JP2007174950A - 抗炎症薬および／または抗アレルギー薬の同定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ニューロメジンＵで誘導された炎症やアレルギーを抑制する化合物の検索方法の提供。
【解決手段】抗炎症作用および／または抗アレルギー作用を有する化合物の同定方法であって、
１）試験化合物の存在下または非存在下にマスト細胞にニューロメジンＵを接触させる工程、
２）前記マスト細胞の脱顆粒の程度を測定する工程、
３）試験化合物の存在下における前記マスト細胞の脱顆粒の程度と、同様にして測定した試験化合物の非存在下における前記マスト細胞の脱顆粒の程度とを比較する工程、
４）前記マスト細胞の脱顆粒の程度が試験化合物の非存在下よりも試験化合物の存在下において減少している場合、試験化合物が抗炎症作用および／または抗アレルギー作用を有する化合物であると判定する工程、
を含む、抗炎症作用および／または抗アレルギー作用を有する化合物の同定方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、抗炎症作用および／または抗アレルギー作用を有する化合物の同定方法に関する。具体的には、本発明は、ニューロメジンＵがマスト細胞（肥満細胞）に作用して惹起する炎症反応および／またはアレルギー反応を抑制する化合物の同定方法に関する。

マスト細胞は、全身の臓器に広く分布し、種々の刺激に応じて脱顆粒してヒスタミンなどの炎症性ケミカルメディエーターを遊離し、気管支などの平滑筋の収縮、細動脈の拡張、血管の透過性亢進、組織の浮腫などの即時型アレルギー反応を引き起こす。また、即時型アレルギー反応の数時間後には、マスト細胞は各種のサイトカインを遊離する。このサイトカインは、炎症細胞が血管壁にローリング、粘着し、組織へと遊走して、活性化され、気道粘膜の炎症を主体とする遅発型反応を引き起こす。気道粘膜の炎症を主体とする遅発型反応には、気管支喘息やアレルギー性鼻炎がある。また、サイトカインは、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎などの遅延型アレルギー反応にも深く関与している。

マスト細胞の脱顆粒は、マスト細胞表面のＩｇＥ抗体が抗原により架橋されることで引き起こされることが知られている。また、マスト細胞の脱顆粒は、抗原が存在しなくても、サブスタンスＰやインターロイキン−１（ＩＬ−１）などによっても引き起こされることが知られている。

一方、ニューロメジンＵは、１９８５年にブタの脊髄から単離され、子宮の平滑筋収縮作用を有するニューロペプチドとして見出された（非特許文献１）。その後、ニューロメジンＵは、食欲抑制作用、体重抑制作用、ストレス反応制御作用、消化管におけるイオン輸送調節作用等を有することが明らかにされている。ニューロメジンＵの受容体としては、Ｇ蛋白にカップルしたＮＭＵ−Ｒ１とＮＭＵ−Ｒ２と称する受容体が知られている。ＮＭＵ−Ｒ２は、脳の特異的領域に発現していることが知られ、ＮＭＵ−Ｒ１は小腸、膵臓、胃などの末梢組織に比較的多く発現していることが知られている。また、ＮＭＵ−Ｒ１受容体のアンタゴニスト（または、アゴニスト）については、ピペリジン誘導体が知られている（特許文献１）。

最近では、ニューロメジンＵがマウスＴｈ２クローン細胞において各種のサイトカインの分泌を促進することが明らかになった。また、ニューロメジンＵは、濾胞樹状細胞、単球、Ｂリンパ球のような抗原提示細胞に存在していることから、免疫調節にも関与していることが示唆されている（非特許文献２）。

しかしながら、ニューロメジンＵとマスト細胞との関係については、何ら知られていなかった。また、上記のようにニューロメジンＵが免疫に関与していることは示唆されてはいたが、生体内において炎症および／またはアレルギーの起因物質または増悪因子として作用しているかどうかも明らかではなかった。
特開２００４−１６８７７２号公報 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１３０巻，１０７８−１０８５頁、１９８５年。 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１７３巻，７２３０−７２３８頁、２００４年。

このような状況下、本発明は、ニューロメジンＵが生体内において炎症やアレルギーに対してどのような作用をしているのか、またニューロメジンＵが炎症やアレルギーを引き起こす物質であるならば、どの組織を通じてそれらを誘導するかについて明らかにし、ニューロメジンＵで誘導される炎症やアレルギーを抑制する手段を提供することを課題とする。また、本発明は、ニューロメジンＵで誘導される炎症やアレルギーを抑制する化合物の探索を可能とする方法を提供することを課題とする。

本発明者等は、ニューロメジンＵが作用して炎症やアレルギーを誘導する主要な標的組織について検討し、さらには実際にニューロメジンＵにより炎症やアレルギーが引き起こされるかどうかを鋭意検討した結果、ニューロメジンＵがマスト細胞の脱顆粒を引き起こし、炎症やアレルギーを惹起することを見出し、本発明を完成した。

すなわち、マスト細胞にニューロメジンＵを作用させると、脱顆粒を引き起こすことを見出した。また、ニューロメジンＵをマウスに投与した場合、マスト細胞欠損マウスでは正常マウスと比較して有意に強い炎症反応（および／またはアレルギー反応）が惹起された。
この結果は、ニューロメジンＵの受容体を阻害すれば、ニューロメジンＵで惹起される炎症反応（および／またはアレルギー反応）を抑制できることを示す。また、ニューロメジンＵにより誘導されるマスト細胞の脱顆粒を阻害する化合物を探索すれば、ニューロメジンＵで惹起されるマスト細胞依存性の炎症および／またはアレルギーを治療する薬物を得ることができることを示す。

したがって、本発明は、ニューロメジンＵの受容体のアンタゴニストを用いてマスト細胞依存性の炎症および／またはアレルギーを治療する方法を提供する。
また、本発明は、ニューロメジンＵで誘導される炎症および／またはアレルギーを抑制する化合物を同定する方法を提供する。

具体的には、抗炎症作用および／または抗アレルギー作用を有する化合物の同定方法であって、
１）試験化合物の存在下または非存在下にマスト細胞にニューロメジンＵを接触させる工程、
２）前記マスト細胞の脱顆粒の程度を測定する工程、
３）試験化合物の存在下における前記マスト細胞の脱顆粒の程度と、同様にして測定した試験化合物の非存在下における前記マスト細胞の脱顆粒の程度とを比較する工程、
４）前記マスト細胞の脱顆粒の程度が試験化合物の非存在下よりも試験化合物の存在下において減少している場合、試験化合物が抗炎症作用および／または抗アレルギー作用を有する化合物であると判定する工程、
を含む、抗炎症作用および／または抗アレルギー作用を有する化合物の同定方法を提供する。
また、本発明は、マスト細胞およびニューロメジンＵを含有する、抗炎症作用および／または抗アレルギー作用を有する化合物の同定用キットを提供する。
また、本発明は、抗炎症作用および／または抗アレルギー作用を有する化合物の同定方法であって、
１）非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与する工程、
２）非ヒト哺乳動物にニューロメジンＵを投与する工程、
３）ニューロメジンＵを投与した部位の炎症および／またはアレルギー反応の程度を測定する工程、
４）試験化合物を投与した非ヒト哺乳動物における炎症および／またはアレルギー反応の程度と、同様にして測定した試験化合物を投与しなかった非ヒト哺乳動物における炎症および／またはアレルギー反応の程度とを比較する工程、
５）炎症反応および／またはアレルギー反応の程度が試験化合物を投与しなかった非ヒト哺乳動物よりも試験化合物を投与した非ヒト哺乳動物において減少している場合、試験化合物が抗炎症作用および／または抗アレルギー作用を有する化合物であると判定する工程、
を含む、抗炎症作用および／または抗アレルギー作用を有する化合物の同定方法を提供する。

本発明は、ニューロメジンＵの受容体のアンタゴニストを用いてマスト細胞依存性の炎症および／またはアレルギーを予防または治療することを可能とする。また、本発明は、ニューロメジンＵで誘導される炎症および／またはアレルギーを予防または治療する化合物を同定することを可能とする。より具体的には、マスト細胞の脱顆粒、すなわちヒスタミンなどの炎症性ケミカルメディエーターの遊離を抑制し、炎症および／またはアレルギーを予防または治療する化合物の探索を可能とする。

ニューロメジンＵの受容体のアンタゴニストを用いてマスト細胞依存性の炎症および／またはアレルギーを予防または治療する場合、例えば特許文献１に記載されているニューロメジンＵ受容体Ｒ１のアンタゴニストであるピペリジン誘導体を用いることが考えられる。しかしながら、ニューロメジンＵ受容体のアンタゴニストとしては、特に上記のピペリジン誘導体に限定されるものではない。

また、ニューロメジンＵで誘導される炎症および／またはアレルギーを予防または治療する化合物を同定する方法は、イン・ビトロ試験とイン・ビボ試験に分けられる。

イン・ビトロ試験で、ニューロメジンＵで惹起される炎症および／またはアレルギーを予防または治療する化合物を同定する場合には、マスト細胞の脱顆粒を指標として測定すればよい。具体的には、前記工程１）〜４）を行えばよい。

まず、１）試験化合物の存在下または非存在下にニューロメジンＵを接触させ、２）該マスト細胞の脱顆粒の程度を測定する。具体的には、ラットなどの哺乳動物のマスト細胞と試験化合物を含む緩衝液を３７℃前後の温度でプレインキュベートした後、ニューロメジンＵを添加して同温度でインキュベートして得られる上清のβ−ヘキソサミニダーゼ活性を測定すればよい。なお、脱顆粒の程度の測定は、β−ヘキソサミニダーゼ活性以外に、マスト細胞から遊離されるヒスタミンやセロトニンなどの各種メディーエーターの量を測定しても良い。ヒスタミンやセロトニンを測定する方法としては、放射性同位元素で標識したセロトニンあるいはヒスタミンを予めマスト細胞に取り込ませておき、脱顆粒により放出された量を測定する方法を挙げることができる。

次に、３）試験化合物の存在下におけるマスト細胞の脱顆粒の程度と、同様にして測定した試験化合物の非存在下におけるマスト細胞の脱顆粒の程度とを比較する工程、および４）マスト細胞の脱顆粒の程度が試験化合物の非存在下よりも試験化合物の存在下において減少している場合、試験化合物が抗炎症作用および／または抗アレルギー作用を有する化合物であると判定する工程を行えばよい。すなわち、試験化合物の存在下におけるマスト細胞の脱顆粒が、試験化合物の非存在下における値よりも減少している場合には、当該試験化合物がニューロメジンＵで惹起される炎症および／またはアレルギーを抑制する作用を有すると判定する。この判定に際しては、必ずしも統計学的な手法を用いる必要はないが、統計学的に有意差の有無を検定して判定することが好ましい。有意差の有無の検定には、一般的に使用されている統計学的な手法を用いればよく、例えば、ｔ−検定、Ｄｕｎｎｅｔ多重比較検定などを挙げることができる。

上記の試験におけるプレインキュベートおよびインキュベートの時間は、１０〜４０分でよく、２０〜３０分が好ましい。緩衝液としては、例えば、タイロード緩衝液（ギブコ社製）が挙げられる。β−ヘキソサミニダーゼ活性の測定は、市販の測定試薬または測定用キットを用いればよく、例えば、ｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミニド（シグマ社製）が挙げられる。ニューロメジンＵは、非ヒトのニューロメジンＵであっても、ヒトのニューロメジンＵでもよいが、例えば、ニューロメジンＵ−２５（フェニックス・ファイマシューティカルズ社製）が挙げられる。緩衝液中のニューロメジンＵの濃度は、１０^-8〜１０^-5Ｍが好ましい。

また、上記のイン・ビトロ試験には、マスト細胞およびニューロメジンＵを含有する、抗炎症作用および／または抗アレルギー作用を有する化合物を同定するためのキット（同定用キット）を使用することができる。このキットは、さらに、マスト細胞、ニューロメジンＵおよびβ−ヘキソサミニダーゼ活性測定用試薬からなるものとしてもよい。β−ヘキソサミニダーゼ活性測定用試薬としては、上述の試薬を挙げることができる。

イン・ビボ試験で、ニューロメジンＵで惹起される炎症および／またはアレルギーを予防または治療する化合物を同定する場合には、１）試験化合物を前投与したマウスやラット等の非ヒト哺乳動物に、２）ニューロメジンＵを投与して、３）炎症反応および／またはアレルギー反応の程度を調べればよい。試験化合物の投与時期は、ニューロメジンＵの投与前に限られるものではなく、投与後でもよい。

次に、４）試験化合物を投与した非ヒト哺乳動物における炎症および／またはアレルギー反応の程度と、同様にして測定した試験化合物を投与しなかった非ヒト哺乳動物における炎症および／またはアレルギー反応の程度とを比較し、５）試験化合物を投与した非ヒト哺乳動物における炎症反応および／またはアレルギー反応の程度が、試験化合物を投与しなかった非ヒト哺乳動物における炎症反応および／またはアレルギー反応の程度よりも減少している場合には、当該試験化合物がニューロメジンＵで惹起される炎症反応および／またはアレルギー反応を抑制する作用を有すると判定する。この判定に際しては、必ずしも統計学的な手法を用いる必要はないが、統計学的に有意差の有無を検定して判定することが好ましい。有意差の有無の検定には、一般的に使用されている統計学的な手法を用いればよく、例えば、ｔ−検定、Ｄｕｎｎｅｔ多重比較検定などが挙げられる。なお、非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与しない場合には、試験化合物を溶解するために使用する溶媒のみを投与するとよい。

上記の試験において、ニューロメジンＵを投与する部位としては、好ましくは足底であるが、それに限定されるものではない。なお、足底へ投与する場合には、皮下投与が好ましく、投与部位の皮下組織における炎症反応および／またはアレルギー反応の程度を測定することが好ましい。

炎症反応および／またはアレルギー反応の程度は、ニューロメジンＵの投与部位に生じた浮腫の大きさを測定するとよい。浮腫の大きさは、ノギス等を使用して測定すればよい。ニューロメジンＵを足底へ投与した場合には、足の大きさを測定してもよい。

また、炎症反応および／またはアレルギー反応の程度は、血漿の血管外への漏出の程度を測定してもよい。血漿の血管外への漏出の程度を測定する場合には、エバンスブルー等の色素を静脈投与した後、ニューロメジンＵを皮下投与して、投与部位を摘出し、ホルムアミドなどの溶媒で色素を抽出後、光学的手段で色素の量を測定して炎症の程度を比較してもよい（参照文献：ネーチャー、４０９巻、５１３−５１７頁）。試験化合物の投与時期は、ニューロメジンＵの投与前でも投与後でもよい。また、色素の投与時期も、ニューロメジンＵの投与前もしくは投与後であってもよい。試験化合物の投与時期と色素の投与時期についても、前後してよい。

また、炎症反応および／またはアレルギー反応を測定することなく、マスト細胞の脱顆粒の程度を測定してもよい。その場合には、ニューロメジンＵの投与部位を摘出した後、投与部位の皮下組織を病理切片標本とし、ヘマトキシリンとエオシン、またはトルイジンブルーで染色し、標本におけるマスト細胞の脱顆粒の程度を顕微鏡で調べてもよい。

本発明方法によれば、インビトロまたはインビボにおいて、ニューロメジンＵで誘導される炎症および／またはアレルギーを予防または治療する化合物が同定でき、全く新たな作用機序による抗炎症薬および／または抗アレルギー薬をスクリーニングすることができる。

以下に試験例を示して本発明を説明する。

［試験例１］
ニューロメジンＵ皮下投与後に惹起される炎症へのマスト細胞の関与：マウスにおける試験例
試験には、マスト細胞欠損マウス（ＷＢＢ６Ｆ１−Ｗ／Ｗ^v：日本ＳＬＣ）とマスト細胞欠損のない正常対照（ＷＢＢ６Ｆ１^-+/+）を用いた。炎症部位血管からのエバンスブルー漏出の測定の概略は、以下の通りである。麻酔下でマウスにエバンスブルー（５０ｍｇ／ｋｇ）を頸静脈に注射した。その後、上記マウスの一側足底にニューロメジンＵを５０ｐｍｏｌ皮下投与した。もう一側には対照とするため溶媒を注射した。３０分後に足を分離し、重量測定し、５６℃のホルムアミド中で、２４時間インキュベーションし、抽出されたエバンスブルー量を６００ｎｍの波長で分光光度計により測定した。ニューロメジンＵ注射側と溶媒注射側のエバンスブルー量の比を求めて、マスト細胞の関与を評価した。もう一つの炎症の指標としては、ニューロメジンＵ投与３０分後に足の直径を測定し、やはりニューロメジンＵ注射側と溶媒注射側のエバンスブルー量の比を求めて、マスト細胞の関与を評価した。

＜結果＞
下表のようにニューロメジンＵは、マスト細胞欠損マウスでは炎症反応を起こさなかったが、マスト細胞欠損のない正常対照マウスでは炎症反応を起こした。

［試験例２］
ラット腹腔のマスト細胞における脱顆粒
ラット腹腔のマスト細胞（２５，０００個）を緩衝液（１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１％−ゼラチン含有タイロード緩衝液）０．１５ｍＬに浮遊させ、ヒト・ニューロメジンＵ（フェニックス・ファイマシューティカルズ社製）０、２×１０^-7、２×１０^-6、および２×１０^-5Ｍを加えて２０分間インキュベートした。上清を分取し、発色基質ｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミニド（シグマ社製）を添加して２時間インキュベートした後、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。

＜結果＞
下表のように、ニューロメジンＵは、ラット腹腔のマスト細胞の脱顆粒を濃度依存的に起こした。

Claims (10)

1. 抗炎症作用および／または抗アレルギー作用を有する化合物の同定方法であって、
   １）試験化合物の存在下または非存在下にマスト細胞にニューロメジンＵを接触させる工程、
   ２）前記マスト細胞の脱顆粒の程度を測定する工程、
   ３）試験化合物の存在下における前記マスト細胞の脱顆粒の程度と、同様にして測定した試験化合物の非存在下における前記マスト細胞の脱顆粒の程度とを比較する工程、
   ４）前記マスト細胞の脱顆粒の程度が試験化合物の非存在下よりも試験化合物の存在下において減少している場合、試験化合物が抗炎症作用および／または抗アレルギー作用を有する化合物であると判定する工程、
   を含む、抗炎症作用および／または抗アレルギー作用を有する化合物の同定方法。
2. 前記マスト細胞の脱顆粒の程度をβ−ヘキソサミニダーゼ活性で測定することを特徴とする、請求項１に記載の抗炎症作用および／または抗アレルギー作用を有する化合物の同定方法。
3. マスト細胞およびニューロメジンＵを含有する、抗炎症作用および／または抗アレルギー作用を有する化合物の同定用キット。
4. マスト細胞、ニューロメジンＵ、およびβ−ヘキソサミニダーゼ活性測定用試薬を含有する、抗炎症作用および／または抗アレルギー作用を有する化合物の同定用キット。
5. 抗炎症作用および／または抗アレルギー作用を有する化合物の同定方法であって、
   １）非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与する工程、
   ２）非ヒト哺乳動物にニューロメジンＵを投与する工程、
   ３）ニューロメジンＵを投与した部位の炎症反応および／またはアレルギー反応の程度を測定する工程、
   ４）試験化合物を投与した非ヒト哺乳動物における炎症反応および／またはアレルギー反応の程度と、同様にして測定した試験化合物を投与しなかった非ヒト哺乳動物における炎症反応および／またはアレルギー反応の程度とを比較する工程、
   ５）炎症反応および／またはアレルギー反応の程度が試験化合物を投与しなかった非ヒト哺乳動物よりも試験化合物を投与した非ヒト哺乳動物において減少している場合、試験化合物が抗炎症作用および／または抗アレルギー作用を有する化合物であると判定する工程、
   を含む、抗炎症作用および／または抗アレルギー作用を有する化合物の同定方法。
6. 炎症反応および／またはアレルギー反応の程度を、ニューロメジンＵを投与した部位におけるマスト細胞の脱顆粒の程度で測定する、請求項５に記載の抗炎症作用および／または抗アレルギー作用を有する化合物の同定方法。
7. 炎症反応および／またはアレルギー反応の程度を、ニューロメジンＵを投与した部位における浮腫の程度で測定する、請求項５に記載の抗炎症作用および／または抗アレルギー作用を有する化合物の同定方法。
8. 炎症反応および／またはアレルギー反応の程度を、ニューロメジンＵを投与した部位における血漿の漏出量で測定する、請求項５に記載の抗炎症作用および／または抗アレルギー作用を有する化合物の同定方法。
9. ニューロメジンＵの投与前または投与後に色素を静注投与し、ニューロメジンＵを投与した部位における色素量で血漿の漏出量を測定する、請求項５に記載の抗炎症作用および／または抗アレルギー作用を有する化合物の同定方法。
10. 色素がエバンスブルーである、請求項９に記載の抗炎症作用および／または抗アレルギー作用を有する化合物の同定方法。