CN104830866B - 一种特异性识别氧氟沙星的ssDNA适配体及其应用 - Google Patents
一种特异性识别氧氟沙星的ssDNA适配体及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104830866B CN104830866B CN201510256011.0A CN201510256011A CN104830866B CN 104830866 B CN104830866 B CN 104830866B CN 201510256011 A CN201510256011 A CN 201510256011A CN 104830866 B CN104830866 B CN 104830866B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ofloxacin
- ssdna
- aptamers
- specific recognition
- screening
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
一种特异性识别氧氟沙星的ssDNA适配体及其应用，属于生物化学与分子生物学、分析化学和组合化学领域。本发明提供了利用修饰的氧化石墨烯‑SELEX技术（GO‑SELEX）筛选氧氟沙星适配体的方法，得到A1、A3、A4、A5四条与氧氟沙星具有高亲和力的ssDNA适配体序列，为氧氟沙星残留的检测提供了稳定性良好、亲和力高、特异性高、成本低、易修饰和标记的检测识别元件。
Description
技术领域
本发明涉及一种特异性识别氧氟沙星的ssDNA适配体及其应用，属于生物化学与分子生物学、分析化学和组合化学领域。
背景技术
氟喹诺酮类药物如氧氟沙星、沙拉沙星、培氟沙星等，对大肠杆菌、沙门杆菌、葡萄球菌、克霉白杆菌、志贺杆菌、变形杆菌、流感嗜血杆菌、淋球菌、链球菌等抗菌活性较强，对化脓杆菌、肺炎链球菌、肺炎衣原体、肺炎支原体也有良好的抗菌作用。氧氟沙星药物的作用机理同其他喹诺酮类抗生素一样，通过抑制细菌的DNA旋转酶（gyrase）的合成，阻断DNA的正常的合成与复制，导致细菌死亡。因此，喹诺酮药物是目前人兽共用的抗感染的主要药物之一。但是当动物体内喹诺酮类抗生素长期积累达到某个程度时，生物体内对此类抗生素的耐药性增强，耐药细菌的数量逐渐增加，最后导致此类药物的药效降低；除此之外，还会损伤幼龄动物的软骨生长。大剂量的此类抗生素进入人体，会导致胃肠道不适，中枢神经和肝细胞受损等不良反应。氧氟沙星属于氟喹诺酮类药物，因其8-位被氟元素取代增强了光毒性，长期食用兽药超标的动物源食品不仅对人体健康造成直接或间接的伤害，还会造成人体对此类药物产生抗药性，不利于细菌性疾病的预防和治疗。因此，很多国家和地区均规定了此类抗生素在动物源食品中的最大残留限量。
美国食品药品监督管理局（FDA）就明令禁止喹诺酮类药物用于食源性动物的细菌感染治疗上，我国严格规定了动物源食品中喹诺酮类药物的残留量，最高残留限量为0.01~1.9mg·kg-1，日本规定进口的鳗鱼及鳗鱼产品的残留检测限量应在0.05mg·kg-1以内。由于养殖过程中经常存在着违法使用或者不合理使用的现象，食品中喹诺酮类抗生素的过量残留，已经成为国内外普遍关注的食品安全问题之一。因此，加大对药物残留的监控力度，加强药残检测新技术的开发是十分有必要的。基于适配体的生物传感检测方法具有灵敏度高、特异性强等特点，因此筛选氧氟沙星的特异性适配体对于建立高效快速、特异灵敏的氧氟沙星检测方法具有十分重要的意义。
指数富集的配体系统进化技术（systematic evolution of ligands byexponential enrichment，简称为SELEX）是由Tuerk和Gold于1990年开发的一种体外筛选技术，认为该技术经过发展可以得到蛋白质的高亲和配基。该技术是新建立的一种体外合成的组合化学技术，基于单链寡核苷酸碱基之间可以形成多种空间结构，这些结构容易与靶分子结合的原理，从含有1013~1015个不同基元的初始文库中，经过几轮或数十轮的重复筛选富集过程，获得高亲和性、高特异性的核酸适配体。核酸适配体的筛选技术可以应用于各种类型靶分子的筛选上，不仅可以筛选无机或有机小分子、蛋白质、糖、抗生素等单个靶分子，还可以筛选复杂的靶结构或组成不明确的复合靶如靶分子混合物、生物体、完整细胞等。利用SELEX技术筛选获得的适配体有着比抗体分子更高的特异性和亲和力，甚至能识别单抗不能区分的抗原物质。同时，与蛋白质性质的抗体相比，核酸适配体具有明显的优越性，例如：靶分子范围广，不受免疫条件和免疫原性的限制，可在体外人工合成并且合成技术已非常成熟，变性与复性可逆，可应用于非生理条件下，可根据需求进行多种化学修饰，易于长期室温保存等。这些特性使得适配体在生物医药研究领域得到广泛应用。近年来已有学者将适配体应用于抗生素的检测领域，同生物传感器平台结合，发展出快速、新颖的检测方法而备受关注。
本发明通过氧化石墨烯-SELEX（GO-SELEX）技术，利用氧化石墨烯可以富集ssDNA分子，而不富集与氧氟沙星结合的ssDNA，以氧化石墨烯作为筛选中结合与分离的介质，通过多轮筛选得到可以与氧氟沙星高特异性结合的ssDNA适配体序列，为氧氟沙星尤其是食品中氧氟沙星残留的检测提供了稳定性良好、灵敏度高、成本低、易制备、易修饰和标记的高特异性检测识别元件。
发明内容
本发明的目的是通过改良的GO-SELEX技术，借助于氧化石墨烯可以结合ssDNA分子，而不能结合与氧氟沙星结合的ssDNA分子的特点，以其作为结合与分离的介质，筛选得到能特异性结合氧氟沙星的ssDNA适配体。该适配体是氧氟沙星的新型识别元件，具有稳定性良好、灵敏度高、成本低、易制备、易修饰和标记的高特异性的优势。
本发明的技术方案：
特异性识别氧氟沙星的ssDNA适配体，选自序列表A1~A12所示序列的一种或多种，包括含有A1~A12所述序列的ssDNA。
其中，序列表A1~A12在结构上均符合下述通式1所示的结构特征，
5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CC-N35-CTGCAGGTCG ACGCATGCGC CG-3′ （通式1）；其中N代表碱基A，T，C，G中任一个，N35代表随机片段长度为35个碱基。
在序列表中，优选序列A1、A3、A4或A5所示的序列。
特异性识别氧氟沙星的ssDNA适配体被能提高稳定性的基团，提供检测信号的荧光基团、同位素、电化学标记物、酶标记物，以及用于形成组合物的亲和配基、巯基所修饰。
特异性识别氧氟沙星的ssDNA适配体的应用：使可能含有氧氟沙星的样品与特异性识别氧氟沙星的ssDNA适配体接触，检测氧氟沙星与所述适配体的结合。具体用于检测氧氟沙星的组合物、试剂盒或芯片上。
筛选特异性结合氧氟沙星的ssDNA适配体的方法，包括步骤（a）-（l）：
（a）筛选文库：ssDNA文库；
5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CC-N35-CTGCAGGTCG ACGCATGCGC CG-3′ 其中N代表碱基A，T，C，G中任一个，N35代表随机片段长度为35个碱基。
（b）氧化石墨烯：功能化的石墨烯，配制成浓度为2mg·mL-1；
（c）氧氟沙星溶液：配置成浓度为10mmol·L-1；
（d）链霉亲和素磁珠：粒径1-2µm，浓度为10mg·mL-1；
（e）使步骤（a）中的筛选文库和步骤（c）中的氧氟沙星在适宜的条件下保温；所述适宜条件是指使筛选文库中的成员能和氧氟沙星特异性结合的条件，包括室温25℃，作用时间1h，结合缓冲液成分为100mmol·L-1 NaCl，2mmol·L-1 MgCl2，5mmol·L-1 KCl，1mmol·L-1 CaCl2，0.02% Tween 20和20mmol·L-1 Tris-HCl，pH7.6；
（f）使步骤（e）与步骤（b）中的氧化石墨烯在适宜的条件下结合；适宜的条件包括室温25℃，结合时间2h；
（g）收集经步骤（f）处理的与（c）中氧氟沙星结合的文库成员；
（h）对步骤（g）的文库成员进行PCR扩增处理，下游引物5′-端标记生物素；
（i）将步骤（h）中的文库成员与（d）中的链霉亲和素磁珠在适宜条件下接触，得到单链次级文库，将单链次级文库与步骤（c）中氧氟沙星在适宜条件下接触；
单链次级文库制备：取链霉亲和素磁珠，用Bind and Wash buffer（B&W 10mmol·L-1 Tris-HCl，1mmol·L-1 EDTA，2mol·L-1 NaCl，pH7.5）冲洗，将第一轮筛选后用上游引物跟生物素标记的下游引物进行扩增的产物加入链霉亲和素磁珠中，室温结合15min（轻微震荡），用B&W缓冲液冲洗，磁性分离，洗去未结合到磁珠上的DNA，在链霉亲和素磁珠中加入50μL 0.1mol·L-1的NaOH溶液，37℃孵育15min，磁性分离，将带生物素的一条链留在链霉亲和素磁珠上，洗下不带生物素的一条单链DNA即为下一轮筛选的次级文库。
（j）收集步骤（g）或（i）中与（c）特异性结合的文库成员；
（k）重复步骤（e）～（j），重复次数1、2、3、4、5、6、7次，优选重复7次；重复6次后，进行一轮负筛选实验后，随后进行第7次重复。
负筛选实验：将制备的次级文库加入200μL的结合缓冲液，90℃下混匀10min。加入环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星混合物（环丙沙星:恩诺沙星:诺氟沙星摩尔比=1:1:1），室温轻微震荡1h，加入质量为ssDNA 1000倍的氧化石墨烯，室温震荡2h，能够与环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星结合的ssDNA从氧化石墨烯上解吸下来，游离在溶液中，不能与它们结合的ssDNA结合在氧化石墨烯上，离心弃掉上清液。往含有氧化石墨烯沉淀的离心管中加入结合缓冲液，离心弃掉上清液，重复操作3次，彻底去除能与环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星结合的ssDNA。加入结合缓冲液200μL，再加入等物质量的氧氟沙星，轻微震荡1h，与氧氟沙星高特异结合的ssDNA形成能与氧氟沙星结合的三维结构从氧化石墨烯上解吸下来留在上清液中。
（l）任选地，对（j）步骤获得的文库成员进行确定，优选序列测定。
本发明的有益效果：本发明采用修饰的GO-SELEX技术，筛选得到与氧氟沙星高特异结合的ssDNA适配体，方法快速简便易操作，使用仪器简单，一般的实验条件都可以达到。筛选得到的高亲和力适配体序列可以特异性地跟氧氟沙星结合，为食品中氧氟沙星残留的检测提供了稳定性良好、灵敏度高、成本低、易制备、易修饰和标记的高特异性检测识别元件。
附图说明
图1 每一轮筛选，适配体跟氧氟沙星结合后的ssDNA回收率。
图2 测定适配体序列A1、A3、A4、A5的Kd值的拟合曲线图。
具体实施方式
实施例1 随机ssDNA文库及其引物的构建
（a）构建长度79个碱基的随机ssDNA文库
5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CC-N35-CTGCAGGTCG ACGCATGCGC CG-3′ 其中N代表碱基A，T，C，G中任一个，N35代表随机片段长度为35个碱基。
（b）合成上游引物
上游引物1：5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT-3′
（c）合成下游引物
下游引物1：5′-CGGCGCATGC GTCGACCTG-3′
下游引物2：5′-biotin-CGGCGCATGC GTCGACCTG-3′
实施例2 核酸适配体的体外筛选
为筛选出与氧氟沙星有高亲和力和高特异性的ssDNA适配体，共进行了7轮核酸适配体的筛选。为了提高筛选的特异性，在第六轮筛选结束后进行了一轮负筛选实验，每一轮筛选，适配体跟氧氟沙星的结合后ssDNA回收率如图1所示。
（a）取1μL 100μmol·L-1（0.1nmol）的初始文库ssDNA，加入199μL的结合缓冲液，混合均匀，于90℃下变性10min，迅速冰浴10min，常温放置10min，加入等物质量的氧氟沙星溶液，混合均匀，室温轻微震荡1h，ssDNA自适应形成三维结构，一部分ssDNA形成的三维结构可以与氧氟沙星结合，形成ssDNA-氧氟沙星复合物。加入氧化石墨烯溶液，氧化石墨烯与ssDNA的质量比为1000:1，室温下轻微震荡2h。游离ssDNA通过π-π堆积作用均匀吸附于氧化石墨烯上，ssDNA-氧氟沙星复合物不能结合在氧化石墨烯上。离心弃掉沉淀，上清液中含有能与氧氟沙星结合的ssDNA。
（b）上清液通过苯酚、氯仿、异戊醇（苯酚:氯仿:异戊醇体积比=25:24:1）混合液抽提，12000r·min-1，离心5min，吸取上层水相，并加入1/10倍体积的3mol·L-1的醋酸钠，2.5倍体积的冰乙醇混匀，置于-20℃的冰箱2h，4℃、10000r·min-1，离心15min，弃掉上清液，用4℃预冷过的75%的乙醇洗涤后，4℃、10000r·min-1，离心15min。沉淀部分室温干燥，用30μL的灭菌水重溶，用微量核酸蛋白分析仪测其浓度。取适量灭菌水重溶ssDNA为模板，以不带生物素的上游引物1和带生物素的下游引物2进行PCR扩增，核酸电泳进行验证。25μL的PCR扩增体系如下：
Taq酶 0.1μL
Buffer 2.5μL
dNTP 2μL
模板 5μL
上游引物1（10μmol·L-1） 1μL
下游引物2（10μmol·L-1） 1μL
加入无菌水，补充体系至25μL。
扩增条件：95℃，预变性5min；95℃，变性30s；55℃，退火1min；72℃，延伸1min；22个循环。最后72℃，延伸5min。
（c）制备次级文库：取10μL的链霉亲和素磁珠，用B&W缓冲液冲洗3遍，磁力架分离，用80μL的B&W缓冲液悬浮链霉亲和素磁珠，加入20μL第一轮PCR扩增产物，室温结合轻微震荡15min。ssDNA通过生物素与链霉亲和素的作用连接在链霉亲和素磁珠上，缓冲液冲洗5遍，磁力架分离，除去未结合在磁珠上的ssDNA。加入50μL 0.1mol·L-1的NaOH溶液，37℃下水浴15min，带生物素的那条ssDNA链连在磁珠上，没有携带生物素的另外一条链裂解下来，作为下一轮筛选的次级文库，取样用核酸蛋白分析仪测其浓度。
（d）回收率计算：每一轮筛选醇沉后计算回收率，回收率=（m回收的ssDNA/m加入的ssDNA）× 100%。随着筛选的进行，不能与氧氟沙星结合的ssDNA不断被筛掉，与氧氟沙星高亲和的ssDNA不断得到富集，回收率不断增加，直到回收率趋于平稳，氧氟沙星的亲和适配体得到富集，筛选过程基本结束。
（e）下一轮筛选根据上面的筛选方法重复进行，重复7次。如图1所示，当筛选进行到第六轮时，回收率趋于平稳。因此，第6次重复筛选结束后进行一轮负筛选实验：将上一轮制备的次级文库加入200μL的结合缓冲液，90℃下混匀10min。加入环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星混合物（环丙沙星:恩诺沙星:诺氟沙星摩尔比=1:1:1），室温轻微震荡1h，加入质量为ssDNA 1000倍的氧化石墨烯，室温震荡2h，能够与环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星结合的ssDNA从氧化石墨烯上解吸下来，游离在液体中，不能与它们结合的ssDNA结合在氧化石墨烯上，离心弃掉上清液。往含有氧化石墨烯沉淀的离心管中加入结合缓冲液，离心弃掉上清液，重复操作3次，彻底去除能与环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星结合的ssDNA。加入结合缓冲液200μL，再加入等物质量的氧氟沙星，轻微震荡1h，与氧氟沙星高特异结合的ssDNA形成能与氧氟沙星结合的三维结构从氧化石墨烯上解吸下来，离心，上清液通过苯酚氯仿抽提、乙醇沉淀，灭菌水重溶，测定浓度。
实施例3 筛选得到的ssDNA克隆、测序、结构分析
（a）ssDNA克隆测序
经过终轮筛选得到的ssDNA，用上游引物1和下游引物1进行PCR扩增，扩增产物全量上样于3%琼脂糖，电泳并切下目的条带，通过DNA胶回收试剂盒进行ssDNA回收。用7μL纯化的PCR产物与1μL pMD-19T载体混合均匀，在T4连接酶的作用下16℃连接过夜，转化进大肠杆菌JM109感受态细胞，37℃过夜培养。经菌落PCR验证，随机挑取21个阳性克隆子转接到液体LB培养基中，培养12h，用质粒提取试剂盒提取质粒，测序得到A1~A12的12条不同序列的适配体。
实施例4 用平衡渗透法测定适配体序列的解离常数Kd值
对12条适配体序列的中间35个随机序列做了同源性分析，选择同源性相对较高的序列A1、A3、A4、A5进行Kd值的测定。氧氟沙星母液用结合缓冲液稀释至200μmol·L-1，取10μL于0.5mL的离心管中，分别加入不同体积的20μmol·L-1的氧氟沙星适配体，用结合缓冲液补充至200μL体系，混合均匀，适配体的终浓度分别在0~1.4μmol·L-1之间，氧氟沙星的终浓度为10μmol·L-1。此含不同适配体浓度的混合液于室温轻微震荡反应30min，将混合液转移至3000Da的超滤离心管上，12000r·min-1、离心8min，使100μL的滤液滤过超滤膜。滤液中只含有未与适配体结合的氧氟沙星，氧氟沙星含量通过紫外测定，计算滤液中氧氟沙星的浓度。根据方程y = Bmax × free ssDNA / ( Kd + free ssDNA )，通过GraPad Prism 5.0拟合曲线，分析每一个核酸适配体的Kd值。方程中y表示核酸适配体结合的氧氟沙星占总的氧氟沙星的比例，即饱和度；Bmax表示最大结合位点的数目，free ssDNA表示未与氧氟沙星结合的游离的ssDNA浓度。拟合曲线如图2所示，测得A1、A3、A4、A5的Kd值分别为251.3、130.1、159.1、304.4nmol·L-1，均具有较高的亲和力，其中A3与氧氟沙星具有最高的亲和力。
A1: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCTCGGCTAC TTACGGCGTC CTCTGTTTGCTGGACCTCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′
A2: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCGTTAACCG TCTGATCTTA CCCGTGGGGCAAACGCACTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′
A3: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCTGGCGCTT AGGTGTAATA ACCTGAGGACGGCTTGGCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′
A4: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCTGGTTAAA CCACGGTGAA CCACTGCGCAGTAGGTCCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′
A5: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCGGGGTCTG GTGTTCTGCT TTGTTCTGTCGGGTCGTCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′
A6: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCAAGCTGAA CTGCTGATTG CTAAAGGAAATCAGCTTCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′
A7: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCCGCACCGT CTCGTCCTAT CATGACCTTGTCCTGTCCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′
A8: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCCGCCTCCG GGCACTCGTT GGACAGCTCT TAATTAACTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′
A9: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCGAGGCGAG GTTGGTCACG AGACGACTCCGCCAAATCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′
A10: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCCTCCTGTG AGAGCTCTGA ATTAAATGGGTCTGAGCCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′
A11: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCTGCGCATT TGTGCGTACG GTTCCTGCCAACGAAGTCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′
A12: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCCATCGCAT CGTGCTGGGG TCACCCATCGATACGGTCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3′
Claims (4)
1.一种特异性识别氧氟沙星的ssDNA适配体，其特征在于：如A1、A3、A4或A5所述序列的ssDNA；
A1: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCTCGGCTAC TTACGGCGTC CTCTGTTTGC TGGACCTCTGCAGGTCGACG CATGCGCCG-3′；
A3: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCTGGCGCTT AGGTGTAATA ACCTGAGGAC GGCTTGGCTGCAGGTCGACG CATGCGCCG-3′；
A4: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCTGGTTAAA CCACGGTGAA CCACTGCGCA GTAGGTCCTGCAGGTCGACG CATGCGCCG-3′；
A5: 5′-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCGGGGTCTG GTGTTCTGCT TTGTTCTGTC GGGTCGTCTGCAGGTCGACG CATGCGCCG-3′。
2.根据权利要求1所述的特异性识别氧氟沙星的ssDNA适配体，其特征在于：被能提高稳定性的基团，提供检测信号的荧光基团、同位素、电化学标记物、酶标记物，以及用于形成组合物的亲和配基、巯基所修饰。
3.权利要求1所述特异性识别氧氟沙星的ssDNA适配体的应用，其特征在于：使可能含有氧氟沙星的样品与特异性识别氧氟沙星的ssDNA适配体接触，检测氧氟沙星与所述适配体的结合。
4.根据权利要求3所述特异性识别氧氟沙星的ssDNA适配体的应用，其特征在于：将特异性识别氧氟沙星的ssDNA适配体用于检测氧氟沙星的组合物、试剂盒或芯片上。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510256011.0A CN104830866B (zh) | 2015-05-20 | 2015-05-20 | 一种特异性识别氧氟沙星的ssDNA适配体及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510256011.0A CN104830866B (zh) | 2015-05-20 | 2015-05-20 | 一种特异性识别氧氟沙星的ssDNA适配体及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104830866A CN104830866A (zh) | 2015-08-12 |
| CN104830866B true CN104830866B (zh) | 2017-12-26 |
Family
ID=53809066
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510256011.0A Active CN104830866B (zh) | 2015-05-20 | 2015-05-20 | 一种特异性识别氧氟沙星的ssDNA适配体及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104830866B (zh) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108866065B (zh) * | 2018-07-20 | 2021-06-08 | 江南大学 | 特异性识别庆大霉素的ssDNA适配体及其应用 |
| CN109628456B (zh) * | 2019-01-25 | 2022-03-15 | 江南大学 | 特异性识别粪肠球菌的ssDNA适配体 |
| CN110412260A (zh) * | 2019-04-26 | 2019-11-05 | 山东省食品药品检验研究院 | 化妆品中氟喹诺酮类药物直接竞争化学发光定性定量免疫分析方法 |
| CN110283189A (zh) * | 2019-07-17 | 2019-09-27 | 大连理工大学 | 一种示踪氧氟沙星抗生素的荧光化合物及应用 |
| CN110423756B (zh) * | 2019-08-05 | 2023-03-28 | 江南大学 | 特异性识别链霉素的短链dna适配体序列及其应用 |
| CN110684773B (zh) * | 2019-11-05 | 2023-04-14 | 江南大学 | 特异性识别甲硝唑的ssDNA适配体及其应用 |
| CN112505024A (zh) * | 2020-11-03 | 2021-03-16 | 常州大学 | 检测恩诺沙星的电化学发光适配体传感器及其制备方法和检测恩诺沙星的方法 |
| CN112578118B (zh) * | 2020-11-20 | 2024-04-16 | 上海雄图生物科技有限公司 | 快速检测抗生素的时间分辨荧光免疫层析试剂盒 |
| CN112662664B (zh) * | 2021-01-28 | 2022-04-19 | 北京化工大学 | 一种特异性结合盐酸沙拉沙星核酸适配体的筛选方法 |
| CN112961859B (zh) * | 2021-02-03 | 2022-05-13 | 江南大学 | 特异性识别金刚烷胺的适配体及其应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102680677A (zh) * | 2012-05-08 | 2012-09-19 | 嘉兴博泰生物科技发展有限公司 | 一种检测氧氟沙星的酶联免疫试剂盒及检测方法 |
-
2015
- 2015-05-20 CN CN201510256011.0A patent/CN104830866B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102680677A (zh) * | 2012-05-08 | 2012-09-19 | 嘉兴博泰生物科技发展有限公司 | 一种检测氧氟沙星的酶联免疫试剂盒及检测方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 恩诺沙星和磺胺二甲嘧啶核酸适配体的筛选及化学发光检测方法的研究;倪姮佳;《中国博士学位论文全文数据库 农业科技辑》;20140815(第8期);摘要，正文第2.1.2节 * |
| 适体在抗生素残留检测中的应用;刘宾等;《食品科学》;20100915;第31卷(第17期);第1.2节，表2 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104830866A (zh) | 2015-08-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104830866B (zh) | 一种特异性识别氧氟沙星的ssDNA适配体及其应用 | |
| US9435776B2 (en) | Immunosorbent and immunoaffinity column for aflatoxin M1 nanobody and preparation method thereof | |
| CN113151282B (zh) | 结合新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核衣壳蛋白的核酸适配体及其用途 | |
| CN102703454B (zh) | 可用于检测肌红蛋白的核酸适体、筛选用微流控芯片及其筛选方法和应用 | |
| CN108866065B (zh) | 特异性识别庆大霉素的ssDNA适配体及其应用 | |
| CN107109485A (zh) | 用于多重捕获反应的通用阻断寡聚物系统和改进的杂交捕获的方法 | |
| CN109628457A (zh) | 单链dna核酸适配体及其筛选方法与用途 | |
| Dû et al. | Identification of saliva-regulated genes of Streptococcus gordonii DL1 by differential display using random arbitrarily primed PCR | |
| CN102703453A (zh) | 特异性识别链霉素的dna适配体及其应用 | |
| Liu et al. | Gold nanoparticle-based colorimetric detection of staphylococcal enterotoxin B using ssDNA aptamers | |
| Cooper et al. | Experimental evolution in vivo to identify selective pressures during pneumococcal colonization | |
| CN110088282A (zh) | 用磁性颗粒分离高纯度核酸的方法 | |
| CN112094847A (zh) | 幽门螺旋杆菌检测用核酸适配体与筛选检测方法及用途 | |
| CN106047882A (zh) | 一组特异性结合结核分枝杆菌的核酸适配体及其应用 | |
| KR101891406B1 (ko) | 살모넬라 타이피뮤리움 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 이의 용도 | |
| CN109161586A (zh) | 一种对rna分子进行绝对定量的高通量测序方法 | |
| CN106591315A (zh) | 金黄色葡萄球菌肠毒素c2的核酸适配体c202及其筛选方法和应用 | |
| CN104278036B (zh) | 一组特异识别宋内氏志贺氏菌的寡核苷酸适配子 | |
| CN108300717A (zh) | 一种检测卷烟中植物源成分的特异性引物对及其应用 | |
| CN109628456B (zh) | 特异性识别粪肠球菌的ssDNA适配体 | |
| CN106701768A (zh) | 金黄色葡萄球菌肠毒素c2的核酸适配体c201及其筛选方法和应用 | |
| CN106636105A (zh) | 金黄色葡萄球菌肠毒素c2的核酸适配体c203及其筛选方法和应用 | |
| KR101678946B1 (ko) | 25-하이드록시 비타민 디3에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 앱타머 및 그 용도 | |
| CN114032243B (zh) | 特异性结合环丙沙星的核酸适配体及其用途 | |
| CN113406028B (zh) | 一种基于纳米金聚集的卡那霉素均相生物传感方法及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant |