる。しかしながら、D89E MFG−E8の存在下においては、CD300aはSHP−1をリクルートしなかった。
すなわち、LPS刺激の応答に対するCD300aによるSHP−1の誘導(リクルート)には、PSがCD300aへ結合することが必要であると考えられる。
SHP−1が、CD300a介在性のシグナリングに関与しているかどうかを調べるために、まず、野生型マウス由来のBMMCにおいて、siRNAでPtpn6(SHP−1遺伝子)をノックアウトして、SHP−1欠損(Ptpn6−KD)野生型マウス由来のBMMCを以下の条件で作製した。また、同様にして、CD300a遺伝子欠損マウス由来BMMCからSHP−1欠損(Ptpn6−KD)CD300a遺伝子欠損マウス由来のBMMCを作製した。
マスト細胞が産生するTNF−α、IL−3およびMCP−1は、好中球の化学誘引物質であり、CLP腹膜炎マウスにおいて、細菌クリアランスに重要な役割を果たすことが知られている(下記文献15〜19)。
そこで、CD300aが細菌クリアランス機能を有するか否かを検討するために、下記参考例4A〜4Hを行った。
野生型マウスの盲腸(腹側域)上において、1〜2cmの正中線切開を実施し、その末端部を結紮した。次いで、結紮部位において、27ゲージ針を用いて2回穿刺した後、該盲腸を腹部に戻し、無菌食塩水1mLを皮下注射して補水した後、切開部を縫合して切開部分を閉じた。なお、上記のCLPの詳細内容・条件は、下記文献16に記載されている。
すなわち、CD300aは、膜炎部位のマスト細胞の免疫制御に影響を与えることが示唆される。
CD300aとマスト細胞の免疫制御との関係を検証すべく、以下のようにプロテオーム解析を行った。
CLP実施から4時間経過後、各マウスの腹膜灌流液を採取して、採取された腹膜灌流液を、製造元の説明書に準拠して、Proteome Profiler Array(R&D Systems社製)を用いてサイトカインおよびケモカインのプロテオーム解析に供した。
図9Bに示されるように、CLP後4時間目において、腹腔内のケモカインの濃度は、野生型マウスよりもkitW-sh/W-shマウスにおいて高いことが分かる。なお、本試験は、2回実施しても同様の結果が得られた。
参考例4Bと同様にして、野生型マウスおよびマスト細胞欠損マウス(kitW-sh/W-shマウス)から腹膜灌流液を採取した(各n=3)。
さらに、野生型マウスまたはマスト細胞欠損マウス(kitW-sh/W-shマウス)からBM由来マクロファージを調製した。これらのマクロファージ(細胞数:1X106)を、フルオレセイン標識化大腸菌を含むメディウム中で、24穴プレートで1時間共培養し、フローサイトメトリーで大腸菌を貪食した各マクロファージの細胞数を測定し、貪食しているマクロファージの比率を算出した(結果:図11「BM macrophage」)。
CD300aが好中球の誘導(リクルート)に関与するか否かを検証するために、以下の実施例を行った。
BMMCをマスト細胞欠損マウス(KitW-sh/W-shマウス)の腹腔内に投与することで、TNF−αの放出量が増加するか否かを検証するために、以下の実施例を行った。
抗CD300aモノクローナル抗体(TX41)を投与した場合、CD300aにおいてどのような影響があるのかを検証するために、以下のような実施例を行った。
参考例4Fにおける、CLP後4時間目の各マウスから腹膜灌流液を採取した。得られた腹膜灌流液を用いて、参考例4Cと同様にして、細菌CFUおよび好中球の細胞数を測定した(コントロール用抗体:n=5および、抗CD300aモノクローナル抗体:n=5)(それぞれ図12Fおよび図12G)。
図12Fおよび図12Gに示されるように、CLP実施の1時間または18時間前において野生型マウスに腹腔内注射によってTX41を投与した場合、腹腔内において、有意に好中球の細胞数は増加し、細菌クリアランスも向上した。
なお、生理的状況下においては、多くの細胞がアポトーシスに至っている。ここで、アポトーシス細胞の取り込みには、PS受容体は中心的な役割を果たし、自己免疫疾患の進展を防ぐのに必須なものである(下記文献22)。
(材料と方法)
(マウス)
C57BL/6Jマウスはクレア日本社より購入した。CD300a遺伝子欠損マウス(CD300a-/-マウス)は、当研究室で作成したBalb/cのCD300a遺伝子欠損マウスと、購入したWT C57BL/6Jマウスとを12世代交配し、バッククロスを行うことにより得た。喘息の誘導開始時にはいずれも8-10週の雄または雌マウスを用いた。
図13Aに、鶏卵白アルブミンで誘導喘息のプロトコールを示す。喘息誘導開始から0、7、14日目に、100μgの鶏卵白アルブミン(OVA、鶏卵のアルブミン, シグマ社製)と100μLのアルミニウム水酸化物ゲル (ALUM、ALhydrogel 2%, インビトロジェン社製)を混和したものを各マウスに腹腔内注射した。
(気管支肺胞洗浄BAL)
マウスの気管を切開し、1mLの2%FBS/PBSで3回洗浄し、洗浄液を回収し、細胞数を測定した。図13AおよびBに示すように、喘息誘導開始から25日目の各マウスの肺胞洗浄液(BAL液)中の細胞数は、総細胞数について、好酸球数についても、CD300a遺伝子欠損マウスの方がWTマウスよりも有意に少なかった。この結果は、CD300aが卵白アルブミン(OVA)による好酸球性気道炎症を増悪させており、CD300a遺伝子欠損マウスは好酸球性気道炎症の症状が改善されることを示している。
回収した気管支肺胞洗浄液から1×106個の細胞をCD45.2−FITC、Siglec−F−PE、CD11b−APCCy7、CD11c−PECCy7、F4/80−Alexa(いずれも購入,BD)で染色し、 CD45+SiglecF−CD11b+CD11c−F4/80−を好酸球分画としてフローサイトメトリー(FACS)にて解析した。
血清IgEの測定はラット抗マウスIgE(BD)とビオチン化抗マウスIgE(BD)を用いて、ELISA法にて測定した。
CD300aがアトピー性皮膚にどのように関与しているのか、調べた。
以下、材料と方法、および各実施例を示す。
Balb/cマウスは、Clea社から、購入し、承認された飼育舎条件下、発明者らの実験室で飼育した。本研究に用いたマウスのうち、8匹はCD300a(MAIR−I)遺伝子欠損であり、他の8匹のマウスはBalb/c種の野生型(WT:Wild Type)のマウスであった。実験期間中、各マウスは餌および水を自由に与えられ、通常の実験室条件で維持された。
各マウスに対し、イソフルラン(マイラン制約株式会社、大阪、日本)により穏やかに麻酔を行った後、電気シェーバーで背部の剃毛を行った。各マウスにつき背面皮膚の一箇所(1cm2)に、粘着性セロファンテープを用いて、少なくとも10回テープストリッピングを行った。
擦過行動数は、第1〜3週の各週の終わりに各マウスを注意深く観察することにより、30分間カウントすることにより計測した。
組織学的観察のために、各マウスのOVA感作部位の皮膚を採取した。採取した全ての皮膚のサンプルを小さな組織ブロックにカットし、4%のパラホルムアルデヒドに4℃で24時間浸漬した。
組織初見の評価は、表皮厚(細胞層)、好酸球、単核細胞およびマスト細胞の浸潤、繊維芽細胞の過形成のレベルについて行った。
図15に各マウスの30分毎の擦過行動数を示す。そう痒症(発疹がないのに、かゆみだけがある疾患)は、アトピー性皮膚炎の一般的な条件である。したがって、OVA感作時に擦過行動数を慎重に30分間、それぞれの動物を観察することによってカウントし、これに基づいて評価している。
OVA感作をした各マウスの皮膚について観察した。
図16(A)にWTマウスでOVA感作をしなかったマウスの皮膚を示す。鶏卵白アルブミン感作を行わなかったWTマウス未処理では、真皮で細胞浸潤は見られず、薄い表皮が観察される。なお、図16の下側のパネルは、上段の矩形領域の拡大図を示している。また、太いバーの長さは、10μmを示す。
図16(D)に示すように、OVA感作後のCD300a遺伝子欠損マウスの皮膚では、驚くべきことに、表皮の厚さは増加したが、表皮の過形成は観察されなかった。さらに、その真皮では、細胞浸潤や線維芽細胞の過形成が認められなかった。
図17に示すように、すべてのマウスの皮膚サンプルでトルイジンブルー染色を行った。トルイジンブルー染色は、マスト細胞の細胞内顆粒を好適に染色する染色法である。
図17に示すように、OVA感作後、WTマウスの皮膚でマスト細胞の数の増加が観察され、表皮もCD300a遺伝子欠損マウスに比較してより厚くなった。
すべてのマウスの皮膚サンプルで表皮内の細胞層数を計数した(図18A参照)。OVA感作後、WTマウスで最も多い細胞層数を示した。これに対して、OVA感作を行ったCD300a遺伝子欠損マウスでは、その半数以下であった。
図18Bに示すように、全てのマウスの表皮サンプルで真皮内に浸潤したアトピー性皮膚炎の指標である好酸球数とマスト細胞数の計測を行った。鶏卵白アルブミン感作後のWTマウスの表皮で最も多い細胞数が観測された。
したがって、OVA感作の後において、WTマウスは、CD300a遺伝子欠損マウスと比べて、アトピー性皮膚炎の特徴がより重度に表れる。
連続皮膚切片上のCD300a(MAIR−I)およびランゲリン抗原の検出を行うために、酵素免疫組織化学の1工程または2工程の方法を行った。まず、全ての切片を0.05%Tween添加リン酸緩衝食塩水(TPBS,pH7.4)で3回すすいだ。その後、これらを冷無水メタノールおよび0.5%H2O2にそれぞれ30分ずつ浸漬した。
各マウスの表皮について、免疫染色時の樹状細胞マーカーであるランゲリンについて、陽性であるか否かを調べた。ランゲリンは、ランゲルハンス細胞に発現するC型レクチンの1つであり,真皮樹状細胞の一部にも発現し、抗原認識と取り込み、細胞内の抗原輸送を担うバーベック顆粒(Birbeck granules)の形成に関与する。
図19(A)は、未処理(OVA感作なし)のWTマウスの表皮を示す。図19(B)は、OVA感作をしたWTマウスの表皮を示す。図19(C)は、未処理のCD300a遺伝子欠損マウスの表皮を示す。図19(D)は、OVA感作をしたCD300a遺伝子欠損マウスの表皮を示す。なお、a、b、cおよびdは、それぞれ上段の図面の矩形領域を拡大した図である。
ランゲリン抗体の免疫陽性をトルイジンブルーによるカウンター染色で評価した。WTマウスの皮膚は、真皮内のランゲリン陽性細胞数の増加を示した。真皮では、いくつかのランゲリン陽性細胞はマスト細胞と相互作用していた。マスト細胞は紫色に染色されている。スケールバーは10μmを示す。
したがって、このことから、CD300a遺伝子欠損マウスの皮膚と比べてWTマウスの皮膚においてアトピー性皮膚炎が重度に発現することを導き出すことができる。これらの結果から、CD300a(MAIR−I)がアトピー性皮膚炎において重要な働きを有していることが示唆される。
(抗CD300a(MAIR−I)抗体での処置)
本実験では、6匹の7週齢Balb/cマウスを使用した。図22に示したプロトコールに従い、6動物のうち3動物については、抗CD300a(MAIR−I)ラットIgG 2aλ(TX41)を静注し、残りの3動物については、ラットIgG 2aλコントロール抗体(TX74)を静注した。これらの抗体は、両方とも、発明者らの実験室で調製しチェックした。「TX74」は、TX41のアイソタイプコントロール抗体であり、以下に示すように中和作用を有さない抗体である。抗体の稀釈は滅菌PBSを用いて行い、抗体濃度1600μg/mLにて150μLを一度に注射した。
図22に、Balb/cWTマウスでCD300a(MAIR−I)抗原をブロックする手順を示す。太い線は、OVA感作の期間を示す。矢印は、各抗体の注射の日程を示す。
末梢血を、プレーン(plain)のガラス製ヘマトクリット管(ドラモンド サイエンティフック カンパニー,ブルームオール,ペンシルバニア,米国)を用いて後眼窩洞 (retro−orbital cavity)から採取し、12000rpmで5分間遠心分離を行った。
(ELISA)
図22に示すようにWTマウスに対して、それぞれTX41とTX74を上述した手順に従って投与し、アトピー性皮膚炎の指標であるIgE濃度を測定した。
図23に、ELISA法により測定した血清総IgE濃度を示す。OVA感作後のIgE値は、TX41を注射したマウスより、TX74を注射したマウスの方が高かった。
図24に示すように、OVA感作後、TX74を注射したWTマウスは、TX41を注射したWTマウスより高い擦過行動の症状を示した。
図25に示すように、実施例2Iの各WTマウスの皮膚切片でH&E染色を行った。OVA感作後、TX74を注射されたWTマウスの皮膚は、TX41を注射されたWTマウスの皮膚よりも表皮の過形成および単核細胞の浸潤を示した。なお、図25の各写真右下のスケールバーは10μmを示す。
図26に示すように、各WTマウスの皮膚について、トルイジンブルー染色を行った。OVA感作後、TX41を注射したWTマウスよりも、TX71を注射したWTマウスの皮膚の方が、相対的に多くのマスト細胞が観測された。図25と同様に、スケールバーは10μmを示す。
全IgEおよび擦過行動数は、TX41を注射されたマウスよりもTX74を注射されたマウスの方が高かった(図23および図24参照)。表皮厚、浸潤細胞数、線維芽細胞数および肥満細胞数もまた、TX41を注射されたマウスよりもTX74を注射されたマウスの方が高かった(図25および図26参照)。
方法:CD300a遺伝子欠損マウス及び野生型マウスにOVA100μg/アルミニウムハイドロゲル(aluminium hydrogel)100μLとしたものを0,7,14日目に腹腔内投与し、21,22、23日目に10%OVA/PBSとした噴霧液を鼻腔投与して喘息を誘導した(図28)。25日目にメサコリンを吸入させ、高性能呼吸機能解析システム(プライムテック株式会社製「FLexivent(TM)」)にて気道内圧を測定した。また、PBS 3mLにて気管支を洗浄し、洗浄液を回収した。気管支洗浄液は細胞を遠心分離し、フローサイトメトリー法にて表面マーカーから細胞集団を解析した。
結果:CD300a遺伝子欠損マウスでは野生型マウスと比較して、メサコリンを吸入させた際の気道内圧が低下しており(図29)、また、気管支洗浄液中の総細胞数、及び好酸球数が低下していた(図30)。CD300a遺伝子欠損マウスは野生型マウスに比べて喘息の病態が軽減されていることが分かる。
方法:実施例2Mと同様に喘息を誘導した(図28)。25日目に血清を回収し、血清中のIgE, OVA特異的IgG1,IgG2b, IgG2c, IgG3をELISA法にて測定した。
結果:CD300a遺伝子欠損マウスでは野生型マウスと比較して、IgE, OVA特異的IgG1が低下しており、一方で、IgG2b, IgG2cの増加が認められた(図31〜図35)。
Th2細胞による免疫応答の指標であるIgEおよびOVA特異的IgG1が低下したことは、CD300a遺伝子欠損マウスではTh2細胞の誘導が減ってアレルギー反応が軽減されることを示している(図31、図32)。
また、Th1細胞による免疫応答の指標であるIgG2cの血中濃度については、CD300a遺伝子欠損マウスの方がWTマウスよりも高く、CD300a遺伝子欠損マウスではTh1細胞の免疫反応がWTマウスよりも増強される結果となった。このTh1細胞の免疫反応の増強は、Th2細胞の免疫反応が相対的に低減されたことを示している(図33)。
方法:CD300a遺伝子欠損マウス及び野生型マウスにOVA100μg/アルミニウムヒドロゲル(aluminium hydrogel)100μLとしたものを腹腔内投与して3日目に縦隔リンパ節を採取し、細胞を単離して細胞数を測定した。
結果:CD300a遺伝子欠損マウスでは野生型マウスと比較して、縦隔リンパ節の腫大が認められ(図36)、その細胞数も増加していた(図37)。
方法:CD300a遺伝子欠損マウス及び野生型マウスにOVA100μg/アルミニウムハイドロゲル(aluminium hydrogel)100μLとしたものを腹腔内投与して7日目に縦隔リンパ節を採取した。細胞を単離して染色し、細胞内転写因子の発現をフローサイトメトリー法にて解析した。
結果:CD300a遺伝子欠損マウスでは野生型マウスと比較して、縦隔リンパ節におけるCD4陽性細胞中のCD25陽性FOXP3陽性細胞、つまりCD4+CD25+FOXP3+Treg細胞が増加していた(図38〜図40)。各種の免疫抑制機能を有するTreg細胞が増加していることは、CD300a遺伝子欠損マウスが野生型マウスより免疫機能が抑制された状態にあり、結果的に喘息の病態が軽減されることが示唆されている。
方法:脾臓、及び縦隔リンパ節におけるCD300aの発現をフローサイトメトリー法にて解析した。
結果:CD300aは、野生型マウスの脾臓細胞および縦隔リンパ節細胞のいずれにおいても、CD11b陽性CD11c陽性細胞で強い発現が認められた(図41〜図48)。
方法:野生型マウスにOVA100μg/アルミニウムハイドロゲル(aluminium hydrogel) 100μLとしたものを0日目、7日目、14日目に腹腔内投与し、21日目、22日目、23日目に10%OVA/PBSとした噴霧液を鼻腔投与して喘息を誘導した(図49)。この際、0、3、7、10日目にTX41抗体もしくはコントロールIgG抗体を300μgずつ腹腔内投与した。25日目にメサコリンを吸入させ、高性能呼吸機能解析システム(プライムテック株式会社製「FLexivent(TM)」)にて気道内圧を測定した。また、PBS 3mLにて気管支を洗浄し、洗浄液を回収した。気管支洗浄液は細胞を遠心分離し、フローサイトメトリー法にて好酸球数を解析した。
結果:TX41抗体を投与したマウスではコントロール抗体を投与したマウスと比較して、メサコリンを吸入させた際の気道内圧が低下しており、また、気管支洗浄液中の総細胞数、及び好酸球数が低下していた(図50〜図52)。TX41抗体(抗CD300a抗体)は喘息の病態を軽減する効果を有することが分かる。
方法:野生型マウスにOVA100μg/アルミニウムハイドロゲル(aluminium hydrogel) 100μLとしたものを腹腔内投与して7日目に縦隔リンパ節を採取した。この際、1、2日目にD89E MFG−E8もしくはコントロールタンパク質(EPT MFG−E8)を100μg腹腔内投与した。縦隔リンパ節の細胞を単離して染色し、細胞内転写因子の発現をフローサイトメトリー法にて解析した。
結果:D89E MFG−E8投与マウスではコントロールタンパク質(EPT MFG−E8)投与マウスと比較して、縦隔リンパ節におけるCD4陽性細胞中のCD25陽性FOXP3陽性細胞が増加していた(図53)。D89E MFG−E8は、各種の免疫抑制機能を有するTreg細胞を増加させることで、喘息の病態を軽減する効果を有することが示唆されている。
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Claims (9)
- CD300aとホスファチジルセリンの結合を阻害する物質を含有する、CD300aを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を抑制するための活性調節剤を有効成分として含有することを特徴とする、アレルギー疾患を治療または予防するための医薬品。
- 前記CD300aとホスファチジルセリンの結合を阻害する物質がホスファチジルセリン結合性物質である、請求項1に記載の医薬品。
- 前記ホスファチジルセリン結合性物質が、MFG−E8、MFG−E8変異体(D89E MFG−E8)、T細胞免疫グロブリン、可溶型TIM−1、可溶型TIM−4、可溶型スタビリンおよび可溶型インテグリンαvβ3からなる群から選択される少なくとも1種類である、請求項2に記載の医薬品。
- 前記CD300aとホスファチジルセリンの結合を阻害する物質がCD300a結合性物質である、請求項1に記載の医薬品。
- 前記CD300a結合性物質が、配列番号3で表されるアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対して1,2,3,4または5個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列からなるH鎖可変領域と、配列番号4で表されるアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対して1,2,3,4または5個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列からなるL鎖可変領域とを有する、抗ヒトCD300a抗体である、請求項4に記載の医薬品。
- 前記CD300a結合性物質が、配列番号1で表されるアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対して1,2,3,4または5個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列からなるH鎖可変領域と、配列番号2で表されるアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対して1,2,3,4または5個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列からなるL鎖可変領域とを有する、抗マウスCD300a抗体である、請求項4に記載の医薬品。
- 前記アレルギー疾患が、アトピー性皮膚炎または喘息である、請求項1〜6のいずれかに記載の医薬品。
- アレルギー疾患について、病態解析を行うための、またはその治療薬もしくは予防薬の有効成分となりうる候補物質をスクリーニングするための、CD300a遺伝子欠損マウスの使用であって、
前記CD300a遺伝子欠損マウスを、アレルギー疾患を誘導させる物質を投与したときにアレルギー疾患を誘発しにくいモデルマウスとして使用することを特徴とする、CD300a遺伝子欠損マウスの使用。 - アレルギー疾患について、病態解析を行う際、またはその治療薬もしくは予防薬の有効成分となりうる候補物質をスクリーニングする際の、比較解析用のツールとしての、
CD300aとホスファチジルセリンの結合を亢進する物質を含有する、CD300aを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を亢進するための活性調節剤の使用。
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