CN116333033A - 检测游离b细胞刺激因子的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及检测样品中游离B细胞刺激因子的方法，所述方法包括以下步骤：a. 使用亲和捕获介质过滤样品；b. 在预包被捕获抗体的酶标板中加入经步骤a过滤的样品并孵育；c. 用洗板液冲洗，加入检测抗体并孵育；d. 用洗板液冲洗，加入底物工作液并孵育；e. 加入终止液，使用酶标仪读取吸光度；其中所述亲和捕获介质选自：Protein A琼脂糖凝胶、Protein G琼脂糖凝胶和Protein L琼脂糖凝胶。
Description
技术领域
本申请涉及检测游离B细胞刺激因子的方法及其应用。
背景技术
B细胞刺激因子（B lymphocyte stimulator, BLyS）主要表达于髓系细胞表面，其为同源三聚化的II型穿膜蛋白，属于肿瘤坏死因子家族；通常胞外区部分在蛋白酶作用下发生水解，形成可溶性BLyS。
新药研发过程中，机体和药物的相互作用，需要了解药物和疗效、药物与靶标的结合率以及毒性之前的关系。建立监测游离BLyS浓度随靶向BLyS新药给药后的变化情况，为建立药效模型奠定数据基础至关重要。
通过调研现有的检测BLyS的方法，目前无任何一个方法可以检测机体在给予针对不同的靶向BLyS新药后，体内游离BLyS浓度的变化趋势。建立一个通用的检测游离BLyS方法可以加速新药上市进程，同时也能为新药研究过程中，找到无创性生物标志物即药效指标提供依据。
目前本领域的难点在于如何能检测到游离的Blys。
发明内容
第一方面，本申请提供了亲和捕获介质在制备用于检测样品中游离B细胞刺激因子的方法的试剂盒中的用途，所述方法包括以下步骤：a. 使用亲和捕获介质过滤样品；b.在预包被捕获抗体的酶标板中加入经步骤a过滤的样品并孵育；c. 用洗板液冲洗，加入检测抗体并孵育；d. 用洗板液冲洗，加入底物工作液并孵育；e. 加入终止液，使用酶标仪读取吸光度；其中所述亲和捕获介质选自：Protein A琼脂糖凝胶、Protein G琼脂糖凝胶和Protein L琼脂糖凝胶。
在一个实施方式中，在步骤a之前，所述方法还包括预处理亲和捕获介质的步骤：在离心速度为2500rpm且离心时间为5分钟的条件下，使用磷酸缓冲液冲洗亲和捕获介质。
在一个实施方式中，步骤a的过滤包括，将样品加入亲和捕获介质中并室温过夜静置孵育，再离心收集过滤的样品。
在一个实施方式中，步骤b还包括，在加入经步骤a过滤的样品之后，加入AssayDiluent RD1-111以封板。
在一个实施方式中，步骤b的孵育为在室温下以500-600 rpm振荡孵育3小时。
在一个实施方式中，步骤c的孵育为在室温下以500-600 rpm振荡孵育1小时。
在一个实施方式中，步骤d的孵育为在室温下以500-600 rpm振荡孵育30分钟。
在一个实施方式中，所述亲和捕获介质是Protein A配体偶联于4%琼脂糖凝胶的孔径为1 μm的微孔板。
第二方面，本申请提供了检测样品中游离B细胞刺激因子的方法，所述方法包括以下步骤：a. 使用亲和捕获介质过滤样品；b. 在预包被捕获抗体的酶标板中加入经步骤a过滤的样品并孵育；c. 用洗板液冲洗，加入检测抗体并孵育；d. 用洗板液冲洗，加入底物工作液并孵育；e. 加入终止液，使用酶标仪读取吸光度；其中所述亲和捕获介质选自：Protein A琼脂糖凝胶、Protein G琼脂糖凝胶和Protein L琼脂糖凝胶。
在一个实施方式中，在步骤a之前，所述方法还包括预处理亲和捕获介质的步骤：在离心速度为2500rpm且离心时间为5分钟的条件下，使用磷酸缓冲液冲洗亲和捕获介质。
在一个实施方式中，步骤a的过滤包括，将样品加入亲和捕获介质中并室温过夜静置孵育，再离心收集过滤的样品。
在一个实施方式中，步骤b还包括，在加入经步骤a过滤的样品之后，加入AssayDiluent RD1-111以封板。
在一个实施方式中，步骤b的孵育为在室温下以500-600 rpm振荡孵育3小时。
在一个实施方式中，步骤c的孵育为在室温下以500-600 rpm振荡孵育1小时。
在一个实施方式中，步骤d的孵育为在室温下以500-600 rpm振荡孵育30分钟。
在一个实施方式中，所述亲和捕获介质是Protein A配体偶联于4%琼脂糖凝胶的孔径为1 μm的微孔板。
第三方面，本申请提供了用于检测样品中游离B细胞刺激因子的试剂盒，所述试剂盒包括第二方面所述的方法中的试剂。
具体实施方式
第一方面，本申请提供了亲和捕获介质在制备用于检测样品中游离B细胞刺激因子的方法的试剂盒中的用途，所述方法包括以下步骤：a. 使用亲和捕获介质过滤样品；b.在预包被捕获抗体的酶标板中加入经步骤a过滤的样品并孵育；c. 用洗板液冲洗，加入检测抗体并孵育；d. 用洗板液冲洗，加入底物工作液并孵育；e. 加入终止液，使用酶标仪读取吸光度；其中所述亲和捕获介质选自：Protein A琼脂糖凝胶、Protein G琼脂糖凝胶和Protein L琼脂糖凝胶。在一个实施方式中，使用酶标仪读取吸光度时，检测波长为450 nm，参比波长为570 nm。
在一个实施方式中，所述检测抗体是人BAFF/BLyS缀合物。
在一个实施方式中，所述检测抗体是辣根过氧化物酶标记的抗人Blys多克隆抗体。
在一个实施方式中，所述洗板液是0.05% tween 20的磷酸盐缓冲液。
在一个实施方式中，所述捕获抗体是包被对人BAFF/BLyS特异化的单克隆抗体。
在一个实施方式中，所述底物工作液是TMB（Tetramethylbenzidine）。
在一个实施方式中，所述终止液是2N硫酸。
在一个实施方式中，在步骤a之前，所述方法还包括预处理亲和捕获介质的步骤：在离心速度为2500 rpm且离心时间为5分钟的条件下，使用磷酸缓冲液冲洗亲和捕获介质。
在一个实施方式中，所述磷酸缓冲液是1×PBS缓冲液。
在一个实施方式中，步骤a的过滤包括，将样品加入亲和捕获介质中并室温过夜静置孵育，再离心收集过滤的样品。
在一个实施方式中，所述离心是2500 rpm离心15分钟。
在一个实施方式中，样品按200μL/孔加入亲和捕获介质中。
在一个实施方式中，在步骤b中，以50 μL/孔加入经步骤a过滤的样品。
在一个实施方式中，步骤b还包括，在加入经步骤a过滤的样品之后，加入AssayDiluent RD1-111以封板。
Assay Diluent RD1-111为含防腐剂的蛋白溶液。
在一个实施方式中，在步骤b中，以100 μL/孔加入Assay Diluent RD1-111。
在一个实施方式中，步骤b的孵育为在室温下以500-600 rpm振荡孵育3小时。
在一个实施方式中，在步骤c中，用洗板液以400 μL/孔冲洗数次，例如，1次、2次、3次或4次。
在一个实施方式中，在步骤c中，以200 μL/孔加入检测抗体。
在一个实施方式中，步骤c的孵育为在室温下以500-600 rpm振荡孵育1小时。
在一个实施方式中，在步骤d中，用洗板液以400 μL/孔冲洗数次，例如，1次、2次、3次或4次。
在一个实施方式中，在步骤d中，以200 μL/孔加入底物工作液。
在一个实施方式中，步骤d的孵育为在室温下以500-600 rpm振荡孵育30分钟。
在一个实施方式中，所述亲和捕获介质是Protein A配体偶联于4%琼脂糖凝胶的孔径为1 μm的微孔板。
在一个实施方式中，所述亲和捕获介质是Protein L配体偶联于4%琼脂糖凝胶的孔径为1 μm的微孔板。
在一个实施方式中，所述亲和捕获介质是Protein G配体偶联于4%琼脂糖凝胶的孔径为1 μm的微孔板。
在一个实施方式中，在步骤e中，以50 μL/孔加入终止液，轻敲板边确保各孔边缘无蓝-绿色现象。
在一个实施方式中，在步骤e中，30分钟内用酶标仪读取吸光度。
在一个实施方式中，所述洗板液是0.05% tween 20的磷酸盐缓冲液。
在一个实施方式中，所述底物工作液是TMB（Tetramethylbenzidine）。
在一个实施方式中，所述终止液是2N硫酸。
第二方面，本申请提供了检测样品中游离B细胞刺激因子的方法，所述方法包括以下步骤：a. 使用亲和捕获介质过滤样品；b. 在预包被捕获抗体的酶标板中加入经步骤a过滤的样品并孵育；c. 用洗板液冲洗，加入检测抗体并孵育；d. 用洗板液冲洗，加入底物工作液并孵育；e. 加入终止液，使用酶标仪读取吸光度；其中所述亲和捕获介质选自：Protein A琼脂糖凝胶、Protein G琼脂糖凝胶和Protein L琼脂糖凝胶。
在一个实施方式中，在步骤a之前，所述方法还包括预处理亲和捕获介质的步骤：在离心速度为2500rpm且离心时间为5分钟的条件下，使用磷酸缓冲液冲洗亲和捕获介质。
在一个实施方式中，步骤a的过滤包括，将样品加入亲和捕获介质中并室温过夜静置孵育，再离心收集过滤的样品。
在一个实施方式中，步骤b还包括，在加入经步骤a过滤的样品之后，加入AssayDiluent RD1-111以封板。
在一个实施方式中，步骤b的孵育为在室温下以500-600 rpm振荡孵育3小时。
在一个实施方式中，步骤c的孵育为在室温下以500-600 rpm振荡孵育1小时。
在一个实施方式中，所述检测抗体是人BAFF/BLyS缀合物。
在一个实施方式中，所述检测抗体是辣根过氧化物酶标记的抗人Blys多克隆抗体。
在一个实施方式中，步骤d的孵育为在室温下以500-600 rpm振荡孵育30分钟。
在一个实施方式中，所述亲和捕获介质是Protein A配体偶联于4%琼脂糖凝胶的孔径为1 μm的微孔板。
在一个实施方式中，所述亲和捕获介质是Protein L配体偶联于4%琼脂糖凝胶的孔径为1 μm的微孔板。
在一个实施方式中，所述亲和捕获介质是Protein G配体偶联于4%琼脂糖凝胶的孔径为1 μm的微孔板。
在一个实施方式中，所述洗板液是0.05% tween 20的磷酸盐缓冲液。
在一个实施方式中，所述捕获抗体是包被对人BAFF/BLyS特异化的单克隆抗体。
在一个实施方式中，所述底物工作液是TMB（Tetramethylbenzidine）。
在一个实施方式中，所述终止液是2N硫酸。
第三方面，本申请提供了用于检测样品中游离B细胞刺激因子的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的用途或第二方面所述的方法中的试剂。
在一个实施方式中，所述试剂盒包括亲和捕获介质、预包被捕获抗体的酶标板、洗板液、检测抗体、底物工作液和终止液；其中所述亲和捕获介质选自：Protein A琼脂糖凝胶、Protein G琼脂糖凝胶和Protein L琼脂糖凝胶。
在一个实施方式中，所述试剂盒还包括磷酸缓冲液。
在一个实施方式中，所述试剂盒还包括Assay Diluent RD1-111。
在一个实施方式中，所述亲和捕获介质是Protein A配体偶联于4%琼脂糖凝胶的孔径为1 μm的微孔板。
在一个实施方式中，所述亲和捕获介质是Protein L配体偶联于4%琼脂糖凝胶的孔径为1 μm的微孔板。
在一个实施方式中，所述亲和捕获介质是Protein G配体偶联于4%琼脂糖凝胶的孔径为1 μm的微孔板。
在一个实施方式中，所述洗板液是0.05% tween 20的磷酸盐缓冲液。
在一个实施方式中，所述捕获抗体是包被对人BAFF/BLyS特异化的单克隆抗体。
在一个实施方式中，所述底物工作液是TMB（Tetramethylbenzidine）。
在一个实施方式中，所述终止液是2N硫酸。
在一个实施方式中，所述检测抗体是人BAFF/BLyS缀合物。
在一个实施方式中，所述检测抗体是辣根过氧化物酶标记的抗人Blys多克隆抗体。
本申请的方法建立简易的亲和捕获装置，该装置在实现实验目的的同时，材料易获取，且易于操作。
本申请的方法具有较高的灵敏度（62.5 pg/mL），创新性高，操作简便。使用本申请的方法可以通用的检测机体在给予针对不同的靶向BLyS新药后体内游离BLyS浓度的变化趋势，可以加速新药上市进程，同时也能为新药研究过程中，找到无创性生物标志物即药效指标提供依据。
亲和捕获介质，例如Protein A琼脂糖凝胶、Protein G琼脂糖凝胶和Protein L琼脂糖凝胶可高效去除样品中的结合的Blys。使用本申请的方法能够将样品中结合的Blys和游离的Blys相区分。
本申请的方法操作简单，重复性好，适用大规模检测样品中的游离的Blys。
实施例
将通过具体实例的方式更详细地描述本申请。提供以下实施例仅用于说明目的，且并不旨在以任何方式限制本申请。本领域技术人员将容易认识到各种非关键参数，这些参数可以被改变或修改以产生基本上相同的结果。
实施例1
概述
样品通过亲和捕获步骤后，结合的Blys吸附在亲和捕获凝胶上，样品中的游离BLyS被预先包被在96孔微孔板上的包被抗体捕获，加入检测抗体，形成“捕获抗体-BLyS-检测抗体”免疫复合物，最后加入辣根过氧化物酶的底物，读取吸光度值，吸光度的高低与BLyS的含量成函数关系，利用函数关系回算样品中的BLyS浓度，从而实现定量游离BLyS的检测目的。
步骤
1) 预处理步骤：
将偶联Protein A的凝胶（例如，Protein A配体偶联于4%琼脂糖凝胶）充分混匀，以200 μL/孔快速加入孔径为1 μm的96孔滤板中。
将上述96孔板用磷酸缓冲液，在离心条件为2500rpm离心5min的条件下，冲洗3遍，以便洗净凝胶保护液和形成稳固的柱床。
2) 实验步骤
样品经亲和捕获处理：将样品按照微孔板计划的位置以200 μL/孔加入至经上述步骤处理后的含Protein A的滤板中，滤板下方放置一块新的PP板，于室温过夜静置孵育。
收集样品：孵育完成后，将上述滤板和PP板于2500 rpm离心15分钟，收集PP板中的样品，样品暂存于2-8℃。
加样：在预包被捕获抗体的96孔酶标板中以50 μL/孔加入经上述亲和捕获装置处理后的样品，之后再以100 μL/孔加入Assay Diluent RD1-111。封板后在室温环境下以500-600 rpm振荡孵育3小时。
洗板：孵育结束后取出酶标板，彻底吸出溶液，用洗板液以400 μL/孔冲洗4次。最后一次洗涤后吸干并拍干。
加检测抗体：在酶标板中以200 μL/孔加入检测抗体（Human BAFF/BLySConjugate）。封板后在室温环境下以500-600 rpm振荡孵育1小时。
洗板：孵育结束后取出酶标板，彻底吸出溶液，用洗板液以400 μL/孔冲洗4次。最后一次洗涤后吸干并拍干。
加底物：在酶标板中以200 μL/孔加入底物工作液。封板后在室温环境下以500-600 rpm避光振荡孵育30分钟。
加终止液：50 μL/孔加入终止液，轻敲板边确保各孔边缘无蓝-绿色现象。
检测：30分钟内用酶标仪读取吸光度，检测波长450nm，参比波长570nm，打印并保存原始数据。
结果
标准曲线样品、验证样品以及人血清中的结果如表1和表2所示，表1与表2中的数据相对应。
表1
| 1 | 2 | 3 | 4 | |
| A | STD01 | VS01 | Hu1-D1 | SP01-ULOQ |
| B | STD02 | VS02 | Hu1-D2 | SP01-LLOQ |
| C | STD03 | VS03 | Hu1-D3 | SP02-ULOQ |
| D | STD04 | VS04 | Hu1-BLK | SP02-LLOQ |
| E | STD05 | VS05 | Hu2-D1 | SP03-ULOQ |
| F | STD06 | Hu2-D2 | SP03-LLOQ | |
| G | STD07 | Hu2-D3 | ULOQ | |
| H | BLK | Hu2-BLK | LLOQ |
表2
| 1 | 2 | 3 | 4 | |
| A | 2.1521 | 2.1816 | 0.0891 | 0.0320 |
| B | 1.1280 | 1.5534 | 0.1223 | 0.0180 |
| C | 0.5844 | 0.3388 | 0.1722 | 0.0534 |
| D | 0.2972 | 0.1231 | 0.2901 | 0.0182 |
| E | 0.1597 | 0.0496 | 0.0562 | 0.5159 |
| F | 0.0994 | 0.0875 | 0.0242 | |
| G | 0.0479 | 0.1324 | 2.0855 | |
| H | 0.0234 | 0.2100 | 0.0510 |
注：STD：标准曲线样品，VS：验证样品，Hu：人血清，D：药物，
BLK：空白，SP：特异性，ULOQ：定量上限，LLOQ：定量下限。
标曲回算结果如表3所示，质控样品回算结果如表4所示，其中孔编号与表1对应。
表3：标曲回算结果
| 样品 | 孔 | 浓度pg/mL | 值 | CalConc(pg/mL) | RE% |
| 1 | A1 | 4000 | 2.152 | 4045.174 | 1.1 |
| 2 | B1 | 2000 | 1.128 | 2023.054 | 1.2 |
| 3 | C1 | 1000 | 0.584 | 996.554 | -0.3 |
| 4 | D1 | 500 | 0.297 | 478.53 | -4.3 |
| 5 | E1 | 250 | 0.160 | 241.579 | -3.4 |
| 6 | F1 | 125 | 0.099 | 141.719 | 13.4 |
| 7 | G1 | 62.5 | 0.048 | 59.956 | -4.1 |
| 8 | H1 | 0.00 | 0.023 | NA | NA |
表4：质控样品回算结果
| 样品 | 孔 | 浓度pg/mL | 值 | CalConc(pg/mL) | RE% |
| VS01 | A2 | 4000 | 2.182 | 4104.608 | 2.6 |
| VS02 | B2 | 3000 | 1.553 | 2852.164 | -4.9 |
| VS03 | C2 | 550 | 0.339 | 551.967 | 0.4 |
| VS04 | D2 | 187.5 | 0.123 | 180.559 | -3.7 |
| VS05 | E2 | 62.5 | 0.05 | 62.576 | 0.1 |
表5：个体血清检测结果
| 样品 | 孔 | 值 | CalConc(pg/mL) | Final Con.(pg/mL) | Drug Con.(ng/mL) | 抑制率% |
| 1 | A3 | 0.089 | 125 | 250 | 2000 | 73.2 |
| 2 | B3 | 0.122 | 179 | 358 | 400 | 61.5 |
| 3 | C3 | 0.172 | 263 | 525 | 80.0 | 43.6 |
| 4 | D3 | 0.29 | 466 | 932 | 0.00 | NA |
表6：个体血清测试结果
| 样品 | 孔 | 值 | CalConc(pg/mL) | Final Con.(pg/mL) | Drug Con.(ng/mL) | 抑制率% |
| 1 | E3 | 0.056 | 73 | 146 | 2000 | 77.7 |
| 2 | F3 | 0.087 | 122 | 245 | 400 | 62.6 |
| 3 | G3 | 0.132 | 196 | 392 | 80.0 | 40.1 |
| 4 | H3 | 0.21 | 327 | 654 | 0.00 | NA |
注：药物浓度不同时，药物与Blys的结合量不同，可以观察到药物浓度越高，游离的Blys含量越低。
表7：加药抑制作用
注：进一步测试了药物浓度由低到高时，药物浓度高结合Blys增加，游离Blys减少。
通过基质样品和质控样品中加入不同浓度的药物，可以观察到游离Blys的检测量的变化。表5至表7表明，随着药物浓度增加，结合的Blys增加，游离Blys的含量降低。
Claims (13)
1.亲和捕获介质在制备用于检测样品中游离B细胞刺激因子的方法的试剂盒中的用途，所述方法包括以下步骤：
a. 使用亲和捕获介质过滤样品；
b. 在预包被捕获抗体的酶标板中加入经步骤a过滤的样品并孵育；
c. 用洗板液冲洗，加入检测抗体并孵育；
d. 用洗板液冲洗，加入底物工作液并孵育；
e. 加入终止液，使用酶标仪读取吸光度；
其中所述亲和捕获介质选自：Protein A琼脂糖凝胶、Protein G琼脂糖凝胶和ProteinL琼脂糖凝胶。
2.如权利要求1所述的用途，其中在步骤a之前，所述方法还包括预处理亲和捕获介质的步骤：
在离心速度为2500rpm且离心时间为5分钟的条件下，使用磷酸缓冲液冲洗亲和捕获介质。
3.如权利要求1所述的用途，其中步骤a的过滤包括，
将样品加入亲和捕获介质中并室温过夜静置孵育，再离心收集过滤的样品。
4.如权利要求1所述的用途，其中步骤b还包括，
在加入经步骤a过滤的样品之后，加入Assay Diluent RD1-111以封板。
5. 如权利要求1所述的用途，其中，
步骤b的孵育为在室温下以500-600 rpm振荡孵育3小时；和/或
步骤c的孵育为在室温下以500-600 rpm振荡孵育1小时；和/或
步骤d的孵育为在室温下以500-600 rpm振荡孵育30分钟。
6. 如权利要求1所述的用途，其中所述亲和捕获介质是Protein A配体偶联于4%琼脂糖凝胶的孔径为1 μm的微孔板。
7.检测样品中游离B细胞刺激因子的方法，所述方法包括以下步骤：
a. 使用亲和捕获介质过滤样品；
b. 在预包被捕获抗体的酶标板中加入经步骤a过滤的样品并孵育；
c. 用洗板液冲洗，加入检测抗体并孵育；
d. 用洗板液冲洗，加入底物工作液并孵育；
e. 加入终止液，使用酶标仪读取吸光度；
其中所述亲和捕获介质选自：Protein A琼脂糖凝胶、Protein G琼脂糖凝胶和ProteinL琼脂糖凝胶。
8.如权利要求7所述的方法，其中在步骤a之前，所述方法还包括预处理亲和捕获介质的步骤：
在离心速度为2500rpm且离心时间为5分钟的条件下，使用磷酸缓冲液冲洗亲和捕获介质。
9.如权利要求7所述的方法，其中步骤a的过滤包括，
将样品加入亲和捕获介质中并室温过夜静置孵育，再离心收集过滤的样品。
10.如权利要求7所述的方法，其中步骤b还包括，
在加入经步骤a过滤的样品之后，加入Assay Diluent RD1-111以封板。
11. 如权利要求7所述的方法，其中，
步骤b的孵育为在室温下以500-600 rpm振荡孵育3小时；和/或
步骤c的孵育为在室温下以500-600 rpm振荡孵育1小时；和/或
步骤d的孵育为在室温下以500-600 rpm振荡孵育30分钟。
12. 如权利要求7所述的方法，其中所述亲和捕获介质是Protein A配体偶联于4%琼脂糖凝胶的孔径为1 μm的微孔板。
13.用于检测样品中游离B细胞刺激因子的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求7至12中任一项所述的方法中的试剂。
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