TWI811793B - 豬瘟病毒可溶性Erns重組蛋白、其製造方法及其用於鑑別豬瘟病毒感染之套組及方法 - Google Patents
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Abstract
本發明有關於一種豬瘟病毒可溶性Erns重組蛋白及其製造方法暨其用於鑑別豬瘟病毒感染之套組及方法。豬瘟病毒Erns重組蛋白利用原核轉形細胞表現後，經過均質化處理並利用萃取緩衝溶液進行可溶化處理，以獲得豬瘟病毒Erns可溶性重組蛋白，其可應用於鑑別套組及/或方法，區分生物樣本來源的豬隻對象是否受到豬瘟病毒感染，或已接受豬瘟病毒E2次單位疫苗免疫。
Description
本發明係有關一種動物病毒之重組蛋白及其應用，特別是有關於一種豬瘟病毒可溶性Erns重組蛋白、其製造方法暨其用於鑑別豬瘟病毒感染之套組及方法。
豬瘟(Classical swine fever)是由經典豬瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV) 所引起之高傳染性與高致死性疾病。於1903年首次被發現後，一直在亞洲、非洲、歐洲、中南美洲地區流行著，造成全球養豬業的經濟嚴重的損失，更對於無豬瘟的國家的農業安全產生極大威脅。例如：美國的豬瘟是一種有強傳染性病毒的豬病，這種病就是由經典豬瘟病毒所引起的。此病毒流行的國家必須使用常規疫苗接種來預防和控制豬瘟的傳播。如果使用得當，疫苗接種可以成為限制豬瘟傳播、預防疾病爆發並在未感染豬群中建立保護性免疫的有效方法。
豬瘟病毒屬於黃病毒科(Flaviviridae)中的瘟疫病毒屬(Pestivius)，其基因組單股正向的RNA，全長約12.3 kb，可轉譯出具有3898個胺基酸之多聚蛋白(polyprotein)。經蛋白酶加工後可形成四種結構蛋白(C、Erns、E1和E2)及八種非結構病毒蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)，其中E2蛋白、Erns重組蛋白及NS3蛋白可誘發宿主產生抗體反應。
目前普遍使用之商品化豬瘟疫苗有豬瘟活毒減毒疫苗(Modified Live Vaccine；MLV)，以及豬瘟病毒套膜蛋白E2次單位疫苗。雖然豬瘟MLV疫苗價格低廉且有效，然而在血清抗體檢測上，抗體呈現的陽性免疫反應僅能檢測出受試豬隻具有抗豬瘟病毒的內生性抗體，但無法鑑別此內生性抗體究竟是因為接種MLV疫苗而產生，或是受到豬瘟病毒感染而產生。
其次，動物接種豬瘟MLV疫苗後，存在於環境中的病毒仍可能持續感染動物，而動物體內仍具有一定程度的低病毒量，難以消除存在於環境及動物體內的病毒。為完全撲滅豬瘟病毒之感染源，亟需提供一種鑑別試劑，以在動物養殖場中，區別豬隻是已接受疫苗免疫或受到豬瘟病毒感染，以利後續進行撲滅計畫。
因此，本發明之一態樣是提供一種豬瘟病毒可溶性Erns重組蛋白的製造方法，其係利用原核轉形細胞表現豬瘟病毒(CSFV) Erns重組蛋白後，經均質化處理及利用萃取緩衝溶液進行可溶化處理後，可獲得豬瘟病毒Erns可溶性重組蛋白。
其次，本發明之另一態樣是提供一種豬瘟病毒可溶性Erns重組蛋白，其係由上述方法製得。
再者，本發明之又一態樣是提供一種鑑別豬瘟病毒感染之套組，其係將上述豬瘟病毒可溶性Erns重組蛋白固定於反應區域的表面，並利用二級抗體專一性辨識抗Erns重組蛋白的第一抗體，但二級抗體不與由豬瘟病毒E2次單位疫苗免疫產生的第二抗體產生交互作用，有利於鑑別豬瘟病毒感染或已接受豬瘟病毒E2次單位疫苗免疫。
另外，本發明之再一態樣是提供一種鑑別豬瘟病毒感染之方法，其包含利用上述套組鑑別豬瘟病毒感染或已接受豬瘟病毒E2次單位疫苗免疫。
根據本發明之上述態樣，提出一種豬瘟病毒可溶性Erns重組蛋白的製造方法。首先，對原核轉形細胞進行蛋白表現步驟，其中原核轉形細胞可包含重組質體，以表現如序列辨識編號(SEQ ID NO):1所示之胺基酸序列之豬瘟病毒(CSFV) Erns重組蛋白。接著，對前述原核轉形細胞進行均質化處理，以獲得細胞沉澱物，其中此細胞沉澱物包含豬瘟病毒Erns重組蛋白之包涵體。然後，利用萃取緩衝溶液對前述細胞沉澱物進行可溶化處理，以獲得豬瘟病毒Erns可溶性重組蛋白，其中前述的萃取緩衝溶液可由20 mM至30 mM之三羥甲基胺基甲烷(Tris)鹽、450 mM至550 mM之氯化鈉(NaCl)及7 M至9 M之尿素(Urea)所組成，且其酸鹼值為pH 7.0至pH 8.0。
在上述實施例中，前述原核轉形細胞的宿主細胞可例如為大腸桿菌BL21(DE3)株。
在上述實施例中，前述重組質體可包含如SEQ ID NO:2所示之核酸序列，以編碼豬瘟病毒Erns重組蛋白。
在上述實施例中，前述萃取緩衝溶液是由例如25 mM之Tris鹽、500 mM之氯化鈉(NaCl)及8 M之尿素(Urea)所組成，且萃取緩衝溶液之酸鹼值為pH 7.5。
在上述實施例中，前述可溶化處理可例如於0°C至4°C進行20分鐘至40分鐘。
在上述實施例中，於前述可溶化處理之後，可選擇性對豬瘟病毒Erns可溶性重組蛋白進行管柱純化步驟，以獲得純化之豬瘟病毒Erns可溶性重組蛋白。
根據本發明之另一態樣，提出一種豬瘟病毒可溶性Erns重組蛋白，其係由上述之方法製得。
根據本發明之再一態樣，提出一種鑑別豬瘟病毒感染之套組。在一實施例中，前述套組可包括豬瘟病毒可溶性Erns重組蛋白固定於反應區域的表面，以及二級抗體，且二級抗體係與反應區域連通。在上述實施例中，豬瘟病毒可溶性Erns重組蛋白可例如為如SEQ ID NO:1所示之胺基酸序列。前述二級抗體只專一性辨識抗Erns重組蛋白的第一抗體，但不與由豬瘟病毒E2次單位疫苗免疫產生的第二抗體產生交互作用。
在上述實施例中，前述套組可選擇性包含顯示區域，以呈現前述鑑別反應的結果。
根據本發明之另一態樣，提出一種鑑別豬瘟病毒感染之方法。在一實施例中，首先，將如SEQ ID NO:1所示之胺基酸序列的豬瘟病毒可溶性Erns重組蛋白固定於反應區域的表面。接著，加入生物樣本於反應區域中，使生物樣本與豬瘟病毒可溶性Erns重組蛋白進行鍵結反應。然後，移除未反應之生物樣本。之後，將二級抗體導入反應區域中，使二級抗體與豬瘟病毒可溶性Erns重組蛋白鍵結之生物樣本進行鑑別反應，其中二級抗體只專一性辨識生物樣本中抗Erns重組蛋白的第一抗體，但不與生物樣本中經豬瘟病毒E2次單位疫苗免疫產生的第二抗體反應。而後，判斷鑑別反應之結果，當鑑別反應為陽性時，則判斷生物樣本來源的豬隻對象為受到豬瘟病毒感染；或者當鑑別反應為陰性時，判斷生物樣本來源的豬隻對象為已接受該豬瘟病毒E2次單位疫苗免疫。
在上述實施例中，前述生物樣本可包括離體的臟器、組織、細胞、體液、淋巴液、尿液、全血、血漿、血清及/或細胞培養上清液。
應用本發明豬瘟病毒可溶性Erns重組蛋白及其製造方法，其可利用原核轉形細胞表現出豬瘟病毒Erns重組蛋白後，將原核轉形細胞之細胞沉澱物利用萃取緩衝溶液進行可溶化處理，可獲得豬瘟病毒Erns可溶性重組蛋白。當豬瘟病毒Erns可溶性重組蛋白應用於鑑別套組及/或方法時，可有效區分生物樣本來源的豬隻對象是否受到豬瘟病毒感染，或已接受豬瘟病毒E2次單位疫苗免疫。
可以理解的是，前述的概括說明及下述的詳細說明僅為例示，旨在對要求保護的發明提供進一步的解釋。
倘若引用文獻對一術語的定義或用法，與此處對該術語的定義不一致或相反，則適用此處對該術語的定義，而不適用該引用文獻對該術語的定義。其次，除非上下文另有定義，單數術語可包括複數，而複數術語亦可包括單數。
如前所述，本發明是提供一種豬瘟病毒可溶性Erns重組蛋白及其製造方法暨其用於鑑別豬瘟病毒感染之套組及方法。前述豬瘟病毒Erns重組蛋白利用原核轉形細胞表現後，經由均質化處理並利用萃取緩衝溶液進行可溶化處理，以獲得豬瘟病毒Erns可溶性重組蛋白，其可應用於鑑別豬瘟病毒感染之套組及/或方法。
本文所稱之「重組蛋白」、「嵌合蛋白」、「重組抗原」、「蛋白質」、「胜肽」及「多肽」是可互換的，指的是胺基酸的聚合物，通常藉由肽鍵或二硫鍵連接在一起。「胜肽」亦可用於其中一個或多個胺基酸殘基是天然存在的胺基酸及其聚合物、或者對應於天然存在的胺基酸之類似物或模擬物的胺基酸聚合物。「胜肽」更包括經修飾的胺基酸聚合物，例如，具有碳水化合物殘基之醣蛋白，或被磷酸化的胜肽。胜肽、多肽及蛋白質可利用液相合成、固相合成或利用基因工程、重組細胞、原核表現系統、真核表現系統產生。在一實施例中，本文所稱之重組蛋白係指豬瘟病毒Erns重組蛋白。
此處所稱之「胺基酸」與「殘基」是可互換的，當與胜肽併用時，指的是天然存在及合成的胺基酸、胺基酸類似物、胺基酸模擬物及化學上與天然存在的胺基酸相似的非天然存在的胺基酸。
此處所稱之「豬瘟病毒」，其病毒株種類並無特別限制，可例如豬瘟病毒台灣株(基因型2.1，NP_777496.1)，然而在其他實施例中，亦可使用其他病毒株，端視實際需求而定。
此處所稱之「Erns重組蛋白」可例如為全長的Erns重組蛋白，如序列辨識編號(SEQ ID NO):1所示之胺基酸序列，或者由如SEQ ID NO:2所示之核酸序列所編碼之胺基酸序列。另外，為了方便後續純化蛋白，Erns重組蛋白之N端可選擇性添加組胺酸(His)標籤[His tag；或稱聚組胺酸(polyhistidine)]，其中His標籤可包含但不限於6至10個組胺酸殘基。
在一些實施例中，上述豬瘟病毒可溶性Erns重組蛋白可利用習知方法或下述方法製造。首先，對原核轉形細胞進行蛋白表現步驟，其中原核轉形細胞可包含重組質體，其含有如SEQ ID NO:2所示核酸序列之重組基因，以表現如序列辨識編號(SEQ ID NO):1所示之胺基酸序列之豬瘟病毒(CSFV) Erns重組蛋白。為了後續純化重組蛋白，上述重組基因的5’端可選擇性添加編譯His標籤的核酸序列。在一些例子中，前述編譯His標籤的核酸序列可例如由市售質體提供，並設計成與上述重組基因的5’端連接。有關His標籤的核酸序列乃本發明所屬技術領域之通常知識，在此不另贅述。
接著，對前述原核轉形細胞進行均質化處理，以獲得細胞沉澱物(亦稱為細胞碎片)，其中此細胞沉澱物包含豬瘟病毒Erns重組蛋白之包涵體。
由於豬瘟病毒Erns重組蛋白之包涵體是由不可溶蛋白堆積而成，會影響甚至無法發揮Erns重組蛋白原有的生物功能。因此，本發明利用萃取緩衝溶液對前述細胞沉澱物進行可溶化處理，以獲得豬瘟病毒Erns可溶性重組蛋白。在上述實施例中，前述的萃取緩衝溶液可由20 mM至30 mM之Tris鹽、450 mM至550 mM之氯化鈉(NaCl)及7 M至9 M之尿素(Urea)所組成，且萃取緩衝溶液之酸鹼值為pH 7.0至pH 8.0。在一例示中，前述萃取緩衝溶液可由例如25 mM之Tris鹽、500 mM之氯化鈉(NaCl)及8 M之尿素(Urea)所組成且萃取緩衝溶液之酸鹼值可為pH 7.5。在另一例示中，可溶化處理可例如於0°C至4°C進行20分鐘至40分鐘。在其他例示中，可溶化處理可例如於0°C進行30分鐘，且可溶化處理的過程中可併用攪拌處理。
在上述實施例中，於前述可溶化處理之後，可選擇性對豬瘟病毒Erns可溶性重組蛋白進行習知的管柱純化步驟，以獲得純化之豬瘟病毒Erns可溶性重組蛋白。補充說明的是，相較於習知管柱純化步驟中必須另外添加β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol，b-ME或BME)以避免N端His標籤折疊，前述所得的豬瘟病毒Erns可溶性重組蛋白在進行管柱純化步驟時，無須另外添加b-ME，即可獲得較佳的純化效果。
大體而言，上述Erns重組蛋白之生產量在每公升菌液中可得到至少21.8毫克(mg)的可溶性Erns重組蛋白，後續可應用於鑑別套組及/或方法，區分生物樣本來源的豬隻對象是否受到豬瘟病毒感染，或已接受豬瘟病毒E2次單位疫苗免疫。上述鑑別套組及/或方法可包含免疫分析套組及/或方法，例如酵素結合免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)套組及/或方法(如間接式ELISA)，以檢測生物樣本所含的抗體。
此處所稱的「生物樣本」並無特別限制，可例如離體的臟器、組織、細胞、體液、淋巴液、尿液、全血、血漿、血清及/或細胞培養上清液等，然而本發明並不限於此處所舉。
在一些例子中，上述鑑別方法可使用習知ELISA套組(及/或生物晶片)進行。一般而言，適合的ELISA套組及/或生物晶片的種類並無特別限制，在一些例子中，上述套組可包括如SEQ ID NO:1所示之胺基酸序列的豬瘟病毒可溶性Erns重組蛋白以及二級抗體。上述豬瘟病毒可溶性Erns重組蛋白可固定於套組之反應區域的表面。上述二級抗體可為溶液態儲存於試劑區並以微流道與反應區域連通，其中此二級抗體只專一性辨識抗Erns重組蛋白的第一抗體，但不與由豬瘟病毒E2次單位疫苗免疫產生的第二抗體產生交互作用，也不與無特定病原(SPF)豬隻血清有任何抗體-抗原的結合反應。在其他實施例中，上述套組可選擇性包含顯示區域，以呈現鑑別反應的結果。上述套組的種類並無特別限制，舉例而言，當上述套組為快篩試劑時，顯示區域可例如觀測窗，以利用肉眼觀測鑑別反應後色條(strip)之檢測線及控制線的結果。當上述套組為生物晶片時，顯示區域可例如顯示器，以顯示利用光學式或電化學檢測反應產物之影像或訊號。
在此釐清的是，上述所得的Erns重組蛋白是做為免疫分析用，而非做為疫苗用，因此必須要使用全長Erns重組蛋白才能有效區分生物樣本來源的豬隻對象是否受到豬瘟病毒感染，或已接受豬瘟病毒E2次單位疫苗免疫。倘若利用SEQ ID NO:1以外的胺基酸序列所得的重組蛋白，例如改變長度或改變選用的序列範圍，則將無法發揮上述效果，即區分生物樣本來源的豬隻對象是否受到豬瘟病毒感染，或已接受豬瘟病毒E2次單位疫苗免疫。
在一些實施例中，上述區分生物樣本來源的豬隻對象是否受到豬瘟病毒感染的具體方式，指的是上述Erns重組蛋白只專一性辨識生物樣本中抗Erns重組蛋白的抗體(亦稱第一抗體)，但不與生物樣本中經豬瘟病毒E2次單位疫苗免疫產生的抗體(亦稱第二抗體)反應。倘若利用SEQ ID NO:1以外的胺基酸序列所得的重組蛋白，例如改變長度或改變選用的序列範圍，則修飾後的Erns重組蛋白有可能同時與第一抗體及第二抗體反應，而無法區分生物樣本來源的豬隻對象是否受到豬瘟病毒感染，或已接受豬瘟病毒E2次單位疫苗免疫。
可以理解的是，下述特定的重組蛋白序列、特定的配方、特定的使用劑量、特定的檢測方式、觀點、例示及實施例僅供舉例說明，並非做為本發明的限制條件。在不脫離本發明之精神和範圍內，本發明的主要特徵可用於各種實施例。因此本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可輕易確定本案的必要技術特徵，對本發明作各種更動及潤飾，以適用不同的用途及條件。
實施例 1：製備豬瘟病毒可溶性Erns重組蛋白
1.1 構築豬瘟病毒Erns重組 蛋白的重組質體
來自於典型豬瘟病毒(Classical swine fever virus) (CSFV Egystrup strain, Genotype1.1) 的Erns 全基因片段，利用全基因合成(生工有限公司)合成該基因片段。經由聚合酶鏈反應[polymerase chain reaction (PCR)，ThermoFisher scientific；Phusion高保真DNA聚合酶，Phusion High-Fidelity DNA polymerase，進階公司，台灣] 擴增Erns全基因片段(如SEQ ID NO:2所示序列)。然後，根據市售In-fusion 構築套組(TaKaRa Bio, USA)提供的方法，取1 μL的Erns基因片段(10 ng/ μL，如SEQ ID NO:2所示序列)、1 μL 的pET21 質體 (10 ng/μL) (Invitrogen)以及0.5 μL之接合酶(TaKaRa Bio, USA)，在50°C反應20分鐘。之後，將上述反應產物加入25 μL之ECOSTM X勝任細胞[DH5a] (益生生技，台灣)，42°C 50秒進行轉形反應。然後，將轉形細胞之菌液塗在含安比西林(Ampicillin，Biobasic, 台灣)的LB 培養基(DifcoTM LB Broth, Miller , BD)的表面。放置37°C 約16至18小時，等待菌落形成。之後，挑出單一菌落進行基因定序。
1.2 表現豬瘟病毒Erns重組蛋白
取1 μL基因定序確認的pET-21-Erns質體(即含有如SEQ ID NO:2所示核酸序列之重組質體)加上25 μL之 ECOSTM 21勝任細胞[BL21(DE3)] (益生生技，台灣)]，以42°C、50秒進行轉殖。然後，將菌液塗在含100 μg/μL之安比西林 (Biobasic，台灣)的LB 培養基(DifcoTM LB Broth, Miller, BD)上。放置37°C 約16至18小時等待菌落形成。挑單一菌落到500 μL含有100 μg/μL之安比西林的LB 培養液中，培養在37°C達6至8小時，取50 μL菌液到50mL 含有100 μg/μL之安比西林的LB 培養液中，培養在37°C達16至18小時，取10mL之菌液到1L 含有100 μg/μL之安比西林的LB 培養液中，培養在37°C約3小時後，加入500 μL、1M的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷[Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside，IPTG；友和貿易，台灣) 進行蛋白誘導表現，培養在22°C約16至18小時。
1.3豬瘟病毒Erns重組蛋白的均質化處理、可溶化處理及管柱純化步驟
在此實施例中，豬瘟病毒Erns重組蛋白依序經由均質化處理(以下亦稱為步驟1)及可溶化處理(以下亦稱為步驟2)，析述如下。
步驟1：取大腸桿菌的細胞加入100mL之細胞溶解緩衝溶液 (含有25mM Tris鹽及500mM之NaCl，pH 7.5)，利用市售均質機 (IKA,台灣)進行均質化處理。然後，於上述反應產物中加入0.5g之溶菌酶(lysozyme，Cyrusbioscience，台灣)並混合均勻後，靜置於冰上30分鐘。接著，於上述反應產物中加入0.05g DNase I (Cyrusbioscience，台灣)，利用市售超音波細胞破碎儀(尚偉，台灣)進行震盪，每震盪3秒停5秒，全程共20分鐘，以獲得均質化產物。之後，將均質化產物以12000×g之轉速離心40分鐘，以獲得第一上清液(1S，圖號101的S道)及第一沉澱物(1P，圖號101的P道)，其中第一沉澱物(1P)包含豬瘟病毒Erns重組蛋白之包涵體。
步驟2：於第一沉澱物(1P)中加入萃取緩衝溶液(由25 mM之Tris鹽、500 mM之氯化鈉及8 M之尿素所組成)並混合均勻後，置於冰上(0°C)攪拌30分鐘進行可溶化處理。之後，將可溶化產物以12000×g之轉速離心40分鐘，藉此獲得第二上清液(簡稱2S，圖號103的S道)與第二沉澱物(簡稱為2P，圖號103的P道)。
請參閱圖1A，其係顯示根據本發明一實施例之豬瘟病毒可溶性Erns重組蛋白的製造方法之步驟1 (圖號101)與步驟2 (圖號103)的十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE)之膠體影像結果。由圖1A的結果顯示，原核表現系統產生之Erns重組蛋白為不可溶蛋白105，其蛋白質出現在第一沉澱物(1P)(如圖1A之圖號101之P道的箭頭所示之不可溶蛋白105)，且其分子量為28kDa。
然而，利用Erns萃取緩衝溶液(由25 mM之Tris鹽、500 mM之氯化鈉、8 M之尿素所組成，且酸鹼值為pH 7.5)，可將第一沉澱物(1P)中不可溶蛋白105進行可溶化處理，以於第二上清液(簡稱2S)獲得可溶性蛋白107。
具體而言，於第一沉澱物(1P)中加入100mL之萃取緩衝溶液，放置冰上攪拌30分鐘，以12000×g之轉速離心40分鐘後，可獲得第二上清液(2S)及第二沉澱物(2P)，並以SDS-PAGE電泳分析。請參閱圖1A，第一沉澱物(1P)中不可溶蛋白105，在第二上清液(2S)中已轉為可溶性蛋白107 (如圖1A之圖號103之S道的箭頭所示之可溶性蛋白107)。
請參閱圖1B，其係顯示圖1A之西方轉印法的影像結果，其西方轉印法之流程如下所述。將含有Erns重組蛋白的SDS-PAGE膠片轉印到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜(GE healthcare，台灣進階)上，與20 mL之阻隔緩衝溶液[blocking buffer，包含添加聚山梨醇酯20 (Tween 20)之Tris緩衝鹽溶液(Tris Buffered Saline with Tween 20，TBST)及5%之牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)]在室溫(約25°C)反應2小時。然後，移除阻隔緩衝溶液，將PVDF膜與10mL之抗His標籤的抗體溶液[稀釋倍數1:1000之抗體與TBST緩衝溶液(添加0.1% Tween-20之1x PBS)]在4°C反應16至18小時。之後，移除抗His標籤的抗體溶液，以10 mL之TBST緩衝溶液潤洗PVDF膜三次，每次潤洗20分鐘。然後，將PVDF膜與抗-小鼠抗體(anti-mouse antibody，稀釋倍數1:10000之)的TBST緩衝溶液，在室溫反應1小時。之後，移除含抗體的TBST緩衝溶液，加入10mL之 TBST緩衝溶液清洗PVDF膜三次後，每次20分鐘，加入呈色劑(ECL stain kit，台灣進階)進行呈色，其結果如圖1B所示。
圖1B的結果顯示，以抗His標籤的抗體與Erns重組蛋白之N端聚組胺酸(polyhistidine)作用，確認第一沉澱物(1P，圖號101的P道)中不可溶蛋白105經過可溶化處理後，在第二上清液(2S)中已轉為可溶性蛋白107，如圖1B之圖號103之S道的箭頭所示之可溶性蛋白107，其分子量為28kDa，且含有N端His標籤。
另外，利用市售分光儀(例如BioSpectrometer儀器，Eppendorf，台灣)測量可溶性蛋白107於280nm的吸光值(OD
280nm)，並利用下式(I)計算蛋白濃度：
(A280吸光值×蛋白消光係數)×樣品體積=蛋白濃度 (I)。
經計算出可溶性Erns重組蛋白的濃度為(1.2/2.2)×40 mL =21.8 mg，代表每公升菌液可獲得21.8毫克(mg)之可溶性Erns重組蛋白。
含可溶性Erns重組蛋白的第二上清液(圖號2S)可選擇性通過鎳-氮[基]三醋酸瓊脂糖管柱(Ni-nitrilotriacetic acid agarose column，Ni-NTA agarose column，Cytiva，台灣進階)，進行管柱純化步驟，並以流洗液[圖號FT，含有100 mM之咪唑(imidazole)]予以流洗。由此所得的蛋白即為純化的可溶性Erns重組蛋白，如圖2A之圖號Erns道的箭頭所示之可溶性蛋白107，其分子量為28kDa。
請參閱圖2B，其係顯示圖2A之西方轉印法的影像結果，其中純化的可溶性Erns重組蛋白如圖2B之圖號Erns道的箭頭所示之可溶性蛋白107，其分子量為28kDa，且含有N端His標籤。
實施例 2：豬瘟病毒之Erns重組蛋白之專一性鑑別結合反應
此實施例建立抗原與抗體之免疫結合功能驗證，以酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)進行豬瘟病毒Erns重組蛋白之專一性鑑別結合反應。
1.4.1 生物樣本
此實施例將血清來源分別為以下三組：(1) 陽性血清組：台灣南部某牧場，施打活毒減毒豬瘟病毒疫苗(來源為高市農乾燥兔化豬瘟疫苗，高雄市農會生物製藥廠，模擬豬瘟病毒感染)的六週齡仔豬血清，於施打疫苗二週後採血。(2) 陰性血清組：無特定病原之八週齡仔豬(來源為動物科技研究所，竹南)血清。(3)疫苗組：無特定病原(SPF)之四週齡仔豬(來源為動物科技研究所，竹南)，於施打市售Bayovac® CSF-E2次單位疫苗(Bayer)後四週採血之血清。以上每組為至少三重複。
1.4.2實驗步驟
純化後的Erns重組蛋白利用碳酸鹽-碳酸氫鹽緩衝溶液(carbonate-bicarbonate buffer，Sigma,台灣友和)，把蛋白濃度調整為1 μg/μL。接著，將60 ng/μL Erns重組蛋白塗佈在96孔(well)平底微量盤的底部(Corning,台灣)。置於4°C達16至18小時。然後，於每孔中加入250 μL之 PBST(1x PBS及0.5 % Tween-20)潤洗，於室溫進行10分鐘，期間以125 rpm之轉速震盪，並重複此步驟5次。之後，於每孔加入250 μL之阻隔緩衝溶液[PBST及5 % BSA(Sigma, 友和)]，37°C達2小時。移除阻隔緩衝溶液後，於每孔加入100 μL (稀釋比例為1:1500)的各種血清，於37°C反應1小時後，移除各種血清。接著，於每孔加入250 μL之 PBST (1x PBS及0.5 % Tween-20)，在室溫反應10分鐘，以125 rpm轉速震盪，並重複此步驟5次。然後，於每孔加入100 μL之二級抗體[山羊抗豬之辣根過氧化物酶標記之抗體，Goat-anti pig horseradish peroxidase(HRP) Ab，稀釋比例為1:10000，abcam(ab18184)，台灣]，37°C反應1小時後，移除二級抗體。接著，於每孔加入250 μL之 PBST (1x PBS及0.5 % Tween-20)，在室溫反應10分鐘，以125 rpm轉速震盪，並重複此步驟5次。而後，於每孔加入100 μL之呈色受質(例如四甲基聯苯胺二鹽酸鹽，3,3',5,5'- tetramethyl benzidine dihydrochloride，TMB)，於室溫反應15至20分鐘後，加入100 μL 之終止(STOP)溶液(ScyTek，友和)，檢測每孔於450 nm 之吸光值(OD
450 nm)，其結果如圖3所示。
請參閱圖3，其係繪示根據本發明一實施例利用豬瘟病毒Erns可溶性重組蛋白鑑別不同生物樣本之直條圖。如圖3結果顯示，利用上述實施例純化之豬瘟病毒Erns可溶性重組蛋白，經由ELISA 方式測試後，Erns可溶性重組蛋白會和陽性血清組之血清抗體 (施打活毒減毒疫苗的仔豬血清)有結合反應，且具有統計上顯著差異(如圖號＊所示，*
p＜0.05)。然而，上述純化之豬瘟病毒Erns可溶性重組蛋白與陰性血清組(即SPF仔豬的仔豬血清)以及疫苗組(即施打市售E2次單位疫苗(Bayer)的仔豬血清)皆無免疫結合反應。
上述實施例純化之豬瘟病毒Erns可溶性重組蛋白確實可與全病毒產生之血清抗體產生專一性結合反應，但與E2次單位疫苗接種之免疫反應產生之抗體則無結合反應，代表上述實施例純化之豬瘟病毒Erns可溶性重組蛋白確實能有效區分生物樣本來源的豬隻對象是否受到豬瘟病毒感染，或已接受豬瘟病毒E2次單位疫苗免疫，未來可望應用於豬瘟病毒鑑別型診斷試劑，進而達到清除豬瘟病毒的目標。
綜言之，本發明以特定的胺基酸序列、特定的製造方法、特定的組成、特定的分析模式或特定的評估方法僅用於例示說明豬瘟病毒可溶性Erns重組蛋白及其製造方法暨其用於鑑別豬瘟病毒感染之套組及方法。然而，本發明所屬技術領域中具有通常知識者應可理解，在不脫離本發明的精神及範圍內，其他的胺基酸序列、其他的製造方法、其他的組成、其他的分析模式或其他的評估方法亦可用於豬瘟病毒可溶性Erns重組蛋白及其製造方法暨其用於鑑別豬瘟病毒感染之套組及方法，並不限於上述。
舉例而言，豬瘟病毒可溶性Erns重組蛋白可使用其他表現系統(例如真核表現系統)製得，以優化製程及量產。所得的豬瘟病毒可溶性Erns重組蛋白可視實際需求，應用於快篩試劑或生物晶片或其他市售的檢驗產品。另外，用於鑑別豬瘟病毒感染的生物樣本除了血清之外，亦可使用例如離體的臟器、組織、細胞、體液、淋巴液、尿液、全血、血漿及/或細胞培養上清液等。
根據上述實施例，本發明的豬瘟病毒可溶性Erns重組蛋白及其製造方法，其優點在於利用原核轉形細胞表現出豬瘟病毒Erns重組蛋白後，將原核轉形細胞之細胞沉澱物利用萃取緩衝溶液進行可溶化處理，可獲得豬瘟病毒Erns可溶性重組蛋白。當豬瘟病毒Erns可溶性重組蛋白未來可應用於鑑別套組及/或方法，能有效區分生物樣本來源的豬隻對象是否受到豬瘟病毒感染，或已接受豬瘟病毒E2次單位疫苗免疫。
雖然本發明已以數個特定實施例揭露如上，但其他實施例亦有可能。因此，本發明後附請求項之精神及範圍不應限於這裡包含的實施例所述。
101:步驟1 103:步驟2
105:不可溶蛋白
107:可溶性蛋白
為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之詳細說明如下：
[圖1A] 係顯示根據本發明一實施例之豬瘟病毒可溶性Erns重組蛋白於可溶化處理後之十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)之膠體影像。
[圖1B]係顯示圖1A之西方轉印法的影像結果。
[圖2A] 係顯示根據本發明一實施例之豬瘟病毒可溶性Erns重組蛋白於管柱純化步驟後之SDS-PAGE之膠體影像。
[圖2B]係顯示圖2A之西方轉印法的影像結果。
[圖3]係繪示根據本發明一實施例利用豬瘟病毒Erns可溶性重組蛋白鑑別不同生物樣本之直條圖。
國內寄存資訊(請依寄存機構、日期、號碼順序註記)
無
國外寄存資訊(請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記)
無
Claims (6)
- 一種豬瘟病毒可溶性Erns重組蛋白的製造方法，包括：對一原核轉形細胞進行一蛋白表現步驟，其中該原核轉形細胞包含一重組質體，以表現如序列辨識編號(SEQ ID NO)：1所示之胺基酸序列之一豬瘟病毒(CSFV)Erns重組蛋白；對該原核轉形細胞進行一均質化處理，以獲得一細胞沉澱物，其中該細胞沉澱物包含該豬瘟病毒Erns重組蛋白之一包涵體；以及利用一萃取緩衝溶液對該細胞沉澱物進行一可溶化處理，以獲得該豬瘟病毒Erns可溶性重組蛋白，其中該萃取緩衝溶液是由20mM至30mM之三羥甲基胺基甲烷(Tris)鹽、450mM至550mM之氯化鈉(NaCl)及7M至9M之尿素(Urea)所組成，且該萃取緩衝溶液之酸鹼值為pH 7.0至pH 8.0。
- 如請求項1所述之豬瘟病毒可溶性Erns重組蛋白的製造方法，其中該原核轉形細胞的一宿主細胞為一大腸桿菌BL21(DE3)株。
- 如請求項1所述之豬瘟病毒可溶性Erns重組蛋白的製造方法，其中該重組質體包含如SEQ ID NO：2所示之核酸序列，以編碼該豬瘟病毒Erns重組蛋白。
- 如請求項1所述之豬瘟病毒可溶性Erns重組蛋白的製造方法，其中該萃取緩衝溶液是由25mM之Tris鹽、500mM之氯化鈉(NaCl)及8M之尿素所組成，且該萃取緩衝溶液之酸鹼值為pH 7.5。
- 如請求項1所述之豬瘟病毒可溶性Erns重組蛋白的製造方法，其中該可溶化處理係於0℃至4℃進行20分鐘至40分鐘。
- 如請求項1所述之豬瘟病毒可溶性Erns重組蛋白的製造方法，在該可溶化處理之後，更包含對該豬瘟病毒Erns可溶性重組蛋白進行一管柱純化步驟，以獲得純化之該豬瘟病毒Erns可溶性重組蛋白。
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