CN112379098B - 一种水产品中组胺含量的模拟酶标记抗体elisa检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于组胺含量检测技术领域，涉及一种水产品中组胺含量的模拟酶标记抗体ELISA检测方法，包括：采用水热法制备铁‑钴共掺杂碳点、合成铁‑钴共掺杂碳点标记抗体、合成组胺半抗原、合成组胺包被原、计算抑制率、建立ic‑ELISA方法并检测水产品中组胺的含量。本发明提供的铁‑钴共掺杂碳点标记抗体对His具有很高的选择性，对His的结构类似物的交叉反应率均低于0.01％，并且利用铁‑钴共掺杂碳点与抗体结合建立ic‑ELISA检测方法具有较高的准确性和实用性，极具应用前景。

Description

一种水产品中组胺含量的模拟酶标记抗体ELISA检测方法
技术领域
本发明属于组胺含量检测技术领域，具体涉及一种水产品中组胺含量的模拟酶标记抗体ELISA检测方法。
背景技术
组胺(Histamine，His)是生物胺的一种，主要由微生物产生的外源性脱羧酶对组氨酸进行脱羧作用生成。组胺是“鲭鱼中毒”的主要原因，它可引起包括恶心、呕吐、腹泻、皮疹、荨麻疹在内的多种毒理学症状。因此，许多国家和食品安全组织都制定了食品中组胺含量的水平标准。欧洲食品安全局(EFSA)和美国食品药品管理局(FDA)均建议新鲜食品中组胺浓度应低于50mg·kg-1。世界卫生组织(WHO)和FDA提醒，50～200mg·kg-1的食源性组胺可引起轻微不良健康反应，当组胺浓度超过200mg·kg-1时，就会引发中毒症状。由于组胺缺乏特征官能团，且与多种生物胺共存，快速检测水产品中的组胺浓度仍具有一定难度。
目前食品中组胺检测方法主要以大型仪器，如高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)和色谱-质谱联机为主。这些方法在测定和分析水产品中的组胺含量都具有结果可靠、灵敏度高、选择性高、重复性好的优点。但这些方法在样品前处理过程都存在繁琐复杂、耗时等不足，而且设备昂贵，检测成本高，不仅需要消耗大量的溶剂和时间，还容易造成二次污染，影响检测结果的准确性。因此，发展一种快速高效的组胺浓度的检测方法对控制水产品质量安全具有重要意义。
发明内容
本发明旨在提供一种新的水产品组胺的模拟酶标记抗体ELISA检测方法。
具体地，本发明提供了一种水产品中组胺含量的模拟酶标记抗体ELISA检测方法，该方法包括以下步骤：
(1)铁-钴共掺杂碳点的制备：将柠檬酸、FeCl3·H2O和CoCl2·H2O溶解于水中，再将所得混合物加热至160～220℃反应5～15h，所得反应产物采用800Da透析袋透析纯化20～30h，截留液离心分离，之后将所得沉淀物干燥，得到铁-钴共掺杂碳点；
(2)铁-钴共掺杂碳点标记抗体的制备：将所述铁-钴共掺杂碳点分散于MES缓冲溶液中，之后往所得铁-钴共掺杂碳点分散液中加入偶联剂并超声分散均匀，将所得混合物于35～40℃下震荡10～20min以激活铁-钴共掺杂碳点表面羧基，再将pH值调节至中性后加入鼠源组胺单克隆抗体(His-Ab)，于35～40℃下震荡过夜，之后将所得溶液用800Da透析袋透析10～20h，截留液即为铁-钴共掺杂碳点标记抗体，于4℃下保存备用；
(3)组胺半抗原的合成：将组胺盐酸盐溶于甲醇中，加入甲醇钠和对甲酰苯甲酸搅拌混合均匀，再加入硼氢氧化钠反应20～40min，将所得乳白色溶液采用硅胶柱纯化，用氯仿、甲醇和氨水的混合液进行洗脱，收集洗脱液并将该洗脱液与乙醇混合，于4℃下过夜以使组胺半抗原结晶，过滤、洗涤、干燥后得到组胺半抗原，于4℃下保存备用；
(4)组胺包被原的合成：将组胺半抗原搅拌溶于硼酸中，搅拌状态下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和载体蛋白，4℃搅拌过夜，所得溶液用500Da透析袋于4℃下透析2～4h，所得截留液冷冻干燥后得到组胺包被原His-OVA，-20℃保存备用；
(5)抑制率的计算：将His-OVA溶解在碳酸盐缓冲液中，加入孔板后4℃过夜，采用PBS(磷酸缓冲盐溶液，下同)洗涤孔板，甩干，每孔加入脱脂牛奶，于35～40℃下孵育1～3小时，以封闭孔板多余位点，采用PBS洗涤孔板，甩干，之后加入不同浓度的组胺标准溶液或组胺样品溶液和铁-钴共掺杂碳点标记抗体，于35～40℃下孵育1～3小时，采用PBS洗涤孔板，甩干，各孔分别加入NaAc-HAc缓冲液、H2O2和底物显色液，于35～40℃下孵育5～15min，最后加入终止液进行终止反应，450nm处测定吸光度值，按照以下公式计算各浓度下的抑制率：
Figure GDA0003499652040000031
其中，IR为抑制率，A为组胺标准溶液或样品溶液在450nm处测定吸光度值，A0为无游离组胺溶液在450nm处测定吸光度值(与组胺标准溶液组的区别仅在于未加入组胺)；
(6)建立ic-ELISA方法并检测：以组胺标准溶液浓度作为横坐标，以不同组胺标准溶液浓度下对应的IR值作为纵坐标建立ic-ELISA标准曲线，并获得ic-ELISA线性方程，之后将待检测水产品样品的吸光度值代入ic-ELISA线性方程中即可计算出待检测水产品样品中的组胺含量。
进一步地，步骤(1)中，柠檬酸、FeCl3·H2O和CoCl2·H2O的质量比为1:(50～100):(50～100)。
进一步地，步骤(1)中，所述离心分离的条件包括转速为7000～9000rpm，时间为20～40min。
进一步地，步骤(2)中，所述偶联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合物。
进一步地，步骤(2)中，所述偶联剂中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的重量比为(1～1.5):1。
进一步地，步骤(2)中，所述铁-钴共掺杂碳点与偶联剂的重量比为1:(1～3)。
进一步地，步骤(2)中，所述鼠源组胺单克隆抗体在使用前分散于PBS缓冲溶液中，以鼠源组胺单克隆抗体分散液的形式使用；所述铁-钴共掺杂碳点分散液与鼠源组胺单克隆抗体分散液的体积比为(8～10):1。。
进一步地，步骤(3)中，所述组胺盐酸盐、甲醇、甲醇钠和对甲酰苯甲酸的用量比为1g:(4～6)mL:(0.5～0.6)g:(0.6～1)g。
进一步地，步骤(3)中，所述混合液中氯仿、甲醇和氨水的体积比为(8～12):(4～6):1。
进一步地，步骤(4)中，所述组胺半抗原、硼酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和载体蛋白的用量比为1mg:(0.1～0.2)mL:(1～2)mg:(5～10)g。
进一步地，步骤(4)中，所述载体蛋白为鸡卵清白蛋白(OVA)。
进一步地，步骤(5)中，所述底物显色液为3,3',5,5'-四甲基联苯胺。
进一步地，步骤(5)中，所述终止液为硫酸溶液。
进一步地，步骤(5)中，所采用的组胺标准溶液优选为五种以上，且任意两种组胺标准溶液中组胺的浓度优选均为5μg/mL以上，更优选为10～30μg/mL。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供的铁-钴共掺杂碳点具备良好的导电性、快速的电子转移性、稳定且高效的催化活性等显著特点，所述铁-钴共掺杂碳点标记抗体对His具有很高的选择性，对His的结构类似物(腐胺等6种生物胺)的交叉反应率均低于0.01％，而酶联免疫法检测具有特异性强、反应效率高的特点，本发明巧妙地将二者结合起来，利用铁-钴共掺杂碳点与抗体结合建立ic-ELISA检测方法具有较高的准确性和实用性。此外，本发明建立的ic-ELISA检测方法的检测线性范围为2.5-150μg·mL-1，检出限为0.50μg·g-1(3σ/K)，低于商品化His试剂盒的检出限2μg·g-1。
附图说明
图1为实施例所得铁-钴共掺杂碳点的透射电镜扫描图；
图2为实施例所得铁-钴共掺杂碳点的傅里叶红外光谱图；
图3为实施例所得铁-钴共掺杂碳点的X射线光电子能谱图；
图4为实施例所得铁-钴共掺杂碳点的能量色散谱图；
图5和图6为实施例所得铁-钴共掺杂碳点的催化反应动力学图；
图7为实施例所得铁-钴共掺杂碳点标记抗体的紫外吸收谱图；
图8为实施例所得His半抗原、His-OVA和OVA的紫外吸收谱图；
图9为实施例所建立的ic-ELISA方法对组胺检测的标准曲线；
图10为实施例所建立的ic-ELISA方法对不同生物胺的检测结果图；
图11为实施例所建立的ELISA方法和HPLC法对样品中组胺检测结果对比图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
本实施例用于说明水产品中组胺含量的模拟酶标记抗体ELISA检测方法，具体步骤如下：
(1)铁-钴共掺杂碳点的制备：将2.0g柠檬酸、150mg FeCl3·H2O和150mg CoCl2·H2O在聚四氟乙烯反应釜中混合，加入20mL去离子水溶解，180℃加热反应10h，所得溶液用800Da透析袋透析纯化24h，截留液于8 000rpm下离心30min，收集沉淀，之后将所得沉淀于60℃下干燥，得到铁-钴共掺杂碳点。
所述铁-钴共掺杂碳点的透射电镜扫描图如图1所示。从图1可以可以看出，该铁-钴共掺杂碳点形貌规则，粒径均匀，呈粒径2nm左右的近球形。
所述铁-钴共掺杂碳点的傅里叶红外光谱(FT-IR)图如图2所示。从图2可以看出，1678cm-1处有一个由C＝O伸缩振动产生的强吸收峰，3389cm-1处的宽吸收峰归因于羧酸的O-H伸缩振动，1389cm-1处的吸收峰归因于O-H平面的弯曲振动。FT-IR表明，所述铁-钴共掺杂碳点表面含有丰富羧基，可利用EDC/NHS反应与抗体表面氨基发生酰胺反应制备免疫偶联物。
所述铁-钴共掺杂碳点的X射线光电子能谱图和能量色散谱图分别如图3和图4所示。从图3和图4可以看出，铁和钴元素以近1:1的质量比共同掺杂在碳点中。
所述铁-钴共掺杂碳点的催化反应动力学图如图5和图6所示。从图5和图6可以看出，铁-钴共掺杂碳点模拟酶对底物亲和力好，反应速度快，Km值分别为102μmol L-1(TMB)和260μmol L-1(H2O2)。
(2)铁-钴共掺杂碳点标记抗体的制备：将10mg铁-钴共掺杂碳点分散于10mL MES缓冲溶液(0.1mol L-1，pH 5)中，依次加入15mg EDC和10mg NHS，超声辅助分散，再将所得分散液于37℃下震荡15min以激活铁-钴共掺杂碳点表面羧基，用三乙胺将溶液pH值调节至中性，之后加入His-Ab(采用PBS按照体积比1:100稀释)100μL，37℃震荡过夜，所得溶液用800Da透析袋透析16h，得到铁-钴共掺杂碳点标记抗体，于4℃保存备用。
所述铁-钴共掺杂碳点标记抗体的紫外吸收谱图如图7所示。从图7可以看出，铁-钴共掺杂碳点标记抗体有两个紫外吸收波段，分别位于280nm和217nm处，证明铁-钴共掺杂碳点已成功与His-Ab偶联。经分析，280nm的光谱峰来自His-Ab，是蛋白质中的芳香族基团吸收所致。由于抗体对肽键的吸收，His-Ab在210nm处的吸收峰较弱，所以铁-钴共掺杂碳点标记抗体位于217nm的强峰可能来自铁-钴共掺杂碳点，而不是His-Ab。
(3)组胺半抗原的合成：将2.76g组胺盐酸盐溶解在15mL甲醇中，加入1.62g甲醇钠和2.25g对甲酰苯甲酸，室温搅拌1h，然后缓慢加入1.11g硼氢化钠，反应30min，得到乳白色溶液。将该乳白色溶液过300目硅胶柱纯化，用氯仿、甲醇、氨水按照体积比10:5:1的混合液洗脱，收集洗脱液将并其与乙醇按照体积比1:9混合，置于4℃下过夜以使组胺半抗原结晶，所得组胺半抗原晶体用冷乙醇洗涤3次，干燥后于4℃保存备用。
(4)组胺包被原的合成：称取组胺半抗原24.6mg溶于4mL硼酸(0.1mol L-1，pH 4.5)中，搅拌状态下加入38.4mg EDC和180mg鸡卵清白蛋白(OVA)，4℃搅拌过夜，溶液采用500Da透析袋于4℃透析3天，冷冻干燥后得到组胺包被原(His-OVA)，于-20℃保存备用。
所述组胺半抗原(His半抗原)、His-OVA以及OVA的紫外吸收谱图如图8所示。从图8可以看出，OVA分别在210nm和280nm处有两个吸收峰。His半抗原在213nm处有一个吸收峰，这可能与组胺分子结构中的咪唑环有关。偶联后，His-OVA的紫外光谱分别在220nm和280nm处有两个吸收峰。与OVA相比，位于220nm的His-OVA吸收峰出现轻微红移，这可能是由于组胺通过EDC与OVA发生了酰胺化反应所致。由此可见，组胺半抗原已成功与OVA载体蛋白结合。
(5)抑制率的计算：将His-OVA溶解在碳酸盐缓冲液(CBS，0.01mol L-1，pH 9.6)中，加入孔板后4℃过夜，之后用PBS洗涤孔板，甩干，每孔加入脱脂牛奶，37℃孵育2小时，以封闭孔板多余位点，采用PBS洗涤孔板三次后，加入不同浓度组胺标准溶液或样品溶液50μL和铁-钴共掺杂碳点标记抗体50μL(PBS 1:50000稀释)，37℃孵育1小时，PBS洗涤并干燥，各孔分别加入NaAc-HAc缓冲液80μL(1mmol L-1，pH 3.7)、100μL H2O2(1mmol L-1)和20μL TMB(5mmol L-1)，37℃下孵育10min，最后用50μL浓度为1mmol L-1的H2SO4终止反应，450nm处测定吸光度值，按照以下公式计算各浓度下的抑制率。
Figure GDA0003499652040000071
其中，IR为抑制率，A为组胺标准溶液在450nm处测定吸光度值，A0为无游离组胺溶液在450nm处测定吸光度值。
(6)建立ic-ELISA方法和组胺含量检测：以组胺标准溶液浓度作为横坐标，以不同组胺标准溶液浓度下对应的抑制率IR(％)值作为纵坐标建立ic-ELISA标准曲线，所得结果如图9所示。从图9可以计算出，IR(％)值与组胺标准浓度的线性方程为IR(％)＝0.3704CHis+3.7033(R2＝0.994)。根据IC50值，ic-ELISA检测组胺的灵敏度为106μg mL-1。
所建立ELISA方法的特异性验证：选择组胺及其结构类似物腐胺等生物胺作为分析物。按照以下公式计算不同分析物与组胺间的交叉反应率(CR)：
Figure GDA0003499652040000072
其中，IR50为抑制率达50％时分析物的浓度。如表1和图10的结果表明，所制备的铁-钴共掺杂碳点标记抗体对His具有很高的选择性，对His的结构类似物(腐胺等6种生物胺)的交叉反应率均低于0.01％。
表1分析物与组胺的交叉反应率
分析物 CR值(％)
组胺(His) 100
腐胺(Put) ＜0.01
尸胺(Cad) ＜0.01
精胺(Spm) ＜0.01
亚精胺(Spd) ＜0.01
酪胺(Tyr) ＜0.01
色胺(Trp) ＜0.01
ELISA方法的准确性验证：分别用ic-ELISA法和HPLC法对3种冰鲜鱼(样品编号1-3)和13种发酵鱼(样品编号4-16)中组胺含量进行检测，所得结果如图11所示。从图11可以看出，所建立的ELISA法和HPLC法对实际样品的测定结果具有比较好的一致性，用IBM SPSS25软件对两种方法的检测结果进行配对t检验统计分析，结果详见表2。从表2可以看出，两种方法无显著性差异(p﹥0.05)。由此可见，所建立的铁-钴共掺杂碳点ic-ELISA检测方法具有较高的准确性和实用性。
表2检测结果配对t检验分析
Figure GDA0003499652040000081
实际样品的添加回收实验：将25μg mL-1、50μg mL-1、100μg mL-1组胺标准溶液添加到冰鲜大黄鱼样品中，然后采用建立的ic-ELISA测定样品回收率，与商品化His试剂盒进行对比。试验结果如表3所示，所建立的方法能够应用于实际样品检测中，并且检测效果较好。
表3鱼样品加标回收率试验结果(n＝3)
Figure GDA0003499652040000082
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种水产品中组胺含量的模拟酶标记抗体ELISA检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)铁-钴共掺杂碳点的制备：将柠檬酸、FeCl3·H2O和CoCl2·H2O溶解于水中，再将所得混合物加热至160～220℃反应5～15h，所得反应产物采用800Da透析袋透析纯化20～30h，截留液离心分离，之后将所得沉淀物干燥，得到铁-钴共掺杂碳点；
(2)铁-钴共掺杂碳点标记抗体的制备：将所述铁-钴共掺杂碳点分散于MES缓冲溶液中，之后往所得铁-钴共掺杂碳点分散液中加入偶联剂并超声分散均匀，将所得混合物于35～40℃下震荡10～20min以激活铁-钴共掺杂碳点表面羧基，再将pH值调节至中性后加入鼠源组胺单克隆抗体，于35～40℃下震荡过夜，之后将所得溶液用800Da透析袋透析10～20h，截留液即为铁-钴共掺杂碳点标记抗体，于4℃下保存备用；
(3)组胺半抗原的合成：将组胺盐酸盐溶于甲醇中，加入甲醇钠和对甲酰苯甲酸搅拌混合均匀，再加入硼氢氧化钠反应20～40min，将所得乳白色溶液采用硅胶柱纯化，用氯仿、甲醇和氨水的混合液进行洗脱，收集洗脱液并将该洗脱液与乙醇混合，于4℃下过夜以使组胺半抗原结晶，过滤、洗涤、干燥后得到组胺半抗原，于4℃下保存备用；
(4)组胺包被原的合成：将组胺半抗原搅拌溶于硼酸中，搅拌状态下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和载体蛋白，4℃搅拌过夜，所得溶液用500Da透析袋于4℃下透析2～4h，所得截留液冷冻干燥后得到组胺包被原His-OVA，-20℃保存备用；
(5)抑制率的计算：将His-OVA溶解在碳酸盐缓冲液中，加入孔板后4℃过夜，采用PBS洗涤孔板，甩干，每孔加入脱脂牛奶，于35～40℃下孵育1～3小时，以封闭孔板多余位点，采用PBS洗涤孔板，甩干，之后加入不同浓度的组胺标准溶液或组胺样品溶液和铁-钴共掺杂碳点标记抗体，于35～40℃下孵育1～3小时，采用PBS洗涤孔板，甩干，各孔分别加入NaAc-HAc缓冲液、H2O2和底物显色液，于35～40℃下孵育5～15min，最后加入终止液进行终止反应，450nm处测定吸光度值，按照以下公式计算各浓度下的抑制率：
Figure FDA0003499652030000021
其中，IR为抑制率，A为组胺标准溶液或样品溶液在450nm处测定吸光度值，A0为无游离组胺溶液在450nm处测定吸光度值；
(6)建立ic-ELISA方法并检测：以组胺标准溶液浓度作为横坐标，以不同组胺标准溶液浓度下对应的IR值作为纵坐标建立ic-ELISA标准曲线，并获得ic-ELISA线性方程，之后将待检测水产品样品的吸光度值代入ic-ELISA线性方程中即可计算出待检测水产品样品中的组胺含量。
2.根据权利要求1所述的水产品中组胺含量的模拟酶标记抗体ELISA检测方法，其特征在于，步骤(1)中，柠檬酸、FeCl3·H2O和CoCl2·H2O的质量比为1:(50～100):(50～100)。
3.根据权利要求1所述的水产品中组胺含量的模拟酶标记抗体ELISA检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述离心分离的条件包括转速为7000～9000rpm，时间为20～40min。
4.根据权利要求1所述的水产品中组胺含量的模拟酶标记抗体ELISA检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述偶联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的混合物。
5.根据权利要求4所述的水产品中组胺含量的模拟酶标记抗体ELISA检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述偶联剂中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的重量比为(1～1.5):1。
6.根据权利要求1所述的水产品中组胺含量的模拟酶标记抗体ELISA检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述铁-钴共掺杂碳点与偶联剂的重量比为1:(1～3)。
7.根据权利要求1所述的水产品中组胺含量的模拟酶标记抗体ELISA检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述鼠源组胺单克隆抗体在使用前分散于PBS缓冲溶液中，以鼠源组胺单克隆抗体分散液的形式使用；所述铁-钴共掺杂碳点分散液与鼠源组胺单克隆抗体分散液的体积比为(8～10):1。
8.根据权利要求1所述的水产品中组胺含量的模拟酶标记抗体ELISA检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述组胺盐酸盐、甲醇、甲醇钠和对甲酰苯甲酸的用量比为1g:(4～6)mL:(0.5～0.6)g:(0.6～1)g；所述混合液中氯仿、甲醇和氨水的体积比为(8～12):(4～6):1。
9.根据权利要求1所述的水产品中组胺含量的模拟酶标记抗体ELISA检测方法，其特征在于，步骤(4)中，所述组胺半抗原、硼酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和载体蛋白的用量比为1mg:(0.1～0.2)mL:(1～2)mg:(5～10)g；所述载体蛋白为鸡卵清白蛋白。
10.根据权利要求1所述的水产品中组胺含量的模拟酶标记抗体ELISA检测方法，其特征在于，步骤(5)中，所述底物显色液为3,3',5,5'-四甲基联苯胺；所述终止液为硫酸溶液。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101013129A (zh) * 2007-02-13 2007-08-08 北京望尔生物技术有限公司 检测呋喃西林代谢物的酶联免疫试剂盒及其应用
CN105842451A (zh) * 2016-05-17 2016-08-10 郑州大学 基于量子点荧光免疫检测dnmt1的方法
CN110568184A (zh) * 2019-08-21 2019-12-13 安徽师范大学 一种负载抗癌药物喜树碱的纳米药物载体的荧光免疫定量检测方法
CN111320698A (zh) * 2020-03-26 2020-06-23 江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所 CdTe标记抗体的制备方法、应用及检测多溴联苯的方法

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU633195B2 (en) * 1990-03-13 1993-01-21 Tosoh Corporation Process for producing carriers for immunoassay
CN100403030C (zh) * 2006-05-10 2008-07-16 北京望尔生物技术有限公司 检测苏丹红药物的酶联免疫试剂盒及方法
CN101256188B (zh) * 2008-04-16 2012-07-11 北京望尔生物技术有限公司 检测林可霉素药物的酶联免疫试剂盒及其应用
CN101776685B (zh) * 2009-11-11 2013-03-13 北京望尔生物技术有限公司 检测三甲氧苄胺嘧啶药物的酶联免疫试剂盒及其应用
US10234470B2 (en) * 2012-07-04 2019-03-19 Beijing Kwinbon Biotechnology Co., Ltd. Enzyme-linked immunosorbent assay kit for detecting dinitolmide and use thereof
CN102879572A (zh) * 2012-09-26 2013-01-16 苏州大学 一种检测食品中三聚氰胺含量的elisa方法
CN104119277B (zh) * 2014-07-16 2016-08-17 华南农业大学 一种直接针对组胺的半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法与应用
CN104833781B (zh) * 2015-05-26 2017-03-22 集美大学 一种水产品孔雀石绿的磁性分子印迹仿生elisa检测方法
CN105036074A (zh) * 2015-07-03 2015-11-11 中国工程物理研究院材料研究所 一种LiBH4掺杂氟化物的高容量可逆储氢复合材料及其制备方法
WO2017148330A1 (zh) * 2016-02-29 2017-09-08 丹娜（天津）生物科技有限公司 一种新型隐球菌荚膜多糖gxm的制备方法及gxm抗原免疫检测试剂盒及其应用
CN106248753B (zh) * 2016-07-05 2019-03-12 济南大学 一种基于负载型双金属共掺杂光敏剂的光电化学杀虫脒传感器的制备方法
CN106198699B (zh) * 2016-07-20 2019-01-18 太原理工大学 制备两种二抗共轭物及其用于同时检测甲胎蛋白和癌胚抗原的方法
CN109371374A (zh) * 2018-11-14 2019-02-22 中国工程物理研究院材料研究所 一种薄膜结构的ZrCo基贮氚材料及制备方法
CN109781999A (zh) * 2019-02-27 2019-05-21 华中科技大学 一种pd-l1外泌体的磁免疫化学发光检测方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101013129A (zh) * 2007-02-13 2007-08-08 北京望尔生物技术有限公司 检测呋喃西林代谢物的酶联免疫试剂盒及其应用
CN105842451A (zh) * 2016-05-17 2016-08-10 郑州大学 基于量子点荧光免疫检测dnmt1的方法
CN110568184A (zh) * 2019-08-21 2019-12-13 安徽师范大学 一种负载抗癌药物喜树碱的纳米药物载体的荧光免疫定量检测方法
CN111320698A (zh) * 2020-03-26 2020-06-23 江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所 CdTe标记抗体的制备方法、应用及检测多溴联苯的方法

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