KR20210117832A

KR20210117832A - Gla-se를 포함하는 수족구병 백신 조성물

Info

Publication number: KR20210117832A
Application number: KR1020200034636A
Authority: KR
Inventors: 고현정; 조관구
Original assignee: 강원대학교산학협력단; 주식회사 큐라티스
Priority date: 2020-03-20
Filing date: 2020-03-20
Publication date: 2021-09-29
Also published as: WO2021187932A1

Abstract

본 발명은 면역증강제를 포함하는 수족구병 예방용 백신 조성물에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 수족구병 백신의 면역증강제로 GLA-SE를 사용함으로서 수족구 바이러스 감염에 대한 방어능을 크게 증가시킨 것을 특징으로 한다.

Description

GLA-SE를 포함하는 수족구병 백신 조성물{VACCINE COMPOSITION COMPRISING GLA-SE FOR HAND-FOOT-AND-MOUTH DISEASE}

수족구병은 피코르나바이러스과(Picornaviridae)에 속하는 엔테로바이러스(enterovirus)속 바이러스의 감염에 의해 유발되는 질환으로, 국내에서는 주로 콕사키바이러스 A16 (CVA16) 또는 엔테로바이러스 71 (EV71)의 감염에 의해서 발생하는 것으로 보고되고 있다. Enterovirus속에 속하는 콕사키바이러스와 엔테로바이러스는 외피(envelope)가 없으며, 양성 단일 가닥(positive-sense single-stranded)의 RNA 유전자를 가지고 있는 구조적 특징을 가진다. 바이러스 RNA 유전자로부터 하나의 단백질이 발현되며, 이후 단백질 분해효소(protease)에 의해 여러 개의 단백질로 분절화된다.

콕사키바이러스 A16 또는 엔테로바이러스 71은 분변-경구 경로로 주로 감염되며, 이외에도 호흡기 경로, 또는 모계에서 신생아에게로 수직감염에 의해 전파가 가능하다. 이들 바이러스는 일상에 존재하는 사물의 표면에서 일정기간 이상 생존할 수 있으며, 비말을 통해 전파가 가능하고, 오염된 물의 섭취나 수영장 등에서 전파될 수 있다. 따라서, 주로 가족 내 전파 또는 학교, 보육시설, 놀이터, 병원 내 감염 등을 통해 전파되는 것으로 알려져 있다. 수족구병은 최근 10년간 국내에서 지속적으로 발생하였으며, 2009년 신경계 합병증을 동반한 국내 사망사례가 보고됨에 따라 법정전염병으로 지정하여 관리하고 있다. 현재까지 국내에 식약처의 승인을 받은 수족구의 치료를 위한 항바이러스제나 예방백신은 없으며, 지속적 환자 발생과 사망자 출현을 억제하기 위한 대비책 마련이 필수적으로 요구되는 실정이다.

엔테로바이러스 감염에 의한 증상은 특유의 발진을 포함하며, 경우에 따라 미열이 동반될 수 있다. 대부분 경미한 임상경과를 보이며, 발병 후 약 7일 이내에 발진이 소실되고 자연 치유되지만, 일부 엔테로바이러스 71 감염에 의한 수족구병은 영유아에서 높은 비율로 신경계 합병증을 일으키고, 낮은 확률로 뇌간뇌염(brain stem encephalitis), 신경인성 폐부종(neurogenic pulmonary edema), 폐출혈 또는 쇼크(shock) 등을 유발하여 급속한 사망에 이를 수 있다. 수족구를 유발하는 바이러스의 잠복기는 3 ~ 6일 정도이며, 증상을 가지거나 가지지 않은 아이들에게서 감염 후 호흡기로는 1 ~ 3주 이내, 분변을 통해서는 7 ~ 11주 까지도 바이러스가 배출될 수 있기 때문에, 영유아에 대한 백신의 개발이 시급한 질병이다.

엔테로바이러스 감염에 의한 수족구병은 1969년 미국에서 처음 보고되었으며, 이후 국내뿐만 아니라 유럽 및 아시아 등의 지역에서 현재까지 지속적으로 발생하고 있다. 1970년대 유럽 지역에서 수족구병의 대규모 발생이 보고되었으며, 2000년대 이후 말레이시아, 싱가포르, 중국 등지에서 대규모로 발생되었다. 최근 유럽 및 미국에서 발생한 수족구병의 원인 바이러스는 콕사키바이러스 A16과 콕사키바이러스 A6 (CVA6)로 보고되었으나, 국내를 포함한 아시아 지역에서는 엔테로바이러스 71과 콕사키바이러스 A16에 의한 발병이 주로 보고되고 있다. 특히 중국에서는 1990년대 후반부터 현재까지 엔테로바이러스 71 (EV71 유전형 C2, C4)이 지속적으로 발생하고 있으며, 신경계 합병증을 동반한 중증 환자에서 엔테로바이러스 71이 높은 비율로 검출되었다. 또한 중국 Hebei 지역에서 2010년부터 2012년까지 엔테로바이러스 71와 함께 콕사키바이러스 A16이 유행하였다. 따라서, 수족구병의 효과적인 예방을 위해서는 엔테로바이러스 71에 대한 백신 접종뿐만 아니라, 점차로 감염이 증가하고 있는 콕사키바이러스 A16에 대한 백신의 동시 접종이 필요하다.

수족구병 예방을 위한 백신 개발 연구와 관련하여, 중국의 Signopharm사와 Sinovac사에서 세포 배양을 기반으로 한 엔테로바이러스 71 사백신을 개발하였으며, 2014년에 임상 3상을 완료하였다. 이 백신의 경우, 면역증강제(adjuvant)로 알룸(alum)을 사용하였다. 이외에도 대만, 말레이시아, 일본에서 엔테로바이러스 71과 콕사키바이러스 A16에 대한 재조합 단백질 백신 또는 VLP 백신을 개발하고 있다. 국내에서도 질병관리본부에서 국내 분리된 백신후보주를 이용한 불활화 엔테로바이러스 71형 사백신을 개발하여 특허 출원한 바 있으며(출원번호 10-2017-0026363), 민간기업에 기술이전되어 alum을 백신 보조제로 사용한 백신 개발 연구를 진행 중이다.

백신의 보조제로 사용되는 면역증강제는 백신에 사용된 항원에 대한 면역원성을 증가시키고, 면역반응의 특성을 조절하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 현재 임상적으로 사용되는 면역증강제로는 alum, 스쿠알렌을 함유하고 있는 oil-in-water emulsion 형태인 MF59, 또 다른 emulsion 형태인 AS03, alum에 TLR4 agonist인 monophosphoryl lipid A(MPL)가 첨가된 복합 면역증강제인 AS04 등이 있으며, 이외에도 GLA-SE(glucopyranosyl lipid adjuvant-stable emulsion)를 포함한 다양한 면역증강제에 대한 임상 시험이 진행 중이다.

Alum은 인체에 적용이 허가된 첫 번째 면역증강제이며, 1920년대 이후부터 다양한 백신의 면역증강제로 첨가되어 임상적으로 널리 사용되고 있는 물질이다. Alum은 백신의 항원을 흡착시켜 서서히 방출시키는 작용을 하는 것으로 알려져 있으며, 이러한 작용을 통해 면역세포를 오랜 기간 동안 자극하는 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. Alum은 주로 Th2 형태의 CD4 T 세포 면역반응을 유도하고, 이를 통해 항원 특이적인 IgG1 항체의 생성을 증가시킨다. 최근, alum이 NLRP3 inflammasome을 활성화시켜 항체성 면역반응을 증가시킨다는 보고가 있었으며, 이외에도 alum에 의해 세포로부터 분비된 이중 나선(double-stranded) DNA, 요산(uric acid), alarmin 등의 danger-associated molecular pattern (DAMPs)들이 면역반응을 증가시킨다는 보고가 있다. 하지만 여전히 alum의 면역증강 기전은 명확하지 않은 부분이 많다.

세균의 세포벽 성분인 지질 다당체(lipopolysaccharide: LPS)는 TLR4에 작용하여 대식세포와 수지상세포를 자극하고, 이들 세포의 식균작용, 주조직 적합 복합체(Major Histocompatibility Complex:　MHC) 발현, 사이토카인(cytokine) 분비를 촉진하여 강한 면역반응을 유발하는 면역계의 강력한 자극인자이다. 이러한 TLR4를 통한 자극은 Th1 형태의 CD4 T 세포 반응을 유도하고, 이를 통해 IgG2a/c 항체의 생성을 증가시키는 것으로 보고되었다. 그러나 LPS 자체는 생체내에서 독성이 매우 강하기 때문에, 독성을 일으키는 부분을 제거한 monophosphoryl Lipid A (MPL) 혹은 GLA-SE가 새로운 면역증강제로 개발되었고, MPL은 허가된 HBV(B형 간염바이러스) 백신(Fendrix)과 HPV(인유두종바이러스) 백신(Ceravix)의 면역증강제인 AS04 (alum+ MPL)의 주요 성분으로 포함되었다. Emulsion을 기반으로 TLR4 agonist인 GLA를 첨가한 복합 면역증강제인 GLA-SE는 말라리아, 결핵, HIV 항원에 대한 효과적인 Th1 면역반응 생성을 촉진시키며, 높은 농도의 항원 특이적인 IgG2a/c 항체 생성을 유도하는 것으로 보고되었다. 또한 GLA-SE는 H5N1 인플루엔자 바이러스 항원인 recombinant HA과 함께 투여한 경우, ferret에서 HA 특이적인 Th1 CD4 면역반응을 효과적으로 유도하여 인플루엔자 감염을 예방하는 것으로 보고되었다. RSV(호흡기세포융합바이러스)의 재조합 단백질 항원과 GLA-SE를 함께 투여한 경우, Cotton Rat 모델과 Cynomolgous macaque에서 효과적인 항체 반응과 Th1 세포 매개 면역반응이 유도되는 것이 확인되었다.

현재까지 개발 중인 모든 세포 배양을 기반으로 한 엔테로바이러스 71와 콕사키바이러스 A16를 이용한 사백신은 alum을 면역증강제로 사용하여 개발되었으며, 아직까지 수족구병을 유발하는 enterovirus속의 바이러스 감염에 대한 사백신의 면역증강제로 GLA-SE의 효능을 평가해 본 연구는 없다.

한국출원번호 10-2015-0009273 한국출원번호 10-2017-0026363

Pillet S et al., NPJ Vaccines. 2018 Jan 23;3:3. Patton K et al., Vaccine 33 (2015) 4472-4478

본 발명은 GLA-SE 및 수족구병 예방 백신을 포함하는 수족구병 예방용 백신 조성물을 제공하고자 한다.

수족구병의 백신에 대한 면역증강제로서 GLA-SE의 효능을 평가한 연구는 없었다.

본 발명에서는 수족구병 예방 백신의 면역증강제로 GLA-SE를 사용하였을 때, 바이러스 감염에 대한 방어능이 증가함을 확인하고, 그에 따라 GLA-SE를 포함하는 것을 특징으로 하는 수족구병 예방에 효과적인 백신 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 수중유 스쿠알렌 에멀젼 형태의 글루코피라노실 지질 아쥬번트(GLA-SE) 및 수족구병에 특이적인 면역원을 포함하는, 수족구병 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.

일 실시태양에서, 상기 면역원은 펩티드, 항원, 불활화 또는 살아있는 약독화 생물체, 또는 세포로부터 유래된 것일 수 있다.

바람직하게는, 상기 면역원은 (i) 폴리오바이러스, 콕사키바이러스 A (CVA), 콕사키바이러스 B (CVB), 에코바이러스, 및 엔테로바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이러스 또는 (ii) 상기 바이러스로부터 유래한 폴리펩티드일 수 있다.

더욱 바람직하게는, 상기 면역원은 (i) 콕사키바이러스 A16 (CVA16), 엔테로바이러스 71 (EV71), 또는 콕사키바이러스 A16 (CVA16) 및 엔테로바이러스 71 (EV71)의 혼합 바이러스; 또는 (ii) 상기 바이러스로부터 유래한 폴리펩티드일 수 있다.

가장 바람직하게는, 상기 면역원은 콕사키바이러스 A16 (CVA16) 및 엔테로바이러스 71 (EV71)의 혼합 바이러스일 수 있다.

일 실시태양에서, 상기 바이러스는 불활화된 바이러스이거나 또는 살아있는 약독화 바이러스일 수 있으며, 바람직하게는, 불활화된 바이러스이다.

상기 백신 조성물은 근육 내 또는 정맥 내 투여를 통해, 전신 투여될 수 있다.

또한 상기 백신 조성물은 아쥬번트를 추가로 포함할 수 있다. 상기 추가로 포함되는 아쥬번트는 알루미늄 염, toll-유사 수용체 (TLR) 효능제, 모노포스포릴 지질 A (MLA), 합성 지질 A, 지질 A 모방체 또는 유사체, MLA 유도체, 사이토킨, 사포닌, 무라밀 디펩타이드 (MDP) 유도체, CpG 올리고, 그람 음성균의 리포폴리사카라이드 (LPS), 폴리포스파젠, 에멀젼, 비로좀, 코클리에이트(cochleate), 폴리(락티드-코-글리콜라이드) (PLG) 미립자, 폴록사머 입자, 미세입자, 리포좀, 완전 프로인트 보강제 (CFA), 및 불완전 프로인트 보강제 (IFA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.

본 발명의 면역증강제 GLA-SE는 불활화 EV71과 불활화 CVA16을 포함하는 불활화 혼합백신과 함께 투여되었을 때, 혼합백신의 면역원성을 증가시켜 수족구 예방에 효과적임이 확인되었다. 구체적으로, 혼합백신과 GLA-SE를 함께 투여하였을 때, Th1 면역 세포와 Th2 면역 세포를 동시에 활성화시킴으로써 VP1 특이적인 IgG1 및 IgG2c 항체 생성을 모두 증가시키는 효과적인 면역증강제로 작용함을 확인하였다. 또한, 항원 특이적인 IL-6와 IL-17의 분비 증가를 통해 B 세포의 class switch 반응과 항체 생산이 증가했음을 확인할 수 있었다. 특히, 마우스 감염 실험에서 GLA-SE를 면역증강제로 사용한 경우, CVA16 감염에 의한 질환의 발생 및 사망률이 현저히 감소됨을 확인하였다.

따라서 본 발명의 GLA-SE를 포함하는 수족구병 백신 조성물을 사용할 경우, 바이러스 감염에 대한 방어능을 크게 증가시켜 수족구병의 효과적인 예방이 가능하다.

도 1a 및 1b는 혼합백신을 투여한 마우스에서 각각 최초 백신 투여 2주 후 및 마지막 백신 투여 2주 후의 VP1 특이적인 IgG 항체의 상대적인 양을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2a 내지 2c는 혼합백신을 투여한 마우스에서 각각 VP1 특이적인 IgG, IgG1 및 IgG2c 항체의 역가를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 2d는 혼합백신을 투여한 마우스에서 VP1 특이적인 IgG2c 항체에 대한 IgG1 항체의 비율 (IgG1/IgG2c)을 나타낸 그래프이다.
도 3a 내지 3g는 혼합백신을 투여한 마우스의 면역세포에 의한 EV71 특이적 사이토카인 생성을 나타낸 그래프이다.
도 4a 내지 4g는 혼합백신을 투여한 마우스의 면역세포에 의한 CVA16 특이적 사이토카인 생성을 나타낸 그래프이다.
도 5a 내지 5c는 EV71 감염에 대한 방어능 평가 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6a 내지 6c는 CVA16 감염에 대한 방어능 평가 결과를 나타내는 그래프이다.

이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시태양 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시태양 및 실시예에 한정되지 않는다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명은 글루코피라노실 지질 아쥬번트(GLA)를 포함하는 수족구병 백신 조성물을 제공한다.

일 실시태양에서, GLA는 하기 화학식으로 표시되는 것일 수 있으며, 본 발명에서는 GLA뿐 아니라 이의 약제학적으로 허용되는 염도 포함한다.

상기 화학식에서,

R1, R3, R5 및 R6은 C11-C20 알킬이고;

R2 및 R4는 C12-C20 알킬이다.

일 실시태양에서, R1, R3, R5 및 R6은 운데실이고 R2 및 R4는 트리데실일 수 있다.

"알킬"은 탄소원자 1 내지 20개를 함유하는, 바람직한 특정 양태에서는 탄소원자 11 내지 20개를 함유하는, 직쇄 또는 측쇄, 비환형 또는 환형 불포화 또는 포화 지방족 탄화수소를 의미한다. 대표적인 포화 직쇄 알킬에는 메틸, 에틸, n-프로필, n-부틸, n-펜틸, n-헥실 등이 포함되고, 그 예로는 운데실, 도데실, 트리데실, 테트라데실, 펜타데실, 헥사데실, 헵타데실, 옥타데실 등이 있으며; 포화된 측쇄 알킬은 이소프로필, 2급-부틸, 이소부틸, 3급-부틸, 이소펜틸 등을 포함한다. 대표적인 포화 환형 알킬은 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실 등을 포함하는 한편, 불포화 환형 알킬은 사이클로펜테닐 및 사이클로헥세닐 등을 포함한다. 환형 알킬은 또한 "동소환" 또는 "동소환식 고리"라고도 부르기도 한다. 불포화 알킬은 인접 탄소 원자 사이에 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합을 포함한다(각각, "알케닐" 또는 "알키닐"이라고 부름). 대표적인 직쇄 및 측쇄 알케닐에는 에틸에닐, 프로필에닐, 1-부테닐, 2-부테닐, 이소부틸에닐, 1-펜테닐, 2-펜테닐, 3-메틸-1-부테닐, 2-메틸-2-부테닐, 2,3-디메틸-2-부테닐 등이 포함되는 한편; 대표적인 직쇄 및 측쇄 알키닐에는 아세틸에닐, 프로피닐, 1-부티닐, 2-부티닐, 1-펜티닐, 2-펜티닐, 3-메틸-1-부티닐 등이 포함된다.

바람직하게는, 본 발명의 GLA는 수중유 스쿠알렌 에멀젼 형태의 안정한 에멀젼 형태일 수 있으며, 즉, 수중유 스쿠알렌 에멀젼 형태의 글루코피라노실 지질 아쥬번트(GLA-SE; Glucopyranosyl Lipid Adjuvant, formulated in a stable nanoemulsion of squalene oil-in-water)일 수 있다.

더욱 바람직하게는, 상기 면역원은 (i) 콕사키바이러스 A16 (CVA16), 엔테로바이러스 71 (EV71), 또는 콕사키바이러스 A16 (CVA16) 및 엔테로바이러스 71 (EV71)의 혼합 바이러스 또는 (ii) 상기 바이러스로부터 유래한 폴리펩티드일 수 있다.

일 실시태양에서, 상기 바이러스는 불활화된 바이러스이거나 또는 살아있는 약독화 바이러스일 수 있으며, 바람직하게는, 불활화된 바이러스이다. 상기 불활화된 바이러스는 병원체를 정제한 후 가열하거나, 자외선 조사 또는 포름알데하이드, 알킬화 시약 등의 약품을 이용하여 바이러스를 죽여서 제작할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 이와 같은 투여경로는 비경구 투여, 예를 들어, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 활막강내 투여일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 백신 조성물은 근육 내 또는 정맥 내 투여를 통해, 전신 투여될 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 일반적으로 사용되는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 또한 본 발명에 따른 조성물은 그 투여 방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다.

상기 백신 조성물의 환자에 대한 투여량은 환자의 신장, 체표면적, 연령, 투여되는 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반적인 건강, 및 동시에 투여되는 다른 약물들을 포함하는 많은 요소들에 따라 결정될 수 있다.

일 실시태양에서, 본 발명의 백신 조성물은 면역학적 유효량으로 투여한다. 용어 "면역학적 유효량" 이란 예방효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 정확한 투여 농도는 투여될 특정 면역원에 따라 달라지며, 1회 내지 수회 투여가능하다. 또한, 본 발명의 백신은 공지된 백신과 배합하여 함께 투여할 수 있다

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.

[실시예 1]

바이러스의 배양

EV71 C4a (GenBank: EU703814.1, ATCC)와 2008년 수족구 환자의 대변으로부터 분리하여 동정한 CVA16 (Osong Public Health Res Perspect. 2015 Feb;6(1):52-8.) 바이러스를 사용하여 실험을 진행하였다. EV71과 CVA16은 각각 Vero 세포에서 배양하였다(Biomol Ther (Seoul). 2014;22:41-6.).

[실시예 2]

백신용 불활화 바이러스 제작

EV71 및 CVA16을 Vero 세포에 각각 접종하여 다가 불활화 백신 제작을 위한 바이러스를 생산하였다. Vero 세포는 fetal bovine serum (FBS)가 결여된 상태에서 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂에서 배양하였다. 바이러스 접종 3~4일 후 세포병변(cytopathic effect)이 발생하였으며, 이후에 대량 배양한 Vero 세포에서 바이러스 감염 후의 배양액을 얻었다. 그 후, Amicon centrifugal filter tube를 이용하여 바이러스 배양액을 농축하고, 단백질 양을 정량하였다. 각각의 바이러스를 동물 실험 접종 농도 (20 μg/50 μl)로 희석한 후 0.02% formalin (Merck, Darmstadt, Germany) in PBS 상태의 37℃ 인큐베이터(incubator)에서 5일간 불활화하였다. 불활화 과정을 마친 후, 즉시 Dispodialyzer (Spectrum Laboratories, CA)를 사용하여 포름알데하이드를 제거하고, 50 ml의 PBS로 2회 투석을 진행하였다. 그 후, Amicon centrifugal filter tube를 이용하여 불활화 바이러스액을 농축하고, 단백질 양을 정량하였다. 각각의 바이러스를 동물 실험 접종 농도 (20 μg/50 μl)로 조절한 후 -80 °C에 보관하였다.

[실시예 3]

백신의 면역원성 평가를 위한 마우스 모델

5주령의 암컷 마우스 (C57BL/6 background)를 ㈜오리엔트로부터 구입하여, 사육하였다.

그룹당 6마리의 6주령 C57BL/6 마우스를 사용하였으며, 아래와 같이 4개의 그룹으로 분류하여 실험을 진행하였다.

i) PBS만을 투여한 그룹(대조군)

ii) 불활화 EV71 (iEV71) 및 불활화 CVA16 (iCVA16) 바이러스를 혼합하여 백신으로 투여한 그룹

iii) 불활화 바이러스 혼합백신 및 alum을 투여한 그룹

iv) 불활화 바이러스 혼합백신 및 GLA-SE를 투여한 그룹

불활화 혼합백신은 iEV71 (200 ng) 및 iCVA16 (600 ng)을 포함하였고, PBS로 희석하거나 100 μg의 alum 또는 2 μg의 GLA-SE와 혼합하여 사용하였다. 백신은 4주 간격으로 2회 근육주사로 투여하였으며, 마우스 양쪽 종아리 부위에 각각 50 μl 씩, 마우스 당 총 100 μl를 투여하였다.

[실험예 1]

VP1 특이적 IgG 항체의 생성량 측정

대장균으로부터 생산한 재조합 VP1 단백질(Vaccine. 2015 Nov 27;33(48):6604-10)을 3 μg/mL의 농도가 되도록 0.05 M carbonate-bicarbonate buffer (pH 9.6)에 희석하여 100 μl씩 Immuno plates (Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Denmark)의 각 well에 넣고 4°C에서 12시간 동안 정치하였다. PBS로 세척(washing)한 후, 1% bovine serum albumin (BSA)을 포함하는 PBS (200 μl/well)로 상온에서 1시간 동안 각 well을 blocking하였다.

실시예 3의 마우스로부터 최초 백신 투여 2주 후, 및 마지막 백신 투여 2주 후에 혈액을 얻고 혈청을 분리하였다. 각각의 혈청을 0.1% BSA/PBS로 연속 희석(serial dilution)하고, 플레이트(plate)에 200 μl/well씩 넣은 후 4°C에서 12시간 동안 정치하였다. PBS로 세척한 후, 1/2000으로 희석된 horseradish peroxidase-conjugated rabbit anti-mouse IgG, IgG1, 또는 IgG2c (Southern Biotech, Birmingham, AL)를 포함하고 있는 PBS 용액을 플레이트에 넣고 4°C에서 12시간 동안 정치하였다. Peroxidate의 기질인 TMB (MOSS Inc., Pasadena, MD)로 발색하고, 15분 후 0.5 N HCl을 넣고 반응을 중단하였다. ELISA reader (Synergy H1 Hybrid Reader, BioTek, Winooski, VT)를 사용하여 450 nm 파장에서 흡광도 (O.D.)를 측정하였다.

그 결과, 도 1a 및 1b에 나타난 바와 같이 혼합백신과 GLA-SE를 투여한 경우, 혼합백신 단독 또는 혼합백신과 alum을 투여한 경우와 비교하여, 더 많은 VP1 특이적 IgG 항체의 생성이 유도되었음을 확인하였다. 특히 도 1b에 나타낸 마지막 백신 투여 2주 후의 결과에서는 혼합백신 단독 투여와 혼합백신과 alum을 함께 투여한 경우의 항체 생성량에 큰 차이가 없었던 반면, 혼합백신과 GLA-SE를 함께 투여한 경우 훨씬 더 많은 항체가 생성되었음을 확인할 수 있었다.

[실험예 2]

GLA-SE에 의한 VP1 특이적 항체의 아형 측정

실시예 3의 마우스로부터 마지막 백신 투여 4주 후에 혈액을 얻고 혈청을 분리하여, 실험예 1과 동일한 방법으로 450 nm 파장에서 흡광도 (O.D.)를 측정하였다. 이 때, 혈청을 PBS로 2배씩 희석해 가면서 450 nm에서의 흡광도가 0.1 이상인 최대 희석배수의 역수를 혈청 중에 존재하는 VP1 특이적인 IgG, IgG1 및 IgG2c 항체의 역가(Endpoint titers)로 결정하였다. 그 결과를 각각 도 2a 내지 2c에 나타내었다.

그 결과, 도 2a 내지 2c에 나타난 바와 같이 혼합백신과 GLA-SE를 함께 투여한 경우, 혼합백신 단독 또는 혼합백신과 alum을 투여한 경우와 비교하여 IgG, IgG1 및 IgG2c 항체의 평균 역가가 증가하는 것을 확인하였다. 또한 도 2d에 나타난 바와 같이 VP1 특이적인 IgG2c 항체에 대한 IgG1 항체의 비율 (IgG1/IgG2c)에는 큰 차이가 없었다.

따라서 수족구병 원인 바이러스에 대한 혼합백신을 투여하는 경우 GLA-SE를 함께 투여하면, 혼합백신을 단독으로 투여하거나 alum을 함께 투여하는 경우와 비교하여 VP1 특이적인 IgG1과 IgG2c 항체의 생성이 모두 증가한다는 것을 확인하였다.

[실험예 3]

면역세포에 의한 사이토카인 생성 분석

실시예 3의 마우스로부터 마지막 백신 투여 4주 후에 draining lymph node를 얻었다. 이로부터 분리한 면역세포를 round bottom 96 well plate에 10⁶ cells/well씩 넣고, 2 μg/ml의 iEV71 또는 iCVA16를 투여하였다. 3일간 배양 후, 배양액에 존재하는 interleukin-2 (IL-2), interleukin-4 (IL-4), interleukin-6 (IL-6), interferon-γ (IFN-γ), tumor necrosis factor (TNF), interleukin-17A (IL-17A), 및 interleukin-10 (IL-10) 사이토카인의 양을 BD CBA Mouse Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit (BD Bioscience, San Jose, CA, USA)를 사용하여 FACSVerse (BD Bioscience)로 측정하였다.

iEV71을 투여하고 분비된 사이토카인의 양을 분석한 결과, 도 3a 내지 3g에 나타난 바와 같이 혼합백신과 GLA-SE를 함께 투여한 경우, 혼합백신 단독 또는 혼합백신과 alum을 투여한 경우와 비교하여 Th1 세포에 의해 분비되는 사이토카인 (IL-2, IFN-γ, TNF), Th2 세포에 의해 분비되는 사이토카인 (IL-4, IL-10), 및 Th17에 의해 분비되는 사이토카인과 B 세포 활성화에 영향을 주는 사이토카인 (IL-6, IL-17)의 양이 모두 유의적으로 증가하였음을 확인하였다.

iCVA16을 투여하고 분비된 사이토카인의 양을 분석한 결과, 도 4a 내지 4g에 나타난 바와 같이 혼합백신과 GLA-SE를 함께 투여한 경우, 혼합백신 단독 또는 혼합백신과 alum을 투여한 경우와 비교하여 Th1 세포에 의해 분비되는 사이토카인 (IL-2, IFN-γ, TNF), Th2 세포에 의해 분비되는 사이토카인 (IL-4, IL-10), 및 Th17에 의해 분비되는 사이토카인과 B 세포 활성화에 영향을 주는 사이토카인 (IL-6, IL-17)의 양이 모두 유의적으로 증가하였음을 확인하였다.

[실험예 4]

바이러스 감염에 대한 방어능 평가

실시예 3의 마우스로부터 마지막 백신 투여 4주 후에 혈액을 얻어 혈청을 분리하였다. 각 그룹의 마우스로부터 얻은 혈청 25 μl을 태어난 지 3일 된 마우스의 neonate에 복강으로 전달하고, 10⁵ TCID₅₀/ml의 EV71 또는 CVA16 바이러스 10 μl을 뇌내 (intracerebral inoculation)로 투여하였다. 그 후, 감염된 마우스의 활동성, 마비 증상, 체중 및 사망 여부 등을 매일 측정하였다. 또한 Neonate 마우스에서의 수족구병 유사 증상을 점수로 등급화하여 질환의 정도를 평가하였다 (0, 건강함(healthy); 1, 털이 헝클어짐(ruffled hair); 2, 뒷다리가 허약해짐(weakness in hind limbs); 3, 한 쪽 뒷다리의 마비(paralysis in a single hind limb); 4, 양 뒷다리의 마비(paralysis in both hind limbs)).

EV71 바이러스 투여시의 결과는, 도 5a 내지 5c에 나타난 바와 같이 혼합백신 단독 또는 혼합백신과 GLA-SE 또는 alum을 함께 투여한 마우스의 혈청을 전달받은 neonate 마우스 모두가, PBS를 투여한 마우스의 혈청을 전달받은 neonate 마우스와 비교하여 EV71 뇌내 감염에 의한 질환의 정도가 완화되었고, 생존률 또한 증가하였음을 확인하였다.

또한, CVA16 바이러스 투여시의 결과는, 도 6a 내지 6c에 나타난 바와 같이 혼합백신과 GLA-SE를 함께 투여한 마우스의 혈청을 전달받은 neonate 마우스의 경우, 혼합백신 단독 또는 혼합백신과 alum을 투여한 마우스의 혈청을 전달받은 neonate 마우스와 비교하여, CVA16 뇌내 감염에 의한 질환의 정도가 현저히 완화되었으며 생존률 또한 크게 증가하였음을 확인하였다.

Claims

수중유 스쿠알렌 에멀젼 형태의 글루코피라노실 지질 아쥬번트(GLA-SE); 및
수족구병에 특이적인 면역원
을 포함하는, 수족구병 예방 또는 치료용 백신 조성물.
제1항에 있어서, 상기 면역원은 펩티드, 항원, 불활화 또는 살아있는 약독화 생물체, 또는 세포로부터 유래된 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
제1항에 있어서, 상기 면역원은
(i) 폴리오바이러스, 콕사키바이러스 A (CVA), 콕사키바이러스 B (CVB), 에코바이러스, 및 엔테로바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이러스; 또는
(ii) 상기 바이러스로부터 유래한 폴리펩티드
인 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
제1항에 있어서, 상기 면역원은
(i) 콕사키바이러스 A16 (CVA16), 엔테로바이러스 71 (EV71), 또는 콕사키바이러스 A16 (CVA16) 및 엔테로바이러스 71 (EV71)의 혼합 바이러스; 또는
(ii) 상기 바이러스로부터 유래한 폴리펩티드
인 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
제1항에 있어서, 상기 면역원은 콕사키바이러스 A16 (CVA16) 및 엔테로바이러스 71 (EV71)의 혼합 바이러스인 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스는 불활화된 바이러스 또는 살아있는 약독화 바이러스인 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
제1항에 있어서, 근육 내 또는 정맥 내 투여되는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
제1항에 있어서, 아쥬번트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
제8항에 있어서, 상기 추가로 포함되는 아쥬번트는 알루미늄 염, toll-유사 수용체 (TLR) 효능제, 모노포스포릴 지질 A (MLA), 합성 지질 A, 지질 A 모방체 또는 유사체, MLA 유도체, 사이토킨, 사포닌, 무라밀 디펩타이드 (MDP) 유도체, CpG 올리고, 그람 음성균의 리포폴리사카라이드 (LPS), 폴리포스파젠, 에멀젼, 비로좀, 코클리에이트(cochleate), 폴리(락티드-코-글리콜라이드) (PLG) 미립자, 폴록사머 입자, 미세입자, 리포좀, 완전 프로인트 보강제 (CFA), 및 불완전 프로인트 보강제 (IFA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.