JP2004523231A - 療法 - Google Patents
療法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004523231A JP2004523231A JP2002558870A JP2002558870A JP2004523231A JP 2004523231 A JP2004523231 A JP 2004523231A JP 2002558870 A JP2002558870 A JP 2002558870A JP 2002558870 A JP2002558870 A JP 2002558870A JP 2004523231 A JP2004523231 A JP 2004523231A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- lxrα
- modulator
- compound
- hydroxycholesterol
- lxra
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
- G01N33/5023—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on expression patterns
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
- A61K31/575—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of three or more carbon atoms, e.g. cholane, cholestane, ergosterol, sitosterol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/06—Antihyperlipidemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- G01N2333/70567—Nuclear receptors, e.g. retinoic acid receptor [RAR], RXR, nuclear orphan receptors
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Obesity (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
(発明の分野)
本発明は、LXRα活性もしくは発現のモジュレーターとしての試験化合物の活性を測定することによって、前脂肪細胞分化を刺激するその能力に関して、該化合物をスクリーニングする方法に関する。本発明はまた、前脂肪細胞分化の刺激における、そしてしたがってまた、インスリン抵抗性症候群、または異脂肪血症(dyslipidemia)、または2型糖尿病の治療における、LXRα活性もしくは発現の能動的モジュレーターの使用にも関する。
【0002】
(発明の背景)
PPARγは、脂肪細胞分化を駆動するための確立されたマスタースイッチである。非脂肪生成性である線維芽細胞株(NIH−3T3)におけるPPARγのレトロウイルス仲介発現は、この細胞に脂肪細胞表現型を与えた(Tontonozら、1994)。3T3−L1前脂肪細胞をピオグリタゾン(チアゾリジンジオンクラスのPPARγアゴニスト)で処理すると、インスリンもしくはインスリン様増殖因子−1(IGF−I)が調節する分化が増進されることが、脂質生成もしくはトリグリセリド集積速度によってモニターされた(Kletzienら、1992)。ピオグリタゾンは、IGF−Iに調節される細胞分化の左方移動および最大反応の増進の両方を引き起こしたが、これは、この薬剤がポリペプチドホルモンへの細胞の感度を増進するという考え方と一致する。したがって、PPARγアゴニストは、脂肪細胞分化促進因子およびインスリン増感因子であり、そして2型糖尿病を治療するのに臨床的に処方される。
【0003】
ここで、我々は、チアゾリジンジオンであるダーグリタゾン(darglitazone)が、3T3−L1脂肪細胞およびヒト初代脂肪細胞において、核受容体LXRαの発現増加を導くことを示す。さらに、我々は、LXRαの活性化が、前脂肪細胞の脂肪細胞への分化を導くことを示す。
【0004】
LXR類は、核受容体スーパーファミリーのオーファンメンバーとして最初に同定され(Willyら、1995)、そして22(R)−ヒドロキシコレステロール、24(S)−ヒドロキシコレステロール、および24,25(S)−エポキシコレステロールを含む、コレステロールの天然に存在する酸化誘導体の特定のクラスによって活性化されることが後に示された(Janowskiら、1996、Janowskiら、1999)。LXRファミリーの2つのメンバー:組織限定(主に肝臓、腸、腎臓および脂肪細胞)LXRαおよび遍在性LXRβが同定されている(Peetら、1998、Repa & Mangelsdorf、1999)。コレステロールが過剰であり、そしてその酸化代謝産物が存在する場合、LXRαが活性化され、そして古典的な胆汁酸合成経路の律速酵素であるコレステロール7α−水酸化酵素をコードするCyp7a1遺伝子の転写を誘導する。コレステロール7α−水酸化酵素の上方制御によって、コレステロールの胆汁酸への変換が増進し、それによって循環コレステロール量が減少する。コレステロール恒常性の重要な調節因子としてのLXRαの役割は、破壊されたLXRα遺伝子に関してホモ接合体であるマウスで研究されてきている。これらの遺伝子修飾されたマウスは、通常の食餌を与えた際は、見かけ上健康でそして繁殖性である。しかし、高コレステロール含量の食餌(0.2%または2%)を与えた場合、コレステロール集積を伴う肝腫大が生じて、肝不全を導き、そしてまたCyp7a1転写誘導の失敗も検出された。これらの結果は、マウスにおいて、Cyp7a1発現を調節するのにLXRαが必要であり、そしてこれがコレステロール恒常性の維持に非常に重要であるという証拠を提供する。これらの観察がきっかけとなって、血中コレステロールレベルを低下させる手段として、胆汁酸合成を増加させるためのLXRαアゴニストの使用が示唆された。
【0005】
最近、ATP結合カセット輸送体タンパク質1(ABC−1)をコードする遺伝子が、LXRαによって転写的に調節されると報告された(Costerら、2000、Repaら、2000)。ABC−1輸送体は、コレステロールから高密度リポタンパク質(HDL)への細胞性流出に関与する。興味深いことに、この輸送体のいくつかの遺伝子欠陥はまた、多様な組織におけるコレステロール集積およびタンジール病コホートに属する患者における冠状動脈疾患のリスク増加によっても特徴付けられる。これによって、LXRαが、Cyp7a1遺伝子を制御するのに加えて、コレステロールレベルを調節する際に、さらなる役割を有する可能性があることが示される。
【0006】
WO 93/06215(EP609240)、The Salk Institute。この出願は、受容体のステロイド/甲状腺スーパーファミリーに属する5つの新規オーファン受容体のクローニングを記載するが、1つ(XR2)は後に、ヒトLXRαであることが示された。
【0007】
WO 96/21726、The Salk Institute。この出願は、LXRαの性質決定を記載し、そして特定の反応要素、LXR/RXRヘテロ二量体、およびLXRに基づくアッセイを請求する。
【0008】
WO 99/18124(EP1021462)Merck & Co。この出願は、核受容体のアゴニストおよびアンタゴニストを同定する方法を含む。請求される方法は、第一の蛍光試薬で標識した、核受容体またはそのリガンド結合ドメイン;第二の蛍光試薬で標識した、核受容体活性化補助因子またはその結合部分の使用;並びに第一および第二の蛍光試薬間のFRET測定を含んでなる。LXRは、請求される方法の核受容体の1つとして例示され、そしてSRC−1が活性化補助因子として例示される。
【0009】
WO 00/34461 テキサス大学。この出願は、LXRαノックアウトマウスおよびスクリーニングにおけるその使用、胆汁酸合成を増加させる能力に関するLXRαアゴニストのスクリーニング、コレステロールレベルを減少させるか、または胆汁酸合成を増加させる物質に関する、LXRαノックアウトを用いたスクリーニング、ABC1発現のモジュレーターに関するスクリーニングなどの、コレステロール代謝をモジュレートする多様な側面を含む。
【0010】
(発明の概要)
本発明は、LXRα活性のアゴニストが、前脂肪細胞分化を刺激するという発見に基づく。さらに、前脂肪細胞の分化には、LXRαの発現増加が伴う。前脂肪細胞分化の刺激は、インスリン抵抗性症候群、または異脂肪血症、または2型糖尿病の治療にもまた有用である。
【0011】
1つの側面において、本発明は、細胞において、前脂肪細胞分化を刺激する方法であって、細胞にLXRαアゴニストを投与することを含んでなり、該アゴニストが前脂肪細胞分化を刺激する、前記方法を特徴とする。1つの態様において、細胞は、脂肪細胞、3T3−L1前脂肪細胞、または3T3−L1脂肪細胞などの哺乳動物細胞である。1つの態様において、LXRαアゴニストは、22(R)−ヒドロキシコレステロール、24(S)−ヒドロキシコレステロール、および24,25(S)−エポキシコレステロールなどのコレステロールの酸化誘導体である。別の態様において、LXRαアゴニストは、ダーグリタゾン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、またはトログリタゾン、およびその薬剤的に許容しうる塩などのチアゾリジンジオン化合物である。
【0012】
別の側面において、本発明は、異常な前脂肪細胞分化と関連する障害を治療する方法を特徴とする。該方法は、療法的有効量のLXRαモジュレーターを哺乳動物に投与することを含み、該LXRαモジュレーターが前脂肪細胞分化を刺激する。1つの態様において、LXRαモジュレーターは、22(R)−ヒドロキシコレステロール、24(S)−ヒドロキシコレステロール、および24,25(S)−エポキシコレステロールなどのコレステロールの酸化誘導体である。別の態様において、LXRαモジュレーターは、ダーグリタゾン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、またはトログリタゾン、およびその薬剤的に許容しうる塩などのチアゾリジンジオン化合物である。障害は、異常な脂肪細胞分化を有するいかなる障害であることも可能であり、例えば、障害は、インスリン抵抗性症候群、異脂肪血症または2型糖尿病であることも可能である。LXRαモジュレーターは、経口、局所、静脈内、経皮、直腸、または非経口投与を含む、当該技術分野に知られるいかなる方式で投与することも可能である。1つの態様において、薬剤的に許容しうるキャリアーまたは賦形剤を含んでなる薬剤組成物中で、モジュレーターを哺乳動物に投与する。
【0013】
別の側面において、本発明は、LXRα発現または活性レベルを増加させる方法であって、薬剤的有効量のLXRαモジュレーターを投与することを含んでなる、前記方法を特徴とする。1つの態様において、LXRαモジュレーターは、22(R)−ヒドロキシコレステロール、24(S)−ヒドロキシコレステロール、および24,25(S)−エポキシコレステロールなどのコレステロールの酸化誘導体である。別の態様において、LXRαモジュレーターは、ダーグリタゾン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、またはトログリタゾン、およびその薬剤的に許容しうる塩などのチアゾリジンジオン化合物である。1つの態様において、モジュレーターを哺乳動物の前脂肪細胞に投与する。別の態様において、哺乳動物は、インスリン抵抗性症候群、異脂肪血症または2型糖尿病を有する。
【0014】
本発明はさらに、受容体機能または発現モジュレーターを発見する際にLXRα受容体を使用する多様な方法の使用に関連し、こうしたモジュレーターは、前脂肪細胞分化を刺激する際に使用可能であり、そしてしたがって、インスリン抵抗性症候群または異脂肪血症または2型糖尿病を変更するかまたは改善するのに使用可能である。
【0015】
1つの側面において、本発明は、前脂肪細胞分化を刺激する化合物を同定する方法を特徴とする。該方法は次を含む:レポーター遺伝子に機能可能であるように連結したLXRα調節配列を含んでなる細胞を提供し;試験化合物を該細胞に導入し;細胞におけるレポーター遺伝子の転写をアッセイする、ここで、化合物の非存在下での転写に比較した、化合物の存在下での転写の増加が、該化合物が前脂肪細胞分化を刺激することの示標となる。該細胞は、哺乳動物細胞などのいかなる細胞であることも可能である。1つの態様において、細胞は、脂肪細胞、3T3−L1前脂肪細胞、または3T3−L1脂肪細胞である。レポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスフェート、または蛍光タンパク質をコードすることが可能である。
【0016】
別の側面において、本発明は、LXRαポリペプチドに結合する化合物を同定する方法であって、LXRαポリペプチド、またはLXRαポリペプチドを発現している細胞を、試験化合物と接触させ;そしてポリペプチドが試験化合物に結合するかどうかを決定することを含んでなる、前記方法を特徴とする。ポリペプチドへの試験化合物の結合は、ポリペプチドに結合した化合物の直接検出によって、または競合結合アッセイによって、検出可能である。
【0017】
本発明はさらに、LXRαポリペプチド活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、LXRαポリペプチドと試験化合物を接触させ、そして試験化合物が前脂肪細胞分化を刺激する能力に関してアッセイする、ここで、ポリペプチドが前脂肪細胞分化を刺激する能力の増加が、該化合物がLXRαポリペプチド活性をモジュレートすることの示標となることを含んでなる、前記方法を特徴とする。
【0018】
別の側面において、本発明は、LXRαのアゴニストを同定する方法であって、LXRαタンパク質もしくはその断片、LXRα活性化補助因子および化合物を接触させ;そしてLXRαタンパク質もしくはその断片、およびLXRα活性化補助因子が相互作用するかどうかを決定する、ここで、LXRαタンパク質もしくはその断片、およびLXRα活性化補助因子の間の相互作用が、該化合物がLXRαアゴニストであることの示標となることを含む、前記方法を特徴とする。1つの態様において、LXRα活性化補助因子はステロイド受容体活性化補助因子である。
【0019】
さらに別の側面において、本発明は、LXRαのアゴニストを同定する方法であって、LXRαタンパク質もしくはその断片、LXRαヘテロ二量体化パートナーもしくはその断片、および化合物を接触させ;そしてLXRαタンパク質もしくはその断片、およびLXRαヘテロ二量体化パートナーもしくはその断片が相互作用するかどうかを決定する、ここで、LXRαタンパク質もしくはその断片、およびLXRαヘテロ二量体化パートナーもしくはその断片の間の相互作用が、該化合物がLXRαアゴニストであることの示標となることを含む、前記方法を特徴とする。1つの態様において、LXRαへテロ二量体化パートナーはレチノイドX受容体である。
【0020】
本発明は、本出願に記載する方法によって発見したモジュレーターを含有する薬剤組成物、ならびに前脂肪細胞分化を刺激する際の、そしてしたがって、インスリン抵抗性症候群または異脂肪血症または2型糖尿病を変更するかまたは改善するのに用いる、該モジュレーターまたはこうしたモジュレーターを含んでなる薬剤組成物の使用に関連する。
【0021】
1つの側面において、本発明は、異常な前脂肪細胞分化と関連する障害の治療用の医薬品製造におけるLXRαモジュレーターの使用であって、LXRαモジュレーターが前脂肪細胞分化を刺激する、前記使用を特徴とする。1つの態様において、LXRαモジュレーターは、22(R)−ヒドロキシコレステロール、24(S)−ヒドロキシコレステロール、および24,25(S)−エポキシコレステロールなどのコレステロールの酸化誘導体である。別の態様において、LXRαモジュレーターは、ダーグリタゾン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、またはトログリタゾン、およびその薬剤的に許容しうる塩などのチアゾリジンジオン化合物である。障害は、インスリン抵抗性症候群、異脂肪血症または2型糖尿病などの、異常な前脂肪細胞分化に関連するいかなる障害であることも可能である。LXRαモジュレーターを、経口、局所、静脈内、経皮、直腸、または非経口投与することが可能である。
【0022】
さらに別の側面において、本発明は、異常な前脂肪細胞分化と関連する障害の治療における使用のための薬剤配合物を特徴とする。1つの態様において、LXRαモジュレーターは、22(R)−ヒドロキシコレステロール、24(S)−ヒドロキシコレステロール、および24,25(S)−エポキシコレステロールなどのコレステロールの酸化誘導体である。別の態様において、LXRαモジュレーターは、ダーグリタゾン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、またはトログリタゾン、およびその薬剤的に許容しうる塩などのチアゾリジンジオン化合物である。障害は、インスリン抵抗性症候群、異脂肪血症または2型糖尿病などの、異常な前脂肪細胞分化に関連するいかなる障害であることも可能である。LXRαモジュレーターを、経口、局所、静脈内、経皮、直腸、または非経口投与することが可能である。
【0023】
(発明の詳細な説明)
3T3−L1前脂肪細胞を、LXRαアゴニスト、22−R−ヒドロキシコレステロールで処理すると、3T3−L1前脂肪細胞の脂肪細胞分化が増進する。これは、LXRαがコレステロール恒常性の維持に非常に重要であるだけでなく、脂肪細胞分化の重要な調節因子に相当することを示す。LXRα活性モジュレーターまたはLXRα発現モジュレーターで処理すると、前脂肪細胞分化の刺激につながる可能性があり、そしてインスリン感作を改善する際に有用性を有する可能性があり、そしてしたがって異脂肪血症およびインスリン抵抗性および2型糖尿病の新規治療を構成する。
【0024】
本発明は、前脂肪細胞分化の刺激法であって、こうした治療が必要な患者に、LXRα活性モジュレーターまたはLXRα発現モジュレーターの有効量を投与することを含んでなる、前記方法を提供する。
【0025】
化合物によるLXRα発現のモジュレーション(好ましくは「上方制御因子」によるモジュレーション)は、例えば、改変された遺伝子発現レベルまたはメッセージ安定性を通じて引き起こすことが可能である。化合物によるLXRα活性のモジュレーション(好ましくは「アゴニスト」によるモジュレーション)は、LXRα、LXRα/RXRαヘテロ二量体、LXRα/活性化補助因子またはLXRα/RXRα/活性化補助因子複合体への化合物の結合を通じて、引き起こすことが可能である。
【0026】
本発明のさらなる側面において、脂肪細胞分化剤の提供法であって、試験化合物がLXRαをモジュレートする能力を測定する1以上の方法において、試験化合物としてLXRα発現もしくは活性の推定上のモジュレーターを1以上用いて、そして前脂肪細胞分化を刺激可能な薬剤として使用する活性化合物を選択することを含んでなる、前記方法を提供する。
【0027】
好適な試験法は、試験化合物の役割を試験するための動物モデルの使用を含む。これらは、典型的には、腹腔内注射、皮下注射、静脈内注射、経口胃管栄養法、またはカニューレを介した実験動物の血流への直接注入による、化合物の投与を伴うであろう。インスリン感受性、脂質プロフィール、食物摂取、体温、代謝速度、行動上の活動(behavioural activity)および体重変化に対する影響は、すべて、標準法を用いて測定可能である。
【0028】
適切なモジュレーターは、まず、単離LXRα受容体またはその断片もしくはキメラ型に対してスクリーニングすることによって、同定可能である。
好ましくは、以下からスクリーニングを選択する:
i)LXRα、およびLXRα反応要素にカップリングしたレポーター遺伝子を発現する細胞株を含んでなり、そしてレポーター遺伝子の発現に関してアッセイする、レポーター遺伝子アッセイを用いる、LXRα活性の測定。
【0029】
ii)精製LXRαタンパク質もしくはその断片と活性化補助因子もしくはその断片とを用いて、そして好ましくは時間分解蛍光共鳴エネルギー転移によるかまたはシンチレーション近接アッセイによって、LXRαと活性化補助因子との間の相互作用をアッセイする、LXRα活性の測定。
【0030】
iii)精製LXRαタンパク質もしくはその断片およびヘテロ二量体化パートナーもしくはその断片を用いて、そして好ましくは時間分解蛍光共鳴エネルギー転移によるかまたはシンチレーション近接アッセイによって、LXRαおよびヘテロ二量体化パートナー間の相互作用をアッセイする、LXRα活性の測定。
【0031】
iv)LXRαを発現している細胞株における、LXRα転写もしくは翻訳の測定。
v)好ましくは時間分解蛍光共鳴エネルギー転移またはシンチレーション近接アッセイによる、LXRαへの直接化合物結合または競合的結合の測定。
【0032】
適切なアッセイの例は、WO 99/18124(EP1021462)Merck & Co.に見出すことが可能である。
適切な活性化補助因子の例は、限定されるわけではないが、SRC−1、SRC−2、およびSRC−3などのステロイド受容体活性化補助因子、NcoA−1、NcoA−2、CREB結合タンパク質(CBP)、p300、p/CIP、TIF−1、TIF−2、TRIP−1、およびGRIP−1などの核受容体活性化補助因子である。
【0033】
適切なヘテロ二量体化パートナーは、RXRα、RXRβおよびRXRγなどのレチノイドX受容体(RXR)であり、好ましくはRXRαである。
好ましくは、細胞株は、3T3−L1前脂肪細胞または3T3−L1脂肪細胞または一般的に用いる他の哺乳動物細胞株いずれかである。
【0034】
哺乳動物LXRα受容体は、商業的に入手可能なRNA、脳cDNAライブラリー、ゲノムDNA、またはゲノムDNAライブラリーから、ライブラリースクリーニングおよび/またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などの好適な分子生物学技術を用いて、好適に単離可能である。これらの技術は、Molecular Cloning−A Laboratory Manual, 第2版, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Cold Spring Harbor Pressに広範囲にわたって詳述される。
【0035】
こうして得られた哺乳動物LXRα受容体をコードするcDNA類は、その後、pcDNA3シリーズ(InVitrogen Ltdなど。以下を参照されたい)などの商業的に入手可能な哺乳動物発現ベクターにクローニングする。別の哺乳動物発現ベクターが、Daviesら, J of Pharmacol & Toxicol. Methods, 33, 153−158に開示されている。標準的トランスフェクション技術を用いて、CHO、HEK293、HeLaなどの一般的に入手可能な培養哺乳動物細胞株に、これらのDNA類を導入して、そして受容体を発現しているクローン性派生物を単離する。別の発現系は、我々の英国特許第2251622号に請求するMEL細胞発現系である。
【0036】
これらの細胞への天然リガンドの適用は、トランスフェクションした受容体の活性化を引き起こし、この受容体の活性化は、ABC−1またはaFABPなどの内因性分子レベルに変化を引き起こす可能性がある。これらはすべて、標準的な公表された方法および商業的に入手可能な試薬を用いて測定可能である。さらに、これらのcDNA類は、あらかじめ「レポーター」遺伝子でトランスフェクションしておいた、これらの細胞株の派生物にトランスフェクションすることが可能である。適切なレポーター遺伝子の例は、これらの細胞内変化を「レポート」するであろうエステラーゼ、ホスファターゼ、プロテアーゼ、GFP、YFP、BFP、およびCFPなどの蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼである。
【0037】
これらのトランスフェクション細胞株を用いて、これらの受容体を活性化する低分子化合物を同定することが可能であり、これらを「アゴニスト」と定義する。
さらに、またはあるいは、同じアッセイを用いて、LXRαリガンドの活性化効果をアンタゴナイズする低分子化合物を同定することが可能であり、これらを「アンタゴニスト」と定義する。アンタゴニストは、肥満症、異脂肪血症、インスリン抵抗性症候群および2型糖尿病を治療する際に有用性を有する可能性がある。
【0038】
試験化合物は、2アミノ酸以上、例えば最大6アミノ酸、最大10または12アミノ酸、最大20アミノ酸、あるいは20アミノ酸より大きい、例えば最大50アミノ酸のポリペプチドでもよい。薬剤をスクリーニングする目的のために好ましい化合物は、低分子量でそして潜在的な療法剤である化学化合物である。これらは例えば、重量800、600または400ダルトン未満などの、約1000ダルトン未満のものである。所望により、試験化合物は化学物質ライブラリーのメンバーであってもよい。これは、適切な化合物、例えばペプチド、ペプトイドおよび他のオリゴマー化合物(環状または直鎖)、およびテンプレートに基づく、より小さい分子、例えばベンゾジアゼピン、ヒダントイン、ビアリール、炭素環および多環化合物(例えばナフタレン、フェノチアジン、アクリジン、ステロイドなど)、炭水化物およびアミノ酸誘導体、ジヒドロピリジン、ベンズヒドリルおよび複素環化合物(例えばトリアジン、インドール、チアゾリジンなど)の、いかなる好適な数の、例えば数十から数百から数千から数百万などの、個々のメンバーを含んでなることも可能である。引用した数および列挙した化合物の種類は例であるが、限定的でない。好ましい化学物質ライブラリーは、低分子量でそして潜在的な療法剤である化学化合物を含んでなる。
【0039】
本発明のさらなる側面において、前脂肪細胞分化を刺激し、そしてそれによってインスリン抵抗性症候群または異脂肪血症または2型糖尿病を変更するかまたは改善することが可能な薬剤としての、LXRα受容体の活性もしくは発現モジュレーターの使用を提供する。
【0040】
本発明のさらなる側面において、インスリン抵抗性症候群、異脂肪血症または2型糖尿病を治療する方法であって、こうした疾患を患う患者に、LXRαの活性もしくは発現をモジュレートすることによって前脂肪細胞分化を刺激して、そしてそれによってインスリン抵抗性症候群、異脂肪血症または2型糖尿病疾患を変更するかまたは改善することが可能な薬剤であって、好ましくは本発明の1以上の方法を用いて同定した、前記剤の薬剤的有効量を投与することを含んでなる、前記方法を提供する。
【0041】
本発明はさらに、異脂肪血症またはIRSまたは2型糖尿病の治療用の医薬品調製における、LXRα活性をモジュレートすることによって前脂肪細胞分化を刺激可能な薬剤の使用を提供する。好ましくは、化合物はLXRαアゴニストである。
【0042】
本発明の別の側面にしたがって、薬剤組成物を調製する方法であって:
i)本明細書記載の方法にしたがって、ある薬剤を前脂肪細胞分化の刺激に有用と同定し;および
ii)その薬剤またはその薬剤的に許容しうる塩を、薬剤的に許容しうる賦形剤または希釈剤と混合する
ことを含んでなる、前記方法を提供する。
【0043】
本発明がヒトLXRα受容体の相同分子種および相同体の使用を含むことが認識されるであろう。
2型糖尿病、IRSまたは異脂肪血症の治療に必要な前脂肪細胞分化の度合いは、特定の疾患を患う患者で測定した際、既定レベルを超える刺激のほぼいかなるレベルであってもよく、好ましくは既定レベルを率にして少なくとも10%超える増加である。好ましくは、単離受容体に対して測定した際、100μM未満の、好ましくは1μM未満の、LXRαに対する親和性(Km)を有する化合物を投与すべきである。
【0044】
薬剤組成物はさらに、PPARγアゴニスト、好ましくはダーグリタゾン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、またはトログリタゾンなどのチアゾリジンジオンを含んでなることが可能である。
【0045】
用語「相同分子種」により、他の種における機能的に同等の受容体を意味する。
用語「相同体」により、同一または異なる種における、実質的に類似のおよび/または関連する受容体を意味する。
【0046】
上記定義のいずれに関しても、受容体は例えば、少なくとも30%、例えば少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、そして特に少なくとも70%、例えば少なくとも80%、例えば85%、または90%または95%のペプチド配列同一性を有する可能性があると考えられる。相同受容体は、機能ドメインに相当する小領域に渡って、実質的により高いペプチド配列同一性を有する可能性があると認識される。DNAコード配列において、上記アミノ酸配列に関して概略したよりもより広い多様性を有するが、上記配列範囲内に属するペプチド配列同一性を有する受容体を生じるDNAコード配列である、受容体を含む。LXRα受容体の好適な型には、公表された配列が含まれる。ヒトLXRαのアミノ酸配列は、SwissProtデータベース、寄託番号Q13133(NRH3_HUMAN)から得ることが可能であり、そしてcDNA配列は、例えばEMBLデータベース寄託番号U22662から得ることが可能である。LXRα受容体は、ヒト、サル、ラット、マウスおよびイヌを含む、哺乳動物種いずれか由来である。好ましくはヒトLXRα受容体を用いる。
【0047】
LXRα受容体の断片および部分的配列は、本発明のアッセイおよび解析法の有用な基質である可能性がある。これらに対する限定は実際的なもののみであって、これらは適切なアッセイおよび/または解析法で使用するのに必要な機能要素を含んでならなければならないと認識されるであろう。
【0048】
本発明の薬剤は、治療が所望される状態のための標準的方式で投与可能であり、例えば経口、局所、非経口、頬側、鼻、または直腸投与によるか、あるいは吸入によって投与可能である。これらの目的のため、本発明の化合物は、当該技術分野に知られる手段によって、例えば錠剤、カプセル、水性もしくは油性溶液、懸濁物、エマルジョン、クリーム、軟膏、ゲル、鼻スプレー、座薬、細分粉末または吸入用エアロゾルの形に、そして非経口使用(静脈内、筋内もしくは注入を含む)のため、無菌水性もしくは油性溶液または懸濁物または無菌エマルジョンに製剤可能である。
【0049】
LXRα受容体の知識はまた、例えばアンチセンスDNAまたはRNAの使用によって、in vivoでのLXRα受容体の発現を調節する能力も提供する。したがって、本発明のさらなる側面にしたがって、配列番号1、3および5に示すポリヌクレオチド配列のすべてもしくは一部に相補的なアンチセンスDNAまたはアンチセンスRNAを含んでなる食欲制御剤を提供する。「相補的」によって、2つの分子が、ヌクレオチド塩基対相互作用による二本鎖分子を形成し他の分子相互作用を排除するように、ハイブリダイズ可能であることを意味する。
【0050】
LXRα遺伝子のすべてもしくは一部に対応するポリヌクレオチド配列と協調するアンチセンスDNAもしくはRNAは、標準的分子生物学によって、そして/または化学合成によって、慣用的手段を用いて産生可能である。アンチセンスDNAもしくはRNAは、本発明の全長LXRα受容体遺伝子に相補的であるか、またはその断片に相補的であることが可能である。タンパク質コード領域に近接するかまたは該領域を含む遺伝子領域、あるいはその一部に相補的な、約12〜約30ヌクレオチドの範囲にあるオリゴマーを含んでなるアンチセンス分子は、本発明の好ましい態様である。所望により、アンチセンスDNAまたはアンチセンスRNAは、in vivoの分解を予防するように、または細胞膜通過を促進するように、化学的に修飾可能であるし、そして/またはmRNAを不活性化することが可能な物質、例えばリボザイムをそこに連結することが可能であり、そして本発明はこうした構築物にも及ぶ。
【0051】
LXRα受容体に相補的であり、そしてハイブリダイズ可能な配列を含んでなるオリゴヌクレオチドが、療法使用に意図される。in vivo活性を示すオリゴヌクレオチド配列を同定する方法を完全に記載する、米国特許第5,639,595号、Identification of Novel Drugs and Reagents、1997年6月17日発行が、本明細書に援用される。
【0052】
LXRα受容体をコードする核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を、アンチセンス療法のため合成することが可能である。これらのアンチセンス分子は、DNA、DNAの安定な誘導体(ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートなど)、RNA、RNAの安定な誘導体(2’−O−アルキルRNAなど)、あるいは他のオリゴヌクレオチド擬似体(mimetics)であることが可能である。生理学的に安定なアンチセンス分子の合成および効果を記載する、米国特許第5,652,355号、Hybrid Oligonucleotide Phosphorothioates、1997年7月29日発行および米国特許第5,652,356号、Inverted Chimeric and Hybrid Oligonucleotides、1997年7月29日発行が、本明細書に援用される。LXRα遺伝子アンチセンス分子は、マイクロインジェクション、リポソーム被包によって、またはアンチセンス配列を宿するベクターからの発現によって、細胞に導入することが可能である。
【0053】
新規実験モデルを提供し、異脂肪血症、インスリン抵抗性症候群、2型糖尿病、肥満症および摂食障害の制御に対する試験化合物の効果を評価するのに有用な、トランスジェニック動物技術もまた、意図する。LXRαは、以下に簡略に概略するような、そして例えば“Gene Targeting;A Practical Approach”, IRL Press, 1993に記載されるような、標準法を用いて、欠失させるか、不活性化するか、または修飾することが可能である。好ましくは、標的遺伝子またはその一部(例えばコード領域に隣接する相同配列)を、遺伝子機能を破壊するために遺伝子に挿入した選択マーカー(Neoなど)と共にベクターへクローニングする。ベクターを直線化し、その後、胚性幹細胞(ES)(例えばマウスの129/Ola株由来)に形質転換し(通常、エレクトロポレーションによる)、そしてその後、ある割合の幹細胞で、相同組換え事象が起こる。遺伝子破壊を含有する幹細胞を増殖させ、そして胚盤胞(例えばC57BL/6Jマウス由来のもの)に注入し、そして発生のため、養母に移植する。キメラ子孫は、外皮の色マーカーによって同定可能である。キメラを、ES由来配偶子および宿主胚盤胞由来配偶子間の区別を可能にする遺伝子マーカーを持つマウスと交尾させることによって、交配して、生殖系列へのES細胞の寄与を確かめる。ES細胞由来配偶子の半数は遺伝子修飾を所持するであろう。子孫をスクリーニングして(例えばサザンブロッティングによって)、遺伝子破壊を持つもの(子孫の約50%)を同定する。これらの選択された子孫は、ヘテロ接合体であろうし、そしてしたがって、別のヘテロ接合体と交配して、ホモ接合体子孫を生じることが可能である(子孫の約25%)。
【0054】
前核へのDNAのマイクロインジェクション、スフェロプラスト融合またはES細胞の脂質仲介トランスフェクションなどの既知の技術によって産生したトランスジェニック動物と、標的遺伝子欠失(「ノックアウト」)を持つトランスジェニック動物を交配して、内因性遺伝子ノックアウトおよび外来(foreign)遺伝子置換を持つトランスジェニック動物を得ることが可能である。標的遺伝子破壊を含有するES細胞は、特定の改変を含有する標的遺伝子配列で形質転換することによって、さらに修飾することが可能である。相同組換え後、改変した遺伝子をゲノムに導入する。これらの胚性幹細胞を引き続き用いて、上述のようなトランスジェニック動物を生成可能である。適切な方法は、WO 00/34461 テキサス大学に記載される。
【0055】
トランスジェニック動物は、食欲および肥満症を制御する際のLXRαの役割を反映した表現型を示すであろうし、そしてしたがって試験化合物の効果を評価する、有用な実験モデルを提供するであろう。したがって、本発明のさらなる側面において、LXRαを欠失させるか、不活性化するか、または修飾して、そして異脂肪血症、インスリン抵抗性症候群、2型糖尿病、食欲制御および肥満症における試験化合物の効果を評価するのに用いる、トランスジェニック動物を提供する。LXRα受容体はまた、例えば直接DNA配列比較またはDNA/RNAハイブリダイゼーションアッセイによって、例えばヒト被験者における発現レベルを決定する、診断の基礎としても使用可能である。診断アッセイは、PCRおよび特に我々の欧州特許第0 332 435号に請求するような増幅不応突然変異系(Amplification Refractory Mutation System)(ARMS)などの核酸増幅技術の使用を伴うことが可能である。こうしたアッセイを用いて、遺伝子の対立遺伝子変異体、例えば挿入、欠失および/または1以上の点突然変異などの突然変異を決定することが可能である。こうした変異体は、ヘテロ接合体であることもまたはホモ接合体であることも可能である。肥満症患者において、類似の分子をコードする遺伝子の突然変異を同定するのに、他のアプローチが用いられてきている(Yeoら, 1998, Nature Genetics, 20, 111−112)。
【0056】
本発明のさらなる側面において、LXRα受容体は、他の細胞内および膜関連タンパク質との相互作用が維持されるが、そのエフェクター機能および生物学的活性が除去されるような方式で遺伝子操作することが可能である。この遺伝子修飾タンパク質は、優性ネガティブ突然変異体として知られる。適切な細胞種における優性ネガティブ突然変異体の過剰発現は、内因性タンパク質の影響を下方制御し、したがって、異脂肪血症、インスリン抵抗性症候群、2型糖尿病における該遺伝子の生物学的役割を明らかにする。
【0057】
同様に、LXRα受容体はまた、そのエフェクター機能および生物学的活性が増進されるように、遺伝子操作することも可能である。生じた過活性(overactive)タンパク質は、優性ポジティブ突然変異体として知られる。適切な細胞種における優性ポジティブ突然変異体の過剰発現は、内因性天然タンパク質の生物学的反応を増幅し、異脂肪血症、インスリン抵抗性症候群、2型糖尿病におけるその役割にスポットライトを当てる。これはまた、リガンドの非存在下で、恒常的に活性である受容体のアンタゴニストを検出するためのスクリーニングにおいても、有用性を有する。
【0058】
したがって、本発明のさらなる側面において、LXRα受容体の優性ネガティブ突然変異体および優性ポジティブ突然変異体、並びにインスリン抵抗性症候群、異脂肪血症または2型糖尿病の制御におけるLXRα受容体の生物学的役割を評価する際のそれらの使用を提供する。
【0059】
本発明は、ここで、以下の特定の説明および配列表に言及することによって例示されるが、限定されないであろう[用いる多くの特定の技術は、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 第2版, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Pressなどの標準的な分子生物学の教科書に詳述される。その結果、本文中の適切な箇所で、この文献への言及がなされるであろう]。
【0060】
(実施例)
3T3−L1脂肪細胞におけるLXRα発現に対するPPARγ活性化因子の影響
増加する用量のPPARγアゴニストで処理した3T3−L1脂肪細胞からの総RNAに対して、ノーザンブロット解析を行った。24時間の期間に渡って、0.01、0.1、および1mMのダーグリタゾンで脂肪細胞を処理した。20μgの総RNAをノーザンブロッティングに供して、そして32P標識したLXRα cDNAプローブで探査した(probed)。オートラジオグラムをスキャンすることによってシグナルを得て、そして18S RNA発現に関して規準化した。結果は、LXRα mRNAのおよそ5倍の誘導を示した(図1)。これらの濃度は、レポーターアッセイにおいて、PPARγの活性化に必要な濃度と一致する(Lehmannら、1995)。したがって、選択的PPARγアゴニストで脂肪細胞を処理すると、LXRα mRNAレベルが増加する。
【0061】
22−R−ヒドロキシコレステロールおよびダーグリタゾンでの3T3−L1脂肪細胞の処理
脂肪細胞分化に拘束された(committed)3T3−L1細胞を、ダーグリタゾン、LXRαアゴニスト22−R−ヒドロキシコレステロールいずれか、または両方で処理した。22−R−ヒドロキシコレステロール(22−R)は、LXRαの天然存在アゴニストである(Janowskiら、1996)。22−R、ダーグリタゾンまたは両方で刺激した細胞は、細胞のオイルレッド−O染色によって示されるように、次第により大きい脂質小滴を形成していた。これらの結果は、PPARγのダーグリタゾン刺激と共に、LXRαの22−R刺激が、脂肪細胞におけるトリグリセリド貯蔵の増加を導くことを示す。平行して、総RNAのノーザンブロット解析は、ダーグリタゾンまたは22−Rで処理した分化しつつある3T3−L1細胞における、LXRα mRNAの増加、並びにダーグリタゾンおよび22−R両方での刺激による相加効果を示す(図2)。したがって、PPARγアゴニストまたはLXRαアゴニストいずれかでの3T3−L1前脂肪細胞の処理は、脂肪集積およびLXRα発現増加を導く。
【0062】
22−R−ヒドロキシコレステロールでのヒト脂肪細胞の処理
ヒト脂肪細胞は、乳房縮小術から得た。無菌条件下で、脂肪組織片(5〜600mg)を調製し、そしてOttossonら(1994)に本質的に記載されるようにして、プラスチック試験管中でのインキュベーションに用いた。1μMダーグリタゾン、5μM 22−(R)−ヒドロキシコレステロール、またはこれらの両方を、図の説明に示すように、48時間添加した。ポリA+ RNAを単離し、そしてノーザンブロット解析に供した(図3)。ダーグリタゾンおよび22−(R)−ヒドロキシコレステロールの両方での処理は、相加効果で、LXRα mRNA発現レベル増加を導いた。したがって、選択的PPARγアゴニストまたはLXRαアゴニストでの刺激は、ヒト脂肪細胞において、LXRα mRNAの上方制御を導く。
【0063】
細胞および試薬
10%ウシ胎児血清、2mM L−グルタミンおよびペニシリン/ストレプトマイシンを補ったDMEM中、37℃で、3T3−L1細胞株(ATCC)を維持した。LinおよびLane(1992)に記載されるようにして、細胞を集密まで増殖させて脂肪生成試薬に3日間曝露した後、インスリンのみを含有する培地中でさらに3日間培養した。インスリンは1μg/mlの濃度で用い、デキサメタゾンは1μMの濃度で用い、そしてイソブチルメチルキサンチンは0.5mMの濃度で用いた。
【0064】
RNAの調製および解析
分化した3T3−L1脂肪細胞または脂肪組織からの総RNAは、製造者に推奨されるように、Trizol(Life Technologies, Inc.)法によって抽出した。RNAのノーザンブロット解析は、Sorensenら(1994)に先に記載されるように行った。LXRαおよびリボソームタンパク質18S mRNAに関して、20μgの総RNAを解析した。
【0065】
オイルレッドO染色
光学顕微鏡法およびオイルレッドO染色を用いて、分化中、これらの細胞における特徴的な細胞球状化および脂質小滴集積をモニターした。顕微鏡(Leica DMIL)および二色電荷結合素子カメラ(Leica MPS 60)を用いて撮影した。
【図面の簡単な説明】
【0066】
【図1】図1は、分化3T3−L1細胞から単離した総RNAの、LXRαプローブで探査したノーザンブロット解析を示す、棒グラフを表す。
【図2】図2は、22−R(5μM)単独、ダーグリタゾン(1μM)単独、または併用で24時間刺激した、完全に分化した3T3−L1細胞から得た総RNA 20μgの、LXRαプローブで探査したノーザンブロット解析を示す、棒グラフを表す。
【図3】図3は、1μM ダーグリタゾン(Dar)、5μM 22−R−ヒドロキシコレステロール(22−R−OH)または両方(Dar+22−R−OH)の存在下で増殖させたヒト脂肪細胞から単離したポリA+ RNAの、LXRαプローブで探査したノーザンブロット解析を示す、棒グラフを表す。
Claims (43)
- 細胞において前脂肪細胞分化を刺激する方法であって、細胞にLXRαアゴニストを投与することを含んでなり、該アゴニストが前脂肪細胞分化を刺激する、前記方法。
- 細胞が哺乳動物細胞である、請求項1の方法。
- 細胞が脂肪細胞、3T3−L1前脂肪細胞、または3T3−L1脂肪細胞である、請求項1の方法。
- LXRαアゴニストがコレステロールの酸化誘導体である、請求項1の方法。
- 誘導体が、22(R)−ヒドロキシコレステロール、24(S)−ヒドロキシコレステロール、および24,25(S)−エポキシコレステロールからなる群より選択される、請求項4の方法。
- LXRαアゴニストがチアゾリジンジオン化合物である、請求項1の方法。
- チアゾリジンジオン化合物が、ダーグリタゾン(darglitazone)、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、またはトログリタゾン、およびその薬剤的に許容しうる塩からなる群より選択される、請求項6の方法。
- 異常な前脂肪細胞分化と関連する障害を治療する方法であって、療法的有効量のLXRαモジュレーターを哺乳動物に投与することを含んでなり、該LXRαモジュレーターが前脂肪細胞分化を刺激する、前記方法。
- LXRαモジュレーターがコレステロールの酸化誘導体である、請求項8の方法。
- 誘導体が、22(R)−ヒドロキシコレステロール、24(S)−ヒドロキシコレステロール、および24,25(S)−エポキシコレステロールからなる群より選択される、請求項9の方法。
- LXRαモジュレーターがチアゾリジンジオン化合物である、請求項8の方法。
- チアゾリジンジオン化合物が、ダーグリタゾン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、またはトログリタゾン、およびその薬剤的に許容しうる塩からなる群より選択される、請求項11の方法。
- 障害が、インスリン抵抗性症候群、異脂肪血症(dyslipidemia)または2型糖尿病である、請求項8の方法。
- LXRαモジュレーターを、薬剤的に許容しうるキャリアーまたは賦形剤を含んでなる薬剤組成物中で、哺乳動物に投与する、請求項8の方法。
- 前脂肪細胞において、LXRα発現または活性レベルを増加させる方法であって、薬剤的有効量のLXRαモジュレーターを投与することを含んでなる、前記方法。
- LXRαモジュレーターがコレステロールの酸化誘導体である、請求項15の方法。
- 誘導体が、22(R)−ヒドロキシコレステロール、24(S)−ヒドロキシコレステロール、および24,25(S)−エポキシコレステロールからなる群より選択される、請求項16の方法。
- LXRαモジュレーターがチアゾリジンジオン化合物である、請求項15の方法。
- チアゾリジンジオン化合物が、ダーグリタゾン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、またはトログリタゾン、およびその薬剤的に許容しうる塩からなる群より選択される、請求項18の方法。
- モジュレーターを哺乳動物に投与する、請求項15の方法。
- 哺乳動物が、インスリン抵抗性症候群、異脂肪血症または2型糖尿病を有する、請求項20の方法。
- 前脂肪細胞分化を刺激する化合物を同定する方法であって:
レポーター遺伝子に機能可能であるように連結したLXRα調節配列を含んでなる、前脂肪細胞または脂肪細胞を提供すること;
試験化合物を該細胞に導入すること;および
細胞におけるレポーター遺伝子の転写をアッセイすること、ここで、化合物の非存在下での転写に比較した、化合物の存在下での転写の増加が、該化合物が細胞において前脂肪細胞分化を刺激することの示標となる
を含んでなる、前記方法。 - 細胞が哺乳動物細胞である、請求項22の方法。
- 細胞が、3T3−L1前脂肪細胞、または3T3−L1脂肪細胞である、請求項23の方法。
- レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスフェイト、または蛍光タンパク質をコードする、請求項22の方法。
- LXRαのアゴニストを同定する方法であって:
LXRαタンパク質もしくはその断片、LXRα活性化補助因子および化合物を接触させること;および
LXRαタンパク質もしくはその断片とLXRα活性化補助因子とが相互作用するかどうかを決定すること、ここで、LXRαタンパク質もしくはその断片とLXRα活性化補助因子との間の相互作用が、該化合物がLXRαアゴニストであることの示標となる
を含んでなる、前記方法。 - LXRα活性化補助因子がステロイド受容体活性化補助因子である、請求項26の方法。
- LXRαのアゴニストを同定する方法であって:
LXRαタンパク質もしくはその断片、LXRαヘテロ二量体化パートナーもしくはその断片、および化合物を接触させること;および
LXRαタンパク質もしくはその断片とLXRαヘテロ二量体化パートナーもしくはその断片とが相互作用するかどうかを決定すること、ここで、LXRαタンパク質もしくはその断片とLXRαヘテロ二量体化パートナーもしくはその断片との間の相互作用が、化合物がLXRαアゴニストであることの示標となる
を含んでなる、前記方法。 - LXRαへテロ二量体化パートナーがレチノイドX受容体である、請求項28の方法。
- 異常な前脂肪細胞分化と関連する障害の治療用の医薬品製造におけるLXRαモジュレーターの使用であって、LXRαモジュレーターが前脂肪細胞分化を刺激する、前記使用。
- LXRαモジュレーターがコレステロールの酸化誘導体である、請求項30記載の使用。
- 誘導体が、22(R)−ヒドロキシコレステロール、24(S)−ヒドロキシコレステロール、および24,25(S)−エポキシコレステロールからなる群より選択される、請求項31記載の使用。
- LXRαモジュレーターがチアゾリジンジオン化合物である、請求項30記載の使用。
- チアゾリジンジオン化合物が、ダーグリタゾン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、またはトログリタゾン、およびその薬剤的に許容しうる塩からなる群より選択される、請求項33記載の使用。
- 障害が、インスリン抵抗性症候群、異脂肪血症または2型糖尿病である、請求項30記載の使用。
- LXRαモジュレーターを、経口、局所、静脈内、経皮、直腸、または非経口投与する、請求項30記載の使用。
- 異常な前脂肪細胞分化と関連する障害の治療において使用するための薬剤配合物。
- LXRαモジュレーターがコレステロールの酸化誘導体である、請求項37の薬剤配合物。
- 誘導体が、22(R)−ヒドロキシコレステロール、24(S)−ヒドロキシコレステロール、および24,25(S)−エポキシコレステロールからなる群より選択される、請求項38の薬剤配合物。
- LXRαモジュレーターがチアゾリジンジオン化合物である、請求項37の薬剤配合物。
- チアゾリジンジオン化合物が、ダーグリタゾン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、またはトログリタゾン、およびその薬剤的に許容しうる塩からなる群より選択される、請求項40の薬剤配合物。
- 障害が、インスリン抵抗性症候群、異脂肪血症または2型糖尿病である、請求項37の薬剤配合物。
- LXRαモジュレーターを、経口、局所、静脈内、経皮、直腸、または非経口投与する、請求項37の薬剤配合物。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GBGB0101933.0A GB0101933D0 (en) | 2001-01-25 | 2001-01-25 | Therapy |
PCT/SE2002/000102 WO2002058532A2 (en) | 2001-01-25 | 2002-01-22 | Method for identifying ligands to lxr-receptor that stimulates pre-adipocyte differentiation and formulations thereof |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2004523231A true JP2004523231A (ja) | 2004-08-05 |
Family
ID=9907491
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002558870A Pending JP2004523231A (ja) | 2001-01-25 | 2002-01-22 | 療法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20040077613A1 (ja) |
EP (1) | EP1355891A2 (ja) |
JP (1) | JP2004523231A (ja) |
AU (1) | AU2002219773A1 (ja) |
GB (1) | GB0101933D0 (ja) |
WO (1) | WO2002058532A2 (ja) |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2834996B1 (fr) * | 2002-01-18 | 2004-12-03 | Genfit S A | Methode d'identification de substances capables de moduler la differenciation adipocytaire |
EP1563309A2 (en) * | 2002-11-14 | 2005-08-17 | Novo Nordisk A/S | Use of nuclear hormone receptors to identify meiosis regulating compounds |
US9532994B2 (en) | 2003-08-29 | 2017-01-03 | The Regents Of The University Of California | Agents and methods for enhancing bone formation by oxysterols in combination with bone morphogenic proteins |
EP1993558B1 (en) * | 2006-02-27 | 2014-07-30 | The Regents of The University of California | Oxysterol compounds and the hedgehog pathway |
GB0619860D0 (en) * | 2006-10-06 | 2006-11-15 | Birkeland Innovasjon As | Treatment of insulin resistance and disorders associated therewith |
EP1925938A1 (en) * | 2006-11-23 | 2008-05-28 | PheneX Pharmaceuticals AG | Method for determining the effect of a test agent on a target molecule |
AU2008331808B2 (en) * | 2007-03-16 | 2014-08-21 | The Regents Of The University Of California | Oxysterols for activation of hedgehog signaling, osteoinduction, antiadipogenesis, and Wnt signaling |
CA2872751A1 (en) | 2012-05-07 | 2013-11-14 | The Regents Of The University Of California | Oxysterol analogue oxy133 induces osteogenesis and hedgehog signaling and inhibits adipogenesis |
CN105263500A (zh) | 2013-05-02 | 2016-01-20 | 加利福尼亚大学董事会 | 骨选择性成骨性氧固醇-骨靶向剂 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU7074496A (en) * | 1995-09-18 | 1997-04-09 | Ligand Pharmaceuticals Incorporated | Ppar gamma antagonists for treating obesity |
WO2000034461A2 (en) * | 1998-12-10 | 2000-06-15 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Compositions and methods of modulating cholesterol metabolism |
US6316503B1 (en) * | 1999-03-15 | 2001-11-13 | Tularik Inc. | LXR modulators |
NZ515810A (en) * | 1999-04-30 | 2004-05-28 | Arch Dev Corp | Steroid derivatives |
WO2001017994A1 (en) * | 1999-09-08 | 2001-03-15 | Glaxo Group Limited | Oxazole ppar antagonists |
WO2001082917A2 (en) * | 2000-05-03 | 2001-11-08 | Tularik Inc. | Treatment of hypertriglyceridemia and other conditions using lxr modulators |
-
2001
- 2001-01-25 GB GBGB0101933.0A patent/GB0101933D0/en not_active Ceased
-
2002
- 2002-01-22 US US10/466,333 patent/US20040077613A1/en not_active Abandoned
- 2002-01-22 WO PCT/SE2002/000102 patent/WO2002058532A2/en active Application Filing
- 2002-01-22 EP EP02734896A patent/EP1355891A2/en not_active Withdrawn
- 2002-01-22 JP JP2002558870A patent/JP2004523231A/ja active Pending
- 2002-01-22 AU AU2002219773A patent/AU2002219773A1/en not_active Abandoned
-
2007
- 2007-02-08 US US11/672,709 patent/US20080032961A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2002058532A3 (en) | 2002-11-21 |
US20080032961A1 (en) | 2008-02-07 |
AU2002219773A1 (en) | 2002-08-06 |
US20040077613A1 (en) | 2004-04-22 |
WO2002058532A2 (en) | 2002-08-01 |
EP1355891A2 (en) | 2003-10-29 |
GB0101933D0 (en) | 2001-03-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20080032961A1 (en) | Therapy employing LXRalpha modolators | |
An et al. | TBC1D1 regulates insulin-and contraction-induced glucose transport in mouse skeletal muscle | |
JPH09509314A (ja) | 神経ペプチドy/ペプチドyy(y2)受容体をコードした核酸、及び該核酸の使用 | |
WO2005094314A2 (en) | Modulators of shp2 tyrosine phosphatase and their use in the treatment of body weight disorders | |
WO2004055054A1 (en) | Anktm1, a cold-activated trp-like channel expressed in nociceptive neurons | |
US20050036992A1 (en) | Novel use of liver X receptor agonists | |
US8038995B2 (en) | Human N-type calcium channel isoform and uses thereof | |
US20040198655A1 (en) | Use of long pentraxin ptx3 for treating female infertility | |
US20020152479A1 (en) | Car modulators: screening and treatment of hypercholesterolemia | |
WO2006102653A2 (en) | Methods and compositions for treating insulin resistance and obesity-induced diseases | |
US20030113810A1 (en) | Novel assay | |
WO2006017293A2 (en) | Models and methods for nociception, pain transduction, and screening for analgesic compounds | |
CA2652398A1 (en) | G protein-coupled receptor 39 (gpr39) | |
KR20070086003A (ko) | G 단백질 커플된 수용체 | |
US20030170741A1 (en) | Methods for identifying compounds for regulating muscle mass or function using dopamine receptors | |
WO2006006389A1 (ja) | 肥満関連疾患診断方法、Mest発現調節因子検査方法及びMest発現調節因子のスクリーニング方法 | |
EP1705256A1 (en) | Methods for the treatment of insulin resistance and disease states characterized by insulin resistance | |
WO2005012570A1 (ja) | Slc25a10による肥満治療に有効な化合物の評価方法 | |
WO2024013052A1 (en) | Novel use | |
US20050019261A1 (en) | Screening method for compounds that modulate neuronal activity | |
EP1438588B1 (en) | Method for identification of modulators of pre-adipocyte differentiation | |
JPWO2004015415A1 (ja) | 薬剤スクリーニング方法 | |
US20040005997A1 (en) | Methods for identifying compounds for regulating muscle mass of function using amylin receptors | |
JP2003531638A (ja) | 食欲制御物質の同定のためのgタンパク質共役型受容体gpr3の使用 | |
Lodge | 3088 Smith Springs Road Nashville, TN 37013 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20040824 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070413 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20070712 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20070720 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20071206 |