CN101885775B

CN101885775B - 重金属汞多克隆抗体的制备及其酶联免疫吸附测定方法

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Publication number: CN101885775B
Application number: CN 201010229009
Authority: CN
Inventors: 周培; 奚涛; 邢海波; 曹成喜
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2010-07-16
Filing date: 2010-07-16
Publication date: 2013-07-10
Anticipated expiration: 2030-07-16
Also published as: CN101885775A

Abstract

一种重金属检测技术领域的重金属汞多克隆抗体的制备及其酶联免疫吸附测定方法。通过将双工能螯合剂青霉素G钠盐的一端结合重金属汞，另一端与大分子载体蛋白牛血清白蛋白、卵清蛋白偶联形成汞-螯合剂-蛋白的免疫原MMPA-BSA和包被原MMPA-OVA，最后经对免疫原MMPA-BSA进行乳化、免疫后制备多克隆抗体用于酶联免疫吸附测定，本发明制备得到的抗体对汞离子具有很高的特异性，除了与镉的交叉反应率为7.9％之外，其他金属的均小于0.001％，添加回收率在91.4％-120％之间，可用于水样中的重金属汞的测定，也可以通过结合一定的前处理技术发展为快速检测农产品等其他样品中重金属汞的快速免疫检测技术。

Description

重金属汞多克隆抗体的制备及其酶联免疫吸附测定方法

技术领域

本发明涉及的是一种重金属检测技术领域的方法，具体是一种重金属汞多克隆抗体的制备及其酶联免疫吸附测定方法。

背景技术

近年来，随着工农业迅速发展，重金属污染日益加剧，造成的环境及食品安全问题也日益突出。重金属主要通过水循环，经由饮用水及农产品等途径，进入人体，威胁人们健康。污染水体的重金属主要包括Hg、Cd、Cr、Cu、Co、Ni等，其中Hg的毒性最大，因此快速检测重金属汞污染现状，显得尤为重要。目前，重金属的检测分析方法主要有：原子吸收光谱分析(AAS)、电感耦合等离子发射光谱(ICP-AES)、电感耦合等离子质谱分析(ICP-MS)、原子荧光光谱分析(AFS)等。这些检测方法虽然可以精确地测定重金属的含量，但需要对样品做繁琐的预处理步骤，检测过程需在配备大型分析仪器的室内进行，且需要专业的仪器操作员，检测费用也代价高昂，难以快速、简便、费用低廉地检测环境中的重金属汞。

经过对现有技术的检索发现，Reardan等人于1985年首次利用螯合剂螯合金属制备单克隆抗体以来，重金属免疫学检测方法受到了国内外的广泛关注，尤其是近些年相关研究越来越多，多种重金属包括Cd²⁺、Hg²⁺、Pb²⁺、U⁶⁺、Cu²⁺、Zn²⁺等螯合剂复合物的抗体均有研究报道，其主要集中于单克隆抗体。

进一步检索发现，Huan He等在Analytical Letters(42：409-424，2009)上公开了用EDTA衍生物螯合镉制备多克隆抗体进行间接酶联免疫吸附的研究。多克隆抗体就特异性而言不如单克隆抗体，但其检测方法也可以达到一定的检测要求。青霉素G盐作为双功能螯合剂连接重金属汞及大分子蛋白，藉此作为免疫原制备多克隆抗体，建立IC-ELISA，未见报道先例。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种重金属汞多克隆抗体的制备及其酶联免疫吸附测定方法，针对水样中汞离子的检测限为14.5μg/L，对汞离子具有很高的特异性，可以运用于重金属污染地区及污染样本的快速检测。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种重金属汞多克隆抗体的制备方法，通过将双工能螯合剂青霉素G钠盐的一端结合重金属汞，另一端与大分子载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)偶联形成汞-螯合剂-蛋白的免疫原MMPA-BSA和包被原MMPA-OVA，最后经对免疫原MMPA-BSA进行乳化、免疫后制备多克隆抗体，其反应式如下：

所述的将双工能螯合剂青霉素G钠盐的一端结合重金属汞是指：取青霉素G钠盐或钾盐的水溶液中加入咪唑，搅拌溶解后逐滴加入HCl并调节pH到6.8，然后加入HgCl₂经水浴反应并冷却后产生黄色粉末状沉淀，最后再加入HCl并震荡离心处理后弃去上清，得到青霉烯酸硫醇汞盐。

所述的与大分子载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)偶联是指：采用碳二亚胺法和载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)加入青霉烯酸硫醇汞盐，经室温反应并透析后得到免疫原Hg-青霉素-BSA和包被原Hg-青霉素-OVA。

所述的偶联中采用紫外吸收法对完全抗原进行扫描，并且对完全抗原中的蛋白含量和重金属汞的含量进行测定，分别采用考马斯亮蓝法和电感耦合等离子发射光谱法，确定抗原是否合成成功

本发明涉及上述重金属汞多克隆抗体的酶联免疫吸附测定方法，包括以下步骤：

第一步、酶联免疫吸附测定方法，包括用棋盘法优化多克隆抗体及包被抗原工作浓度，建立IC-ELISA，绘制出标准曲线，具体为：将重金属汞多克隆抗体加入到孔底固定有表面半抗原的酶标板孔中，使待测抗原与固相载体表面半抗原竞争抗体表面的结合位点。

第二步、优化二抗、包被缓冲液、包被介质工作浓度，具体为：加入酶标记的二抗，二抗与结合在固相载体表面抗原上的抗体反应，也固定在固相载体上，使得底物被酶催化成为有色产物，而产物的量与待测重金属标准溶液的量相关，呈现的颜色通过紫外光一定波长下测定吸光度值，以进行定性或定量分析。

第三步、检验该IC-ELISA方法中其他金属Cu²⁺、Cd²⁺、Pb²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Fe²⁺、Ni²⁺的干扰，建立对水样的添加回收实验，实现对酶联免疫吸附的测定。

本发明在制备重金属汞多克隆抗体的基础上，建立了测定水样中汞离子含量的间接竞争酶联免疫吸附测定方法。本发明的检测限为14.5μg/L，对汞离子具有很高的特异性，除了与镉的交叉反应率为7.9％之外，其他金属的均小于0.001％，添加回收率在91.4％-120％之间。本方法可用于水样中的重金属汞的测定，也可以通过结合一定的前处理技术发展为快速检测农产品等其他样品中重金属汞的快速免疫检测技术。

附图说明

图1为本发明测定方法示意图。

图2为实施例重金属抑制率示意图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

多克隆抗体的制备

步骤1：完全抗原的合成

取青霉素G钠盐或钾盐50mg溶解在10ml超纯水中，加入1g咪唑，搅拌使其完全溶解，逐滴加入1M HCl调pH到6.8；加入与青霉素G钠盐或钾盐等物质量的HgCl₂，60℃水浴2小时，取出室温中冷却，反应产生黄色粉末状沉淀。

在所得溶液中加入过量的1M HCl，边滴边轻轻震荡，溶液中产生大量黄色絮状沉淀，将溶液分装在4mlEP管中，10000r/m离心5分钟，弃去上清；在EP管中加入超纯水洗涤沉淀，振荡2min，然后10000r/m离心5分钟，重复洗涤2次，得到青霉烯酸硫醇汞盐。

采用碳二亚胺法(Harlow and Lane，1988)与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)，反应液在缓慢搅拌下室温反应24小时后装入预处理过的透析袋中，PBS缓冲液透析三次，纯水透析二次，4℃透析3天。然后取透析液，即为免疫原Hg-青霉素-BSA，低温保存。相同方法制备包被原Hg-青霉素-OVA。

用电感耦合等离子发射光谱测定汞的含量，考马斯亮蓝染色法测定蛋白含量。根据重金属汞与蛋白的摩尔比得出偶联比，MMPA-BSA与MMPA-OVA偶联比分别为25/1与9/1。

步骤2：抗体的制备与鉴定

MMPA-BSA作为免疫原，共分5次免疫，初免采用弗氏完全佐剂与免疫原等体积乳化，28天后的二免及以后的免疫均用弗氏不完全佐剂作为乳化剂且间隔为2周，最后一次免疫之后8～10天，获得多克隆抗体，分装后于-20℃冻存。

通过间接非竞争ELISA法测定抗体效价，以效价高用作后续间接竞争ELISA的建立。

效价检测步骤包括：

(1)以MMPA-OVA及青霉素-OVA作为包被原包被，100μL/孔，4℃过夜，洗涤3次，拍干；(2)封闭，200μL/孔，37℃2h，洗涤3次，拍干；(3)加抗体(稀释成2000、4000、8000、16000、32000、64000、128000倍)100μL/孔，37℃1h，洗涤3次，拍干；(4)加酶标二抗(2000倍稀释)，37℃1h，洗涤3次，拍干；(5)加TMB反应液显色，100μL/孔，37℃10min；(6)加50μL/孔2M硫酸终止反应；(7)酶标仪测OD450值，值若等于或大于阴性的2.1倍即为阳性。

测试结果显示以青霉素-OVA作为包被原的没有阳性反应，可见抗体并非是针对青霉素的；经测定效价超过1∶128000，可以进行酶联免疫吸附试验。

实施例2

酶联免疫吸附测定方法

步骤一：效价测定

采用棋盘法优化抗原抗体最佳工作浓度：把包被抗原MMPA-OVA用碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释到一定浓度(1，1.3，2，2.5，3，4，5，10μg/mL)，分别包被在96孔酶标板A～H排，抗体也稀释一定倍数(4000，8000，10000，12000，16000，32000)加入1～6列，其余列作为对照；用间接非竞争ELISA的方法测定出OD₄₅₀值，以0.8～1.2的值为最优值，即该值对应的为最佳工作浓度。确定最佳包被原浓度为MMPA-OVA 2.5μg/mL，最佳抗体稀释度为1∶8000。

步骤二：IC-ELISA法测定重金属汞方法建立

用间接竞争ELISA法建立抗体对重金属汞的检测方法。

0.5mM EDTA与汞标准溶液混合，形成浓度为0.01，0.05，0.1，0.5，1，5，10mg/mL的反应液，与等体积抗体溶液先混合过夜为样品进行前抑制。

间接竞争ELISA法的步骤如下：

(1)前处理：0.5mM EDTA与标准溶液(待测样)预混，37℃温浴1h。

(2)包被：包被原用CB缓冲液100μL/孔包被4℃过夜，洗板3次。

(3)封闭：200μL/孔5％甘氨酸37℃封闭1h，洗板3次。

(4)加样：将预混好的样品50μL/孔加入，用PBS稀释抗体到两倍工作浓度，50μL/孔加入，振荡10min，37℃温浴2h，洗板3次。

(5)加酶标二抗；1∶2000倍稀释的酶标二抗100μL/孔，37℃温浴1h，洗板3次。

(6)显色：加TMB底物液显色10min。

(7)终止反应：50μL/孔2M硫酸终止反应，450nm下读取OD值。

步骤三：优化条件

在ELISA试验中，封闭介质的作用是消除非特异性吸附，本方法中比较了各种不同的封闭剂包括1％明胶，8％脱脂奶粉，5％甘氨酸，2％BSA，2％OVA对ELISA的影响，确定了5％甘氨酸为封闭介质。

本方法还比较了不同的二抗稀释度及不同的包被缓冲液对ELISA的影响，确定了最佳稀释比例为1∶2000～8000，碳酸盐缓冲液(CB，pH9.6)为最佳包被缓冲液。

步骤四：方法评价与应用

根据IC-ELISA测定的OD₄₅₀值，以未添加汞标准溶液的OD值为B₀，添加了标准溶液的OD值为B₁，按公式(B₀-B₁)/B₀×100％计算抑制率；以抑制物(汞标准溶液)对数值为横坐标，抑制率为纵坐标绘制得标准曲线，见图1，用直线拟合后得回归方程Y＝0.17886X-0.10732，相关系数为0.988，以抑制率为10％的待测样品汞含量(IC₁₀)作为检测限，为0.0145μg/mL。

按本例步骤二，用其他金属Cu²⁺、Cd²⁺、Pb²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Fe²⁺、Ni²⁺的标准溶液代替汞的标准溶液检验交叉反应率，交叉反应率公式如下CR＝IC₅₀(汞)/IC₅₀(其他金属)×100％。结果验证抗体对于汞具有很高的特异性，除了重金属镉有7.9％的交叉反应率外，其他的供试金属交叉反应率都小于0.001％。

通过对纯水中按5，0.5，0.05μg/mL三种不同浓度添加汞离子，按步骤二进行试验，检验添加回收率，得添加回收率在91.40％～120％之间。

Claims

1.一种重金属汞多克隆抗体的酶联免疫吸附测定方法，包括以下步骤：

步骤1：取青霉素G钠盐或钾盐50mg溶解在10ml超纯水中，加入1g咪唑，搅拌使其完全溶解，逐滴加入1M HCl调pH到6.8;加入与青霉素G钠盐或钾盐等物质量的HgC1₂，60℃水浴2小时，取出室温中冷却，反应产生黄色粉末状沉淀；在所得溶液中加入过量的1M HCl，边滴边轻轻震荡，溶液中产生大量黄色絮状沉淀，将溶液分装在4mlEP管中，10000r/m离心5分钟，弃去上清;在EP管中加入超纯水洗涤沉淀，振荡2min，然后10000r/m离心5分钟，重复洗涤2次，得到青霉烯酸硫醇汞盐；采用碳二亚胺法与载体蛋白牛血清白蛋白反应，反应液在缓慢搅拌下室温反应24小时后装入预处理过的透析袋中，PBS缓冲液透析三次，纯水透析二次，4℃透析3天；然后取透析液，即为免疫原Hg-青霉素-BSA，低温保存，相同方法制备包被原Hg-青霉素-OVA；用电感耦合等离子发射光谱测定汞的含量，考马斯亮蓝染色法测定蛋白含量，根据重金属汞与蛋白的摩尔比得出偶联比，MMPA-BSA与MMPA-OVA偶联比分别为25/1与9/1；

步骤2：MMPA-BSA作为免疫原，共分5次免疫，初免采用弗氏完全佐剂与免疫原等体积乳化，28天后的二免及以后的免疫均用弗氏不完全佐剂作为乳化剂且间隔为2周，最后一次免疫之后8～10天，获得多克隆抗体，分装后于-20℃冻存；通过间接非竞争ELISA法测定抗体效价，以效价高用作后续间接竞争ELISA的建立；以MMPA-OVA及青霉素-OVA作为包被原包被，100μL/孔，4℃过夜，洗涤3次，拍干，封闭，200μL/孔，37℃2h，洗涤3次，拍干，加抗体，稀释成2000、4000、8000、16000、32000、64000、128000倍，100μL/孔，37℃1h，洗涤3次，拍干；加酶标二抗2000倍稀释，37℃1h，洗涤3次，拍干；加TMB反应液显色，100μL/孔，37℃10min；加50μL/孔2M硫酸终止反应；酶标仪测OD450值，值若等于或大于阴性的2.1倍即为阳性；测试结果显示以青霉素-OVA作为包被原的没有阳性反应，可见抗体并非是针对青霉素的;经测定效价超过1：128000，可以进行酶联免疫吸附试验；

步骤三：采用棋盘法优化抗原抗体最佳工作浓度：把包被抗原MMPA-OVA用碳酸盐缓冲液pH9.6稀释到一定浓度1、1.3、2、2.5、3、4、5和10μg/mL，分别包被在96孔酶标板A～H排，抗体也稀释一定倍数4000、8000、10000、12000、16000和32000倍，加入1～6列，其余列作为对照；用间接非竞争ELISA的方法测定出OD₄₅₀值，以0.8～1.2的值为最优值，即该值对应的为最佳工作浓度，确定包被原浓度为MMPA-OVA2.5μg/mL，抗体稀释度为1：8000；

步骤四：用间接竞争ELISA法建立抗体对重金属示的检测方法，0.5mM EDTA与汞标准溶液混合，形成浓度为0.01，0.05，0.1，0.5，1,5，10mg/mL的反应液，与等体积抗体溶液先混合过夜为样品进行前抑制，间接竞争ELISA法的步骤如下：前处理：0.5mM EDTA与标准溶液待测样预混，37℃温浴1h；包被：包被原用CB缓冲液100μL/孔包被4℃过夜，洗板3次；封闭:200μL/孔5%甘氨酸37℃封闭1h，洗板3次；加样:将预混好的样品50μL/孔加入，用PBS稀释抗体到两倍工作浓度，50μL/孔加入，振荡10min，37℃温浴2小时，洗板3次；加酶标二抗：1：2000倍稀释的酶标二抗100μL/孔，37℃温浴1h，洗板3次；显色：加TMB底物液显色10min；终止反应：50μL/孔2M硫酸终止反应，450nm下读取OD值。