RU2366662C2 - Моноклональное антитело к вирусу типа а гриппа и устройство для иммунного анализа с использованием антитела - Google Patents
Моноклональное антитело к вирусу типа а гриппа и устройство для иммунного анализа с использованием антитела Download PDFInfo
- Publication number
- RU2366662C2 RU2366662C2 RU2006103301/13A RU2006103301A RU2366662C2 RU 2366662 C2 RU2366662 C2 RU 2366662C2 RU 2006103301/13 A RU2006103301/13 A RU 2006103301/13A RU 2006103301 A RU2006103301 A RU 2006103301A RU 2366662 C2 RU2366662 C2 RU 2366662C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- virus
- influenza
- antibody
- zone
- developer
- Prior art date
Links
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 title claims abstract description 112
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 62
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 62
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 51
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 49
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 49
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 49
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 claims description 42
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 claims description 42
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 38
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 37
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 37
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 37
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 35
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 32
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 claims description 32
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 30
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 30
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 22
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 20
- 101900222562 Influenza A virus Nucleoprotein Proteins 0.000 claims description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 241001500351 Influenzavirus A Species 0.000 claims description 2
- 230000002155 anti-virotic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 6
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 35
- 241000713196 Influenza B virus Species 0.000 description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 description 31
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 26
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 20
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 19
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 15
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 15
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 15
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 15
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 15
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 15
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 15
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 14
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 14
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 13
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 13
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 description 13
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 12
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 12
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 12
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 11
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 11
- 208000037798 influenza B Diseases 0.000 description 10
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 6
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 6
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 6
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 6
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000701076 Macacine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 5
- 239000011358 absorbing material Substances 0.000 description 5
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 5
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 5
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 5
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 5
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L (5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl) phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP([O-])(=O)[O-])=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 4
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 4
- ZTOJFFHGPLIVKC-YAFCTCPESA-N (2e)-3-ethyl-2-[(z)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound S\1C2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N(CC)C/1=N/N=C1/SC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N1CC ZTOJFFHGPLIVKC-YAFCTCPESA-N 0.000 description 3
- ZTOJFFHGPLIVKC-UHFFFAOYSA-N 3-ethyl-2-[(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound S1C2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N(CC)C1=NN=C1SC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N1CC ZTOJFFHGPLIVKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 3
- 241001647372 Chlamydia pneumoniae Species 0.000 description 3
- 241000606153 Chlamydia trachomatis Species 0.000 description 3
- 241000186227 Corynebacterium diphtheriae Species 0.000 description 3
- 241001466953 Echovirus Species 0.000 description 3
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 3
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 3
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 3
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 3
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 3
- 241000711386 Mumps virus Species 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 241000202934 Mycoplasma pneumoniae Species 0.000 description 3
- 241001467460 Myxogastria Species 0.000 description 3
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 3
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 3
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 3
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 3
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 3
- 241000191963 Staphylococcus epidermidis Species 0.000 description 3
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 3
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 3
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 3
- 229940038705 chlamydia trachomatis Drugs 0.000 description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 3
- 229940023064 escherichia coli Drugs 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 3
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 3
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 3
- BCHIXGBGRHLSBE-UHFFFAOYSA-N (4-methyl-2-oxochromen-7-yl) dihydrogen phosphate Chemical compound C1=C(OP(O)(O)=O)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C BCHIXGBGRHLSBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 2
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 241000709687 Coxsackievirus Species 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010069767 H1N1 influenza Diseases 0.000 description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- 241000609499 Palicourea Species 0.000 description 2
- 241000845082 Panama Species 0.000 description 2
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 2
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 2
- 235000001630 Pyrus pyrifolia var culta Nutrition 0.000 description 2
- 240000002609 Pyrus pyrifolia var. culta Species 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 2
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 2
- 241000194022 Streptococcus sp. Species 0.000 description 2
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 229940117432 influenza b virus antigen Drugs 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 238000010030 laminating Methods 0.000 description 2
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 description 2
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- VSZGPKBBMSAYNT-RRFJBIMHSA-N oseltamivir Chemical compound CCOC(=O)C1=C[C@@H](OC(CC)CC)[C@H](NC(C)=O)[C@@H](N)C1 VSZGPKBBMSAYNT-RRFJBIMHSA-N 0.000 description 2
- 229960002194 oseltamivir phosphate Drugs 0.000 description 2
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 2
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 2
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 2
- 201000010740 swine influenza Diseases 0.000 description 2
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 229960001028 zanamivir Drugs 0.000 description 2
- ARAIBEBZBOPLMB-UFGQHTETSA-N zanamivir Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)C=C(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO ARAIBEBZBOPLMB-UFGQHTETSA-N 0.000 description 2
- PVGATNRYUYNBHO-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)butanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCN1C(=O)C=CC1=O PVGATNRYUYNBHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMTZYGZMIJRCFG-UHFFFAOYSA-N 3-phenyldioxetane Chemical compound C1OOC1C1=CC=CC=C1 UMTZYGZMIJRCFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- HUDPLKWXRLNSPC-UHFFFAOYSA-N 4-aminophthalhydrazide Chemical compound O=C1NNC(=O)C=2C1=CC(N)=CC=2 HUDPLKWXRLNSPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 1
- 235000006576 Althaea officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000272161 Charadriiformes Species 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 241001551462 Influenza A virus (A/equine/Kentucky/1/1991(H3N8)) Species 0.000 description 1
- 241001529838 Influenza A virus (A/equine/Kentucky/1/1994(H3N8)) Species 0.000 description 1
- 241000713297 Influenza C virus Species 0.000 description 1
- 241001500350 Influenzavirus B Species 0.000 description 1
- 241000272168 Laridae Species 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 1
- 241000283216 Phocidae Species 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 1
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000874347 Streptococcus agalactiae IgA FC receptor Proteins 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 241000589884 Treponema pallidum Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- XYIPYISRNJUPBA-UHFFFAOYSA-N [3-(3'-methoxyspiro[adamantane-2,4'-dioxetane]-3'-yl)phenyl] dihydrogen phosphate Chemical compound O1OC2(C3CC4CC(C3)CC2C4)C1(OC)C1=CC=CC(OP(O)(O)=O)=C1 XYIPYISRNJUPBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N aldrithiol Chemical compound C=1C=CC=NC=1SSC1=CC=CC=N1 HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001280 amantadine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- WOLHOYHSEKDWQH-UHFFFAOYSA-N amantadine hydrochloride Chemical compound [Cl-].C1C(C2)CC3CC2CC1([NH3+])C3 WOLHOYHSEKDWQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000011152 fibreglass Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010422 painting Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 241000856131 recombinant Influenza A viruses Species 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012764 semi-quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 235000019982 sodium hexametaphosphate Nutrition 0.000 description 1
- GCLGEJMYGQKIIW-UHFFFAOYSA-H sodium hexametaphosphate Chemical compound [Na]OP1(=O)OP(=O)(O[Na])OP(=O)(O[Na])OP(=O)(O[Na])OP(=O)(O[Na])OP(=O)(O[Na])O1 GCLGEJMYGQKIIW-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1018—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/08—RNA viruses
- G01N2333/11—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области иммунологии и вирусологии. Предложены антитело к вирусу А гриппа, обладающее высокой специфичностью, и устройство для иммунологического анализа, в котором использовано это антитело. Изобретение может быть использовано для высокоспецифичного определения вируса А гриппа. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 8 ил, 3 табл.
Description
Область техники
Данное изобретение относится к моноклональному антителу к вирусу типа А гриппа и устройству для иммунологического анализа с использованием антитела.
Уровень техники
С древних времен грипп является наиболее широко распространяющимся во всем мире, периодически повторяющимся заболеванием. Каждый раз при широком распространении инфекции некоторое количество людей умирает от этого заболевания. В 1931 году вирус, вызывающий заболевание, был выявлен, что открыло дорогу к выяснению причин заболевания. Вирус, вызывающий грипп, классифицируют на три типа, а именно на типы А, В и С, в зависимости от антигенности растворимого нуклеопротеина (NP), локализованного в вирусе. Вирус А гриппа далее классифицируют на подтипы в зависимости от антигенности двух оболочечных гликопротеинов, гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA).
С 1972 года для профилактики гриппа использовали вакцину, инактивированную формалином, после ее обработки эфиром. В последние годы помимо вакцины, используемой для профилактики гриппа, были разработаны лекарства против гриппа, которые в настоящее время широко используются. Такие терапевтические лекарства включают гидрохлорид амантадина, эффективный против вируса А гриппа, и занамивир (zanamivir) и фосфат осельтамивира (oseltamivir phosphate), эффективные против вирусов А и В гриппа.
При выборе терапевтических лекарств важно обнаружить вирус гриппа в образце, подтвердить, что он является причиной инфекции, и определить, является ли вирус гриппа вирусом типа А или типа В. Далее, в связи с тем, что вирус А гриппа является более заразным, чем вирус В гриппа, и вызывает возникновение серьезных симптомов, определение типа инфекционного вируса является особенно важным для ранней терапии.
Вирусы гриппа обычно определяли (детектировали), используя антитела к вирусу гриппа. Что касается антител к вирусу А гриппа, известны антитела для определения подтипа вируса, специфично распознающие НА или NA вируса, необходимые для производства вакцины после определения подтипа вируса, который, как ожидается, будет превалировать (см., например, ссылки на патентные источники 1 и 2). Аминокислотные последовательности нуклеопротеинов подтипов вируса А гриппа были определены и представлены в Национальной Медицинской Библиотеке (National Library of Medicine); базе данных Entrez Nucleotides и др.
В качестве устройства для детектирования вируса гриппа известно устройство проточного типа (см. ссылку на патентные источники 3), которое содержит твердую фазу, на которой может быть иммобилизован антиген вируса гриппа. В этом устройстве вирус гриппа, содержащийся в образце, взаимодействует с твердой фазой, затем антитело к вирусу А гриппа, меченное первым ферментом, и антитело к вирусу В гриппа, меченное вторым ферментом, взаимодействуют с твердой фазой. После этого добавляют субстраты для проведения реакции и визуально наблюдают окрашивание твердой фазы. Несмотря на то, что в этом устройстве используют антитела к нуклеопротеинам вирусов гриппа, процедура измерений является сложной, так что это устройство не является простым измерительным средством. Кроме того, известно устройство для иммунологического анализа (которое далее будет названо «иммунохроматографическим устройством»), в котором использовано моноклональное антитело к нуклеопротеину вируса гриппа (см. ссылку 1 на непатентную литературу).
С другой стороны, было разработано иммунохроматографическое устройство, в котором использована сходная с лентой основа (матрикс), через которую может быть осуществлен перенос жидкости. С помощью этого устройства можно легко и за короткое время измерить антитело или антиген в образце просто путем нанесения образца на заранее определенную область без специального устройства или сложной измерительной техники. Например, было разработано иммунохроматографическое устройство, в котором множество антигенов Treponema pallidum (TP антигены) связаны в зоне детектирования, и множество антител к TP, содержащихся в образце, можно определить в отдельных зонах детектирования (см. ссылку на патентные источники 4). Это устройство содержит множество зон детектирования, в которых, соответственно, связаны различные TP антигены. В этом устройстве различные антитела к TP определяются раздельно в одно измерение. Это позволяет определить время инфицирования, что используется при выборе терапевтического лекарства и пр.
Ссылки на патентные источники:
1: Выложенная заявка на патент Японии (Kokai) №6-100594
2: Выложенная заявка на патент Японии (Kokai) №7-304799
3: Выложенная заявка на патент Японии (Kokai) №2001-124775
4: Выложенная заявка на патент Японии (Kokai) №9-229938
Ссылки на непатентную литературу;
1: The Journal of the Japanese Association for Infectious Diseases, 2001; 75: 792-799
Раскрытие изобретения
Проблемы, на решение которых направлено данное изобретение
Несмотря на то, что антитела к нуклеопротеину вируса А гриппа широко используются в иммунохроматографических и других сходных способах, известные антитела обладают низкой реакционной способностью и специфичностью к вирусу А гриппа, так что они не могут быть признаны удовлетворительными для высокочувствительных иммунологических анализов. Кроме того, для выбора терапевтического лекарства против гриппа требуется антитело, которое не взаимодействует с вирусом В гриппа, но взаимодействует со всеми вирусами А гриппа, включая подтипы, в которых НА и NA мутировали.
Кроме того, существует потребность в устройстве, с помощью которого можно отличить вирус А гриппа от вируса В гриппа в одну операцию в течение короткого промежутка времени, без использования специального диагностического оборудования или измерительного устройства.
Следовательно, целью данного изобретения является получение антитела к вирусу А гриппа, обладающего высокой специфичностью. Другой целью данного изобретения является разработка устройства для иммунологического анализа, с помощью которого можно было бы специфично определить вирус А гриппа.
Способы решения проблем.
Авторы данного изобретения интенсивно изучали и преуспели в создании антитела к вирусу А гриппа, соответственно к нуклеопротеину вируса А гриппа, которое специфично взаимодействует с вирусом А гриппа, что и является целью данного изобретения. Авторами данного изобретения также было сделано заключение, что можно разработать устройство для иммунологического анализа, с помощью которого можно определить вирус А гриппа, при этом отличая его от вируса В гриппа, за счет использования этого антитела к вирусу А гриппа.
Таким образом, в данном изобретении создано моноклональное антитело к вирусу А гриппа или его антигенсвязывающий фрагмент, которое вступает в реакцию антиген-антитело с нуклеопротеином вируса А гриппа, имеющим молекулярную массу от 55 кДа до 70 кДа, и которое практически не вступает в реакцию антиген-антитело с вирусом В гриппа. В данном изобретении также разработано устройство для иммунологического анализа, содержащее зону меченого реагента, содержащую меченое мобильное антитело к вирусу А гриппа, зону нанесения образца, зону подачи проявителя, зону поглощения (впитывания) проявителя и зону детектирования вируса А гриппа, в которой антитело к вирусу А гриппа иммобилизуется на основе (макриксе), причем все зоны заданы на матриксе, и, по крайней мере, одно из следующих - меченое антитело к вирусу А гриппа и антитело к вирусу А гриппа, иммобилизованное в зоне детектирования - является описанным выше моноклональным антителом по данному изобретению.
Результат изобретения.
В данном изобретении создано моноклональное антитело к вирусу А гриппа, которое иммунологически взаимодействует с вирусом А гриппа, но не взаимодействует с вирусом В гриппа. С помощью иммунологических анализов с использованием моноклонального антитела к вирусу А гриппа по данному изобретению можно определить (детектировать) или количественно измерить вирус А гриппа, при этом отличая его от вируса В гриппа. В данном изобретении также разработано устройство для иммунологического анализа, в котором используют описанное выше моноклональное антитело к вирусу А гриппа по данному изобретению. С помощью устройства для иммунологического анализа по данному изобретению вирус А гриппа можно легко детектировать, при этом отличая его от вируса В гриппа. Следовательно, ожидается, что данное изобретение внесет значительный вклад в диагностику и терапию гриппа.
Краткое описание чертежей.
На Фиг.1 приведены результаты экспериментов, в которых моноклональные антитела по данному изобретению взаимодействовали с антигенами, фракционированными методом белкового блоттинга.
На Фиг.2 приведена рестрикционная карта экспрессионной плазмиды (pW6A), которую использовали в Примере 4.
На Фиг.3 приведены номера аминокислот фрагментов А1-А7, полученных фрагментацией А фрагмента гриппа H1N1.
На Фиг.4 приведена картина окрашивания кумасси (СВВ) и результаты белкового блоттинга для подтверждения реакционной способности по отношению к FVA2-11.
На Фиг.5 приведены аминокислотные последовательности (80-140) нуклеопротеинов подтипов вируса А гриппа.
На Фиг.6 представлено схематичное изображение в сечении варианта выполнения измерительного устройства согласно данному изобретению.
На Фиг.7 приведен вид сверху, показывающий пример состояния (режима работы), когда измерительное устройство по данному изобретению помещено в кассету.
На Фиг.8 приведено поперечное сечение, выполненное по линии А-А', показанной на Фиг.7.
Наилучший вариант выполнения изобретения.
Как описано выше, моноклональное антитело по данному изобретению вступает в реакцию антиген-антитело с нуклеопротеином вируса А гриппа, причем нуклеопротеин имеет молекулярную массу от 55 кДа до 70 кДа. Тот факт, что антитело вступает в реакцию антиген-антитело с нуклеопротеином вируса А гриппа, имеющим молекулярную массу от 55 кДа до 70 кДа, может быть подтвержден методом белкового блоттинга, включающим гель-электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) с использованием вируса А гриппа в качестве образца. Согласно данным белкового блоттинга (см. Примеры ниже), моноклональное антитело по данному изобретению распознает нуклеопротеин, имеющий молекулярную массу от 55 кДа до 70 кДа.
Как уже было отмечено выше, моноклональное антитело по данному изобретению практически не вступает в реакцию антиген-антитело с вирусом В гриппа. Термин «практически не вступает в реакцию антиген-антитело» в данном описании означает, что антитело не вступает в реакцию антиген-антитело на таком уровне, чтобы ее можно было детектировать, и даже если антитело вступает в реакцию антиген-антитело, то степень взаимодействия оказывается очевидно меньше, чем степень взаимодействия с вирусом А гриппа, так что специалистам ясно, что антитело не вступает в реакцию антиген-антитело с вирусом В гриппа. Термин «практически не вступает в реакцию антиген-антитело с вирусом В гриппа» в данном описании означает, что антитело практически не вступает в реакцию антиген-антитело не только с нуклеопротеином вируса В гриппа, но также и с белками или другими компонентами вируса В гриппа. В предпочтительном варианте выполнения моноклональное антитело по данному изобретению также практически не взаимодействует с вирусом С гриппа.
Согласно предпочтительному варианту выполнения изобретения моноклональное антитело по данному изобретению взаимодействует с эпитопом, присутствующем в области между 59-й аминокислотой (далее обозначенной как «5аа») и 130-й аминокислотой («130аа») нуклеопротеина вируса А гриппа. Аминокислотная последовательность вируса А гриппа известна и описана, например, в GenBank Accession №ITY238021 и др. Аминокислотные последовательности участка 59аа-140аа нуклеопротеинов различных подтипов вируса А гриппа показаны на Фиг.5. Так как одно и тоже моноклональное антитело по данному изобретению вступает в реакцию антиген-антитело с нуклеопротеином каждого подтипа вируса А гриппа, то, согласно предпочтительному варианту выполнения изобретения, моноклональное антитело взаимодействует с эпитопом на участке, имеющим общую последовательность и гидрофильную структуру, например, на участке 90аа-95аа, 111аа-115аа, 120аа-123аа или аналогичных в аминокислотных последовательностях, приведенных на Фиг.5, или моноклональное антитело взаимодействует с эпитопом, включающим эти участки и имеющим общую последовательность.
Согласно предпочтительному варианту выполнения моноклональное антитело по данному изобретению вступает в реакцию антиген-антитело с нуклеопротеином каждого подтипа вируса А гриппа. На поверхности частицы вируса А гриппа расположены гемагглютинин (Н) и нейраминидаза (N), причем вирус А гриппа разделяют на подтипы в зависимости от различий в структурах Н и N. Моноклональное антитело по данному изобретению предпочтительно вступает в реакцию антиген-антитело с нуклеопротеинами по крайней мере следующих подтипов вируса А гриппа: H1N1, H2N2, H3N2, H3N8, H4N6, H5N2, H6N2, H7N7, H8N4, H9N2, H10N7, H11N6, H12N5, H13N6, H14N5, H15N8 и H5N1, и, более предпочтительно, с нуклеопротеинами всех подтипов вируса А гриппа.
Согласно предпочтительному варианту выполнения моноклональное антитело по данному изобретению практически не вступает в реакцию антиген-антитело с патогенами других инфекционных заболеваний, симптомы которых хотя бы частично сходны с симптомами гриппа. Таким образом, предпочтительное моноклональное антитело по данному изобретению практически не вступает в реакцию антиген-антитело, например, с аденовирусом (типы с 1 по 7), коксаки-вирусом (типы А16 и В1-В6), вирусом простого герпеса 1, эховирусом (типы 3, 4, 7, 22 и 30), энтеровирусом (тип 71), вирусом свинки, полиовирусом (типы 1-3), RS (респираторно-синцитиальным) вирусом (подгруппы А и В), вирусом парагриппа (типы 1-3), Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Staphylococcus epidermidis, миксомицетами, Staphylococcus aureus, коринебактериями, Corynebacterium diphtheriae, Candida albicans, Streptococcus pyogenes. Streptococcus sp.(группы В, С, G и F), Streptococcus pneumoniae, Hemophilus influenzae, Listeria monocytogenes, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia trachomatis и Chlamydia pneumoniae.
Хорошо известно, что с помощью расщепления антитела папаином или пепсином можно получить фрагменты антитела, обладающие способностью связываться с соответствующим антигеном, такие как Fab фрагмент и F(ab')2 фрагмент (которые в данном описании названы «антигенсвязывающими фрагментами»). Согласно данному изобретению антигенсвязывающие фрагменты моноклонального антитела по данному изобретению можно использовать таким же образом, как и моноклональное антитело, что находится в рамках данного изобретения.
Моноклональное антитело по данному изобретению можно получить традиционным гибридомным способом, используя нуклеопротеин вируса А гриппа в качестве иммуногена. В связи с тем, что в качестве иммуногена используется нуклеопротеин вируса А гриппа, может быть использована любая вирусная культуральная среда, вакцина против НА гриппа, НА антиген для HI и рекомбинантный антиген до тех пор, пока нуклеопротеин присутствует в большом количестве и может служить в качестве иммуногена. Для того чтобы ингибировать высоко иммуногенные НА и NA, присутствующие в антигене, нуклеопротеин очищают с помощью ультрацентрифугирования (см., например, J. Biochem.; 102:1241-1249, 1987), или можно использовать антиген, обработанный протеазой (см., например, J. Immunol. Methods; 180:107-116, 1995).
Моноклональное антитело можно получить с помощью гибридомы, полученной иммунизацией животного антигеном, содержащим описанный выше нуклеопротеин вируса А гриппа, и слиянием животной клетки, продуцирующей моноклональное антитело, с опухолевой клеткой.
Описанная выше гибридома может быть получена следующим способом. Нуклеопротеин вируса А гриппа, полученный как описано выше, который предполагают использовать в качестве антигена, внутрибрюшинно или внутривенно вводят животному, такому, как мышь, дробно, несколько раз с промежутками от 2 до 3 недель вместе с полным адъювантом Фрейнда (Freund's complete adjuvant). Затем осуществляют слияние клеток селезенки или аналогичных клеток, продуцирующих антитела, с опухолевыми клетками, которые могут расти in vitro, такими, как клетки линии миеломы.
Слияние можно осуществить, используя полиэтиленгликоль согласно традиционному способу Kohler и Milstein (Nature, vol.256, 495, 1975), или используя вирус Sendai или сходный вирус.
Отбор гибридом, продуцирующих антитело, которое распознает нуклеопротеин вируса А гриппа, из полученных слиянием клеток можно провести следующим образом. Те из полученных слиянием клеток, которые остаются живыми в HAT (гипоксантин, аминоптерин, тимидин) среде и/или НТ (гипоксантин, тимидин) среде, могут быть отобраны в качестве гибридом способом ограниченного разбавления. Затем гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело, которое специфично распознает нуклеопротеин вируса А гриппа, можно отобрать с помощью EIA (иммуноферментного анализа) или сходным способом, причем культуральная среда гибридомы взаимодействует с высокоочищенным нуклеопротеином вируса А гриппа, иммобилизованным на аналитической плашке, а затем дополнительно взаимодействует с анти-мышиным иммуноглобулином (Ig) или аналогичным.
В приведенных ниже Примерах описано множество полученных предпочтительных моноклональных антител по данному изобретению, и три из них были названы гибридома FVA2-3, гибридома FVA2-6 и гибридома FVA2-11, соответственно. Эти гибридомы были депонированы в Международном Патентном Депозитарии Организмов (International Patent Organism Depositary), Национальном Институте Развития Прикладной Науки и Технологий (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Япония), в качестве международного депонирования в соответствии с Будапештским Соглашением. Таким образом, гибридома FVA2-3 была депонирована под идентификационным названием «FVA2-3» под инвентарным номером FERM ВР-10066 (дата депонирования: 18 июля 2003; конвертирована 14 июля 2004 из внутреннего депонирования под инвентарным номером FERM P-19437); гибридома FVA2-6 была депонирована под идентификационным названием «FVA2-6» под инвентарным номером FERM BP-10067 (дата депонирования: 18 июля 2003; конвертирована 14 июля 2004 из внутреннего депонирования под инвентарным номером FERM Р-19438); и гибридома FVA2-11 была депонирована под идентификационным названием «FVA2-11» под инвентарным номером FERM ВР-10068 (дата депонирования: 18 июля 2003; конвертирована 14 июля 2004 из внутреннего депонирования под инвентарным номером FERM P-19439).
Каждую из описанных выше гибридом можно выделить путем культурирования гибридомы в среде, обычно используемой для клеточных культур, а моноклональное антитело можно выделить из супернатанта культуры. В альтернативном варианте моноклональное антитело можно выделить путем введения гибридомы животному того вида, от которого она была получена, для аккумулирования в нем асцита и путем выделения моноклональных антител из асцита.
Для выделения моноклональных антител можно использовать традиционные способы очистки. Примеры таких способов очистки включают гель-проникающую хроматографию, ионообменную хроматографию, аффинную хроматографию с использованием белка А и аналогичные способы.
Было подтверждено, что моноклональные антитела, полученные описанным выше способом, взаимодействуют с нуклеопротеином вируса А гриппа и с различными подтипами вируса А гриппа. Они вступают в реакцию с 38 исходными штаммами (см. Таблицу 3 ниже) вируса А гриппа людей, лошадей, уток, индюков, тюленей, кур, чаек, диких уток и пр., и исходные штаммы можно определить, используя моноклональные антитела по данному изобретению. С другой стороны, была протестирована перекрестная реактивность с микроорганизмами, например, аденовирусом (типы 1-7), коксаки-вирусом (типы А16 и В1-В6), вирусом простого герпеса 1, эховирусом (типы 3, 4, 7, 22 и 30), энтеровирусом (тип 71), вирусом свинки, полиовирусом (типы с 1 по 3), RS вирусом (подгруппы А и В), вирусом парагриппа (типы с 1 по 3), Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Staphylococcus epidermidis, миксомицетами, Staphylococcus aureus, коринебактериями, Corynebacterium diphtheriae, Candida albicans, Streptococcus pyogenes, Streptococcus sp. (группы В, С, G и F), Streptococcus pneumoniae, Hemophilus influenzae, Listeria monocytogenes, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia trachomatis и Chlamydia pneumoniae. Взаимодействие не было обнаружено.
Моноклональное антитело согласно данному изобретению можно использовать в иммунологических анализах для определения (детектирования) или количественного измерения вируса А гриппа. Иммунологические анализы сами по себе хорошо известны, и можно использовать любой из известных способов иммунологических исследований. Классифицируя известные способы иммунологических исследований по типу реакции, их можно разделить на сэндвичевые иммунологические анализы, конкурентные иммунологические анализы, иммунологические анализы, основанные на агглютинации, белковый блоттинг и пр. Классифицируя известные способы иммунологических исследований по использованной метке, их можно разделить на флуоресцентные иммунологические анализы, иммуноферментные анализы, радиоиммунологические исследования, иммунологические анализы, основанные на использовании биотина, и пр. Можно использовать любой из этих способов. Более того, диагноз можно получить с помощью иммуногистоокрашивания. В тех случаях, когда в иммунологическом исследовании используют меченое антитело, можно использовать любой из хорошо известных способов, т.к. сами по себе способы мечения антител хорошо известны. Известно, что расщепление антитела с помощью папаина или пепсина приводит к получению фрагмента антитела, такого, как Fab фрагмент или F(аb')2 фрагмент, обладающего способностью связываться с соответствующим антигеном (такой фрагмент в описании назван «антигенсвязывающим фрагментом»), Антигенсвязывающие фрагменты антитела по данному изобретению также могут быть использованы тем же образом, как и само антитело по данному изобретению.
Такие иммунологические исследования сами по себе хорошо известны из уровня техники, поэтому нет необходимости разъяснять их в данном описании. Если коротко, в сэндвичевых иммунологических анализах, например, антитело по данному изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент иммобилизуют на твердом носителе (подложке) как первое антитело. Первое антитело затем вступает в реакцию с образцом, а после промывки твердого носителя получившийся в результате комплекс взаимодействует со вторым антителом, которое вступает в реакцию антиген-антитело с нуклеопротеином вируса А гриппа по данному изобретению. После промывки твердого носителя измеряют второе антитело, связанное с твердым носителем. Если пометить второе антитело ферментом, флуоресцентным соединением, радиоактивным соединением, биотином и т.д., то измерить количество второго антитела, связанного с твердым носителем, можно, измеряя количество метки. Такое измерение проводят для множества стандартных образцов, каждый из которых содержит известную концентрацию нуклеопротеина, после чего для получения калибровочной кривой строят зависимость измеренного количества метки от концентрации нуклеопротеина в стандартных образцах. Определить количество нуклеопротеина в тестируемом образце можно, наложив измеренное количество на калибровочную кривую. Следует заметить, что первое антитело и второе антитело можно поменять. В иммунологических анализах, основанных на агглютинации, антитело согласно данному изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент иммобилизуют на частицах, таких, как латексные частицы, и частицы взаимодействуют с образцом, после чего проводят измерение оптической плотности. Такое измерение проводят для множества стандартных образцов, каждый из которых имеет известную концентрацию нуклеопротеина, и для получения калибровочной кривой строят зависимость измеренной оптической плотности от концентрации нуклеопротеина в стандартных образцах. Определить количество нуклеопротеина в тестируемом образце можно, сравнив измеренную оптическую плотность с калибровочной кривой.
В данном изобретении также разработано устройство для иммунологического анализа, в котором использовано моноклональное антитело согласно данному изобретению, с помощью которого вирус А гриппа можно легко определить, при этом отличая его от вируса В гриппа.
Устройство для иммунологического анализа содержит зону меченого реагента, содержащую меченое мобильное антитело к вирусу А гриппа, зону нанесения образца, зону подачи проявителя, зону поглощения (впитывания) проявителя и зону детектирования вируса А гриппа, в которой антитело к вирусу А гриппа иммобилизуется на основе (макриксе), причем все зоны заданы на матриксе, и, по крайней мере, одно из следующих - меченое антитело к вирусу А гриппа и антитело к вирусу А гриппа, иммобилизованное в зоне детектирования - является описанным выше моноклональным антителом по данному изобретению. Образец, нанесенный в зоне нанесения образца, вступает в реакцию антиген-антитело с меченым антителом, находящимся в зоне меченого реагента, за счет чего формируется меченый комплекс антиген-антитело. Этот комплекс антиген-антитело переносится проявителем, поступающим из зоны подачи проявителя, в зону детектирования вируса А гриппа. Антитело к вирусу А гриппа иммобилизовано на матриксе и меченый комплекс антиген-антитело вступает в реакцию антиген-антитело, так что меченый комплекс антиген-антитело оказывается иммобилизованным на матриксе. Иммобилизован ли комплекс антиген-антитело в зоне детектирования вируса А гриппа или нет, оценивают по наличию метки. Проявитель, проходящий через зону детектирования вируса А гриппа, абсорбируется в зоне поглощения (впитывания) проявителя. Зона нанесения образца и зона меченого реагента могут быть одной и той же зоной (в этом случае образец наносят на зону меченого реагента). В устройстве для иммунологического анализа согласно данному изобретению, по крайней мере, одно из следующих - меченое антитело или антитело, иммобилизованное в зоне детектирования вируса А гриппа - является моноклональным антителом по данному изобретению. Одно из антител может быть также поликлональным антителом. Так как множество молекул нуклеопротеина вируса А гриппа обычно связываются или соединяются друг с другом, вирус А гриппа можно определить, даже если меченое антитело и антитело, иммобилизованное в зоне детектирования вируса А гриппа, являются тем же самым моноклональным антителом.
Составные части (компоненты) устройства для иммунологического анализа согласно данному изобретению ниже будут описаны по отдельности.
Матрикс
Матрикс в виде ленты в устройстве для иммунологического анализа согласно данному изобретению изготовлен из водопоглощающего материала, в котором жидкость может перемещаться за счет капиллярных сил. Примеры водопоглощающих материалов включают в себя целлюлозу и ее производные, такие, как целлюлоза и нитроцеллюлоза, и фильтровальную бумагу, изготовленную из одного стекловолокна или включающую стекловолокно, мембраны и пористые материалы, Несмотря на то, что размер матрикса не ограничен, предпочтительными являются матриксы в форме полоски (ленты) шириной примерно от 3 мм до 10 мм и длиной примерно от 30 мм до 100 мм, так как они удобны в обращении. Для предотвращения неспецифичной адсорбции белков, присутствующих в образце, на матриксе в процессе измерения, часть или весь матрикс можно блокировать сывороточным животным белком, таким, как бычий сывороточный альбумин (БСА, BSA), казеином, сахарозой и др.
Зона детектирования
В зоне детектирования можно задать участок детектирования вируса А гриппа, на котором на матриксе иммобилизовано антитело к вирусу А гриппа. По крайней мере, одно из следующих - антитело к вирусу А гриппа, иммобилизованное на этом участке детектирования, или меченое антитело к вирусу А гриппа, описанное ниже, - является моноклональным антителом по данному изобретению, причем предпочтительно оба они являются моноклональным антителом к вирусу А гриппа по данному изобретению. Антитело к вирусу А гриппа в зоне детектирования предпочтительно размещено на матриксе в форме линии, перпендикулярной направлению перемещения потока жидкости (продольному направлению матрикса) для измерения с высокой чувствительностью. Подходящее поликлональное антитело, используемое в качестве поликлонального антитела к вирусу А гриппа, может быть выбрано из коммерчески и легко доступных поликлональных антител.
Антитело к вирусу А гриппа в зоне детектирования представляет собой описанное выше антитело, причем моноклональные антитела могут быть использованы индивидуально или в комбинации. Антитело к вирусу А гриппа может быть антителом к IgG или IgM, или может быть Fab, F(ab')2 или аналогичным, являющимся антигенсвязывающим фрагментом этих антител.
Антитело к вирусу А гриппа, иммобилизованное на участке детектирования, может быть физически адсорбировано непосредственно в зоне детектирования матрикса, или может быть зафиксировано с помощью химической связи, например ковалентной. В альтернативном варианте антитело к вирусу А гриппа может быть связано с нерастворимым в воде носителем, а носитель может содержаться в матриксе. Примеры нерастворимых носителей включают частицы, полученные путем осаждения смеси желатина, аравийской камеди и гексаметафосфата натрия (Японская патентная публикация №63-29223), полистирольные латексные частицы, стекловолокно и пр. Моноклональное антитело к вирусу А гриппа может быть связано с нерастворимым носителем за счет описанного выше химического связывания или физической адсорбции.
В зоне детектирования помимо участка детектирования вируса А гриппа с помощью антитела к вирусу А гриппа может быть задан участок детектирования вируса В гриппа с помощью антитела к вирусу В гриппа. Такой участок детектирования вируса В гриппа может быть расположен вблизи от участка детектирования вируса А гриппа либо до («выше»), либо после («ниже») него по направлению потока проявителя. Антитело к вирусу В гриппа, иммобилизованное на участке детектирования вируса В гриппа, может быть поликлональным антителом или моноклональным антителом, и может, как и в случае антитела к вирусу А гриппа, быть иммобилизовано на матриксе за счет химической связи или физической адсорбции.
Как было отмечено ранее, предпочтительно задать участок детектирования вируса В гриппа в дополнение к участку детектирования вируса А гриппа, для того, чтобы одновременно определять (измерять) вирус А гриппа и вирус В гриппа. Такие участки детектирования расположены после («ниже») зоны меченного ферментом реагента, зоны нанесения образца и зоны подачи проявителя, и до («выше») зоны поглощения проявителя, по направлению потока жидкости в матриксе. Участки детектирования могут быть заданы на матриксе в виде множества линий, каждая из которых имеет ширину от примерно 0.5 мм до 5 мм, причем эти линии расположены близко друг от друга. В случае использования матрикса с шириной около 5 мм участки детектирования можно задать посредством нанесения антитела и антигена, обычно в количестве примерно от 0.1 мкг до 10 мкг, соответственно, и высушивания матрикса.
Зона меченого реагента
Зону меченого реагента можно задать путем нанесения меченого антитела к вирусу А гриппа на зону, созданную на матриксе, причем таким образом, чтобы меченое антитело сохраняло свою подвижность. Эта зона может быть сформирована до («выше») зоны детектирования по направлению потока проявителя из зоны подачи проявителя. Эта зона может быть сформирована путем нанесения меченного ферментом реагента на матрикс или посредством ламинирования водопоглощающей подложки, содержащей меченный ферментом реагент, или путем включения меченного ферментом реагента в часть или весь матрикс, который плотно контактирует с подложкой. В качестве водопоглощающей подложки может быть использована подложка, которую используют для зоны нанесения образца (описана ниже).
По крайней мере, одно из следующих - меченое антитело к вирусу А гриппа и антитело, иммобилизованное в зоне детектирования - является моноклональным антителом к вирусу А гриппа по данному изобретению, и предпочтительно оба они являются моноклональным антителом к вирусу А гриппа по данному изобретению. Помимо меченого антитела к вирусу А гриппа могут быть использованы его фрагменты, как и в случае описанного выше антитела в зоне детектирования.
Меченое антитело к вирусу А гриппа можно получить путем связывания антитела с меткой. Примеры меток включают ферменты, коллоидные металлические частицы, окрашенные латексные частицы, люминесцентные соединения, флуоресцентные соединения и пр. В качестве фермента могут быть использованы различные ферменты, используемые в иммунологических исследованиях (иммуноферментных анализах, EIA). Примеры ферментов включают щелочную фосфатазу, пероксидазу, β-D-галактозидазу и др. Примеры коллоидных металлических частиц включают коллоидное золото, коллоидный селен и др.
Метку и антитело к вирусу А гриппа можно соединить известными способами, используя ковалентную или нековалентную связь. Примеры способов связывания включают глутаральдегидный метод, периодатный метод, малеимидный метод, пиридилдисульфидный метод, а также способы, в которых используют различные сшивающие агенты (см., например, "PROTEIN, NUCLEIC АСID AND ENZYME" («Белок, нуклеиновая кислота и фермент»), Extra Edition (дополнительный выпуск), т.31, стр.37-45 (1985)). В способах, в которых применяют сшивающий агент, могут быть использованы, например, N-сукцинимидил-4-малеимид-масляная кислота (GMBS), N-сукцинимидил-6-малеимид-гексановая кислота, N-сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)-циклогексан-1-карбоновая кислота и другие аналогичные соединения. В способах, в которых применяют ковалентное связывание, могут быть использованы функциональные группы антитела. Альтернативно, меченое антитело к вирусу А гриппа можно получить описанными выше способами связывания после введения функциональной группы, такой, как тиольная группа, амино группа, карбоксильная группа, гидроксильная группа и др. В способах, основанных на нековалентном связывании, может быть использована физическая адсорбция и др.
В тех случаях, когда вирус типа В гриппа определяют одновременно с детектированием вируса типа А гриппа, как было указано выше, меченое антитело к вирусу В гриппа вводят в зону меченого реагента для подготовки устройства. Меченое антитело к вирусу А гриппа и меченое антитело к вирусу В гриппа, содержащиеся в зоне меченого реагента, могут находиться либо в матриксе, либо в водопоглощающей подложке, либо они могут содержаться и в матриксе, и в водопоглощающей подложке. В случае одновременного определения вируса А гриппа и вируса В гриппа, в связи с тем, что используют большие количества меченых реагентов, для измерений с высокой чувствительностью меченные ферментом реагенты индивидуально или в комбинации полезно вводить и в матрикс, и в подложку. Несмотря на то, что количество меченого антитела к вирусу А гриппа и меченого антитела к вирусу В гриппа может быть соответствующим образом выбрано в зависимости от ожидаемого количества изучаемого вещества в образце, обычно оно составляет от примерно 0.01 мкг до 5 мкг в расчете на сухой вес. При введении меченого антитела к вирусу А гриппа и меченого антитела к вирусу В гриппа в зону меченного ферментом реагента, их можно использовать вместе со стабилизатором, агентом, регулирующим солюбилизацию, и пр.
Зона нанесения образца
Зону нанесения образца можно задать на матриксе после («ниже») зоны подачи проявителя и до («выше») зоны детектирования по направлению потока проявителя, без введения реагента или сходного вещества. Зону нанесения образца также можно задать в: 1) заранее заданной области (месте) после («ниже») зоны подачи проявителя и до («выше») зоны меченного ферментом реагента по направлению потока проявителя, 2) заранее заданной области (месте) после зоны меченого реагента и до зоны детектирования по направлению потока проявителя, или 3) заранее заданном месте зоны меченого реагента. В устройстве, в котором зону нанесения образца формируют в зоне меченного ферментом реагента, предпочтительно вводить водопоглощающую подложку, содержащую ферментную метку для эффективного проведения исследования, как было описано выше. С помощью устройства, содержащего подложку, можно с высокой чувствительностью измерить неосновной (примесный) компонент, содержащийся в образце, так как можно нанести большое количество образца жидкости. Материал, из которого изготовлена водопоглощающая подложка, выбирают из материалов, которые плохо адсорбируют меченый реагент и вирус гриппа. Примеры материалов включают в себя пористые материалы, изготовленные из синтетических или природных полимерных соединений, таких, как поливиниловый спирт (PVA), нетканые материалы, целлюлозу и пр., причем эти материалы можно использовать индивидуально или в комбинации. Несмотря на то, что размер, толщина, плотность и прочие аналогичные характеристики подложки не ограничены, для эффективного проведения исследования предпочтительно использовать подложку, имеющую продольную и поперечную длину примерно от 3 мм до 10 мм, и толщину примерно от 0.5 мм до 4 мм.
Зона подачи проявителя
Зона подачи проявителя представляет собой зону, в которую подается проявитель, сформированную на одном конце матрикса в его продольном направлении. Исследование можно начать путем погружения этой зоны в проявитель, содержащийся в емкости в количестве, достаточном для того, чтобы проявитель достиг зоны поглощения проявителя. Емкость для жидкости, содержащую проявитель, можно присоединить к зоне подачи проявителя, и исследование может быть начато посредством открывания заглушки (крышки, перегородки) сосуда с жидкостью, за счет чего проявитель вступает в контакт с матриксом. Проявитель может содержать подходящее поверхностно-активное вещество, буферный агент, стабилизатор, антибактериальный агент и пр. В тех случаях, когда в качестве метки используют фермент, в проявитель можно добавить субстрат в дополнение к описанной далее зоне субстрата. Примеры буферных растворов, содержащих буферный агент, включают ацетатный буфер, боратный буфер, трис-НСl буфер, буфер на основе диэтаноламина и т.д. В зоне подачи проявителя можно установить подложку для проявителя для его стабильной и непрерывной подачи в матрикс. В качестве подложки для проявителя можно использовать фильтровальную бумагу, изготовленную, например, из целлюлозы или производных целлюлозы.
Зона поглощения проявителя
Зону поглощения (впитывания) проявителя задают на конце матрикса, противоположном тому концу, на котором расположена зона подачи проявителя. Эту зону создают для поглощения (впитывания) подаваемого в матрикс проявителя, с тем, чтобы без труда осуществить проведение анализа. Зону поглощения проявителя можно задать за счет удлинения матрикса. Для ускорения поглощения к матриксу можно присоединить водопоглощающий материал. В качестве водопоглощающего материала можно использовать фильтровальную бумагу, обладающую высокой емкостью по отношению к воде, изготовленную из природных полимерных соединений, синтетических полимерных соединений и пр. Можно использовать губку или аналогичное приспособление. Несмотря на то, что зона поглощения проявителя изготовлена из абсорбционного материала в форме подложки, объем которой позволяет впитать весь проявитель, компактное устройство для иммунологического анализа можно изготовить посредством ламинирования поглощающего материала, расположенного над или под матриксом.
Зона субстрата
В тех случаях, когда в качестве метки используют фермент, находящийся в зоне меченого реагента, субстрат может содержаться в проявителе, как это уже было описано выше, или на матриксе вблизи зоны подачи проявителя можно задать зону субстрата. Предпочтительно, зона субстрата может быть образована в описанной выше подложке для проявителя, расположенной в зоне подачи проявителя, за счет введения субстрата в подложку для проявителя.
В качестве субстрата в зависимости от фермента, используемого в качестве метки, могут применять различные субстраты, дающие окрашивание, флуоресцентные субстраты, люминесцентные субстраты и пр.
(а) Субстраты, дающие окрашивание
Для пероксидазы: 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфонат) (ABTS), 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМВ) и диаминобензидин (DAB), совместно с пероксидом водорода;
Для щелочной фосфатазы: 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат (BCIP).
(б) Флуоресцентные субстраты.
Для щелочной фосфатазы: 4-метилумбеллиферилфосфат (4MUP).
Для β-D-галактозидазы: 4-метилумбеллиферил-β-D)-галактозид (4MUG).
(в) Люминесцентные субстраты.
Для щелочной фосфатазы: 3-(2'-спироадамантан)-4-метокси-4-(3”-фосфорилокси)фенил-1,2-диоксетан-2-натриевая соль (AMPPD).
Для β-D-галактозидазы: 3-(2'-спироадамантан)-4-метокси-4-(3”-β-D-галактопиранозил) фенил-1,2-диоксетан (AMGPD).
Для пероксидазы: люминол и изолюминол совместно с пероксидом водорода.
В тех случаях, когда задают зону субстрата, ее обычно можно сформировать посредством нанесения водного раствора субстрата в форме линии на подложку для проявителя и высушивания раствора. При желании можно добавить агент, усиливающий сигнал, стабилизатор, агент, контролирующий солюбилизацию, и пр. Положение зоны субстрата не ограничено в пределах подложки для проявителя, расположенной на конце матрикса. Количество субстрата, добавляемого в проявитель или подложку для проявителя, можно выбрать в зависимости от условий проведения анализа. Обычно оно составляет от примерно 5 мкг до 500 мкг на устройство.
Расположение зон
Предпочтительный вариант выполнения устройства для иммунологического анализа согласно данному изобретению схематично показан на Фиг.6-8. На Фиг.6 цифрой 2 обозначен матрикс, цифра 4 обозначает зону меченого реагента, цифра 8 - зону нанесения образца, цифра 3 - зону подачи проявителя, цифра 5 - зону поглощения проявителя, цифрой 6а обозначена зона детектирования вируса А гриппа, цифрой 7 - зона субстрата, и цифра 9 обозначает образец. В этом варианте выполнения изобретения зона 8 нанесения образца и зона 4 меченого реагента представляют собой одну зону. Цифрой 6b обозначена зона детектирования вируса В гриппа, цифрой 10 обозначена зона контроля (подтверждения прохождения проявителя), и цифрой 11 обозначена емкость для проявителя (см. Пример 6 ниже).
Способ использования устройства для иммунологического анализа.
С помощью устройства для иммунологического анализа согласно данному изобретению можно определять (исследовать) вирус А гриппа в различных образцах. Анализы можно проводить, если сначала нанести образец в зону нанесения образца устройства для иммунологического анализа, а затем подать проявитель в подложку для проявителя, за счет чего образец будет перемещаться по матриксу. В качестве разбавителя для образца можно использовать буфер, содержащий поверхностно-активное вещество. Проявитель перемещается по матриксу за счет капиллярных сил и достигает зоны поглощения проявителя. В зоне поглощения проявителя абсорбируются те компоненты образца, которые не связались в зоне детектирования, меченный ферментом реагент и пр., и проявление (перемещение) заканчивается. Через заранее заданное время (обычно от 10 до 20 минут) исследуют зону детектирования и измеряют количество метки, связавшейся с участком детектирования за счет вируса А гриппа, содержащегося в образце, что позволяет определить (измерить) вирус А гриппа. В зависимости от использованных субстрата или субстрата и фермента детектирование можно провести с помощью визуального наблюдения или с помощью измерительного устройства, такого, как колориметр, флуориметр, счетчик фотонов, фоточувствительная пленка и др. Простым способом измерения является, например, способ, согласно которому окрашивание зоны детектирования определяют визуально. Согласно этому способу, используя цветовую шкалу, соответствующую концентрациям вируса А гриппа, можно провести полуколичественный анализ. Можно провести количественный анализ, если окрашивание зоны детектирования перевести в цифровую форму с помощью колориметра или другого аналогичного устройства.
Далее принцип исследования будет объяснен более подробно на примере предпочтительного варианта выполнения устройства для иммунологического анализа согласно данному изобретению, показанного на Фиг.6-8 в качестве примера. Образец 9 наносят на зону 8 нанесения образца, и проявитель из емкости 11 для проявителя подают в зону 3 подачи проявителя. Проявитель перемещается по матриксу 2 в направлении, показанном горизонтальной незаштрихованной стрелкой, за счет капиллярных сил. Субстрат, содержащийся в зоне 7 субстрата, растворяется в проявителе и продвигается вместе с ним. Напротив, образец 9 вступает в реакцию с меченым антителом в зоне 4 меченого реагента, так что образуется меченый комплекс антиген-антитело. Когда проявитель доходит до этого участка, меченый комплекс антиген-антитело начинает перемещение в матриксе 2, реагируя при этом с субстратом, содержащимся в проявителе. Когда меченый комплекс антиген-антитело достигает зоны 6а детектирования вируса А гриппа, он взаимодействует с антителом к вирусу А гриппа, иммобилизованным в этой зоне, за счет чего иммобилизуется. В тех случаях, когда вирус А гриппа содержится в образце, появляется окрашивание за счет реакции между меченым ферментом и субстратом. С другой стороны, когда вирус А гриппа в образце отсутствует, меченое антитело не может вступить в реакцию антиген-антитело и, таким образом, не может быть иммобилизовано в зоне 6а детектирования вируса А гриппа, и окрашивание не возникает. Таким образом, содержит ли образец вирус А гриппа или нет, можно определить по тому, окрашена ли зона 6а детектирования вируса А гриппа или нет. В зоне 10 контроля иммобилизован фермент, который дает окрашивание при реакции с субстратом проявителя. Поэтому, если зона 10 контроля окрашена, это означает, что проявитель дошел до этой зоны. В альтернативном варианте в зоне 10 контроля может быть иммобилизовано антитело к ферментной метке, посредством чего меченый реагент, который доходит до зоны 10 контроля, захватывается этим антителом, и захваченная метка и субстрат, содержащийся в проявителе, взаимодействуют таким образом, что возникает окрашивание, когда туда доходит проявитель (в приведенных далее Примерах иммобилизовано антитело к щелочной фосфатазе). Одновременно можно также провести детектирование вируса В гриппа, вводя меченое антитело к вирусу В гриппа в зону 4 меченого реагента и задав зону 6b детектирования вируса В гриппа, так что в процессе одного анализа можно определить, является ли вирус гриппа вирусом типа А или вирусом типа В.
Матрикс можно ламинировать и закрепить на подложке, изготовленной из пластика, металла, бумаги и др. Посредством фиксации матрикса, в том случае, если он изготовлен из пластика или аналогичного материала, использования емкости, содержащей проявитель, в зоне подачи проявителя, и применения покрытия для матрикса в виде корпуса («чехла»), содержащего сквозные отверстия, соответствующие описанным выше зонам, можно создать удобное в обращении устройство. Образец, который должен быть проанализирован с помощью устройства для иммунологического анализа согласно данному изобретению, представляет собой образец, полученный от человека, животного и пр., который предположительно содержит вирус гриппа. Примеры образцов включают в себя экстракты жидкостей тела, таких, как мазок из носа, аспират из носа, мазок из зева и пр.
Данное изобретение ниже будет описано более подробно с помощью Сравнительных Примеров и Примеров. Однако изобретение не ограничено приведенными Примерами.
Примеры.
Пример 1. Получение моноклонального антитела к вирусу А гриппа
Вакцину против НА гриппа (производства KAKETSUKEN: штамм A/New Caledonia/20/99(H1N1)(IVR-116), штамм A/Panama/2007/99(H3N2)(NIB-41)), содержащую нуклеопротеин антигена вируса гриппа, использовали в качестве иммуногена. После полного перемешивания иммуногена с равным количеством полного адъюванта Фрейнда (производства IATRON), иммуноген вводили Balb/c мышам 4 раза с двухнедельными интервалами. За три дня до слияния клеток иммуноген вводили посредством инъекции в брюшную полость мышей, слияние клеток селезенки мышей и клеток миеломы (P3U1) осуществляли, используя полиэтиленгликоль. В качестве культуральной среды использовали HAT селекционную среду. Примерно две недели спустя собрали культуральный супернатант, который затем подвергли скринингу. При первичном скрининге использовали твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA (ТИФА)), в котором применяли твердую фазу, на которую были иммобилизованы вакцина против НА гриппа, содержащая нуклеопротеин антигена, и рекомбинантные нуклеопротеины антигенов вируса А гриппа (r-NP/H1N1 из A/New Caledonia/20/99), r-NP/H3N2 из А/Kitakyushu/l59/93; база данных DDBJ/GenBank). Если описывать более подробно, вакцину против НА гриппа разбавили в 300 раз 0.1 М карбонатным буфером, рН 9.6, рекомбинантный нуклеопротеин антигена вируса А типа разбавили до концентрации 1 мкг/мл тем же буфером. Соответствующие полученные растворы добавили в лунки микропланшетного модуля (производства NUNC) в количестве 100 мкл/лунку, и инкубировали микропланшет при 4°С в течение ночи для иммобилизации антигенов. После промывания каждой лунки PBS (фосфатно-солевым буферным раствором), содержащим 0.1% Твин 20 (товарный знак) (PBS-Tween), добавили 300 мкл 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS и инкубировали микропланшет при 4°С в течение ночи, проводя, таким образом, блокирование. После удаления блокирующего раствора добавили 100 мкл культурального супернатанта и выдерживали полученную смесь для осуществления взаимодействия в течение часа при 37°С. После тщательного промывания каждой лунки PBS-Tween раствором, в каждую лунку добавили 100 мкл меченного ферментом антитела к мышиному Igs (производства DAKO), разбавленного в 2000 раз реакционной средой (0.05 М фосфатный буфер, рН 7.5, содержащий 0.2% BSA, 0.2% Emulgen 985, 1% сахарозы, 1% КСl), после чего смесь оставили для реакции при 37°С на один час. После реакции каждую лунку тщательно промыли PBS-Tween раствором и в каждую лунку добавили по 100 мкл 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоната) (ABTS). Реакционную смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 30 минут для осуществления реакции, после чего в каждую лунку добавили по 100 мкл стоп-раствора и измерили степень окрашивания при основной длине волны 415 нм и при второй длине волны 490 нм.
Культуральные супернатанты, оцененные как положительные, подвергли вторичному скринингу с помощью ELISA, используя рекомбинантный нуклеопротеин гриппа В (B/Yamanashi/166/98(r-NP/B)DDBJ/GenBank база данных). В результате получили три штамма гибридом (гибридома FVA2-3, гибридома FVA2-6 и гибридома FVA2-11), каждый из которых продуцирует антитело, взаимодействующее с нуклеопротеином антигена вируса А гриппа и не взаимодействующее с нуклеопротеином антигена вируса В гриппа. Эти гибридомы депонировали в Международном Патентном Депозитарии Организмов (International Patent Organism Depositary), как описано выше. Подклассы всех моноклональных антител, полученных от этих трех гибридом, принадлежали к IgG1. Реакционная способность гибридом приведена в таблице 1.
| Таблица 1 Реакционная способность моноклональных антител. |
||||
| Моноклональное антитело | Антиген | |||
| r-NP/H1N1 | r-NP/H3N2 | Вакцина | r-NP/B | |
| FVA2-3 | +++ | +++ | 2.206 | 0.018 |
| FVA2-6 | +++ | +++ | 2.183 | 0.017 |
| FVA2-11 | +++ | +++ | 2.223 | 0.018 |
| +++ - выше предела измерений | ||||
Пример 2. Реакционная способность моноклональных антител согласно белковому блоттингу.
Реакционная способность моноклональных антител была подтверждена с помощью белкового блоттинга с использованием рекомбинантных антигенов, вакцины против НА гриппа (содержащей нуклеопротеин антигена) и раствора вируса. Каждый образец растворили в 0.01 М трис-НСl буфере (рН 8.0), содержащем 0,001 М ЭДТА, 1% SDS, 5% 2МЕ (2-меркаптоэтанол), 10% глицерина и 0.005% ВРВ (бромфеноловый голубой). Каждый из полученных растворов нагрели до 100°С, после чего исследовали с помощью электрофореза. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) проводили стандартным способом, используя e-PAGEL, концентрация геля 10% (производства АТТО). После электрофореза полосы перенесли на PVDF мембрану (производства АТТО), и блокировали с помощью Block Асе (производства DAINIPPON PHARMACEUTICAL) при 4°С в течение ночи. После удаления блокирующего раствора и после промывания мембраны PBS-Tween раствором добавили раствор каждого моноклонального антитела, доведенный до концентрации 10 мкг/мл, и оставили для реакции при комнатной температуре на 45 минут. После тщательного промывания мембраны PBS-Tween добавили меченные ферментом антитела к мышиному IgG (производства CAPPEL), разбавленные в 4000 раз реакционной средой и оставили для реакции при комнатной температуре на 45 минут. После тщательного промывания мембраны PBS-Tween раствором мембрану экспонировали на рентгеновскую пленку (производства KODAK) в течение от 1 до 15 минут, используя для детектирования сигналов систему детектирования для белкового блоттинга ECL Western Blotting Detection System (производства AMERSHAM BIOSCIENCES).
Моноклональные антитела FVA2-3, FVA2-6 и FVA2-11 дали полосы в районе примерно от 55 кДа до 70 кДа ко всем антигенам. Результаты приведены на Фиг.1.
Пример 3. Измерение антигена с помощью ELISA с использованием моноклонального антитела.
Раствор каждого из трех типов очищенных моноклональных антител в 0.1 М фосфатном буфере, рН 7.5, имеющий концентрацию 2 мкг/мл, добавили в лунки микропланшетного модуля (производства NUNC) в количестве 100 мкл на лунку и инкубировали микропланшет при 4°С в течение ночи, чтобы иммобилизовать антитело. Затем каждую лунку промыли PBS, содержащим 0.1% твин 20 (Tween 20, товарный знак) (PBS-Tween), туда же добавили по 300 мкл 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS и проводили блокирование при 4°С в течение ночи. Раствор вируса А гриппа, растворенного в реакционной среде, добавили в каждую лунку в количестве 100 мкл на лунку и оставили для реакции при 37°С на один час. После тщательного промывания каждой лунки PBS-Tween раствором, в них добавили каждое из меченных щелочной фосфатазой моноклональных антител, растворенных в реакционной среде, в количестве 100 мкл/лунку и оставили для реакции при 37°С на один час. После реакции каждую лунку тщательно промыли PBS-Tween раствором и добавили в каждую лунку по 100 мкл 4-нитрофенилфосфата (4-NPP). После реакции при комнатной температуре в течение 30 минут добавили стоп-раствор в количестве 100 мкл/лунку. Измерили уровень окрашивания при основной длине волны 415 нм и при второй длине волны 490 нм. Те образцы, для которых уровень окрашивания превосходил контрольный (на буфере) не менее, чем в 2.1 раза, считали положительными, и реакционную способность выражали в терминах окончательного разведения, при котором образец все еще считался положительным.
Все из 9 комбинаций, полученных с тремя типами моноклональных антител, обладали реакционной способностью, в 2-8 раз превосходящей реакционную способность коммерческих моноклональных антител к вирусу А гриппа. Результаты приведены в Таблице 2.
| Таблица 2 ELISA для измерения антигенов. |
|||||
| Моноклональное антитело | АНТИГЕН | ||||
| Антитело, меченое ферментом | Иммобилизованное антитело | А /Sydney /5/97 | A/Beijin /352/89 | A/New Caledonia /20/99 | А /Panama /2007/99 |
| FVA2-3 | FVA2-3 | Х640 | х80 | х320 | Х640 |
| FVA2-6 | х640 | х160 | х320 | Х640 | |
| FVA2-11 | Х640 | х160 | х320 | х640 | |
| FVA2-6 | FVA2-3 | х640 | х80 | х320 | х640 |
| FVA2-6 | х640 | х160 | х320 | х640 | |
| FVA2-11 | Х640 | х80 | х320 | Х640 | |
| FVA2-11 | FVA2-3 | х640 | х80 | х320 | х640 |
| FVA2-6 | х640 | х160 | х320 | х640 | |
| FVA2-11 | Х640 | х160 | х320 | Х640 | |
| Коммерческое антитело* | Коммерческое антитело* | х320 | х40 | х80 | х80 |
| * Коммерчески доступное моноклональное антитело | |||||
Пример 4. Определение сайта узнавания с помощью моноклонального антитела к вирусу А гриппа
4-1. Конструирование плазмид.
Для определения сайта узнавания с помощью моноклонального антитела FVA2-11, посредством ПЦР были амплифицированы три фрагмента гена гриппа штамма H1N1 (New Caledonia/20/99), кодирующего 498 аминокислот, а именно фрагменты, кодирующие с первой по 159-ю аминокислоты (А фрагмент), со 162 по 327 аминокислоты (В фрагмент) и с 327 по 498 аминокислоты соответственно. Праймеры предварительно имели сайты EcoRI и BamHI. Амплифицированные фрагменты были очищены с помощью набора для очистки ПЦР (PCR Purification Kit) производства QIAGEN, и каждый фрагмент был внедрен в сайт EcoRI-ВатHI экспрессионной плазмиды pWG6A, полученной путем введения GST в NdeI-EcoRI сайт экспрессионной плазмиды pW6A, показанной на Фиг.2, для получения плазмид pWGInf.H1N1-А, pWGInf.H1N1-B и pWGInf.H1N1-C. E.coli BL21(DE3) (полученный из Национальной Лаборатории Брукхейвена, Brookhaven National Laboratory) трансформировали каждой плазмидой для получения ампициллин-резистентных трансформантов E.coli BL21(DE3)pWGInf.H1N1-A, BL21(DE3)pWGInf.H1N1-B и BL21(DE3)pWGInf.H1N1-C.
4-2. Экспрессия рекомбинантных белков (GST+H1N1-A, GST+H1N1-B и GST+H1N1-C)
Каждый из трансформантов, полученных согласно 4-1, культурировали в 2 мл LB среды, содержащей 50 мкг/мл ампициллина при 37°С. После доведения оптической плотности (OD) исходной культуры при 600 нм до величины от 0.6 до 0.8, для индуцирования экспрессии добавили 0.4 мМ IPTG и культурировали трансформанты еще в течение трех часов. Бактериальную культуральную среду в количестве 1.5 мл центрифугировали при 5000 об/мин в течение 2 минут, чтобы собрать клетки, которые затем суспендировали в 100 мкл буфера (10 мМ трис-HCl, рН 8.0, содержащий 0.1 М хлорид натрия и 1 мМ ЭДТА), после чего обрабатывали ультразвуком в течение 15 минут для полного разрушения клеток и использовали в качестве бактериального образца.
К 8 мкл бактериального образца добавили 4 мкл SDS-полиакриламидного буфера, имеющего в три раза большую концентрацию (0.15 М трис-HCl, рН 6.8, 6% SDS (додецилсульфата натрия), 24% глицерина, 6 мМ ЭДТА, 2% 2-меркаптоэтанола, 0.03% бромфенолового голубого), смесь хорошо перемешали, после чего подвергли электрофорезу в полиакриламидном геле в присутствии SDS. Полосы перенесли на нитроцеллюлозный фильтр с помощью белкового блоттинга, и, после блокирования 1% BSA, дали возможность прореагировать с моноклональным антителом FVA2-11, разбавленным в 1000 раз фосфатным буфером (10 мМ фосфат, рН 7.4, 0.15 М хлорид натрия). Затем дали возможность прореагировать с кроличьими антимышиными поликлональными антителами к иммуноглобулину (производства DAKO), меченными пероксидазой. Затем после промывания добавили 10 мл раствора субстрата (0.01% водный раствор пероксида водорода, 0.6 мг/мл 4-хлор-1-нафтола), который при расщеплении дал окрашивание раствора. В результате было доказано, что моноклональное антитело FVA2-11 взаимодействует только с GST+H1N1-A.
4-3. Конструирование плазмид.
Фрагменты, полученные последующим делением А фрагмента, а именно, А1 (с 1 по 90 аминокислоту), А2 (с 85 по 159 аминокислоту), A3 (с 44 по 130 аминокислоту), А4 (с 59 по 103 аминокислоту), А5 (с 44 по 103 аминокислоту), А6 (с 59 по 130 аминокислоту) и А7 (с 1 по 130 аминокислоту) (Фиг.3), были амплифицированы с помощью ПЦР. Каждый из амплифицированных фрагментов был очищен с помощью набора для очистки ПЦР (PCR Purification Kit) производства QIAGEN и был внедрен в сайт EcoRI-ВаmHI описанной выше экспрессионной плазмиды pWG6A для получения плазмид pWGInf.H1N1-A1, pWGInf.H1N1-A2, pWGInf.H1N1-А3, pWGInf.H1N1-A4, pWGInf.H1N1-A5 и pWGInf.H1N1-А6. А7 фрагмент внедрили в сайт EcoRI-BamED pW6A, показанный на Фиг.2, для получения плазмиды pWInf.H1N1-A7. E.coli BL21(DE3) (полученный из Национальной Лаборатории Брукхейвена) трансформировали каждой плазмидой для получения ампициллин-резистентных трансформантов E.coli BL21(DE3)pWGInf.H1N1-A1, BL21(DE3)pWGInf.H1N1-A2, BL21(DE3)pWGInf.H1N1-A3, BL21(DE3)pWGInf.H1N1-A4, BL21(DE3)pWGInf.H1N1-A5, BL21(DE3)pWGInf.H1N1-A6 и BL21(DE3)pWInf.H1N1-A7.
4-4. Экспрессия рекомбинантных белков (GST+H1N1-A1, GST+H1N1-A2, GST+H1N1-A3, GST+H1N1-A4, GST+H1N1-A5, GST+H1N1-A6 и H1N1-А7)
Каждый из трансформантов, полученных, как описано в разделе 4-3, культурировали в 2 мл LB среды, содержащей 50 мкг/мл ампициллина при 37°С. После доведения оптической плотности (OD) исходной культуры при 600 нм до величины от 0.6 до 0.8, для индуцирования экспрессии добавили 0.4 мМ IPTG и культурировали трансформанты еще в течение трех часов. Бактериальную культуральную среду в количестве 1.5 мл центрифугировали при 5000 об/мин в течение 2 минут, чтобы собрать клетки, которые затем суспендировали в 100 мкл буфера (10 мМ трис-HCl, рН 8.0, содержащий 0,1 М хлорид натрия и 1 мМ ЭДТА), после чего обрабатывали ультразвуком в течение 15 минут для полного разрушения клеток и использовали в качестве бактериального образца.
К 8 мкл бактериального образца добавили 4 мкл SDS-полиакриламидного буфера, имеющего в три раза большую концентрацию (0.15 М трис-HCl, рН 6.8, 6% SDS, 24% глицерина, 6 мМ ЭДТА, 2% 2-меркаптоэтанола, 0.03% бромфенолового голубого, маркеры молекулярных масс (117.6, 113.9, 81.2, 60.7, 47.4, 36.1, 25,3, 19.0, 14.7.6.1 кДа)), смесь хорошо перемешали, после чего подвергли электрофорезу в полиакриламидном геле в присутствии SDS. Полосы перенесли на нитроцеллюлозный фильтр с помощью белкового блоттинга, и после блокирования 1% BSA дали возможность прореагировать с моноклональным антителом FVA2-11, разбавленным в 1000 раз фосфатным буфером (10 мМ фосфат, рН 7.4, 0.15 М хлорид натрия). Затем дали возможность прореагировать с кроличьими антимышиными поликлональными антителами к иммуноглобулину (производства DAKO), меченными пероксидазой. Затем после промывания добавили 10 мл раствора субстрата (0.01% водный раствор пероксида водорода, 0.6 мг/мл 4-хлор-1-нафтола), который при расщеплении дал окрашивание раствора. Каждый фрагмент показан на Фиг.3. Картина окрашивания кумасси после проведения электрофореза и результаты белкового блоттинга приведены на Фиг.4. По этим результатам можно заключить, что сайт узнавания моноклонального антитела к вирусу А гриппа (FVA2-11) находится в области между 59 и 130 аминокислотами H1N1 гриппа. Как видно из аминокислотных последовательностей нуклеопротеинов подтипов вируса А гриппа, приведенных на Фиг.5, эпитопом, похоже, является обычная последовательность в сайте реакции между 59 и 130 аминокислотами, имеющая гидрофильную структуру, т.е., например, аминокислотные последовательности с 90 по 95 аминокислоту, со 111 по 115 аминокислоту, со 120 по 123 аминокислоту или др..
Сравнительный Пример 1.
Получение моноклонального антитела к вирусу А гриппа, меченного щелочной фосфатазой.
Моноклональное антитело к вирусу А гриппа (FVA2-11) обработали пепсином для удаления Fc участка, с тем, чтобы получить F(аb')2, дисульфидную связь расщепили 2МЕ (2-меркаптоэтанолом производства NACALAI TESQUE) для получения F(аb')2 с открытыми тиольными группами. Затем щелочную фосфатазу, в которую была введена малеимидная группа, соединили с F(ab')2, полученный продукт очистили с помощью гель-проникающей хроматографии для получения очищенного антитела к вирусу А гриппа, меченного щелочной фосфатазой.
Сравнительный Пример 2.
Получение моноклонального антитела к вирусу В гриппа.
Вакцину против НА гриппа (штамм B/Yamanashi/166/98), содержащую нуклеопротеин антигена гриппа, или рекомбинантный нуклеопротеин антигена гриппа A (r-NP/H1N1 из A/New Caledonia/20/99 штамма или 1--NP/H3N2 из A/Kitakyushu/159/93) использовали в качестве иммуногена.
После полного перемешивания иммуногена с равным количеством полного адъюванта Фрейнда (производства IATRON) иммуноген вводили Ваlb/с мышам 4 раза с двухнедельными интервалами. За три дня до слияния клеток иммуноген ввели посредством инъекции в брюшную полость мышей, слияние клеток селезенки мышей и клеток миеломы (P3U1) осуществляли, используя полиэтиленгликоль. В качестве культуральной среды использовали HAT селекционную среду. Примерно две недели спустя собрали культуральный супернатант, который затем подвергли скринингу. При первичном скрининге использовали твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), при котором применяли твердую фазу, на которую были иммобилизованы вакцина против НА гриппа и рекомбинантный нуклеопротеин антигена вируса В гриппа (r-NP/B), Если описывать более подробно, вакцину против НА гриппа разбавили в 300 раз 0.1 М карбонатным буфером, рН 9.6, рекомбинантный нуклеопротеин антигена вируса В типа разбавили до концентрации 1 мкг/мл тем же буфером. Соответствующие полученные растворы добавили в лунки микропланшетного модуля (производства NUNC) в количестве 100 мкл/лунку, и инкубировали микропланшет при 4°С в течение ночи для иммобилизации антигенов. После промывания каждой лунки PBS (фосфатно-солевым буферным раствором), содержащим 0.1% Твин 20 (Tween 20) (товарный знак) (PBS-Tween), добавили 300 мкл 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS и инкубировали микропланшет при 4°С в течение ночи, проводя, таким образом, блокирование. После удаления блокирующего раствора добавили 100 мкл культурального супернатанта и полученную смесь выдерживали для осуществления взаимодействия в течение часа при 37°С. После тщательного промывания каждой лунки PBS-Tween раствором, в каждую лунку добавили 100 мкл меченного ферментом антитела к мышиному Igs (производства DAKO), разбавленного в 2000 раз реакционной средой (0.05 М фосфатный буфер, рН 7.5, содержащий 0.2% BSA, 0.2% Emulgen 985, 1% сахарозы, 1% КСl), после чего смесь оставили для реакции при 37°С на один час. После проведения реакции каждую лунку тщательно промыли PBS-Tween раствором и в каждую лунку добавили по 100 мкл 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоната) (ABTS). Реакционную смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 30 минут для осуществления реакции, после чего в каждую лунку добавили по 100 мкл стопраствора и измерили уровень окрашивания при основной длине волны 415 нм и при второй длине волны 490 нм.
Культуральные супернатанты, оцененные как положительные, подвергли вторичному скринингу с помощью ELISA, используя рекомбинантный нуклеопротеин вируса гриппа A (r-NP/H1N1 из A/New Caledonia/20/99, и r-NP/H3N2 из A/Kitakyushu/159/93). В результате получили три штамма гибридом (гибридома FrB1-03, гибридома FrB1-07 и гибридома FVB2-16), каждый из которых продуцирует антитело, взаимодействующее с нуклеопротеином антигена вируса В гриппа и не взаимодействующее с нуклеопротеином антигена вируса А гриппа. Эти гибридомы депонировали в Международный Патентный Депозитарий Организмов (International Patent Organism Depositary) и Национальный Институт Развития Прикладной Науки и Технологий (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology). Гибридома FrBl-03 была депонирована под инвентарным номером FERM ВР-10070, гибридома FrBl-07 - под инвентарным номером FERM BP-10071 и гибридома FVB2-16 - под инвентарным номером FERM BP-10069. Подклассы всех моноклональных антител, полученных от этих трех 3 гибридом, принадлежали к IgG1.
Реакционная способность моноклональных антител согласно белковому блоттингу.
Реакционная способность моноклональных антител была подтверждена с помощью белкового блоттинга с использованием рекомбинантных антигенов и вакцины против НА гриппа (содержащей нуклеопротеин антигена). Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) проводили стандартным способом, используя e-PAGEL, концентрация геля 10% (производства АТТО). После электрофореза полосы перенесли на PVDF мембрану (производства АТТО), и блокировали с помощью Block Асе (производства DAINIPPON PHARMACEUTICAL) при 4°С в течение ночи. После удаления блокирующего раствора и после промывания мембраны PBS-Tween раствором добавили раствор каждого моноклонального антитела, доведенный до концентрации 10 мкг/мл, и оставили для реакции при комнатной температуре на 45 минут. После тщательного промывания мембраны PBS-Tween добавили меченные ферментом антитела к мышиному IgG (производства CAPPEL), разбавленные в 4000 раз реакционной средой и оставили для реакции при комнатной температуре на 45 минут. После тщательного промывания мембраны PBS-Tween мембрану экспонировали на рентгеновскую пленку (производства KODAK) в течение 1 минуты, используя для детектирования сигналов систему детектирования для белкового блоттинга ECL Western Blotting Detection System (производства AMERSHAM BIOSCIENCES).
С моноклональными антителами FrBl-03 и FrBl-07 сильная полоса наблюдалась в районе примерно от 60 кДа до 75 кДа,
Сравнительный Пример 3. Получение антитела к вирусу В гриппа, меченного щелочной фосфатазой.
Повторяя действия, описанные выше в Сравнительном Примере 1, получили меченное щелочной фосфатазой моноклональное антитело к вирусу В гриппа, используя при этом моноклональное антитело к вирусу В гриппа (FrB1-03), полученное согласно Сравнительному Примеру 2.
Пример 5. Устройство для одновременного иммунологического анализа вируса А гриппа и вируса В гриппа.
Как показано на Фиг.6, на участки, расположенные на расстоянии 16 мм и 13.5 мм от того конца матрикса 2 (изготовленного из нитроцеллюлозной мембраны, производства MELLEPORE), где расположена зона 5 поглощения проявителя, нанесли, соответственно, 0.7 мкл водного раствора антитела к вирусу А гриппа (FVA2-11), полученного согласно Примеру 2, и 0.7 мкл водного раствора антитела к вирусу В гриппа (FrB1-3), полученного согласно Сравнительному Примеру 2, и высушили с получением зон 6а и 6b детектирования. На участок, расположенный на расстоянии 11 мм от конца матрикса 2 со стороны зоны 5 поглощения проявителя, нанесли антитело к щелочной фосфатазе (производства DAKO) и высушили с получением зоны 10 контроля. Затем на матрикс нанесли 5 мкл смешанного водного раствора, содержащего меченное щелочной фосфатазой антитело к вирусу А гриппа (5 мкг/мл), полученное согласно Сравнительному Примеру 1, и меченное щелочной фосфатазой антитело к вирусу В гриппа (5 мкг/мл), полученное согласно Сравнительному Примеру 3, и высушили с получением зоны меченого реагента, представляющей собой подложку 4 для меченного ферментом реагента.
Подложку 3 для проявителя получили путем нанесения (в форме линии шириной 6.1 мм) 100 мкг 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфата (BCIP) в качестве субстрата на фильтровальную бумагу шириной 5 мм и длиной 20 мм (производства MELLEPORE), и высушивания субстрата. Описанный выше матрикс 2, подложку 3 для проявителя, подложку 4 для меченного ферментом реагента и подложку 5 для поглощения проявителя (фильтровальная бумага производства MELLIPORE шириной 10 мм, длиной 20 мм и толщиной 1 мм) закрепили в пластиковом корпусе, снабженном емкостью 11 для проявителя, получив, таким образом, показанное на Фиг.7 и 8 устройство 1 для иммунологического анализа, предназначенное для одновременного анализа вируса А гриппа и вируса В гриппа.
Сравнительный Пример 4. Устройство для одновременного иммунологического анализа вируса А гриппа и вируса В гриппа (традиционное устройство).
Действуя так же, как и в Примере 3, изготовили такое же устройство 1 для иммунологического анализа, предназначенное для одновременного анализа вируса А гриппа и вируса В гриппа, как и описанное ранее в Примере 3, за исключением того, что зоны 6а и 6b детектирования задали, используя, соответственно, приобретенное (коммерческое) моноклинальное антитело к вирусу А гриппа и коммерческое моноклональное антитело к вирусу В гриппа. Получили устройство для иммунологического анализа, предназначенное для одновременного анализа вируса А гриппа и вируса В гриппа (ESPLINE Influenza A&B (производства FUJIREBIO); традиционное устройство для иммунологического анализа).
Пример 6. Анализ вируса А гриппа и вируса В гриппа.
В зону 8 нанесения образца устройства 1 для иммунологического анализа, предназначенного для одновременного анализа вируса А гриппа и вируса В гриппа (устройство для анализа по данному изобретению), изготовленного, как описано в Примере 5, нанесли 30 мкл образца подтипа вируса А гриппа, приведенного в Таблице 3 (в качестве разбавителя использовали трис буфер, рН 8.0, содержащий поверхностно-активное вещество), после чего надавили на зону запуска 12 деформируемого элемента для его деформации таким образом, чтобы погрузить подложку 3 проявителя в емкость 11 для проявителя с выступом 3 на деформируемом элементе, и, таким образом, начали проведение анализа. Через пятнадцать минут после начала проведения анализа окрашивание зоны 10 контроля подтвердило, что проявитель достиг этой зоны. После этого визуально наблюдали окрашивание зон 6а и 6b детектирования. Результаты приведены в Таблице 3.
В качестве контроля 30 мкл каждого из описанных выше образцов, приведенных в Таблице 3, проанализировали, используя традиционное устройство, изготовленное, как описано в Сравнительном Примере 4. Результаты анализов приведены в Таблице 3.
| Таблица 3 Результаты анализа подтипов вируса А гриппа |
|||||
| Штамм | Подтип | Традиционное устройство для анализа | Устройство для анализа по данному изобретению | ||
| Окрашивание | |||||
| 6а | 6b | 6а | 6b | ||
| A/Puerto Rico/8/34 | H1N1 | + | - | + | - |
| A/Singapore/1/57 | H2N2 | + | - | + | - |
| A/Aichi/2/68 | H3N2 | + | - | + | - |
| A/equine/Miami/1/63 | H3N8 | + | - | + | - |
| A/equine/Tokyo/2/71 | H3N8 | + | - | + | - |
| A/equine/Kentucky/1/81 | H3N8 | - | - | + | - |
| A/equine/Suffork/89 | H3N8 | + | - | + | - |
| A/equine/Alaska/1/91 | H3N8 | + | - | + | - |
| A/equine/Kentucky/1/91 | H3N8 | - | + | - | |
| A/equine/Rome/5/91 | H3N8 | - | - | + | - |
| A/equine/Taby/91 | H3N8 | - | - | + | - |
| A/equine/Lambourn/22778/92 | H3N8 | - | + | - | |
| A/equine/Hong Kong/92 | H3N8 | - | - | + | - |
| A/equine/Avesta/1/93 | H3N8 | - | - | + | - |
| A/equine/La Plata/1/93 | H3N8 | + | - | + | - |
| A/equine/Kentucky/1/94 | H3N8 | - | - | + | - |
| A/equine/La Plata/1/95 | H3N8 | + | - | + | - |
| A/equine/La Plata/1/96 | H3N8 | + | - | + | - |
| A/duck/Czech/56 | H4N6 | - | - | + | - |
| A/duck/Pennsylvania/10128/83 | H5N2 | + | - | + | - |
| A/turkey/Massachusetts/3740/65 | H6N2 | + | - | + | - |
| A/seal/Massachusetts/1/80 | H7N7 | + | - | + | - |
| A/equine/Prague/1/56 | H7N7 | - | - | + | - |
| A/equine/Newmarket/1/77 | H7N7 | - | - | + | - |
| A/turkey/Ontario/67 | H8N4 | - | - | + | - |
| A/turkey/Wisconsin/66 | H9N2 | - | - | + | - |
| A/chicken/Germany/N/49 | Н10N7 | - | - | + | - |
| A/duck/England/56 | Н11N6 | - | - | + | - |
| A/duck/Alberta/60/76 | H12N5 | - | - | + | - |
| A/gull/Maryland/704/77 | H13N6 | - | - | + | - |
| A/mallard/Astrakhan/263/82 | H14N5 | + | - | + | - |
| A/duck/Australia/341/83 | H15N8 | + | - | + | - |
| A/Hokkaido/11/02 | H1N1 | + | - | + | - |
| A/Hokkaido/1/03* | H3N2 | + | - | + | - |
| A/swine/Miyagi/5/03 | H1N2 | + | - | + | - |
| A/HongKong/483/97 | H5N1 | - | - | + | - |
| A/HongKong/156/97 | H5N1 | - | - | + | - |
| A/HongKong/reverse genetics-911 | H5N1 | + | - | + | - |
| Контроль | - | - | - | - | |
| * Результаты исследования MDCK культурального супернатанта, так как вирусы не были адаптированы к куриным яйцам. | |||||
Как видно из приведенных результатов, все подтипы вируса А гриппа, которые невозможно определить с помощью традиционного устройства для анализа, оказалось возможным определить с помощью устройства по данному изобретению.
Пример 7
Используя устройство 1 для анализа, предназначенное для одновременного определения (исследования) вируса А гриппа и вируса В гриппа (устройство для анализа по данному изобретению), изготовленное, как описано в Примере 5, аналогично тому, как это описано в Примере 6, проверили перекрестную реактивность с аденовирусом (типы с 1 по 7), коксаки-вирусом (типы А16 и В1 - В6), вирусом простого герпеса 1, эховирусом (типы 3, 4, 7, 22 и 30), энтеровирусом (тип 71), вирусом свинки, полиовирусом (типы с 1 по 3), RS вирусом (подгруппы А и В), вирусом парагриппа (типы с 1 по 3), Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Staphylococcus epidermidis, миксомицетами, Staphylococcus aureus, коринебактериями, Corynebacterium diphtheriae, Candida albicans, Streptococcus pyogenes, Streptococcus sp. (группы В, С, G и F), Streptococcus pneumoniae, Hemophilus influenzae, Listeria monocytogenes, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia trachomatis и Chlamydia pneumoniae. He было обнаружено взаимодействие ни с одним из этих вирусов и бактерий.
Claims (5)
1. Моноклональное антитело к вирусу А гриппа или его антигенсвязывающий фрагмент, которое вступает в реакцию антиген-антитело с нуклеопротеином вируса А гриппа, имеющим молекулярную массу от 55 до 70 кДа, при этом моноклональное антитело к вирусу А гриппа или его антигенсвязывающий фрагмент взаимодействует с эпитопом, имеющимся на участке между 59-й и 130-й аминокислотами нуклеопротеина вируса А гриппа.
2. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, отличающееся тем, что оно вступает в реакцию антиген-антитело с каждым из подтипов вируса А гриппа.
3. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, отличающееся тем, что оно получено с помощью гибридомы FVA2-3, депонированной под инвентарным номером FERM ВР-10066, гибридомы FVA2-6, депонированной под инвентарным номером FERM ВР-10067, или гибридомы FVA2-11, депонированной под инвентарным номером FERM ВР-10068, которые были депонированы в Международном Депозитарии в соответствии с Будапештским Соглашением.
4. Устройство для иммунологического анализа на выявление вируса гриппа А, содержащее зону меченого реагента, содержащую меченое мобильное антитело к вирусу А гриппа, зону нанесения образца, зону подачи проявителя, зону поглощения проявителя и зону детектирования вируса А гриппа, в которой антитело к вирусу А гриппа иммобилизовано на матриксе, причем зоны заданы на матриксе, и, по крайней мере, одно из следующих - меченое антитело к вирусу А гриппа и антитело к вирусу А гриппа, иммобилизованное в зоне детектирования, - является моноклональным антителом по любому из пп.1-3.
5. Устройство для иммунологического анализа по п.4, отличающееся тем, что меткой является фермент, и устройство содержит субстрат для этого фермента в составе проявителя и/или вблизи от зоны подачи проявителя.
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003-278527 | 2003-07-23 | ||
| JP2003278527 | 2003-07-23 | ||
| JP2003-364316 | 2003-10-24 | ||
| JP2003364316 | 2003-10-24 | ||
| JP2004-109763 | 2004-04-02 | ||
| JP2004109763 | 2004-04-02 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2006103301A RU2006103301A (ru) | 2007-09-10 |
| RU2366662C2 true RU2366662C2 (ru) | 2009-09-10 |
Family
ID=34084275
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2006103301/13A RU2366662C2 (ru) | 2003-07-23 | 2004-07-23 | Моноклональное антитело к вирусу типа а гриппа и устройство для иммунного анализа с использованием антитела |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4595810B2 (ru) |
| KR (1) | KR101133910B1 (ru) |
| CN (1) | CN1934133B (ru) |
| HK (1) | HK1105005A1 (ru) |
| RU (1) | RU2366662C2 (ru) |
| WO (1) | WO2005007697A1 (ru) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2457243C1 (ru) * | 2011-01-11 | 2012-07-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации | ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК МЫШИ Mus. Musculus - 1E7, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО, ИММУНОРЕАКТИВНОЕ С БЕЛКОМ ГЕМАГГЛЮТИНИНА ПАНДЕМИЧЕСКОГО ВИРУСА ГРИППА А/IIV-Moscow/01/09(H1N1)sw1 |
| RU2635999C2 (ru) * | 2010-06-17 | 2017-11-17 | ТРЕЛЛИС БАЙОСАЙЕНС, ЭлЭлСи | Антитела, подходящие для пассивной иммунизации против гриппа |
| RU2668802C2 (ru) * | 2011-12-05 | 2018-10-02 | ТРЕЛЛИС БАЙОСАЙЕНС, ЭлЭлСи | Антитела, используемые для пассивной вакцинации против гриппа |
| RU2683498C2 (ru) * | 2013-10-02 | 2019-03-28 | МЕДИММЬЮН, ЭлЭлСи | Нейтрализующие антитела к вирусу гриппа а и пути их применения |
| US11524993B2 (en) | 2015-06-01 | 2022-12-13 | Medimmune, Llc | Neutralizing anti-influenza binding molecules and uses thereof |
| RU2803850C2 (ru) * | 2013-10-02 | 2023-09-21 | МЕДИММЬЮН, ЭлЭлСи | Нейтрализующие антитела к вирусу гриппа а и пути их применения |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007021002A1 (ja) * | 2005-08-19 | 2007-02-22 | Bl Co., Ltd. | インフルエンザウイルスｈ５亜型の免疫検出法 |
| WO2007053487A2 (en) * | 2005-10-28 | 2007-05-10 | Binax, Inc. | Methods and devices for detection of the strain of a pathogen |
| WO2007074812A1 (ja) * | 2005-12-26 | 2007-07-05 | Bl Co., Ltd. | Ａ型インフルエンザウイルスｈ５亜型の検出法 |
| WO2007074811A1 (ja) | 2005-12-26 | 2007-07-05 | Bl Co., Ltd. | Ａ型インフルエンザウイルス強毒株の検出法 |
| JP4936428B2 (ja) * | 2006-03-28 | 2012-05-23 | 大阪府 | Ｈ５亜型インフルエンザウイルスの特異的検出 |
| JP5300200B2 (ja) * | 2006-08-31 | 2013-09-25 | 大阪府 | トリインフルエンザウイルスに特異的な迅速診断法 |
| EP1972938B1 (de) * | 2007-03-19 | 2014-05-14 | Ivoclar Vivadent | Teststreifen für die Bestimmung des Kariesrisikos |
| EP2309264A4 (en) | 2008-06-06 | 2011-11-23 | Univ Toyama Nat Univ Corp | FLU VIRUS DETECTION DEVICE |
| JP5509198B2 (ja) | 2009-04-09 | 2014-06-04 | アークレイ株式会社 | 分析方法、検体液の逆流防止方法およびバックグラウンド上昇の防止方法 |
| JP2010261912A (ja) * | 2009-05-11 | 2010-11-18 | Bl:Kk | ヒトインフルエンザウイルスｈ３亜型の免疫学的検出法 |
| JP5490669B2 (ja) * | 2010-11-26 | 2014-05-14 | 独立行政法人国立国際医療研究センター | 免疫検査試薬、それを用いる検査装置及び検査方法 |
| CN102747040B (zh) * | 2011-04-21 | 2015-07-01 | 菲鹏生物股份有限公司 | 一种抗甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体及其制备与应用 |
| TW201346040A (zh) | 2012-03-30 | 2013-11-16 | Tanaka Precious Metal Ind | 流行性感冒ａ型病毒檢驗用套組 |
| CN103901202B (zh) * | 2014-04-04 | 2015-08-12 | 中国人民解放军成都军区疾病预防控制中心 | 基于共有表位甲型流感病毒抗体通用型竞争性elisa检测方法 |
| US10294292B2 (en) | 2014-07-15 | 2019-05-21 | Medimmune, Llc | Neutralizing anti-influenza B antibodies and uses thereof |
| SG11201805001UA (en) | 2016-01-13 | 2018-07-30 | Medimmune Llc | Method of treating influenza a |
| JP7065338B2 (ja) * | 2017-09-12 | 2022-05-12 | パナソニックＩｐマネジメント株式会社 | インフルエンザウイルス核内蛋白質に結合する抗体、複合体、それを用いた検出装置及び検出方法 |
| EP3802591A4 (en) * | 2018-06-11 | 2022-02-16 | GlaxoSmithKline Consumer Healthcare Holdings (US) LLC | ANTIBODY PAIRS FOR USE IN A RAPID DIAGNOSTIC TEST FOR INFLUENZA B |
| CN116693675B (zh) * | 2023-07-31 | 2023-10-20 | 南京佰抗生物科技有限公司 | 抗甲型流感病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体组合物及应用 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05149951A (ja) * | 1991-05-02 | 1993-06-15 | Fujirebio Inc | 簡易免疫測定用試験片及びそれを用いた測定方法 |
| JP3061960B2 (ja) * | 1992-09-17 | 2000-07-10 | 寳酒造株式会社 | 抗ヒトインフルエンザウイルス抗体 |
| JP3584990B2 (ja) * | 1994-05-09 | 2004-11-04 | タカラバイオ株式会社 | 抗ヒトインフルエンザウイルス抗体 |
| ES2169185T3 (es) * | 1995-09-08 | 2002-07-01 | Fujirebio Kk | Dispositivo de inmunoanalisis y metodo de inmunoanalisis empleando dicho dispositivo. |
| JP3831759B2 (ja) * | 1995-12-20 | 2006-10-11 | 富士レビオ株式会社 | 抗梅毒トレポネーマ抗体の免疫分析方法及び免疫分析装置 |
| JP3334558B2 (ja) * | 1997-04-23 | 2002-10-15 | 富士レビオ株式会社 | 酵素免疫測定方法及び試験片 |
| JP3511872B2 (ja) * | 1997-11-21 | 2004-03-29 | 富士レビオ株式会社 | 免疫測定用試験片及び該試験片を用いる測定法 |
| JP3539277B2 (ja) * | 1999-05-21 | 2004-07-07 | 富士レビオ株式会社 | 酵素免疫測定装置及び該装置を用いる測定法 |
| EP1081496A1 (en) * | 1999-08-31 | 2001-03-07 | Becton, Dickinson and Company | Flow-through assay for visually detecting the presence of influenza A and B |
-
2004
- 2004-07-23 WO PCT/JP2004/010475 patent/WO2005007697A1/ja active Application Filing
- 2004-07-23 CN CN2004800211740A patent/CN1934133B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2004-07-23 JP JP2005511913A patent/JP4595810B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2004-07-23 KR KR1020067001430A patent/KR101133910B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2004-07-23 RU RU2006103301/13A patent/RU2366662C2/ru not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-09-20 HK HK07110243.7A patent/HK1105005A1/xx not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| WALLS H.H. et al. Characterization and evaluation of monoclonal antibodies developed for typing influenza A and influenza В viruses. J Clin Microbiol. 1986 Feb; 23(2):240-5. TKACOVA M. et al. A sensitive one-step immunocapture EIA for rapid diagnosis of influenza A.J Virol Methods. 1996 Jun; 60(1):65-71. * |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2635999C2 (ru) * | 2010-06-17 | 2017-11-17 | ТРЕЛЛИС БАЙОСАЙЕНС, ЭлЭлСи | Антитела, подходящие для пассивной иммунизации против гриппа |
| RU2457243C1 (ru) * | 2011-01-11 | 2012-07-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации | ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК МЫШИ Mus. Musculus - 1E7, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО, ИММУНОРЕАКТИВНОЕ С БЕЛКОМ ГЕМАГГЛЮТИНИНА ПАНДЕМИЧЕСКОГО ВИРУСА ГРИППА А/IIV-Moscow/01/09(H1N1)sw1 |
| RU2668802C2 (ru) * | 2011-12-05 | 2018-10-02 | ТРЕЛЛИС БАЙОСАЙЕНС, ЭлЭлСи | Антитела, используемые для пассивной вакцинации против гриппа |
| RU2683498C2 (ru) * | 2013-10-02 | 2019-03-28 | МЕДИММЬЮН, ЭлЭлСи | Нейтрализующие антитела к вирусу гриппа а и пути их применения |
| US11186627B2 (en) | 2013-10-02 | 2021-11-30 | Medimmune, Llc | Neutralizing anti-influenza A antibodies and uses thereof |
| RU2803850C2 (ru) * | 2013-10-02 | 2023-09-21 | МЕДИММЬЮН, ЭлЭлСи | Нейтрализующие антитела к вирусу гриппа а и пути их применения |
| US11932682B2 (en) | 2013-10-02 | 2024-03-19 | Medimmune, Llc | Neutralizing anti-influenza A antibodies and uses thereof |
| US11524993B2 (en) | 2015-06-01 | 2022-12-13 | Medimmune, Llc | Neutralizing anti-influenza binding molecules and uses thereof |
| US11926657B2 (en) | 2015-06-01 | 2024-03-12 | Medimmune, Llc | Neutralizing anti-influenza binding molecules and uses thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1934133A (zh) | 2007-03-21 |
| WO2005007697A1 (ja) | 2005-01-27 |
| CN1934133B (zh) | 2011-12-14 |
| KR101133910B1 (ko) | 2012-04-13 |
| JP4595810B2 (ja) | 2010-12-08 |
| RU2006103301A (ru) | 2007-09-10 |
| KR20060054332A (ko) | 2006-05-22 |
| HK1105005A1 (en) | 2008-02-01 |
| JPWO2005007697A1 (ja) | 2008-01-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2366662C2 (ru) | Моноклональное антитело к вирусу типа а гриппа и устройство для иммунного анализа с использованием антитела | |
| US8603467B2 (en) | Monoclonal antibodies binding to avian influenza virus subtype H5 haemagglutinin and uses thereof | |
| US20090068637A1 (en) | Monoclonal antibodies binding to avian influenza virus subtype h5 haemagglutinin and use thereof | |
| JP5432453B2 (ja) | Ａ型インフルエンザウイルス強毒株の検出法 | |
| RU2366663C2 (ru) | Устройство для иммунного анализа с использованием антитела к вирусу гриппа типа b | |
| US20090087926A1 (en) | Immunochromatographic test device | |
| US20160223542A1 (en) | Method for measuring type a influenza virus | |
| KR20160051816A (ko) | B형 인플루엔자 바이러스의 측정 방법 | |
| WO2023036152A1 (zh) | 一种SARS-Cov-2检测方法和试剂盒 | |
| JP7479135B2 (ja) | 抗ｒｓウイルスを認識する抗体、並びに該抗体を用いた免疫測定方法及び免疫測定器具 | |
| KR101821956B1 (ko) | 인플루엔자 a 바이러스의 뉴클레오단백질에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 신속 형광면역 진단키트 | |
| WO2021117862A1 (ja) | 免疫測定方法及び免疫測定器具 | |
| JP2023026761A (ja) | ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の免疫測定方法及び免疫測定キット、並びにモノクローナル抗体又はその抗体断片 | |
| KR20220028548A (ko) | 조류 인플루엔자 바이러스 h9n2에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 신속 진단 키트 | |
| US20220403010A1 (en) | Anti-rs virus n protein-recognizing antibody, and immunoassay method and immunoassay apparatus using the antibody | |
| KR102605065B1 (ko) | 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 h5n1에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 신속 진단 키트 | |
| JP7157061B2 (ja) | ジカウイルスを検出する方法及びキット | |
| JP2022123648A (ja) | イムノクロマトグラフィー用キット、ポリペプチドの定量方法 | |
| KR20220092744A (ko) | 말 인플루엔자 바이러스 h3n8형에 특이적인 단일클론항체 및 이를 이용한 말인플루엔자 바이러스 검출용 조성물 | |
| TW202242410A (zh) | 肺炎黴漿菌之免疫測定方法及免疫測定器具 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140724 |