CN110780075A - 生物体粒子测定用方法、装置及试剂盒、及非特异信号的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物体粒子测定用方法、装置及试剂盒、及非特异信号的检测方法。本发明的方法包括：将下列试样供于信号检测：通过将从受试体分取的含生物体粒子的第1试样和能与生物体粒子结合且含标记物质的检测体在能与生物体粒子结合且不含标记物质的抑制物质的存在下混合而调制的第1测定试样、及通过将从与受试体相同的受试体与第1试样独立地分取的第2试样和检测体在抑制物质实质上不存在的条件下混合而调制的第2测定试样，其中在检测工序中检测到来源于第1和第2测定试样中所含的标记物质的信号，从来源于第1和第2测定试样中所含的标记物质的信号的检测结果算出生物体粒子的测定结果。
Description
【技术领域】
在本说明书中公开了涉及生物体粒子的测定方法、非特异信号的检测方法、粒子测定装置及用于检测生物体粒子的试剂盒的技术。
【背景技术】
在生物体内，已知淀粉样凝集体等的凝集体或称为外泌体或微颗粒的各种细胞外小泡等的生物体粒子从细胞内向细胞外释放。近年，这些生物体粒子作为反映组织的病态生理学的信息的生物标志物而受到关注。作为测定细胞外小泡的方法的一例，可举出非专利文献1。在此文献中公开了由作为标记抗体的阴性对照的同种型对照抗体的散点图的荧光强度设定背景信号的阈值，确定CD41阳性的细胞外小泡的方法。
【现有技术文献】
【非专利文献】
【非专利文献1】A flow cytometric method for characterization ofcirculating cell-derived microparticles in plasma.,Nielsen MH et al.,JExtracell Vesicles.2014；3.doi：10.3402/jev.v3.20795.eCollection201)
【发明的概要】
【发明要解决的课题】
本发明人发现，在非专利文献1记载的方法中，不能与通过荧光染料标记抗体与细胞外小泡以外的混杂物非特异性地结合而发生的信号区别开有无法正确地检测细胞外小泡的担忧。
本公开以判别来源于测定对象的生物体粒子的特异性信号和非特异性的信号，提高生物体粒子的测定精度作为一课题。
【用于解决课题的手段】
本公开的有的实施方式涉及生物体粒子的测定方法。上述测定方法包括：将通过将含从受试体分取的生物体粒子的第1试样和能与上述生物体粒子结合并且含标记物质的检测体在能与上述生物体粒子结合并且不含上述标记物质的抑制物质的存在下混合而调制的第1测定试样、及，通过将从与上述受试体相同的受试体与上述第1试样独立地分取的第2试样和上述检测体在上述抑制物质实质上不存在的条件下混合而调制的第2测定试样供于信号检测的检测工序，其中，从在上述检测工序中检测到来源于上述第1测定试样中所含的上述标记物质的信号和来源于上述第2测定试样中所含的上述标记物质的信号的来源于上述第1测定试样中所含的上述标记物质的信号的检测结果和来源于上述第2测定试样中所含的上述标记物质的信号的检测结果算出上述生物体粒子的测定结果的算出工序。由本实施方式，生物体粒子的正确的测定变得可能。
本公开的有的实施方式涉及非特异信号的检测方法。从通过将含从受试体分取的生物体粒子的试样和能与上述生物体粒子结合并且含标记物质的检测体在能与上述生物体粒子结合并且不含上述标记物质的抑制物质的存在下混合而调制的测定试样将来源于上述标记物质的信号由粒子测定装置检测，将检测的信号判断为非特异信号。根据本实施方式，可在生物体粒子的测定中，判别非特异性的信号。
本公开的有的实施方式涉及生物体粒子的测定方法。上述测定方法包括：将含从受试体分取的生物体粒子的第i试样、能与含与固相能解离地结合的标签的上述生物体粒子结合的捕获体和能与上述生物体粒子结合并且含标记物质的检测体在能与上述生物体粒子结合并且不含上述标记物质的抑制物质的存在下混合，在上述固相上形成上述生物体粒子、上述捕获体和上述抑制物质的第i复合物的调制工序a-1，调制含从上述固相解离的上述第i复合物的一部分或全部的第i测定试样的调制工序a-2，将从与上述受试体相同的受试体与上述第i试样独立地分取的第ii试样、上述捕获体和上述检测体在上述抑制物质实质上不存在的条件下混合，在上述固相上形成上述生物体粒子、上述捕获体和上述检测体的第ii复合物的调制工序b-1，调制含从上述固相解离的上述第ii复合物的一部分或全部的第ii测定试样的调制工序b-2，将来源于上述第i测定试样中所含的上述标记物质的信号和来源于上述第ii测定试样中所含的上述标记物质的信号由粒子测定装置检测的检测工序，及从来源于上述第i测定试样中所含的上述标记物质的信号的检测结果和来源于上述第ii测定试样中所含的上述标记物质的信号的检测结果算出上述生物体粒子的测定结果的算出工序。
本公开的有的实施方式涉及粒子测定装置。上述粒子测定装置具备处理部，所述处理部取得对于将含从受试体分取的生物体粒子的第 1试样和与上述生物体粒子结合并且含标记物质的检测体在能与上述生物体粒子结合并且不含上述标记物质的抑制物质的存在下混合而调制的第1测定试样而将来源于上述第1测定试样中所含的上述标记物质的信号由粒子测定装置检测的结果，及对于将从与上述受试体相同的受试体与上述第1试样独立地分取的第2试样和上述检测体在上述抑制物质实质上不存在的条件下混合而调制的第2测定试样而将来源于上述第2测定试样中所含的上述标记物质的信号由粒子测定装置检测的结果，从来源于上述第1测定试样中所含的上述标记物质的信号的测定结果和来源于上述第2测定试样中所含的上述标记物质的信号的检测结果算出上述生物体粒子的测定结果。
本公开的有的实施方式涉及用于检测生物体粒子的试剂盒。上述试剂盒含能结合生物体粒子且含标记物质的检测体、及能与上述粒子结合且不含标记物质的抑制物质。
本公开的有的实施方式涉及检测体及抑制物质用于制造用于检测生物体粒子的试剂盒的用途。上述检测体能与上述生物体粒子结合并且含标记物质，上述抑制物质能与上述生物体粒子结合并且不含上述标记物质，上述试剂盒在上述的方法中使用。
【发明的效果】
由本发明，更正确的生物体粒子的测定变得可能。
【附图说明】
【图1】显示第1测定方法的概略图。
【图2】显示第2测定方法的概略图。
【图3】显示第3测定方法的概略图。
【图4】显示粒子测定系统的构成例。
【图5】显示粒子测定装置的硬件的构成例。
【图6】显示粒子测定装置的动作的流程。
【图7】显示检查试剂盒的例。
【图8】图8A显示由以往方法，使用APC标记抗CD235a抗体而检测的信号。图8B显示由以往方法，使用APC标记同种型对照抗体而检测的信号。
【图9】显示使用抗CD146抗体的细胞外小泡的流式细胞术的结果。
【图10】显示使用抗CD61抗体或抗CD235a抗体的细胞外小泡的流式细胞术的结果。
【图11】显示使用抗CD61抗体的细胞外小泡的流式细胞术的结果。
【图12】图12A显示由本公开的方法，使用APC标记抗CD235a 抗体而检测的信号。图12B显示由本公开的方法，使用APC标记同种型对照抗体而检测的信号。
【具体实施方式】
[1.用语的说明]
首先，对于本公开中使用的用语进行说明。如无特别说明，在本说明书、专利权利要求、附图中使用的用语的解释根据本项的说明。
“受试体”是从动物或植物采集的液体成分，只要是含生物体粒子，就不限制。具体而言，从动物采集的受试体含血清、血浆、淋巴液、尿、腹水、胸水、脑脊髓液、间质液等。另外，从植物采集的液体试样含间质液、导管液、师管液等。另外，受试体也可为生物体粒子的浓缩液或提取液。
“生物体粒子”只要是来源于生物体的粒子，就不限制。生物体粒子是例如，有数nm～数千nm左右的大小的生物体来源成分。在生物体粒子中，含淀粉样凝集体、τ蛋白质凝集体等的蛋白质的凝集体、蛋白质、细胞外小泡等。细胞外小泡是由以从细胞释放的磷脂作为主成分的膜覆盖的有数十～数千nm左右的大小的粒子。在细胞外小泡中，含外泌体、微颗粒、凋亡小体等。在多数情况，在细胞外小泡中，存在生物体分子。例如，外泌体或微颗粒可含多肽、核酸(mRNA、miRNA、非编码RNA等的RNA)等的生物体分子。例如，凋亡小体可含片段化的核、细胞小器官等。细胞外小泡可含多肽、RNA等的生物体分子。“多肽”是指多个氨基酸由肽键结合的化合物，含分子量的比较大的蛋白质及分子量的比较小的肽。
成为测定对象的生物体粒子优选为30nm以上。另外，生物体粒子优选为1,000nm以下。
作为生物体粒子，优选是细胞外小泡。例如，外泌体有30nm～ 100nm左右的大小。微颗粒有例如100nm～1000nm左右的大小。其中粒子的大小优选以外径表示。
存在于生物体粒子、成为测定的对象的分子也称为目标分子。作为目标分子，例如蛋白质、糖链、脂质、核酸等。另外，作为存在于目标分子内的部位，将后述的检测体结合的部位也称为“目标部位”。目标部位可为生物体粒子整体，也可为生物体粒子的一部分。另外，在生物体粒子如细胞外小泡一样，含多种成分时，目标部位也可为各成分的整体、或者各成分的一部分。例如，目标部位可为目标分子的整体或一部分。
“检测体”是含标记物质、与生物体粒子结合的物质。检测体具体可举对能与生物体粒子结合的“结合体”标记标记物质。
“标记物质”只要是发生能检测的信号，就不特别限定。例如，可为其本身发生信号的物质(以下，也称为“信号发生物质”)，也可为催化其他物质的反应而发生信号的物质。作为信号发生物质，例如，可举出荧光物质、放射性同位素等。作为催化其他物质的反应而发生能检测的信号的物质，例如，可举出酶。作为酶，可举出碱性磷酸酶 (ALP)、过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶等。
作为荧光物质，可举荧光素衍生物、罗丹明衍生物、德克萨斯红、 Cy染料、Alexa(注册商标)Fluor、MegaStokes(商标)Dye、Oyster (商标)、DyLight(商标)、HiLyte(商标)Fluor、Brilliant Violet (商标)、Qdot(注册商标)、藻红蛋白(PE)、别藻蓝素(APC)、PerCP、四甲基罗丹明(TRITC)、及这些的串联染料。更具体而言，可举出AMCA、PacificBlue、Alexa Fluor 405、太平洋橙、Krome Orange、亮紫421、亮紫510、亮紫605、亮紫650、亮紫711、亮紫785、Alexa Fluor 488、Qdot(R)605、FITC、PE/RD1、ECD/PE-德克萨斯红、 PC5/SPRD/PE-Cy5、PC5.5/PE-Cy5.5、PerCP、PerCP-Cy5.5、PE-Alexa Fluor 700、PC7/PE-Cy7、PE-Alexa Fluor 750、TRITC、Cy3、Alexa Fluor 594、德克萨斯红、Alexa Fluor 647、AlexaFluor 700、Cy5、Cy5.5、 APC、APC7/APC-Cy7、APC Alexa Fluor700、APC Alexa Fluor750等的荧光染料、增强的绿色荧光蛋白(EGFP)等的荧光蛋白质等。
作为放射性同位素，可举出125I、14C、32P等。在它们之中，作为标记物质，也特别优选荧光染料。
“结合体”是检测体的一部分，是可与生物体粒子结合的物质。作为结合体，可例示例如，抗体、适体、凝集素等。优选地，结合体可至少与目标部位结合。结合体是抗体之时，目标分子也称为抗原，在抗原中可含蛋白质、糖链等。结合体优选其至少一部分与目标部位特异性地结合。
“抗体”含以存在于粒子上的目标蛋白质或其一部分作为抗原而对人以外的动物进行免疫而得到的多克隆抗体、单克隆抗体、及它们的片段(例如，Fab、F(ab)2、Fv片段、小型抗体、scFv-Fc、scFv、双体抗体、三体抗体、及四体抗体等)。另外，免疫球蛋白的类及亚类不特别限制。
为了制作抗体使用的、成为抗原的目标蛋白质只要是可制作目标蛋白质的抗体，就不限制。作为抗原使用的目标蛋白质可为从动物或植物根据公知的方法提取的，也可为由重组基因工程学技术得到的重组体蛋白质。在以目标蛋白质的一部分作为抗原时，可使用将目标蛋白质用酶等消化而得到的片段，另外，也可以有与目标蛋白质的一部分的氨基酸序列相同的序列的肽作为抗原。所述肽可由公知的方法合成。
“凝集素”只要是可与作为目标的糖链结合，就不限制。作为凝集素，可例示例如，凝集素、半乳糖凝集素、共凝集素、纤维胶凝蛋白、内凝集素、膜联蛋白、凝集素蛋白聚糖、F-盒凝集素、岩藻糖凝集素、鲎凝集素、唾液酸结合型凝集素、L型凝集素、M型凝集素、P型凝集素、R型凝集素。
“抑制物质”是可抑制目标部位和检测体的结合的物质。优选地，抑制物质可为能与目标部位结合的物质。抑制物质可例示抗体、凝集素等。抗体及凝集素的说明在其中援用对于结合体的说明。
抑制物质可为与检测体中所含的结合体相同的物质，也可为不同的物质。例如，在目标部位是抗原的表位时，检测体中所含的结合体是抗体时，抑制物质可含至少与检测体中所含的抗体所结合的目标部位结合的抗体。此时，抑制物质可以与上述表位结合的抗体作为多克隆抗体，也可为与上述表位结合的单克隆。另外，抑制物质也可为与目标部位结合的抗体和其他抗体的混合物。再者，在目标部位是抗原的表位时，检测体中所含的结合体是抗体时，抑制物质也可为与上述表位结合的适体、凝集素等。
在目标部位是糖链的凝集素结合部位时，检测体中所含的结合体是凝集素时，抑制物质可含至少与检测体中所含的凝集素所结合的目标部位结合的凝集素。此时，抑制物质中所含的凝集素也可为与上述凝集素结合部位结合的凝集素和其他凝集素的混合物。再者，在目标部位是糖链的凝集素结合部位时，检测体中所含的结合体是凝集素时，抑制物质也可为与上述凝集素结合部位结合的抗体。
检测体和抑制物质更优选在与生物体粒子的结合中竞争结合。
抑制物质优选不含标记物质，或含与检测体不同的标记物质。
“捕获体”只要是含结合体和标签，就不限制。另外，捕获体中所含的结合体只要是可与生物体粒子结合，就不限制。结合体与检测体中所含的结合体同样地，可例示抗体、凝集素等。抗体及凝集素的说明在其中援用对于检测体中所含的结合体的说明。优选地，捕获体中所含的结合体优选即使经后述的B/F分离的工序，也有持续捕获生物体粒子的捕获力。
另外，捕获体中所含的结合体优选不干涉检测体中所含的结合体和生物体粒子的结合、及抑制物质中所含的结合体和生物体粒子的结合。例如，捕获体优选与存在于生物体粒子上的与检测体中所含的结合体所结合的目标部位不同的部位结合。
标签是能与固相能解离地结合的物质。标签与固相直接或间接地结合。“与固相间接结合”是指标签经其他物质而与固相结合。例如，标签可经固定化物质而固定化于固相。标签和固定化物质的结合可通过添加解离剂而解离。
标签和固定化物质的组合是在现有技术领域中公知，可举例如，生物素类(含生物素、脱硫生物素等的生物素类似物)和亲和素类(含亲和素、链霉亲和素等的亲和素类似物)、镍和组氨酸标签、谷胱甘肽和谷胱甘肽-S-转移酶、寡核苷酸和其互补链这样的组合。例如，作为标签，可使用脱硫生物素，作为固定化物质，使用亲和素或链霉亲和素。作为别的例，作为标签，可使用组氨酸标签，作为固定化物质，可使用镍。作为另外别的例，作为标签，可使用谷胱甘肽-S-转移酶，作为固定化物质，可使用谷胱甘肽。再者，作为标签，可使用寡核苷酸，作为固定化物质，可使用其互补链。
另外，作为别的实施方式，也可将标签和固定化物质由二硫键结合。此时，作为解离剂，可添加还原剂或切断二硫键的间隔物内或间隔物附近的酶，还原上述二硫键，或者将间隔物内或间隔物附近切断而解离标签和固定化物质。作为还原剂，可举β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫代赤藓糖醇、三(羟基丙基)膦、三(2-羧基乙基)膦等。
解离剂只要是可解离标签和固定化物质的结合，就不限制。解离剂可使用公知的分子。例如，在作为标签，使用脱硫生物素，作为固定化物质，使用亲和素或链霉亲和素时，作为解离剂，可使用生物素。由于生物素与亲和素或链霉亲和素的结合性比脱硫生物素强，在生物素存在下脱硫生物素和亲和素或链霉亲和素的结合解离。在将脱硫生物素的分子数或量设为1时，添加到反应液中的生物素的分子数或量优选为例如1倍～1兆倍。在作为标签，使用组氨酸标签，作为固定化物质，使用镍时，作为解离剂，可使用咪唑。在作为标签，使用谷胱甘肽-S-转移酶，作为固定化物质，使用谷胱甘肽时，作为解离剂，可使用还原型谷胱甘肽。再者，在作为标签，使用寡核苷酸，作为固定化物质，使用其互补链时，作为解离剂，可使用DNA分解酶、能解离DNA的双键的低盐浓度缓冲液等。另外，此时，也可代替解离剂而进行热变性。
解离剂的处理温度及处理时间可根据解离剂的种类适宜设定。通常可于20～45℃静置3分钟～2小时左右，或者稳搅拌。在作为解离剂，在使用生物素时，优选于20～30℃处理30分钟～1小时左右。
含标签的结合体的调制方法是公知的。标签和结合体可直接键合，也可间接结合。
固相可从在免疫学方法中惯用的公知的固相选择。作为这样的固相的材料，例如，可举出乳胶、橡胶、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、苯乙烯-丁二烯共聚物、聚氯乙烯、聚醋酸乙烯基、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、苯乙烯-甲基丙烯酸酯共聚物、聚缩水甘油基甲基丙烯酸酯、丙烯醛-乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物、聚偏二氟乙烯(PVDF)、硅酮、琼脂糖、明胶、红细胞、硅胶、玻璃、无活性氧化铝、磁性体等。另外，也可将这些的一种或两种以上组合。作为固相的形状，例如，可举出微量滴定板、试管、粒子等。粒子也可有磁性。磁性粒子是在现有技术中公知的，作为基材，可举出含Fe2O3及/或Fe3O4、钴、镍、千枚岩、磁铁矿等的粒子。
“流式细胞仪”是通过向流动池导入粒子，检测从各微粒子发生的信号(光学信号、电信号等)而对粒子进行分析的装置。
[2.生物体粒子的测定方法]
[2-1.第1测定方法]
在本公开中的第1测定方法涉及含使用抑制物质而检测非特异信号的生物体粒子的测定方法。
使用图1而说明第1测定方法的概略。
在图1中所示(1)中，从含生物体粒子的相同受试体独立地分取第1试样和第2试样。独立地分取是指将第1试样和第2试样分取到别的容器中。
在调制工序A中，检测体在第1试样和抑制物质的存在下混合。以在调制工序A中调制的测定试样作为第1测定试样。
在进行在抑制物质的存在下的检测体和第1试样的混合的实施方式中，可含以下的3个实施方式：
i.将第1试样和抑制物质混合后温育一定时间之后，添加检测抗体，
ii.将检测体和抑制物质混合后，将这些的混合液和第1试样混合，
iii.将第1试样和抑制物质混合后添加检测体
iv.将第1试样和检测体混合后添加抑制物质。
优选为i.～iii.之任一者。
上述i.的情况，可以将加检测体之后温育一定时间的作为第1 测定试样。
上述ii.的情况，可以将检测体和抑制物质的混合液与第1试样混合之后温育一定时间的作为第1测定试样。
上述iii.或iv.的情况，可以将检测体和抑制物质和第1试样的混合液温育一定时间的作为第1测定试样。
在上述中，一定时间是指，例如，在20℃～30℃左右的情况中，可例示30分钟～2小时左右，在0～10℃左右的情况中，可例示2小时～24小时左右。
检测体和抑制物质的混合比例可对应于对于目标部位的各结合体的亲和性而适宜设定。例如，在将检测体中所含的结合体的分子数或量设为1时，可将抑制物质中所含的结合体的分子数或量设为2倍～100倍左右、优选设为5倍～50倍左右。
在调制工序B中，检测体在第2试样和抑制物质实质上不存在的条件下混合。“抑制物质实质上不存在”是指不存在抑制物质，或存在不抑制检测体和生物体粒子的结合的程度的分子数。
可以将检测体和第2试样混合之后温育一定时间的作为第2测定试样。一定时间如调制工序A的说明中所例示。
调制工序B可在调制工序A之前，与调制工序A同时，或者调制工序A之后进行。
接下来，在图1中所示(2)中，将来源于第1测定试样中所含的标记物质的信号和来源于第2测定试样中所含的标记物质的信号由粒子测定装置检测。作为粒子测定装置，可例示流式细胞仪。
在将第1测定试样及第2测定试样用粒子测定装置测定时，可直接使用第1测定试样及第2测定试样，也可稀释而使用。在稀释时，可使用例如现有技术领域公知的PBS等的缓冲液。稀释倍率可例示例如5倍～20倍、优选10倍～15倍。
为了检测生物体粒子，有考虑粒子的大小的必要。因此，在流式细胞仪中的粒子的检测条件优选也设为能检测数十nm的粒子的条件。
例如，用于使第1测定试样及第2测定试样在流式细胞仪内流经的流速优选12μl/分左右。另外，检测生物体粒子时的光电压，例如前方散射光(FSC)的可设为700V左右，侧方散射光(SSC)的可设为 320V左右，在荧光染料是荧光素衍生物的情况可设为550V左右，在荧光染料是别藻蓝素(APC)的情况可设为500V左右。另外，SSC 的阈值可设为200V左右。
第1测定试样由于由抑制物质抑制检测体和生物体粒子的结合，因此检测不到要由检测体原本检测的生物体粒子。从而，来源于第1 测定试样中所含的标记物质的信号被认为是非特异信号。来源于第2 测定试样中所含的标记物质的信号被认为含特异信号和非特异信号这两方。
从来源于第1测定试样中所含的标记物质的信号的检测结果和来源于第2测定试样中所含的标记物质的信号的检测结果算出的结果可被认为是基于生物体粒子和检测体的特异性的反应的测定结果。具体而言，通过从来源于第2测定试样中所含的标记物质的信号的检测结果减去来源于第1测定试样中所含的标记物质的信号的检测结果，可算出基于生物体粒子和检测体的特异性的反应的测定结果。
[2-2.第2测定方法]
第2测定方法是在固相上形成生物体粒子和检测体的复合物之后使生物体粒子和检测体的复合物从固相解离，以解离的生物体粒子和检测体的复合物作为测定试样使用的生物体粒子的测定方法。
使用图2而说明第1测定方法的概略。
如图2的(1)所示，在第2测定方法中，首先在固相上形成生物体粒子和检测体的复合物。例如，在第2测定方法中，向固定化了固定化物质的固相添加捕获体而接触一定时间。也可在接触之后进行B/F 分离，除去未与固定化物质结合的未反应的捕获体。接下来，以受试体的原液、或者将受试体用PBS等稀释的稀释液作为试样与和固定化物质结合的捕获体接触一定时间，用固定化于固相上的捕获体捕获试样中的生物体粒子。也可在接触之后进行B/F分离，除去未与捕获体结合的试样成分。接下来，使捕获在捕获体的粒子和检测体接触一定时间。也可在接触之后进行B/F分离，除去未与生物体粒子结合的未反应的检测体。B/F分离以除去未反应成分的目的进行。
如图2的(2)所示，使解离剂与固定在固相的检测抗体-生物体粒子-捕获体的复合物接触一定时间，使检测抗体-生物体粒子-捕获体的复合物从固相解离。在本工序中，形成在固相上的检测抗体-生物体粒子-捕获体的复合物至少一部分解离即可。
如图2的(3)所示，以解离的检测抗体-生物体粒子-捕获体的复合物作为测定试样而供于由粒子测定装置的测定。
在本项中，一定时间是指，例如，在20℃～30℃左右的情况中，可例示可例示1秒钟～2小时左右，在0～10℃左右的情况中，1秒钟～ 24小时左右。
作为粒子测定装置，优选是流式细胞仪，检测抗体-生物体粒子- 捕获体的复合物的测定条件在其中援用上述2-1.的说明。
[2-3.第3测定方法]
第3测定方法是合并第1测定方法和第2测定方法的测定方法。
使用图3而说明第3测定方法的概略。
如图3的(1)所示，在第3测定方法中，在将含从受试体分取的生物体粒子的第i试样、捕获体和检测体混合时，在抑制物质的存在下混合，在固相上形成上述生物体粒子、上述捕获体和上述抑制物质的第i复合物(调制工序a-1)。
接下来，如图3的(2)所示，使用解离剂而调制含从固相解离的上述第i复合物的一部分或全部的第i测定试样(调制工序a-2)。
另外，如图3的(1)所示，在调制工序a-1之前，与调制工序a-1 同时，或者调制工序a-1之后，将从与上述受试体相同的受试体与第i 试样独立地分取的第ii试样、捕获体和上述检测体在上述抑制物质实质上不存在的条件下混合，在固相上形成上述生物体粒子、上述捕获体和上述检测体的第ii复合物(调制工序b-1)。
接下来，如图3的(2)所示，调制含从上述固相解离的上述第ii 复合物的一部分或全部的第ii测定试样(调制工序b-2)。
接下来，将来源于第i测定试样中所含的标记物质的信号和来源于第ii测定试样中所含的标记物质的信号由粒子测定装置检测。
再者，从来源于第i测定试样中所含的标记物质的信号的检测结果和来源于第ii测定试样中所含的标记物质的信号的检测结果算出上述生物体粒子的测定结果。
对于第i复合物的形成的说明、对于第ii复合物的形成的说明在其中援用上述2-1.及2-2.的说明。利用粒子测定装置的信号的检测及测定结果的算出方法在其中援用上述2-1.的说明。
[3.非特异信号的检测方法]
本公开含非特异信号的检测方法。非特异信号的检测方法包括将从通过将在上述2-1.中说明的含从受试体分取的生物体粒子的试样和检测体在能与生物体粒子结合并且不含上述标记物质的抑制物质的存在下混合而调制的测定试样检测的信号判断为非特异信号，将来源于上述测定试样中所含的标记物质的信号由粒子测定装置检测的检测工序。
对于测定试样的调制方法、及利用粒子测定装置的信号的检测方法而在其中援用上述2-1.的说明。
[4.粒子测定装置]
[4-1.装置的构成]
粒子测定装置10至少具备处理部101和存储部。存储部由主存储部102及/或辅助存储部104构成。装置10也可为用于实现记载在权利要求的方法的装置。在装置10及装置10的动作涉及的说明中，对于与上述2-1.中说明的用语共同的用语而在其中援用上述2-1.的说明。
图4及图5显示装置10的构成。装置10也可与输入部111、输出部112和存储介质113连接。另外，也可与流式细胞仪等的粒子测定装置等的测定部30连接。即，装置10有时构成与测定部30直接或经网络等连接的粒子测定系统50。
在装置10中，处理部101、主存储部102、ROM(read only memory) 103、辅助存储部104、通信接口(I/F)105、输入接口(I/F)106、输出接口(I/F)107和介质接口(I/F)108由总线109能互相数据通信地连接。
处理部101由CPU、MPU或GPU等构成。装置10通过处理部 101执行存储在辅助存储部104或ROM103的计算机程序，对取得的数据进行处理而发挥功能。处理部101取得将上述2-1.中所述的来源于第1测定试样中所含的标记物质的信号由粒子测定装置测定的结果和由粒子测定装置检测来源于第2测定试样中所含的标记物质的信号的结果。另外，从上述2个检测结果算出生物体粒子的测定结果。
ROM103由掩模型ROM、PROM、EPROM、EEPROM等构成，记录由处理部101执行的计算机程序及在其中使用的数据。ROM103 在装置10的启动时，存储由处理部101执行的启动程序或与装置10 的硬件的动作关联的程序或设定。
主存储部102由SRAM或DRAM等的RAM(Random access memory)构成。主存储部102在记录在ROM103及辅助存储部104 的计算机程序的读取中使用。另外，主存储部102作为处理部101执行这些计算机程序之时的作业区域利用。主存储部102暂时存储经网络而取得的信号的检测结果等。
辅助存储部104由硬盘、闪存等的半导体存储器元件、光盘等构成。在辅助存储部104中，存储操作系统及应用程序等的用于使处理部101执行的各种计算机程序及在计算机程序的执行中使用的各种设定数据。具体而言，不易失性地记忆信号的检测结果等。
通信I/F105由USB、IEEE1394、RS-232C等的串行接口、SCSI、 IDE、IEEE1284等的并行接口、及由D/A变换器、A/D变换器等组成的模拟接口、网络接口控制器(Networkinterface controller：NIC)等构成。通信I/F105在处理部101的控制下，接收来自测定部30或其他外部机器的数据，根据需要向测定部30或外部发送或显示装置10 保存或生成的信息。通信I/F105也可经网络而与测定部30或其他外部机器(未图示，例如其他计算机、或者云系统)进行通信。
输入I/F106例如由USB、IEEE1394、RS-232C等的串行接口、SCSI、 IDE、IEEE1284等的并行接口、及由D/A变换器、A/D变换器等组成的模拟接口等构成。输入I/F106从输入部111接受文字输入、点击、声音输入等。接受的输入内容存储在主存储部102或辅助存储部104。
输入部111由触控面板、键盘、鼠标、手写板、话筒等构成，向装置10进行文字输入或声音输入。输入部111可从装置10的外部连接，也可与装置10成为一体。
输出I/F107例如由与输入I/F106同样的接口构成。输出I/F107 将处理部101生成的信息输出到输出部112。输出I/F107将处理部101 生成、存储在辅助存储部104的信息输出到输出部112。
输出部112由例如显示器、打印机等构成，显示从测定部30发送的测定结果及在装置10中的各种操作视窗、分析结果等。
介质I/F108读取存储在存储介质113的例如应用软件等。读取的应用软件等存储在主存储部102或辅助存储部104。另外，介质I/F108 向存储介质113写入处理部101生成的信息。介质I/F108向存储介质 113写入处理部101生成、存储在辅助存储部104的信息。
存储介质113由软盘、CD-ROM、或者DVD-ROM等构成。存储介质113由软盘驱动器、CD-ROM驱动器、或者DVD-ROM驱动器等与介质I/F108连接。在存储介质113中，也可收纳用于使计算机执行操作的应用程序等。
处理部101也可代替从ROM103或辅助存储部104读取对于装置 10的控制必要的应用软件或各种设定而经网络取得。上述应用程序收纳在网络上的服务器计算机的辅助存储部内，向此服务器计算机接入装置10而下载计算机程序，将其存储在ROM103或辅助存储部104 也是可能的。
另外，在ROM103或辅助存储部104中，安装例如美国微软公司制造销售的Windows(注册商标)等的提供图形用户界面环境的操作系统。应用程序作为在上述操作系统上运行的。即，装置10可为个人计算机等。
[4-2.装置的动作]
接下来，使用图6而对于装置10的动作的例进行说明。装置10 的动作根据使计算机执行后述的用于算出生物体粒子的检测结果的步骤的计算机程序而控制装置10的处理部101。
处理部101根据由检查者等从输入部111输入的处理开始的指令而取得将上述2-1中所述的来源于第1测定试样中所含的标记物质的信号由粒子测定装置测定的结果(步骤S1)。
处理部101取得将上述2-1中所述的来源于第2测定试样中所含的标记物质的信号由粒子测定装置测定的结果(步骤S2)。进行步骤 S1和步骤S2的顺序不限制。可在先进行步骤S2，也可同时进行步骤 S1和步骤S2。
处理部101从步骤S1中取得的信号的检测结果和在步骤S2中取得的信号的检测结果这2个检测结果算出生物体粒子的测定结果。具体而言，通过从步骤S2中取得的信号的检测结果减去步骤S1中取得的信号的检测结果，算出生物体粒子的测定结果(步骤S3)，结束处理。
处理部101也可在步骤S3之后，进行将生物体粒子的测定结果存储在辅助存储部104，输出到输出部112，及/或发送到上述外部机器 (未图示)。
[5.程序及存储上述计算机程序的存储介质]
计算机程序使计算机执行上述步骤S1～S3。上述计算机程序使计算机作为粒子测定装置10发挥功能。
计算机程序也可存储在存储介质。即，上述计算机程序存储在硬盘、闪存等的半导体存储器元件、光盘等的存储介质。另外上述计算机程序也可存储在能由云服务器等的网络连接的存储介质。计算机程序也可为下载形式的，或者存储在存储介质的程序制品。
程序向上述存储介质的存储形式只要是上述提示装置能读取上述程序，就不限制。向上述存储介质的存储优选为不易失性的。
[6.检查试剂盒]
[6-1.第1检查试剂盒]
检查试剂盒含检测体及抑制物质。图7显示试剂盒150的概略图。
试剂盒150也可在收容检测体的容器151和收容抑制物质的容器 152和试剂盒150中含记载处理说明书或可阅览处理说明书的URL的用纸154。再者，在试剂盒150中也可含收纳这些容器的箱155。另外，试剂盒150也可含收容捕获体的容器151。虽未图示，试剂盒也可含用于使捕获体固定化的固相。
检查试剂盒用于实施记载在上述2-1.、上述2-3.、上述3.的方法。
[6-2.第2检查试剂盒]
检查试剂盒含检测体及捕获体。图7显示试剂盒150的概略图。
试剂盒150也可在收容检测体的容器151和收容捕获体的容器152 和试剂盒150中含记载处理说明书或可阅览处理说明书的URL的用纸 154。再者，在试剂盒150中也可含收纳这些容器的箱155。另外，试剂盒150也可含收容抑制物质的容器151。虽未图示，试剂盒也可含用于使捕获体固定化的固相。
检查试剂盒用于实施记载在上述2-2.、上述2-3.的方法。
以上、对于装置10、装置10的动作、计算机程序、检查试剂盒而参照附图详细地进行说明，但本发明不限定于上述说明的具体性的实施方式。本发明的实施方式可基于本说明书的记载和本领域技术人员的技术常识而变形。
【实施例】
接下来，使用实施例而对于本公开的内容而更详细地进行说明，但本公开不限于实施例中解释的。
[材料及方法]
(1)抗体
在本次的探讨中使用下述表1中所示的抗体。作为抑制物质，使用未标记抗体，作为检测体，使用与荧光标记的未标记抗体相同的克隆的抗体。
【表1】
| 抗原 | 克隆 | 标记 | 厂商 | 型号 |
| CD146 | P1H12 | APC | BioLegend | 361016 |
| CD61 | VI-PL2 | FITC | BioLegend | 336404 |
| CD235a | HIR2 | APC | BioLegend | 306608 |
| 同种型对照IgG2b | MPC-11 | APC | BioLegend | 400320 |
(2)血浆受试体
从ProMedDx公司(代理店：株式会社SUNFCO)购入由以下的流程调制的血浆。
从健康人6名用含3.2％柠檬酸的采血管采血后，在15分钟以内以1500RCF离心15分钟。回收上清之后，将上清于-20℃冷冻保存。交付后，快速-80℃保存。
在将健康人的6受试体用流水融解后混合，在解析中使用。
(3)模型细胞的培养
作为模型细胞，使用HUVEC。HUVEC用添加了2％牛胎儿血清的内皮成长培养基(EGM)培养。在细胞达80％汇合之时回收含细胞外小泡的培养上清。将20ml相当的上述培养上清以1,500RCF离心 15分钟而回收上清，再以20,000 RCF离心30分钟而调制培养细胞来源细胞外小泡。
(4)分析用样品
分析用的样品通过将从上述血浆100μl和1ml的培养上清回收的培养细胞来源细胞外小泡混合调制。
(5)流式细胞术
流式细胞术使用FACS Verse(Becton Dickinson)而进行。将用 PBS稀释的各反应液在表2中所示的条件下测定，取得荧光强度和FSC 的散点图。在表2中，FSC表示前方散射光，SSC表示侧方散射光。另外，测定时的流速设为12μl/min，测定时间设为1分钟。
【表2】
| 测定项目 | 电压[V] | 阈值[V] |
| FSC | 700 | |
| SSC | 320 | 200 |
| FITC | 550 | |
| APC | 500 |
[参考例]
1.由以往方法的粒子的检测
以APC标记抗CD235a抗体作为检测体使用。作为同种型对照(阴性抗体对照)，使用APC标记同种型对照IgG2b。
向上述[材料及方法]的(2)中准备的血浆12.5μl添加0.125μgAPC 标记的抗CD235a抗体或同种型对照抗体，接触20分钟。将此反应液用PBS稀释14倍而作为测定样品。
流式细胞术使用FACS Verse(Becton Dickinson)而进行。将用 PBS稀释的各反应液在表3中所示的条件下测定，取得荧光强度和FSC 的散点图。在表3中，FSC表示前方散射光，SSC表示侧方散射光。另外，测定时的流速设为12μl/min，测定时间设为1分钟。
【表3】
| 测定项目 | 电压[V] | 阈值[V] |
| FSC | 700 | |
| SSC | 320 | 200 |
| APC | 500 |
2.结果
图8显示在流式细胞仪中取得的结果。图8A显示使用APC标记抗CD235a抗体而检测的信号。图8B显示使用APC标记同种型对照抗体而检测的信号。图8A中所示的阳性区域的框内是检测到来源于原本细胞外小泡上的CD235a的阳性信号的阳性区域。在图8B中检测到此区域内不应原本检测到的信号。因此，本发明人认为，由以往方法判别的阳性区域含非特异信号。
[实施例]
1.实施例1
使抑制物质在检测体之前与样品中的细胞外小泡反应，探讨抑制效果。
1-1.细胞外小泡和检测抗体的反应
在细胞外小泡和检测抗体的反应中，向样品10μl添加检测抗体 1～2μl(0.1μg相当)，以总体积成为11～12μl的方式调制。
向6条管分注各10μl上述[材料及方法]的(4)中调制的样品，向其中3条管添加各1μg表1中所示的未标记的抗CD146抗体、抗 CD61抗体、抗CD235a抗体，温育1小时。另外，不向其余的3条管添加抗体，温育1小时。
另外，对于在上述[材料及方法]的(3)中准备的培养细胞来源细胞外小泡也用所使用的培养上清的1/10量的PBS稀释之后，向2 条管分注各10μl，在一方面，添加1μg未标记的抗CD146抗体，在另一方的管中什么也不添加而温育1小时。
再者，对于在上述[材料及方法]的(2)中准备的血浆，也向2 条管各分注10μl，在一方面，添加1μg未标记的抗CD146抗体，在另一方的管中什么也不添加而温育1小时。
向添加了未标记的抗CD146抗体的管添加0.1μg荧光标记的抗 CD146抗体，向添加了未标记的抗CD61抗体的管添加0.1μg荧光标记的抗CD61抗体，向添加了未标记的抗CD235a抗体的管添加0.1μg 荧光标记的抗CD235a抗体。向未添加未标记抗体的3条管也添加各 0.1μg各自荧光标记的抗CD146抗体、抗CD61抗体、或者抗CD235a 抗体。另外，向分注了血浆或培养上清的管也添加0.1μg各自荧光标记的抗CD146抗体。添加荧光标记抗体后温育30分钟。
将结束温育的各反应液用PBS稀释14倍而供于流式细胞术。流式细胞术的测定条件根据上述[材料及方法]的(5)。
1-2.结果
使用抗CD146抗体的细胞外小泡的流式细胞术的结果示于图9。通过进行由未标记的抗CD146抗体的抑制，与不进行抑制的测定比，信号显著地减少(被下段的实线包围的部分)。结果，通过进行抑制，荧光标记的抗CD146抗体无法与目标分子结合，被认为由于检测不到信号。
一方面，在血浆样品的测定结果中，被虚线包围的部分不管有无抑制物质，均得到了同样地信号。被虚线包围的部分的信号被认为是因不受由抗CD146抗体的抑制的影响而与CD146无关系的非特异性的信号。
使用抗CD61抗体或抗CD235a抗体的细胞外小泡的流式细胞术的结果示于图10。在抗CD61抗体或抗CD235a抗体中也可确认到同样地抑制的效果，特异性的信号和非特异性的信号的判别是可能的。
这些结果表示，通过对进行抑制处理的测定结果和不进行抑制处理的测定结果进行比较，可区别特异性的信号和非特异性的信号而解析。
从而认为，通过从自未进行抑制的测定样品得到的生物体粒子的信号的测定值减去从进行抑制的测定样品得到的生物体粒子的信号的测定值，可取得实际测定值。
2.实施例2
在作为抑制物质的未标记抗体存在下使检测抗体和样品反应，探讨抑制的效果。
2-1.细胞外小泡和检测抗体的反应
对于上述[材料及方法]的(1)抗CD61抗体、(2)血浆受试体、(3)模型细胞的培养、(4)分析用样品、(5)流式细胞术，在本项中也同样。
接下来，变更未标记抗体和检测抗体的比率而探讨抑制的效果。
向4条管分注各10μl上述1-1.(4)中调制的样品。向各自的管添加将各自0μg(未添加未标记抗体)、0.5μg(未标记抗体5倍量)、 1μg(未标记抗体10倍量)、10μg(未标记抗体100倍量)表1中所示的未标记的抗CD61抗体和0.1μg荧光标记的抗CD61抗体混合的溶液而温育1小时。
将结束温育的各反应液用PBS稀释14倍而供于流式细胞术。
2-2.结果
使用抗CD61抗体的细胞外小泡的流式细胞术的结果示于图11。在图11的左上图(无未标记抗体)中被虚线包围的部分的信号在图 11的右上图(未标记抗体5倍量)、左下图(未标记抗体10倍量)、右下图(未标记抗体100倍量)中，消失。由此表示，通过使未标记抗体和检测抗体竞争结合而得到了抑制效果。
3.实施例3
在本实施例中，先向固相固定化细胞外小泡，使检测抗体和细胞外小泡反应之后，使用从固相解离检测抗体和细胞外小泡的复合物的测定样品而进行由流式细胞术的解析。
3-1.细胞外小泡和检测抗体的反应
以APC标记抗CD235a抗体(克隆：HIR2、BioLegend、306608) 作为检测体使用。作为同种型对照(阴性抗体对照)，使用APC标记同种型对照IgG2b(克隆：MPC-11、BioLegend、400320)。作为捕获体，使用脱硫生物素标记抗CD235a抗体(克隆：HIR2、BioLegend、306602)。细胞外小泡和检测抗体的反应根据以下的顺序进行。
i.以成为2μg/ml的方式调制脱硫生物素标记的抗CD235a抗体或同种型对照抗体的PBS溶液，在使链霉亲和素固相的96孔板上以 100μl/孔添加而温育1小时。
ii.舍弃96孔板内的抗体溶液而将96孔板用PBS清洗3次，以 100μl/孔添加血浆而温育1小时，在96孔板上捕获血浆中的细胞外小泡。
iii.通过舍弃96孔板内的血浆而将96孔板用PBS清洗3次，以 1μg/ml浓度添加APC标记的抗CD235a抗体或同种型对照抗体，以 100μl/孔温育1小时来形成免疫复合物。
iv.通过舍弃96孔板内的抗体溶液而将96孔微平板用PBS清洗 3次，以100μl/孔添加1mM生物素溶液而接触1小时来溶出免疫复合物，回收孔内的溶液，作为测定样品。
流式细胞术根据上述参考例中记载的条件而进行。
3-2.结果
图12显示在流式细胞仪中取得的结果。图12A显示由本公开的方法，使用APC标记抗CD235a抗体而检测的信号。图12B显示由本公开的方法，使用APC标记同种型对照抗体而检测的信号。图12A中所示的阳性区域的框内是检测到来源于原本细胞外小泡上的CD235a的信号的区域。在图8B中在此区域内检测到非特异性的信号。与此相比，在图12B中，非特异性的信号显著地减少。由此表示，本公开中的方法在使用流式细胞仪检测细胞外小泡时，对于使非特异性的信号减少而言有效。
【符号的说明】
10：粒子测定装置
101：处理部
Claims (19)
1.生物体粒子的测定方法，其包括：
(a)将下列试样供于信号检测的检测工序：
通过将从受试体分取的含生物体粒子的第1试样和能与上述生物体粒子结合并且含标记物质的检测体在能与上述生物体粒子结合并且不含上述标记物质的抑制物质的存在下混合而调制的第1测定试样、及
通过将从与上述受试体相同的受试体与上述第1试样独立地分取的第2试样和上述检测体在上述抑制物质实质上不存在的条件下混合而调制的第2测定试样，
其中，在上述检测工序中检测到来源于上述第1测定试样中所含的上述标记物质的信号和来源于上述第2测定试样中所含的上述标记物质的信号，及
(b)从来源于上述第1测定试样中所含的上述标记物质的信号的检测结果和来源于上述第2测定试样中所含的上述标记物质的信号的检测结果算出上述生物体粒子的测定结果的算出工序。
2.权利要求1所述的生物体粒子的测定方法，其中上述标记物质是荧光物质。
3.权利要求1或2所述的生物体粒子的测定方法，其中抑制：
上述检测体与存在于上述生物体粒子的目标分子中所含的目标部位结合，
上述抑制物质的至少一部分与上述目标部位结合，
上述检测体与上述目标部位结合。
4.权利要求3所述的生物体粒子的测定方法，其中上述目标分子是蛋白质或糖链。
5.权利要求3或4所述的生物体粒子的测定方法，其中上述检测体含与上述目标部位结合的抗体。
6.权利要求3～5之任一项所述的生物体粒子的测定方法，其中上述抑制物质含与上述目标部位结合的抗体。
7.权利要求5所述的生物体粒子的测定方法，其中上述检测体含与上述目标部位结合的凝集素。
8.权利要求1～7之任一项所述的生物体粒子的测定方法，其中在上述第1测定试样的调制中，将上述第1试样和上述抑制物质混合，上述抑制物质的至少一部分与上述生物体粒子结合之后，将上述检测体混合而调制上述第1测定试样。
9.权利要求1～7之任一项所述的生物体粒子的测定方法，其中在上述第1测定试样的调制中，以上述检测体和上述抑制物质竞争结合的方式将上述检测体、上述抑制物质和上述第1试样混合而调制上述第1测定试样。
10.权利要求1～9之任一项所述的生物体粒子的测定方法，其中在上述算出工序中，通过从来源于上述第2测定试样中所含的上述标记物质的信号的检测结果减去来源于上述第1测定试样中所含的上述标记物质的信号的检测结果而算出上述生物体粒子的测定结果。
11.权利要求1～10之任一项所述的生物体粒子的测定方法，其中上述受试体选自：全血、血浆、血清、脑脊髓液、淋巴液、及细胞间质液。
12.权利要求1～11之任一项所述的生物体粒子的测定方法，其中上述生物体粒子的大小是30nm以上、并且1,000nm以下。
13.权利要求1～12之任一项所述的生物体粒子的测定方法，其中上述生物体粒子是选自下列的至少一种：外泌体、微颗粒、凋亡小体、及蛋白质凝集体。
14.权利要求1～13之任一项所述的生物体粒子的测定方法，其中由流式细胞仪进行在上述检测工序中的信号的检测。
15.非特异信号的检测方法，其中
由粒子测定装置从通过将从受试体分取的含生物体粒子的试样和能与上述生物体粒子结合并且含标记物质的检测体在能与上述生物体粒子结合并且不含上述标记物质的抑制物质的存在下混合来调制的测定试样检测来源于上述标记物质的信号，
将检测的信号判断为非特异信号。
16.生物体粒子的测定方法，其包括：
将从受试体分取的含生物体粒子的第i试样、能与含与固相能解离地结合的标签的上述生物体粒子结合的捕获体和能与上述生物体粒子结合并且含标记物质的检测体在能与上述生物体粒子结合并且不含上述标记物质的抑制物质的存在下混合，在上述固相上形成上述生物体粒子、上述捕获体和上述抑制物质的第i复合物的调制工序a-1，
调制含从上述固相解离的上述第i复合物的一部分或全部的第i测定试样的调制工序a-2，
将从与上述受试体相同的受试体与上述第i试样独立地分取的第ii试样和上述捕获体和上述检测体在上述抑制物质实质上不存在的条件下混合，在上述固相上形成上述生物体粒子、上述捕获体和上述检测体的第ii复合物的调制工序b-1，
调制含从上述固相解离的上述第ii复合物的一部分或全部的第ii测定试样的调制工序b-2，
将来源于上述第i测定试样中所含的上述标记物质的信号和来源于上述第ii测定试样中所含的上述标记物质的信号由粒子测定装置检测的检测工序，
从来源于上述第i测定试样中所含的上述标记物质的信号的检测结果和来源于上述第ii测定试样中所含的上述标记物质的信号的检测结果算出上述生物体粒子的测定结果的算出工序。
17.粒子测定装置，其具备取得下列结果的处理部：
对于将从受试体分取的含生物体粒子的第1试样和与上述生物体粒子结合并且含标记物质的检测体在能与上述生物体粒子结合并且不含上述标记物质的抑制物质的存在下混合而调制的第1测定试样，将来源于上述第1测定试样中所含的上述标记物质的信号由粒子测定装置检测的结果，和
对于将从与上述受试体相同的受试体与上述第1试样独立地分取的第2试样和上述检测体在上述抑制物质实质上不存在的条件下混合而调制的第2测定试样，将来源于上述第2测定试样中所含的上述标记物质的信号由粒子测定装置检测的结果，
从来源于上述第1测定试样中所含的上述标记物质的信号的测定结果和来源于上述第2测定试样中所含的上述标记物质的信号的检测结果算出上述生物体粒子的测定结果。
18.用于检测生物体粒子的试剂盒，其含：
能与生物体粒子结合并且含标记物质的检测体，和
能与上述生物体粒子结合并且不含上述标记物质的抑制物质。
19.检测体及抑制物质用于制造用于检测生物体粒子的试剂盒的用途，其中
上述检测体能与上述生物体粒子结合并且含标记物质，
上述抑制物质能与上述生物体粒子结合并且不含上述标记物质，
上述试剂盒在权利要求1～16之任一项所述的方法中使用。
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