RU2457243C1

RU2457243C1 - ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК МЫШИ Mus. Musculus - 1E7, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО, ИММУНОРЕАКТИВНОЕ С БЕЛКОМ ГЕМАГГЛЮТИНИНА ПАНДЕМИЧЕСКОГО ВИРУСА ГРИППА А/IIV-Moscow/01/09(H1N1)sw1

Info

Publication number: RU2457243C1
Application number: RU2011100099/10A
Authority: RU
Inventors: Регина Рафаиловна Климова (RU); Регина Рафаиловна Климова; Ольга Владимировна Масалова (RU); Ольга Владимировна Масалова; Екатерина Ивановна Леснова (RU); Екатерина Ивановна Леснова; Евгений Владимирович Чичев (RU); Евгений Владимирович Чичев; Елена Ивановна Бурцева (RU); Елена Ивановна Бурцева; Алла Александровна Кущ (RU); Алла Александровна Кущ; Дмитрий Константинович Львов (RU); Дмитрий Константинович Львов
Priority date: 2011-01-11
Filing date: 2011-01-11
Publication date: 2012-07-27

Abstract

Изобретение раскрывает получение нового штамма гибридных клеток Mus. Musculus 1E7 - продуцента моноклональных антител к белку гемагглютинина пандемического вируса гриппа A(H1N1)sw1. Вирус гриппа штамм A/IIV-Moscow/01/09(H1N1)sw1 выделен во время пандемии в Москве в 2009 г. от больного человека. Новый гибридный штамм получен путем слияния клеток мышиной миеломы (Sp2/0) с клетками селезенки мыши BALB/c, иммунизированной очищенным и инактивированным препаратом пандемического вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/09(H1N1)sw1. Штамм гибридных клеток Mus. Musculus 1E7 депонирован в Коллекцию клеточных культур ФГУ "НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского Минздравсоцразвития России под номером 8/2/4. Авторское название гибридомной клеточной линии - 1E7. Использование гибридомы позволяет получать специфические моноклональные антитела к белку гемагглютинина пандемического вируса гриппа A(H1N1)sw1, которые можно использовать для изучения антигенной структуры гемагглютинина, для дифференциальной диагностики пандемических вирусов гриппа А. Высокая вируснейтрализующая активность МКА дает возможность получения гуманизированных антител для специфической профилактики и лечения. 1 табл., 6 пр.

Description

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии и касается получения нового штамма гибридных клеток Mus. Musculus (1E7) - продуцента моноклональных антител к белку гемагглютинина пандемического вируса гриппа A(H1N1)sw1, которые можно использовать для дифференциальной диагностики пандемического вируса от сезонных вирусов гриппа А.

Проблема гриппа - одна из актуальнейших научных проблем последнего столетия. Среди людей активно циркулировали или циркулируют вирусы с тремя подтипами гемагглютинина (НА) - H1, H2, Н3 и двумя подтипами нейраминидазы - N1, N2. Точечные мутации, особенно в генах, кодирующих поверхностные белки (антигенный дрейф), позволяют вирусу преодолевать штаммоспецифический иммунитет. Второй вид изменчивости - обмен отдельными сегментами вирусного генома при условии одновременного инфицирования двумя или более подтипами вируса (антигенный шифт), может привести к появлению вирусов, к которым у населения полностью отсутствует иммунитет. Подобный вирус обладает пандемическими потенциями. Оптимальным хозяином, где может происходить событие реассортации, являются свиньи, имеющие два типа клеточных рецепторов - как для НА вирусов гриппа животных (в первую очередь, птиц), так и для НА вирусов гриппа человека. Так называемый вирус свиного гриппа распространен среди домашних свиней в США, Мексике, Канаде, Южной Америке, Европе, Кении, материковом Китае, Тайване, Японии и других странах Азии. При этом вирус может циркулировать в среде людей, птиц и других видов животных, и этот процесс сопровождается его мутациями.

В апреле 2009 года первые вспышки заболевания гриппом, вызванные новым штаммом вируса гриппа A(H1N1)sw1, наблюдались в Мексике и США. Молекулярно-биологический анализ показал, что генетический состав новых штаммов ранее не регистрировался среди вирусов гриппа свиней и человека [1, 2]. В июне 2009 года после выявления устойчивой передачи вируса в нескольких странах мира ВОЗ объявила о пандемии "свиного" гриппа [3]. Опасения ВОЗ связаны с генетической новизной штаммов и их потенциальными способностями к дальнейшей реассортации, вследствие чего возможно возникновение более агрессивных вариантов инфекции.

По данным Минздравсоцразвития Российской Федерации, в нашей стране впервые лабораторно подтвержденный случай заболевания вирусом гриппа A(H1N1)sw1 был зафиксирован 21.05.2009 г. у россиянина, вернувшегося из США. Выделенный штамм был идентифицирован, депонирован в Государственную коллекцию вирусов Российской Федерации (РФ) НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН (новое наименование: ФГУ "НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского" Минздравсоцразвития России) и получил название A/IIV-Moscow/01/09(H1N1)sw1 [4, 5].

Секвенирование полного генома вируса A/IIV-Moscow/01/2009(H1N1)sw1 выявило аминокислотные замены в вирионных белках, отличающие штаммы A/IIV-Moscow/01/2009(H1N1)sw1, A/New York/3205/2009 и A/California/04/2009(H1W1). В белках M1, M2 и РВ2 аминокислотных замен при сравнении со штаммом A/California/04/2009(H1N1) не обнаружено. Из анализа первичной последовательности генов московского штамма однозначно следует его большее родство со штаммом, изолированным в Нью-Йорке, по сравнению с Калифорнийским штаммом вируса уникальной заменой только для штамма A/IIV-Moscow/01/2009(H1N1)sw1 и не обнаруженной ни у одного другого опубликованного в GenBank к настоящему времени штамма можно считать значащую замену в NA-гене кодона GAC на GGC, что привело к замене Asp на Gly в позиции 451 [5].

С июня по август 2009 года сотрудниками ФГУ "НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского" Минздравсоцразвигия России было изолировано 19 штаммов, у которых были выявлены единичные аминокислотные замены по сравнению с эталонным штаммом A/California/07/2009 (H1N1)sw1, что указывает на начавшуюся эволюцию пандемического штамма [6]. Смертность от пандемического вируса гриппа в мире составила более 1%, что на порядок выше показателей смертности от сезонного гриппа [7].

Быстрая, ранняя и надежная детекция циркулирующих вирусов гриппа, вирусологический и молекулярно-генетический мониторинг циркуляции пандемического вируса гриппа A(H1N1)sw1, изучение эволюции, чувствительности к противовирусным препаратам, изменения вирулентности и других фундаментальных свойств возбудителя является ключевой задачей для контроля заболевания. В качестве специфических иммунных реагентов для выявления и изучения антигенной структуры вирусов гриппа используют поликлональные (сывороточные) или моноклональные антитела (МКА).

ВОЗ в дополнение к вакцинации, как основной стратегии борьбы с гриппом, рекомендовано применение этиотропных химиопрепаратов. В настоящее время для лечения гриппа известно 2 класса препаратов: препараты адамантанового ряда и ингибиторы нейраминидазы. Пандемический вирус гриппа A(H1N1)sw1 оказался чувствительным к озельтамивиру, однако в настоящее время существуют данные о появление резистентых штаммов пандемического вируса гриппа A(H1N1)sw1 [8]. В связи с этим необходим поиск новых препаратов для профилактики и лечения гриппа человека. Одним из подходов является пассивная иммунизация с применение специфических человеческих МКА, однако исследования показали, что человеческие гибридомы характеризуются высокой нестабильностью продукции МКА. Новым перспективным направлением в биотехнологии является создание гуманизированных антител, которые могут быть использовать для профилактики и лечения человека. На основе мышиных МКА методом генной инженерии конструируются антитела «мышь-человек», Fab-фрагменты которых содержат гипервариабельные участки специфических иммуноглобулинов мышиных МКА, обладающих вируснейтрализующей активностью, а Fc-фрагменты (константная часть) происходят из иммуноглобулинов человека. Так как гуманизированные антитела содержат минимальное количество фрагментов мышиных антител, их можно использовать для профилактики и лечения человека. Данные об использовании гуманизириванных AT в отношении пандемического вируса гриппа A(H1N1)sw1 в литературе отсутствуют. В работе B.J.Hanson et al. приведены данные по изучению гуманизированных AT, которые были получены на основе двух МКА к вирусу гриппа A/H5N1 [9]. Профилактический и терапевтический эффект гуманизированных антител исследовали в опытах на мышах: разные количества МКА вводили до или после заражения летальной дозой вируса A/H5N1. Оказалось, что оба МКА были эффективны в профилактической схеме; в лечебной схеме одно из антител было более активно и показало полную протекцию от заболевания в концентрации 1 мг/кг веса. Таким образом, пассивная иммунизация может представлять собой альтернативную стратегию как для профилактики, так и для лечения пандемических вариантов вируса гриппа А.

Известны три зарубежные коллекции мышиных МКА к пандемическому вирусу гриппа A(H1N1)sw1, продуцируемые штаммами гибридных клеток животных [10, 11, 12]. Наиболее близким аналогом может служить штамм гибридных клеток Mus. Musculus, полученный к инактивированному пандемическому вирусу гриппа штамм A/California/07/2009 (H1N1)sw1 [10].

Аналоги штаммов гибридных клеток животного Mus. Musculus - продуцентов МКА к пандемическому вирусу гриппа человека A(H1N1)sw1, циркулирующему на территории Российской Федерации, неизвестны.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в получении гибридомы, продуцирующей МКА к пандемическому вирусу гриппа A/IIV-Moscow/01/09(H1N1)sw1. Эти МКА можно использовать для изучения антигенной структуры гемагглютинина, для дифференциальной диагностики пандемического вируса гриппа А, а также для специфической профилактики и лечения с помощью гуманизированных антител, полученных на их основе.

К существенным признакам изобретения, совпадающими с признаками аналога, относятся следующие.

1. Штамм гибридных клеток 1Е7, продуцирующий моноклональные антитела к гемагглютинину вируса гриппа A(H1N1)sw1, получен методом гибридомной технологии при иммунизации мышей BALB/c.

2. Детекция гомологичного вируса с помощью МКА 1Е7 также проводилась в реакции иммунофлюоресценции.

К существенным признакам изобретения, отличающимся от признаков аналога, можно отнести следующие.

1. Иммунизацию животных проводили инактивированным препаратом пандемического вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/09(H1N1)sw1, выделенным на территории РФ, содержащим Gly (GAC-GGC) в 451 позиции молекулы нейраминидазы [5].

2. Отбор специфических гибридных клеток осуществляли также с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) и в реакции торможения гемагглютинации (РТГА), тогда как в аналоге отбор производили только методом непрямой иммунофлюоресценции.

3. МКА 1Е7 направлены к конформационно-зависимым или прерывистым детерминантам белка НА, в аналоге МКА опознают линейные эпитопы белка НА.

Техническим результатом заявляемого изобретения является получение штамма гибридных клеток 1Е7, продуцирующих МКА к пандемическому вирусу гриппа А/IIV-Moscow/01/09 (H1N1)sw1, который можно использовать для диагностики, профилактики и лечения.

Указанный технический результат достигается путем гибридизации культивируемых клеток миеломы мыши Sp2/0 с клетками селезенки мышей линии BALB/c, иммунизированных очищенным и инактивированным препаратом пандемического вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/09(H1N1)sw1, который был получен в результате культивирования и очистки вируса. Заявляемый штамм гибридных клеток Mus. Musculus 1E7 получен в Федеральном государственном бюджетном учреждении "Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ФГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского Минздравсоцразвития России) и депонирован в Коллекции перевиваемых клеточных линий ФГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского Минздравсоцразвития под номером 8/2/4. Авторское название гибридомной клеточной линии - 1E7.

Штамм Mus. Musculus 1E7 характеризуется следующими признаками.

Родословная штамма. Штамм гибридных культивируемых клеток Mus. Musculus L. (1E7) был получен в результате слияния мышиной миеломы Sp2/0 с клетками селезенки мышей линии BALB/c, иммунизированных очищенным и инактивированным препаратом пандемического вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/09(H1N1)sw1. В качестве сливающего агента использовали реагент ПЭГ-ДМСО (Hibri-Max, Sigma США). Гибридные клетки культивировали на селективной среде ГАТ, затем дважды клонировали методом предельных разведений, используя в качестве клеток-кормилок перитонеальные макрофаги мышей BALB/c.

Число пассажей к моменту депонирования составило 8-12.

Контаминация бактериями и грибами не обнаружена.

Морфологические признаки. Культура клеток состоит из слабо прикрепляющихся к субстрату округлых клеток различной величины с крупными ядрами.

Культуральные свойства. В качестве ростовой среды для культивирования использовали среду RPMI-1640, содержащую 20% эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС), 4,5 г/л глюкозы, 3 мМ глутамина, 0,2 ЕД/мл инсулина, 50 мкг/мл гентамицина. Характер роста - стационарная суспензия, метод снятия - встряхивание. Частота пассирования - 2-3 суток. Посевная доза - 200 тыс. клеток в 1 мл. Кратность рассева - 1:2-1:3.

Культивирование гибридомы в организме животного. Самкам мышей BALB/c (виварий ФГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского Минздравсоцразвития России) предварительно вводят внутрибрюшинно 0,5 мл пристана (Sigma, США). Через 10-14 день животным прививают 10⁶/мл гибридных клеток в брюшную полость мышей. Через 7-10 суток формируется асцитная опухоль. От одного животного можно получить 3-5 мл асцитной жидкости, содержащей МКА. Гибридома прививается в 100% случаев.

Криоконсервирование гибридомы. За 24 часа до замораживания гибридомы пересевают 1:2. Осажденные центрифугированием (1000 об/мин, 10 мин) клетки суспендируют в криозащитной среде (90% ЭТС, 10% ДМСО) и разливают по ампулам в концентрации 3-5 млн/мл по 1-1,8 мл. Хранят 24 часа при -70С°, затем переносят в жидкий азот.

Характеристика иммуноглобулинов. Определение класса иммуноглобулинов, продуцируемых МКА 1Е7, проводили методом ИФА с помощью набора "Mouse-Hybridoma-Subtyping Kit" (Boehringer Mannheim, Германия). В лунки панели сорбировали очищенный препарат вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/09(H1N1)sw1 в концентрации 2 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) и инкубировали с МКА в серийных разведениях. После отмывки добавляли конъюгаты - антимышиные антитела к различным классам (IgG, IgA, IgM) и субклассам (IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3) иммуноглобулинов, меченные пероксидазой хрена. В качестве субстрата использовали тетраметилбензидин. Показано, что продуцируемые гибридомой 1Е7 МКА взаимодействовали только с конъюгатами против IgG и IgG2a (оптическая плотность более 1,0 для всех использованных разведений МКА), что позволило отнести их к классу IgG, субклассу IgG2a.

Методика получения заявляемого штамма.

Иммунизация. Самок мышей линии BALB/c, полученных из питомника «Пущино» (Московская обл.), иммунизировали внутрибрюшинно 3-кратно с интервалом 3 недели в дозе 100 мкг антигена/мышь. Для первой иммунизации антиген вводили в смеси с полным адъювантом Фрейнда, для трех следующих - в смеси с неполным адъювантом Фрейнда. Бустерную дозу (100 мкг антигена в 0,1 мл физиологического раствора) вводили внутривенно за 3 дня до выделения селезенки. Титр иммунной сыворотки с гомологичным антигеном в РТГА составил 1:640, в ИФА - 1,8×10⁵.

Слияние. Для слияния используют клетки селезенки мыши и клетки мышиной миеломы Sp2/0 в соотношении 1:5. Смесь клеток центрифугируют, супернатант тщательно удаляют и к клеточному осадку добавляют 1 мл раствора ПЭГ-ДМСО, состоящего из 45% ПЭГа с молекулярной массой 1450 и 10% ДМСО, (Hybri-Max, Sigma, США). После 3 мин паузы смесь центрифугируют 15 мин при 1000 об/мин. Осадок дважды отмывают средой без сыворотки и осадок растворяют в ростовой среде. Клетки распределяют в 96-луночны планшеты (Costar, США) по 100 мкл в лунку. Селекцию гибридных клеток проводят в среде ГАТ (Sigma, США), состоящей из питательной среды RPMI-1640, в которую добавлены 20% эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco, США), 0,1 мМ гипоксантина, 0,04 мМ тимидина и 0,01 мМ аминоптерина.

Отбор специфических гибридов осуществляли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) и в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). В качестве антигена (АГ) в обеих реакциях использовали гомологичный вирус A/IIV-Moscow/01/09(H1N)sw1.

Пример 1. Определение активности МКА 1Е7 при помощи твердофазного иммуноферментного анализа. 96-луночные панели (NUNC, Дания) сенсибилизировали очищенным препаратом вируса гриппа A/DV-Moscow/01/09 в концентрации 2 мкг/мл, инкубировали с асцитной жидкостью, содержащей МКА, в серийных разведениях на фосфатно-солевом буферном растворе, содержащем 0,1% твин-80 (PBST). После отмывки добавляли конъюгат - антимышиные антитела, меченные пероксидазой хрена (DAKO, Дания). В качестве субстрата использовали тетраметилбензидин (Sigma, США). Было показано, что титр МКА составил 2×10⁷.

Пример 2. Определение активности МКА 1Е7 в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). РТГА проводили с использованием человеческих эритроцитов I (0) группы по стандартной методике [13]. Доза вирусов гриппа человека и животных составляла 8 агглютинирующих единиц. Было установлено, что МКА 1Е7 подавляют гемагглютинацию вируса гриппа, штамм A/IIV-Moscow/01/2009(H1N1)sw1, в разведении 1/20480. Полученные данные приведены в Таблице 1.

Таблица 1 Активность МКА 1Е7 в реакции торможения гемагглютинации (РТГА с вирусами гриппа человека
Вирусы гриппа		Активность МКА 1Е7
Пандемические вирусы гриппа А		Активность МКА 1Е7
	A/IIV-Moscow/01/2009(H1N1)sw1	20480
H1N1sw1	A/Califorma/07/2009^∗	40960
Сезонные вирусы гриппа А
	A/Brisbane/59/07	<20
	A/Solomon Islands/3/06	<20
H1N1	A/New Caledonia/20/99	<20
	A/Beijing/262/96^∗	<20
	A/Johannesburg /82/96^∗	<20
H3N2	A/Brisbane/10/07	<20
Вирусы гриппа В
B/Florida/04/06		<20
B/Brisbane/60/08		<20
Примечание: ^∗ - антигены CDC (Атланта, США)

Пример 3. Специфичность МКА 1Е7 в отношении белков вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/09(H1N1)sw1 определяли методом иммуноблота. Белки разделяли в 10% полиакриламидном геле и переносили методом электроэлюции на нитроцеллюлозу с диаметром пор 0,45 мкм ("Bio-Rad", США). Инкубацию с МКА проводили в течение 1 часа или 18 час на качалке при комнатной температуре. Результат реакции проявляли, обрабатывая полоски нитроцеллюлозы AT к Ig мыши, меченными пероксидазой (Sigma, США). В качестве отрицательного контроля использовали Sp2/0-асцитную жидкость в разведении 1/500, в качестве положительного контроля - сыворотку мышей, используемых для получения гибридом в разведении 1/500. Данные опытов показали, что МКА 1Е7 не давали специфических полос в иммуноблоте. Слабое взаимодействие или отсутствие взаимодействия с вирусными белками в иммуноблоте указывает на то, что МКА 1Е7 направлены к конформационно-зависимым или прерывистым детерминантам белка НА.

Пример 4. Вируснейтрализующую активность МКА 1Е7 изучали микрометодом в реакции биологической нейтрализации (РН) в соответствии с рекомендациями ВОЗ [14]. МКА прогревали при 56°С в течение 30 мин на водяной бане. Серийные разведения МКА инкубировали с гомологичным вирусом (инфекционная множественность 100 ТЦД₅₀) в течение 2 ч при 37°С и вносили в клеточную культуру почки собаки (MDCK). После адсорбции вируса клетки промывали, добавляли поддерживающую культуральную среду и инкубировали 24 часа при 37°С в атмосфере 5% CO₂. Затем клетки отмывали PBS, фиксировали 80% холодным ацетоном на физиологическом растворе 10 минут. Для выявления вируса добавляли МКА к белку NP вируса гриппа из набора ВОЗ, инкубировали 1 ч при 37°С, отмывали PBST 5 раз, добавляли конъюгат - антитела к Ig мыши, меченные пероксидазой хрена (DAKO, Дания). После отмывки добавляли субстрат ТМБ. Считали оптическую плотность (ОП) при длине волны 450 нм. В качестве контролей использовали неинфицированную клеточную культуру (К-), а также клетки, зараженные вирусом, но без добавления МКА (К+).

Пороговый уровень реакции (ОП cut-off) вычисляли по формуле:

ОП cut-off=[ср.ОП (К+) - ср.ОП (К-)]/2+ср.ОП (К-), где ср.ОП (К+) - средняя ОП в лунках с вирусом без добавления МКА; ср.ОП (К-) - средняя ОП в лунках без вируса и без добавления МКА (фон реакции).

МКА считали активными в реакции микронейтрализации, если они давали в каком-либо разведении ОП, меньшую, чем ОП cut-off.

Для каждого разведения МКА рассчитывали степень нейтрализации инфекционной активности вируса по формуле: [ср.ОП (К+) - ОП х]/ср.ОП (К+)×100 (%), где ср.ОП (К+) - средняя ОП в лунках с вирусом без добавления МКА; ОП х - ОП в лунках с вирусом в присутствии МКА.

За титр МКА в РН принимали наибольшее обратное разведение антител, снижающее ОП на 50%. Это соответствует разведению антител, которое нейтрализует инфекционную активность вируса на 50%. Установлена высокая нейтрализующая активность заявляемых МКА. МКА 1Е7 нейтрализовали инфекционную активность вируса гриппа, штамм A/IIV-Moscow/01/2009(H1N1)sw1, в разведении 1/40960.

Пример 5. Изучение способности МКА 1Е7 выявлять инфицированные клетки в реакции непрямой иммуннофлюоресценции (нИФ). Клетки MDCK заражали вирусом A/IIV-Moscow/01/2009(H1N1)sw1 с инфекционной множественностью 10-100 ТЦД₅₀.

Через 24 часа после заражения клетки фиксировали охлажденным ацетоном в течение 30 мин. На фиксированные препараты наносили МКА 1Е7 и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Затем промывали проточной водой и наслаивали антимышиную сыворотку, меченную ФИТЦ (DAKO, Дания). Показано, что МКА 1Е7 были способны окрашивать клетки MDCK, инфицированные гомологичным вирусом гриппа A/IIV-Moscow/01/2009(H1N1)sw1. Окраска вирусного АГ была выявлена в цитоплазме инфицированных клеток.

Пример 6. Изучение способности МКА 1Е7 подавлять гемагглютинацию различных вирусов гриппа человека. Для анализа свойств МКА использовали 2 пандемических штамма вируса гриппа A(H1N1)sw1: A/IIV-Moscow/01/09 и A/California/07/2009; 5 сезонных вирусов гриппа A(H1N1): A/Brisbane/59/07, A/Solomon Islands/3/06, A/New Caledonia/20/99, A/Beijing/262/96, A/Johannesburg/82/96; вирус гриппа A/(H3N2) A/Brisbane/10/07 и 2 вируса гриппа В: B/Florida/04/06, B/Brisbane/60/08. Результаты РТГА представлены в Таблице 1. Показано, что МКА 1Е7 с высокой активностью подавляют гемагглютинацию только пандемических вирусов гриппа A(H1N1)sw1. С другими изученными вирусами реакция была отрицательной.

Т.о., впервые на основе мышиной миеломы получена гибридома Mus. Musculus 1Е7 - продуцент МКА к белку гемагглютинина пандемического вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/09(H1N1)sw1. Указанный вирус выделен на территории РФ, в Москве в 2009 году. Штамм гибридных клеток позволяет получить мышиные иммуноглобулины класса IgG2a в количестве 3-5 мг очищенных антител из миллилитра асцитной жидкости. МКА 1Е7 специфично реагируют с вирусом гриппа A/IIV-Moscow/01/09 (H1N1)sw1 в ИФА (титр составлял не менее 2×10⁷). МКА с высокой активностью тормозят гемагглютинацию пандемических вирусов гриппа A(H1N1)sw1, циркулирующих в РФ, и эталонного штамма, полученного из CDC (Атланта, США). Это позволяет использовать их для исследования тонкой антигенной структуры и эпитопной специфичности новых изолятов пандемического вируса гриппа А, а также для дифференциальной диагностики пандемических вирусов гриппа A(H1N1)sw1 от сезонных. Активность МКА 1Е7 в реакции нИФ дает возможность применять их для выявления вируса в носоглоточных смывах, мазках и отпечатках тканей больных. Высокая нейтрализующая активность МКА 1Е7 дает возможность на их основе конструирования гуманизированных антител, используемых для профилактики и лечения пандемического гриппа у людей.

Список цитируемой литературы

1. Update: Outbreak of swine-origin influenza A(H1N1) virus infection - Mexico. March-April 2009 // Morbid. Mortal. Wkly Rep. (MMWR). - 2009. - Vol.58, N16. - p.467-470.

2. Update: Swine A(H1N1) infection in two children - southern California. March-April 2009 // Morbid. Mortal. Wkly Rep. (MMWR). - 2009. - Vol.58, N17. - P.400-402.

3. Frazer C., Donnelly C.A, Cauchemez S. et al. Pandemic potential of strain of influenza A(H1N1): early finding // Science. - 2009. - Vol.324. - P.1557-1561.

4. Львов Д.К., Бурцева Е.И., Прилипов А.Г. и др. Изоляция 24.05.2009 и депонирование в Государственную коллекцию вирусов (ГКВ №2452 от 24.05.2009) первого штамма A/IIV-Moscow/01/2009 больного в Москве // Вопр. Вирусол. - 2009. - №5. - С.10-14.

5. Заявка на выдачу патента РФ на изобретение №2009129374/10 "Штамм вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/2009(H1N1)sw1 для разработки средств и методов биологической защиты", дата подачи 30.07.2009. Решение о выдаче патента на изобретение от 15 сентября 2010 г.

6. Д.К.Львов, Е.И.Бурцева, М.Ю.Щелканов и др. Распространение нового пандемического вируса гриппа A(H1N1)v в России // Вопр. Вирусол. - 2010. - Т.55, №3. - С.4-9.

7. http://www.ecdc.europe.eu/en/helthttopics/Documents/

8. Koudstaal W., Koldijk M.H., Brakenhoff J.P. et al. Pre- and postexposure use of human monoclonal antibody against H5N1 and H1N1 influenza virus in mice: viable alternative to oseltamivir // J. Infect. Dis. - 2009. - Vol.200 (12). - P.1870-1873.

9. Hanson B.J., Boon A.C.M., Lim A.P.C. et al. Passive immunoprophylaxis and therapy with humanized monoclonal antibody specific for influenza A H5 hemagglutinin in mice // Respiratory Research. - 2006. - V.7. - N1. - P.126-136.

10. Higgins A.D., Shaw C.J., Johnson J.G. et al. Monoclonal antibody kit for identification of the novel 2009 H1N1 influenza A virus // J. Clin. Microbiol. - 2010. - Vol.48(8). - P.2677-2682.

11. Yuan Q, Cheng XD, Yang ВС et al. Differentiate diagnosis of pandemic (H1N1) 2009 infection by detecting hemagglutinin using an enzyme-linked immunoassay // Clin. Microbiol. Infect. - 2010. - Nov 4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2010.03413.x. [Epub ahead of print].

12. Kim YK, Uh Y, Chun JK et al. Evaluation of new hemagglutinin-based rapid antigen test for influenza A pandemic (H1N1) 2009 // J. Clin. Virol. - 2010. - V.49. - P.69-72.

13. Дерябин П.Г., Бутенко A.M., Бурцева Е.И. Реакция гемагглютинации и реакция торможения гемагглютинации // В руководстве "Медицинская вирусология" под ред. Академика РАМН Д.К. Львова. Москва. МИФ - 2008. - С.312-318.

14. Scholtissek С. Molecular evolution of influenza viruses // Virus. Genes. - 1996. - Vol.11. - P.209-215.

Claims

Штамм гибридных культивируемых клеток мыши Mus. Musculus - 1Е7, депонированный в Коллекцию перевиваемых клеточных культур при ФГУ "НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского" Минздравсоцразвития России под номером 8/2/4, продуцирующий моноклональное антитело, иммунореактивное с белком гемагглютинина пандемического штамма вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/09(H1N1)sw1, относящийся к субклассу IgG2a.