TWI405966B - 轉錄調控物組合物 - Google Patents

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TWI405966B
TWI405966B TW098145586A TW98145586A TWI405966B TW I405966 B TWI405966 B TW I405966B TW 098145586 A TW098145586 A TW 098145586A TW 98145586 A TW98145586 A TW 98145586A TW I405966 B TWI405966 B TW I405966B
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Description

轉錄調控物組合物
本發明係關於一種轉錄調控物組合物。
雄激素定義為一廣泛種類之主要控制雄性特徵發展及維持之類固醇激素。其經由雄激素受體(AR)發揮其生理作用，該雄激素受體為類固醇激素核受體總科中之一員。該AR係藉由結合雄激素(例如睾固酮)或相關配位體來活化。經活化之AR引發一信號轉導路徑，其驅動眾多"雄激素回應"靶基因(例如前列腺特異性抗原(PSA))之轉錄增加。應注意的是，此路徑中之信號轉導步驟尚未完全闡明。
由雄激素活化AR，接著增加雄激素回應靶基因之轉錄，會激發眾多疾病，例如前列腺癌。因此，治療前列腺癌通常包括投與AR拮抗劑。不幸地，由於由癌細胞所表現之AR常變成雄激素非依賴性，意即組成性活性(例如由於突變)，因此其效用常為短期的。因此，配位體非依賴性AR即使在AR拮抗劑存在下仍驅動高水平之支持持久性癌生長之靶基因轉錄。
因此，需要在AR活化下游之信號轉導步驟中調控雄激素回應靶基因轉錄之組合物，以及用於其識別及治療用途之方法。
本發明係部分基於意外發現，即IκB激酶次單位α(IKKα)與AR相互作用且其活性對於雄激素回應基因轉錄很關鍵。
因此，本發明之一態樣係關於一種藉由對一受檢者投與含有有效劑量之IKKα活性抑制劑之組合物來治療雄激素刺激之疾病的方法。較佳地，在投與該組合物之前，該受檢者經診斷患有該雄激素刺激之疾病。雄激素刺激之疾病為由AR活性所引起或惡化之任何健康異常病症，例如前列腺癌、良性前列腺肥大、乳癌、男性禿頭症、痤瘡丙酸桿菌、多囊性卵巢症、體染色體顯性多囊性腎病或雄性素過多症。組合物可含有來自蟛蜞菊(Wedelia chinensis )、鱧腸(Eclipta prostrata )或旱蓮草(Eclipta alba )之提取物。IKKα活性抑制劑可為葉含蟛蜞菊內酯(wedelolactone)、葉黃酮(luteolin)、槲皮酮(quercetin)、洋元荽黃素(apigenin)、15-去氧-Δ12,14 -前列腺素J2 或前列腺素A1。該方法亦可包括在對受檢者投與上述組合物之前或之後測定來自該受檢者之生物試樣中之PSA含量。在投藥之前測定PSA含量適用於診斷受檢者患有雄激素刺激之疾病(例如前列腺癌)。在投藥之後所測定之PSA含量為回應上述用於治療雄激素刺激之疾病之方法的治療之可靠指數。
本發明之另一態樣係關於一種藉由對一高風險受檢者投與含有有效劑量之IKKα活性抑制劑來降低該受檢者之前列腺癌風險的方法。
本發明之另一態樣係關於一種用於識別調控物(意即IKKα調節之轉錄活性的抑制劑或刺激劑)之方法。轉錄活性抑制劑適用於(例如)治療諸如前列腺癌之雄激素刺激之疾病。該方法包括(1)提供哺乳動物細胞，其表現IKKα及AR，且含有包括可操作性地連接至編碼報導體多肽之序列上的雄激素回應啟動子之序列的經分離核酸以致該細胞亦表現該報導體多肽，(2)將該細胞與測試組合物接觸，且(3)檢定表現量(意即mRNA或蛋白質之表現量)或報導體多肽之活性。若該測試組合物增加或降低與負控制治療有關之表現量或經編碼之報導體多肽的活性，則認為其為由IKKα調節之轉錄活性的調控物。經表現之AR可為組成性活性突變體。若AR為非組成性活性，則該方法包括將細胞與AR促效劑接觸。該方法亦可包括判定測試組合物對IKKα活性之作用以進一步表徵機制，測試組合物藉由該機制調控由此激酶調節之轉錄活性。
本發明之又一態樣係關於一種用於測定一非人類哺乳動物測試受檢者中由IKKα調節之轉錄活性的方法。該方法適用於(例如)判定活體內候選IKKα抑制劑組合物之功效。該方法包括(1)引入眾多細胞，其表現IKKα及雄激素受體，且含有具有可操作性地連接至編碼報導體多肽之序列上的雄激素回應啟動子之序列的經分離核酸以致該細胞亦表現該報導體多肽；及(2)偵測由該等細胞所表現之報導體多肽的活性。報導體活性(例如活體內)之偵測指示測試受檢者中由IKKα調節之轉錄活性。該方法亦可包括測定來自測試受檢者之生物試樣中的IKKα活性程度。
本發明之其他特徵或優點將因以下實施方式亦及申請專利範圍而顯而易見。
下文所描述用於識別特定調控例如雄激素回應靶基因轉錄之由IKKα調節之轉錄(IKKαRT)的組合物之方法。下文亦描述藉由投與有效劑量之該等組合物來治療患有雄激素刺激之疾病或對於雄激素刺激之疾病具高風險之受檢者的方法。
IKKαRT調控物組合物(意即降低或增加IKKαRT之組合物)係藉由雄激素回應報導體檢定來識別。
雄激素回應報導體結構係藉由將雄激素回應啟動子(androgen-responsive promoter)與編碼報導體多肽之核酸融合來產生。雄激素回應啟動子為可由AR依賴性信號轉導路徑活化之啟動子。將該雄激素回應報導體結構引入一宿主細胞中以產生一雄激素回應報導體細胞，在該雄激素回應報導體細胞中該雄激素回應啟動子驅動報導體多肽之表現。為評估在報導體細胞中測試組合物調控IKKαRT之能力，可藉由在有或無測試組合物之情況下將該等細胞與雄激素(例如睾固酮或5α-二氫睾固酮)接觸來增加報導體細胞之IKKα活性。在將細胞與雄激素加上或無測試組合物接觸之後，檢定報導體表現或活性。若在測試組合物存在下與無測試組合物相比，回應雄激素刺激之報導體的表現或活性增加或降低，則認為該組合物為IKKαRT調控物。
測試組合物可為(例如)自生物源純化或經合成之天然產生之組合物、植物提取物、蛋白質、肽或小分子(例如選自一組合合成庫之化合物)。
合適之雄激素回應報導體細胞可衍生自哺乳動物組織或細胞株(例如衍生自人類、猴、小鼠、大鼠或倉鼠)。宿主細胞內源性或異源性地表現IKKα(例如GenBank第NP_001269號)及AR(例如GenBank第AAA51729號)。舉例而言，得自American Type Culture Collection(ATCC® 編號：CRL-2505TM )之人類PCa 22Rvl細胞株可用於產生雄激素回應報導體細胞株。
在報導體檢定中，可藉由使用表現組成性活性AR之報導體細胞來避免雄激素刺激，例如Marcelli等人(1995)，Endocrinology 第136卷，第3期中所述。
用於產生報導體結構、將其引入細胞中且檢定多種報導體多肽活性之方法可於(例如)Current Protocols in Molecular Biology ,John Wiley & Sons,N.Y.(2005)，分別3.16-3.17及9.1-9.14中詳細發現。
雄激素回應啟動子應包括以下雄激素回應元素中之至少一種：AGAACAGCAAGTGCT (SEQ ID NO：1)
GGATCAGGGAGTCTC (SEQ ID NO：2)
GGAACATATTGTATC (SEQ ID NO：3)
參見Cleutjens等人(1997)，Mol.Endocrinol. 11(9)：1256-65。
舉例而言，雄激素回應啟動子可為PSA啟動子，其含有全部三種上文所列之雄激素回應元素，且具有以下序列：
(SEQ ID NO：4)
熟習技術者將認為其他結構上及功能上等效之啟動子可用於剛才所述之啟動子報導體檢定中，例如至少75%與SEQ ID NO：4一致(即，介於75%與100%之間的任何一致性百分數)之啟動子。該等啟動子應包括雄激素回應元素之至少一個複本，例如SEQ ID NOs：1-3中之任一者。
等效啟動子之實例包括彼等刪去或添加高達40種核苷酸且保持至少70%之SEQ ID NO：4之啟動子活性的等效啟動子。該等啟動子之用途亦在本發明之範疇內。
啟動子活性可藉由量測報導體多肽之特性(例如酶促活性或螢光性)、報導體多肽表現(例如根據ELISA檢定)或報導體mRNA表現(例如根據螢光雜交技術)來定量。在曝露於AR促效劑(例如睾固酮或5α-二氫睾固酮)及測試組合物之第一組與曝露於單獨AR促效劑之第二組之間比較PSA啟動子活性。若相對於該第二組，該第一組中報導體活性或表現增加或降低，則認為該測試組合物為IKKαRT調控物。
合適之報導體多肽包括(例如)螢火蟲螢光素酶、水母螢光素酶(Renilla luciferase)、螢光蛋白質(例如強化型綠色螢光蛋白質)、β-半乳糖苷酶、β-內醯胺酶、鹼性磷酸酶及辣根過氧化物酶。
舉例而言，螢光素酶活性可藉由提供適當發光受質(例如用於螢火蟲螢光素酶之螢火蟲發光素或用於水母螢光素酶之腔腸素(coelenterazine))來偵測。在適當受質存在下螢光素酶活性可由例如冷光光度測定法(luminometry)之眾多標準技術來定量。
可使報導體活性量測標準化成細胞溶解產物中之蛋白質濃度。蛋白質濃度可由(例如)使用市售試劑之庫馬斯(Coomassie)檢定來測定。或者，第二報導體結構(意即"標準化報導體結構")可用於標準化報導體活性量測。由標準化報導體結構編碼之標準化報導體多肽通常具有不同於上述雄激素回應報導體多肽之活性。此外，標準化報導體結構通常包括弱組成性啟動子，例如驅動報導體多肽表現之疱疹性胸苷激酶啟動子。該標準化報導體結構可與包括第一報導體結構之相同核酸分離或為該核酸之部分(例如作為一質體之部分)。啟動子活性可藉由測出雄激素回應報導體多肽活性與標準化報導體多肽活性之比率來定量。舉例而言，在雙螢光素酶報導體檢定中，螢火蟲螢光素酶可用作指示雄激素回應啟動子活性之報導體多肽且水母螢光素酶可用作標準化報導體多肽。包括高產量方法之雙螢光素酶檢定之詳細說明揭示於美國專利第5,744,320號中。
報導體表現或活性可在無細胞檢定(例如細胞溶解產物)中或在活細胞中檢定，此視選擇用於檢定之報導體多肽或報導體酶受質而定。無細胞檢定可在任何合適容器(例如微量滴定盤、試管、比色管及微量離心管)中進行。活細胞檢定可在任何適合於哺乳動物細胞培養之容器(例如微量細胞培養盤、多孔盤、細胞培養皿及細胞培養瓶)中進行。多孔細胞培養盤可適用於該盤之孔中細胞或細胞溶解產物之直接冷光光度測定法或螢光光度測定法(fluorimetry)。螢光素酶活性可在活細胞中藉由將合適之螢光素酶受質直接添加至細胞培養基中之培養細胞中(意即無溶解步驟)且量測直接來自完整細胞之光發射來量測。可將VivirenTM 受質(Promega,WI)或其他合適之細胞可滲透性螢光素酶受質直接添加至細胞中以量測螢光素酶活性。
螢光多肽(例如EGFP)可在活細胞中由此項技術中已知之眾多偵測方法(例如螢光光度測定法或螢光顯微法)來偵測及定量。在活細胞中使用螢光多肽之報導體檢定篩檢的詳細說明(包括高產量方法)可於(例如)美國專利第6,875,578號中發現。
報導體mRNA及蛋白質表現量可由眾多習知方法測定。舉例而言，來自經處理及未經處理之細胞的報導體mRNA表現可由標準RNA墨點分析法監測或可由PCR，尤其為定量PCR(qPCR)或此項技術中已知之類似技術來輔助(參見，例如Current Protocols in Molecular Biology ,John Wiley ＆ Sons,N.Y.(2005),15.5-15.7)。免疫檢定亦可用於偵測或監測報導體多肽含量。對於眾多報導體多肽(例如EGFP、螢光素酶或β-半乳糖苷酶)而言，特異性多株或單株抗體為市售的且可用於任何標準免疫檢定格式中。適用於量測報導體多肽含量之檢定包括競爭性及非競爭性檢定、放射免疫檢定、生物發光及化學發光檢定、螢光測定、夾心檢定、點漬墨法、酶聯檢定(包括ELISA)、微量滴定盤及經抗體塗覆之條帶或用於快速監測血液之量桿。對於每一種方法而言，確定檢定之範圍、敏感性、精度、可靠性、特異性及再現性。某些免疫檢定之實例詳細描述於(例如)Current Protocols in Molecular Biology ,John Wiley ＆ Sons,N.Y.(2005),11.1-11.3中。
視情況，經AR調節之IKKα激酶活性程度可在曝露於測試組合物或負控制組合物(例如細胞培養基)之報導體細胞中測定。舉例而言，在有或無IKKαRT-調控物測試組合物之雄激素刺激細胞之後，可製備細胞溶解產物且AR錯合之IKKα激酶含量可由使用AR單株抗體(例如來自Santa Cruz Biotechnology,Inc.(Santa Cruz,CA)之AR-441)之免疫沉澱反應，接著由使用組蛋白H3作為受質之活體外蛋白激酶檢定來測定。組蛋白H3磷酸化之程度指示經AR刺激之IKKα活性程度。或者，在測試組合物存在下IKKα活性可在活體外測定。舉例而言，可首先使用得自(例如)Santa Cruz Biotechnology,Inc.(Santa Cruz,CA)之多株抗IKKα之多株抗體將全部IKKα自細胞溶解產物中免疫沉澱。接著檢定經免疫沉澱之激酶在有或無測試組合物之情況下其使組蛋白H3磷酸化的能力。
上述雄激素回應報導體細胞(例如雄激素回應報導體細胞株)亦適用於測定一非人類哺乳動物測試受檢者中(例如小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠、兔、狗、貓或猴中)的IKKαRT活性。對異種移植物具耐受性之動物模型(例如裸小鼠或裸大鼠)尤其適用。首先將報導體細胞注入測試受檢者中。隨後在一自測試受檢者獲得之生物試樣(例如血樣、皮膚試樣、前列腺組織之活組織試樣等)中檢定報導體活性。其他或另外，可直接在測試受檢者中(意即活體內)偵測報導體活性。螢光素酶為用於活體內偵測之尤其適用之報導體多肽。舉例而言，對含有表現螢光素酶之報導體細胞的測試受檢者投與適當發光受質(例如螢光素)。接著(例如)由(例如)美國專利第6,596,257號中所述之光學斷層攝影術在活體內偵測由活體內螢光素酶活性所產生之光子發射。適用於活體內成像之電荷耦合裝置攝影機係購自(例如)Xenogen(Alameda,CA)之IVIS® 系統。來自測試受檢者之生物試樣中之IKKα活性程度亦可由上述方法檢定。待檢定IKKα活性之生物試樣可包括僅報導體細胞、報導體細胞與原生細胞兩者或僅原生細胞。
在測試受檢者中報導體及IKKα活性之量測適用於(例如)評估在上述測試組合物報導體檢定中所識別之IKKαRT調控物在活體內的效用。
上述啟動子報導體檢定可用於識別抑制IKKαRT之組合物。該等組合物包括(例如)來自蟛蜞菊、鱧腸或旱蓮草之植物提取物，及抑制IKKα活性之純化合物，例如葉含蟛蜞菊內酯、葉黃酮、槲皮酮、洋元荽黃素、15-去氧-△12,14 -前列腺素J2 及前列腺素A1。
IKKαRT抑制劑可用於治療雄激素刺激之疾病。舉例而言，可對需要之受檢者投與含有有效劑量之IKKαRT抑制劑之組合物(例如含有鱧腸提取物或葉含蟛蜞菊內酯之組合物)以治療雄激素刺激之疾病，例如前列腺癌、良性前列腺肥大、乳癌、男性禿頭症、痤瘡丙酸桿菌、多囊性卵巢症、體染色體顯性多囊性腎病或雄性素過多症。在投與抑制劑組合物之前，該受檢者診斷患有雄激素刺激之疾病或具有其之高風險。舉例而言，在前列腺癌之情況下，在一來自該受檢者之生物試樣(例如血樣)中測定PSA含量。用於PSA之檢定可如(例如)美國專利第6,300,088中所描述來進行。PSA含量之量測亦可在投與作為回應此治療之治療指示劑的抑制劑組合物之後在不同時間點進行。
在某些狀況下，一受檢者可具有發展前列腺癌之高風險，例如由過高PSA含量所指示。因此，可藉由對該受檢者預防性地投與含有有效劑量之IKKαRT抑制劑來降低該受檢者之前列腺癌風險。
上述包括例如來自蟛蜞菊、鱧腸或旱蓮草之植物提取物及例如葉含蟛蜞菊內酯、葉黃酮、槲皮酮、洋元荽黃素、15-去氧-Δ12,14 -前列腺素J2 或前列腺素A1之純化合物的抑制劑組合物可併入醫藥組合物中以供預防或治療使用。舉例而言，醫藥組合物可包括有效劑量之葉含蟛蜞菊內酯及醫藥學上可接受之載劑。術語"有效劑量"係指對治療之受檢者施與預防或治療作用所需之活性組合物的量。如熟習此項技術者所認為，有效劑量可視所治療之疾病類型、疾病嚴重性、受檢者之整體健康狀況及/或年齡、先前治療、投藥途徑、賦形劑用法及與其他預防或治療處理共用之可能性而改變。
為實施本發明之方法，可非經腸、經口、經鼻、經直腸、局部或經面頰投與活性組合物。本文中所用之術語"非經腸"係指皮下、皮內、靜脈內、肌肉內、關節內、動脈內、滑膜內、胸骨內、鞘內或病灶內以及任何合適之注入技術。
無菌可注射組合物可為於無毒非經腸可接受之稀釋劑或溶劑中之溶液或懸浮液，諸如於1,3-丁二醇中之溶液。可使用之可接受之媒劑及溶劑為甘露醇、水、林格氏液(Ringer's solution)及等張氯化鈉溶液。另外，不揮發性油習知用作溶劑或懸浮介質(例如合成之單甘油酯或二甘油酯)。諸如油酸之脂肪酸及其甘油酯衍生物係適用於製備如天然醫藥學上可接受之油的可注射物，諸如橄欖油或蓖麻油，尤其其聚氧乙基化型式。該等油溶液或懸浮液亦可含有長鏈醇稀釋劑或分散劑、羧甲基纖維素或類似分散劑。出於調配之目的，亦可使用常用於製造醫藥學上可接受之固體、液體或其他劑型之其他常用界面活性劑(諸如土溫(Tween)或司盤(Span)或其他類似乳化劑)或生物可用性增強劑。
用於口服投藥之組合物可為任何經口可接受之劑型，包括膠囊、錠劑、乳液及水性懸浮液、分散液及溶液。在錠劑之情況下，常用載劑包括乳糖及玉米澱粉。亦通常添加諸如硬脂酸鎂之潤滑劑。對於膠囊形式之口服投藥，適用稀釋劑包括乳糖及乾玉米澱粉。當經口投與水性懸浮液或乳液時，可將活性成份懸浮或溶解於與乳化劑或懸浮劑組合之油相中。若需要，則添加某些甜味劑、調味劑或著色劑。
鼻用噴霧劑或吸入組合物可根據醫藥調配物之技術中熟知之技術製備。舉例而言，使用苄醇或其他合適之防腐劑、增強生物可用性之吸收啟動子、碳氟化合物及/或此項技術中已知之其他增溶劑或分散劑，可將該組合物製備成於生理食鹽水中之溶液。
亦可以用於直腸投藥之栓劑形式投與活性組合物。
醫藥組合物中之載劑就其與該組合物之活性成份相容(且較佳地，能夠使活性成份穩定)且對待治療之受檢者無害的方面而言必須為"可接受的"。一或多種增溶劑可用作用於傳遞活性化合物之醫藥賦形劑。其他載劑之實例包括膠狀氧化矽、硬脂酸鎂、纖維素、月桂基硫酸鈉及D&C Yellow # 10。
以下特定實例僅作為例示性解釋，且在任何情況下決不限制本揭示內容之其餘部分。在無進一步細述之情況下，咸信熟習此項技術者可基於本文中之說明最大程度地利用本發明。本文中所引用之所有公開案的全文以引用的方式併入本文中。
實例1 前列腺癌報導體細胞株之產生及特徵
22Rvl細胞株係購自ATCC。通報質體(p5.7kb-PSA-Luc)係藉由將5.7 kb PSA啟動子插入pGL3質體(Promega)中來建 構。22RvPSA36-103細胞株藉由使p5.7kb-PSA-Luc及pGK-puro穩定轉染至22Rvl細胞中而得到且對所描述之嘌微素進行選擇(Fryer及Archer,1998)。
對於螢光素酶活性檢定，8×104 個衍生自22Rvl之細胞在48孔多孔盤中生長。細胞培養基為含有5%炭披覆葡聚糖吸附胎牛血清(Hyclone)之RPMI。細胞在培養物中生長一天之後，更換其生長培養基以包括如下所述之實驗或對照組合物，且使細胞生長再繼續20小時。藉由添加被動溶解緩衝液(Promega)使細胞溶解，接著使用螢光素酶檢定系統(Promega)及VICTOR2 多標計數儀(PerkinElmer)進行螢光素酶檢定，且標準化至如由庫馬斯(Bradford)蛋白質檢定套組(Pierce)所量測之溶解蛋白質。
AR信號轉導路徑促進前列腺癌發展。因此，吾人建立一基於細胞之模型以觀測人類前列腺癌細胞中之雄激素回應啟動子活性。吾人將PSA-螢光素酶報導體穩定轉染至22Rvl細胞中以產生22RvPSA36-103雄激素回應報導體細胞株。將22RvPSA36-103細胞在雄激素存在下培養20小時。藉由超過基線高達約100倍之雄激素、睾固酮或5α-二氫睾固酮(10nM)以劑量依賴性方式刺激PSA-螢光素酶活性。由於類固醇激素17-β -雌二醇及孕酮未能誘導PSA-螢光素酶表現，因此誘導22RvPSA36-103細胞中之PSA-螢光素酶表現對雄激素為特異的，類似於如Shao等人，(2003),Prostate ,57：1-7中之活體內CWR22異種移植物的類固酮特異性。低基礎活性及由雄激素對PSA-螢光素酶表現之有效 誘導證明22RvPSA36-103細胞可用於識別雄激素回應啟動子活性之調控物。
實例2 雄激素誘導AR與IKKα相互作用
吾人研究IKKα或IKKβ在雄激素刺激後是否可與22Rv/PSA36-103細胞中經活化之AR相互作用。在將細胞曝露於10nM之5α二氫睾固酮歷時五分鐘之後，偵測與IKKα之錯合物中AR之共免疫沉澱反應。與AR相關之IKKα含量在10至15分鐘內積累且達到峰值，接著在30分鐘後下降，且在60分鐘後完全減少。相反，在所有時間點，偵測到IKKβ在AR錯合物中僅處於極低含量。如由使用AR及IKKα抗體之間接免疫螢光染色所測定，AR及IKKα共定位於核中。其共定位之後接著為一類似於由該等蛋白質之共免疫沉澱反應所測定之時程。
該等結果共同證明AR活化誘導細胞核中AR與IKKα之間錯合物的形成以活化雄激素回應靶基因轉錄。
實例3 IKKα 抑制降低雄激素回應啟動子活性
使用上述螢光素酶檢定測試IKK抑制劑15-去氧-△12,14 -前列腺素J2 、前列腺素A1及葉含蟛蜞菊內酯抑制雄激素回應啟動子活性之能力。該等化合物以劑量依賴性方式抑制5α-二氫睾固酮誘導之螢光素酶表現。相反，IKK-β-特異性抑制劑SC-514在所測試之任何濃度下對雄激素回應啟動子活性不發揮作用。此結果暗示AR信號轉導路徑經由IKKα特異性產生作用。
為證實此結論，吾人建構能夠誘導IKKα或IKKβ之RNAi- 敲除的22RvPSA36-103細胞株。
吾人所使用之小髮夾RNAi表現系統為別處(van de Wetering等人，2003)所報導之可誘導之表現系統的修改。使用以下髮夾敲除序列：IKKα(有義股5'-GCAGGCUCUUUCAGGGACA-3')
IKKβ(有義股5'-GGUGAAGAGGUGGUGGUGAGC-3')
兩個序列報導於Takaesu等人，2003中。建構tet操縱子調節之H1-小髮夾RNA表現卡匣且將其插入來自Invitrogen(Carlsbad,CA)之pcDNA6tTRTM 質體中。使每個經敲除之質體轉染至22RvPSA36-103細胞中以產生穩定轉染之細胞株。子細胞株中IKKα或IKKβ之敲除藉由免疫墨點法測定。顯示最顯著敲除之兩個細胞株用於進一步研究。為誘導RNAi調節之敲除，與媒劑對照組作比較，將細胞在含有1μg/ml強力黴素之培養基中生長3天。根據上述螢光素酶檢定程序進行隨後之處理及檢定。
與上述IKK抑制劑結果一致，IKKα之RNAi敲除使雄激素誘導之PSA-螢光素酶表現減少50%至60%。相反，IKKβ之敲除顯示對雄激素誘導之螢光素酶無作用，此暗示IKKα而非IKKβ對於雄激素回應啟動子活性為所需的。
實例4 IKKα 抑制劑對前列腺癌細胞生長之作用
假定AR信號轉導路徑之活化刺激前列腺細胞增殖且吾人發現此路徑中涉及IKKα，吾人設法確定IKKα抑制是否會減少前列腺癌細胞之增殖。為此目的，在有或無IKK抑制劑之雄激素存在下，22Rvl細胞及22RvPSA36-103細胞之 集落形成效率係藉由使2×104 個細胞在12孔多孔盤中生長6天來測定。每三天更換生長培養基。在生長週期結束時，用於磷酸鹽緩衝生理食鹽水中之0.1%結晶紫將細胞集落染色，乾燥且攝影。結晶紫之細胞保持性係用於水中之20%乙酸萃取且在OD595 下進行量測以作為集落形成效率之定量指示。
在相同濃度下用於上述實驗中以抑制雄激素回應啟動子活性之葉含蟛蜞菊內酯證明對以劑量依賴性方式抑制雄激素刺激之22Rvl與22RvPSA36-103細胞之集落生長高度有效。相反，IKKβ-特異性抑制劑SC-514未能抑制集落生長。IKKα之RNAi敲除對減少雄激素刺激之集落生長亦有效。另一方面，IKKβ之RNAi敲除未能減少集落生長。
該等結果確定，當IKKα出現於前列腺癌中時，其對雄激素刺激之細胞增殖很關鍵，且IKKα之抑制可有效治療此癌症。
其他實施例
本說明書中所揭示之所有特徵可與任何組合相組合。本說明書中所揭示之每個特徵可由用作相同、等效或類似用途之替代性特徵替代。舉例而言，候選IKKαRT調控物組合物抑制IKKα活性之能力可自除雄激素回應報導體細胞以外之IKKα-表現細胞中檢定。當然，該等檢定亦在本發明之範疇內。
自上文描述，熟習此項技術者可易於確定本發明之基本特徵，且在不脫離本發明之精神及範疇下可作出本發明之多種變化及修改以使其適應多種用法及條件。因此，本發明亦涵蓋其他實施例。

Claims (7)

  1. 一種用於識別由IκB激酶次單位α調節之轉錄活性之調控物的方法，其包含：提供一哺乳動物細胞，其表現IκB激酶次單位α及雄激素受體，且含有包括可操作性地連接至編碼報導體多肽之序列上的雄激素回應啟動子之序列的經分離核酸，以使得該細胞表現該報導體多肽；將該細胞與測試組合物接觸；及檢定表現量或所表現之報導體多肽的活性，其中與無該測試組合物相比，在該測試組合物存在下該表現量或該報導體多肽之活性的差異指示該測試組合物調控由IκB激酶次單位α調節之轉錄活性。
  2. 如請求項1之方法，其中該雄激素回應啟動子包括SEQ ID NOs：1、2或3中之至少一個複本。
  3. 如請求項2之方法，其中該雄激素回應啟動子包括SEQ ID NOs：1、2及3中之至少一個複本。
  4. 如請求項3之方法，其中該雄激素回應啟動子包括SEQ ID NO：4。
  5. 如請求項1之方法，其進一步包含將該細胞與該雄激素受體之促效劑接觸。
  6. 如請求項1之方法，其中該雄激素受體為該雄激素受體之組成性活性突變體。
  7. 如請求項1之方法，其進一步包含在該接觸步驟之後，測定該IκB激酶次單位α之活性程度。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9149458B1 (en) * 2015-02-03 2015-10-06 Wyntek Corporation Method for treating hypertriglyceridemia with a Wedelia chinensis extract
US10026052B2 (en) * 2016-10-03 2018-07-17 Metrics Medius, Inc. Electronic task assessment platform
CN106924240B (zh) * 2017-04-14 2019-11-19 印晓星 包含槲皮素的药物组合物及其用途
US11839639B2 (en) * 2017-10-19 2023-12-12 Yale University Inhibition of androgen receptor by extracts of medicinal herbs and compositions thereof
CN108178319B (zh) * 2018-01-08 2021-07-13 华南师范大学 杂交蟛蜞菊在治理镉污染水体中的应用及治理方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5130133A (en) * 1990-09-28 1992-07-14 The Procter & Gamble Company Plant extracts as mucosal-protective agents
FR2679134B1 (fr) * 1991-07-19 1993-10-22 Sablon Louis Compositions cosmetiques pour la regulation de la pigmentation cutanee comprenant un extrait d'eclipta alba.
JP3542700B2 (ja) * 1997-06-19 2004-07-14 株式会社資生堂 頭部用組成物
WO1999007381A1 (en) * 1997-08-11 1999-02-18 Weider Nutrition International, Inc. Compositions and treatments to reduce side effects of administration of androgenic testosterone precursors
JP4020285B2 (ja) * 1999-06-01 2007-12-12 株式会社マンダム 育毛剤原料及び育毛剤組成物
US20020192310A1 (en) * 2001-02-02 2002-12-19 Bland Jeffrey S. Medical composition for managing hormone balance
US20050032882A1 (en) * 2002-03-06 2005-02-10 Sophie Chen Botanical extract compositions and methods of use
CN1321639C (zh) * 2003-12-30 2007-06-20 上海安普生物科技有限公司 治疗关节炎的药物

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Kim HJ et al., Effects of 2,4-D and DCP on the DHT-Induced Androgenic Action in Human Prostate Cancer Cells. Toxicol. Sci. (November 2005) 88 (1): 52-59. First published online: August 17, 2005 *
Wilson VS et al., A Novel Cell Line, MDA-kb2, That Stably Expresses an Androgen- and Glucocorticoid-Responsive Reporter for the Detection of Hormone Receptor Agonists and Antagonists. Toxicol. Sci. (2002) 66 (1): 69-81 *
Wilson VS et al., Wilson VS et al., Development and characterization of a cell line that stably expresses an estrogen-responsive luciferase reporter for the detection of estrogen receptor agonist and antagonists. Toxicol Sci. (2004) 81(1):69-77. Epub 2004 May 27 *

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