CN101302499A - 一种流感病毒疫苗种子株的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种流感病毒疫苗种子株的制备方法，将拯救组合物感染或转染到至少一个宿主细胞，如Vero细胞中，其中，拯救组合物包含四个分别携带两个流感病毒片段的腺病毒载体，或三个分别携带两个流感病毒片段的腺病毒载体和两个分别携带HA基因和NA基因的质粒。腺病毒载体是利用构建的含有hCMV/hPol I双向启动子而进一步构建而成的，并携带流感病毒基因组片段。该方法可以在Vero细胞中灵活地拯救出减毒流感病毒疫苗株。本发明提高现有的流感病毒质粒系统在Vero细胞中的病毒产量，而且得到的重组流感病毒安全性高。

Description

一种流感病毒疫苗种子株的制备方法

技术领域

本发明涉及一种流感病毒疫苗种子株的制备方法，特别涉及一种利用腺病毒载体在Vero细胞中进行流感病毒疫苗种子株的制备方法。

背景技术

流感病毒隶属于正粘病毒科，病毒基因组含有多个负链RNA(7-8节段)组成，在甲、乙、丙三型中，甲型流感病毒可以通过抗原漂变和抗原重组两种方式进行变异以逃避人群中已有的针对流感病毒的特异性免疫反应，因此对人类的威胁最大。近年来，禽流感时有爆发，并有多例人感染禽流感病毒H5N1的报道，并且由于人群中没有针对H5N1流感病毒的预存抗体存在，人群流行病学特点表现为高病死率。禽流感的爆发和流行是公共卫生领域的重大隐患。

在抗击流感病毒的过程中，虽然有抗流感药物(如：金刚烷胺，奥斯他韦等)可供选择，但是，由于流感病毒的高变异性，抗流感药物的使用已导致耐药毒株的出现，预防和控制流感病毒爆发流行最有效的方法是疫苗免疫。

每年的流感病毒疫苗株的获得均是通过反向遗传学方法获得。现有的反向遗传系统主要由12质粒或者8质粒组成(参见如下文献：Fodor，E.，Devenish，L.，Engelhardt，O.G.，Palese，P.，Brownlee，G.G.，and Garcia-Sastre，A.(1999).Rescueof Influenza A Virus from Recombinant DNA.J.Virol.73(11)，9679-9682；该文献中文名为从重组DNA中拯救A型流感病毒；Neumann，G.，Watanabe，T.，Ito，H.，Watanabe，S.，Goto，H.，Gao，P.，Hughes，M.，Perez，D.R.，Donis，R.，Hoffmann，E.，Hobom，G.，and Kawaoka，Y.(1999).Generation of influenza A viruses entirely fromcloned cDNAs.Proc Natl Acad Sci U S A 96(16)，9345-50；该文献中文名为通过克隆cDNA产生完整的A型流感病毒。Hoffmann，E.，Neumann，G.，Kawaoka，Y.，Hobom，G.，and Webster，R.G.(2000).A DNA transfection system for generation ofinfluenza A virus from eight plasmids.Proc Natl Acad Sci U S A97(11)，6108-13；该文献中文名为通过8个质粒产生A型流感病毒的DNA转染系统)。因为同时转染12个或者8个质粒进入同一个细胞的效率比较低，所使用的细胞株为比较容易转染的293T与MDCK混合细胞培养物，同时得到的病毒产量也不高。但是293细胞系因为含有了腺病毒的E1基因，可能会含有潜在的危险成分，目前还未被FDA批准用于流感疫苗制备。非洲绿猴肾细胞株(Vero)已经应用于多种病毒疫苗的生产，证明其安全性(可参见如下文献：Montagnon，B.J.，Vincent-Falquet，J.C.，and Saluzzo，J.F.(1999).Experience with vero cells atPasteur Merieux Connaught.Dev Biol Stand 98，137-40；discussion 167；该文献中文名为巴斯德梅里卡耐特公司关于Vero细胞的经验之谈)。并且实验证明Vero细胞可以支持流感病毒的生产(可参见如下文献：Govorkova，E.A.，Murti，G.，Meignier，B.，deTaisne，C.，and Webster，R.G.(1996).African green monkey kidney(Vero)cells provide an alternative host cell system for influenza A and B viruses.ournal of Virology 70(8)，55 19-5524；该文献中文名为非洲绿猴肾细胞株Vero细胞可为A、B型流感病毒的宿主细胞系)。Vero细胞生产的流感病毒疫苗具有与传统鸡胚方式得到的流感病毒疫苗具有相同的免疫原性(可参见如下文献：Bruhl，P.，Kerschbaum，A.，Kistner，O.，Barrett，N.，Dorner，F.，and Gerencer，M.(2000).Humoral and cell-mediated immunity to Vero cell-derived influenza vaccine.Vaccine19(9-10)，1149-1158，该文献中文名为源于Vero细胞的流感疫苗的体液和细胞免疫反应)。因为Vero细胞比较难以通过质粒化学转染方式接受外源基因，以现有的流感病毒质粒系统在Vero细胞中得到的病毒产量很低(可参见文献：Fodor，E.，Devenish，L.，Engelhardt，O.G.，Palese，P.，Brownlee，G.G.，and Garcia-Sastre，A.(1999).Rescue of Influenza A Virus from Recombinant DNA.J.Virol.73(11)，9679-9682，该文献中文名为从重组DNA中拯救A型流感病毒)。有时候需要借助于电转化方式进行病毒拯救(可参见文献：Horimoto，T.，Murakami，S.，Muramoto，Y.，Yamada，S.，Fujii，K.，Kiso，M.，Iwatsuki-Horimoto，K.，Kino，Y.，andKawaoka，Y.(2007).Enhanced growth of seed viruses for H5N1 influenza vaccines.Virology 366(1)，23-7.该文献中文名为H5N1流感疫苗种子株的加强生长)。

因此非常有必要开发出一种可以在Vero细胞中拯救产生疫苗种子株的方法。

发明内容

本发明的主要目的在于克服上述技术缺陷，提供一种流感病毒疫苗种子株的制备方法，克服了通过质粒方式转染Vero细胞进行流感病毒拯救的低效率。同时采用质粒转染与病毒感染相结合的方法，保证了流感病毒拯救的灵活性。

本发明的目的是按以下技术方案来实现的：

一种流感病毒疫苗种子株的制备方法为：将拯救组合物感染或转染到至少一个宿主细胞中，其中，拯救组合物包含四个分别携带两个流感病毒片段的腺病毒载体，或三个分别携带两个流感病毒片段的腺病毒载体和两个分别携带HA基因和NA基因的质粒。

所述的宿主细胞为哺乳动物细胞株。

优选地，宿主细胞为Vero细胞。

优选地，所述的四个分别携带两个流感病毒片段的腺病毒载体为Ad5-IN-PB2+NS、Ad5-IN-PB1+M、Ad5-IN-PA+NP和Ad5-IN-HA+NA。

优选地，所述的三个分别携带两个流感病毒片段的腺病毒载体为Ad5-IN-PB2+NS、Ad5-IN-PB1+M和Ad5-IN-PA+NP。

优选地，所述的腺病毒载体包含一种具有启动效率一致的串连hCMV/hPol I双向启动子DNA结构。

优选地，所述的携带HA基因的质粒为pPolI-VN-1194HA质粒。

优选地，所述的pPolI-VN-1194HA质粒，其HA氨基酸序列中的碱性裂解位点由RRRKK突变为I。

优选地，所述的流感病毒包括甲型、乙型、丙型流感病毒。

上述的具有双向启动能力的hCMV/hPol I的DNA结构，其结构上依次含有：正向的人的CMV病毒II型启动子序列(hCMV)，反向丁型肝炎核酶序列(HDV(R))，反向人Pol I启动子序列与牛生长激素转录终止信号序列(BGH)。在插入流感病毒的基因组片段后，可以通过hCMV启动转录得到信使RNA(message RNA，mRNA)，其含有5’帽子结构和3’的PolyA结构，可以利用宿主细胞的翻译系统，进一步表达出流感病毒的蛋白，同时可以通过反向插入的hPol I启动子从反方向启动流感病毒基因组病毒RNA(viral RNA，vRNA)的转录，其中hPol I可以准确起始流感病毒vRNA的起始，反向(HDV(R))序列可以准确终止这个转录过程，从而得到与流感病毒基因组结构完全相同的单负链RNA序列。此结构如图1A所示。

通过上述的hCMV/hPol I的DNA结构构建一种穿梭质粒。该穿梭质粒包括两个串联的双向启动的hCMV/hPol I的DNA结构，其两个串联结构的连接序列为f1噬菌体的单链DNA转录序列(F1)，F1序列可以保证两个启动子的启动效率一致。即，在用于流感病毒拯救过程中，可以两个表达盒中，保证转录得到的mRNA与vRNA两个病毒基因组片段的比例为1∶1与天然存在的序列一致。

通过上述的包括两个串联的双向启动的hCMV/hPol I的DNA结构的穿梭质粒构建一种腺病毒载体，该腺病毒载体包含上述的含有上述两个串联的双向启动的hCMV/hPol I的DNA结构。其中每个腺病毒载体含有两个流感基因组片段。构建得到四个腺病毒载体为Ad5-IN-PB2+NS，Ad5-IN-PB1+M，Ad5-IN-PA+NP，Ad5-IN-HA+NA。

优选地，使用四个腺病毒载体制备新的甲型流感病毒种子疫苗株的方法可按如下步骤进行：

Vero细胞进行腺病毒感染，感染3-6h后，更换为无血清的培养基，培养基中含有TPCK胰酶，促进流感病毒从细胞表面的释放。得到的细胞上清，接种10日龄鸡胚。48h后检测鸡胚尿囊液中的HA血凝(具体方法参见郭元吉程小雯著《流行性感冒病毒及其实验技术》第88页，第100页)。

优选地，利用质粒转染和腺病毒感染相结合的流感病毒种子疫苗株制备方法，该方法可按如下步骤进行：

两个质粒转染Vero细胞，其中一个质粒携带流感病毒H5N1越南株(VN)1194的HA基因(其中HA的改造过程中去除了碱性裂解位点RRKK，改为I)，另一个携带NA基因。转染更换为新鲜培养基后，用Ad5-IN-PB2+NS、Ad5-IN-PB1+M和Ad5-IN-PA+NP三个腺病毒共同感染转染有HA和NA质粒的细胞。感染3-6h后，更换为无血清的培养基，培养基中含有TPCK胰酶，促进流感病毒从细胞表面的释放。得到的细胞上清，接种10日龄鸡胚。48h后检测鸡胚尿囊液中的HA血凝(具体方法同上《流行性感冒病毒及其实验技术》第88页，第100页)，从得到的鸡胚尿囊液中提取病毒基因组RNA，进行反转录，然后用针对NA的特异性引物进行扩增。PCR扩增得到的片段经过酶切鉴定。

本发明的有益效果在于使用四个腺病毒载体制备的流感病毒种子疫苗株，或利用质粒转染和腺病毒感染相结合的方法制备流感病毒种子疫苗株，提高现有的流感病毒质粒系统在Vero细胞中的病毒产量，而且得到的重组流感病毒安全性高。

附图说明

图1是本发明的串联双向hCMV/hPol I启动子结构示意图；

图2-1，图2-2是本发明的串连启动子启动效率示意图；

图3-1，图3-2，图3-3是本发明的腺病毒载体质粒的一个优选实施例的鉴定图；

图4是本发明的重组质粒pPol I-VN-1194HA的一个优选实施例的测序鉴定图；

图5是本发明的流感病毒拯救示意图；

图6是本发明的拯救流感病毒的一个优选实施例的PCR鉴定示意图。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。

实施例1：含有串连CMV/Pol I双向表达系统的质粒构建。

以pCDNA4To(invitrogen公司)为模板，以引物F1(1308+21)与F1(1757-19)为引物对，扩增得到F1片段，其中5’端引入Mlu I位点，3’端引入Spe I位点。通过Mlu与Spe I酶切插入pGA1-EGFP质粒(本实验室保存)，得到pGA1-F1-EGFP。Spe I，Xba I与Nhe I三个酶切割产生的末端相同，且相互连接后酶切位点消失，该技巧在下述操作中多次使用。以pPol I质粒为模板，以Pol-I(2071+22)与Pol-I(2587-18)为引物扩增得到含有人类Pol I启动子和丙型肝炎病毒核酶序列(HDV(R))的片段，其中Pol I一段引入Spe I位点，HDV(R)一端引入BamH I位点。此PCR片段经过Spe I与BamH I双酶切后插入到经Xba I与BamH I双酶切的pGA1-F1-EGFP质粒，得到pGA1-F1-PolI质粒。

相类似地，以pPolI质粒为模板，以Pol-I(2071+22)与Pol-I(2587-18)为引物扩增得到含有人类Pol I启动子和丙型肝炎病毒核酶序列(HDV(R))的片段，其中Pol I一段引入Nhe I，Spe I位点，HDV(R)一端引入BamH I位点。此PCR片段经过Nhe I与BamH I双酶切后插入到经Xba I与BamH I双酶切的pGA1-F1-EGFP质粒，得到pGA1-F1-Spe I质粒。

以得到的pGA1-F1-Spe I质粒为模板，以pGA1-CMV(7491+19)与pGA1-BGH(1030-18)为引物对，扩增得到含有CMV到BGH的序列，在CMV的5’端引入了Mlu I位点，在BGH序列3’端引入了Nhe I位点。以Mlu I与NheI双酶切得到，插入到经Mlu I与Spe I双酶切的pGA1-F1-Pol I质粒，得到pShuttle-IN穿梭质粒。

F1(1308+21)：TacacgcgtacgGATATCGCCACTAGTCTGAGG

F1(1757-19)：tactctagaTTAACCAATAGGCCGAAAT

Pol-I(2071+22)：AACAGCTATGACCATGATTACG

Pol-I(2587-18)：TGactagtGTGCTGCAAGGCGATTAA

pGA1-CMV(7491+19)：ACT ACGCGT tgtacgggccagatatacg

pGA1-BGH(1030-18)：CAT GCTAGC ccgcctcagaagccatag

实施例2：含有两个流感病毒基因片段的腺病毒质粒构建与病毒拯救。

流感病毒的质粒拯救系统，每个流感基因片段的两端均有Pol I启动子和HDV(R)序列。pPol I-PB2与pPol I-NS分别经过Xba I酶切得到PB2片段与NS片段，pShuttle-IN首先经过Spe I单酶切，插入PB2片段，得到pShuttle-IN-PB2，此质粒再经过Xba I酶切，插入NS片段得到pShuttle-IN-PB2+NS。同样的方法得到，pShuttle-IN-PB 1+M，pShuttle-IN-PA+NP，pShuttle-IN-HA+NA，pShuttle-IN-PB1+EGFP，pShuttle-IN-EGFP+PB1。

四个穿梭质粒分别经过SgrA I线性化，与Cla I线性化的pAd5E1-E3-进行重组。得到腺病毒质粒，pAd5-IN-PB2+NS，pAd5-IN-PB 1+M，pAd5-IN-PA+NP，pAd5-IN-HA+NA。如图1B所示。

具体方法为：1ug线性化Shuttle-IN质粒与0.5ug Cla I线性化的pAd5E1-E3-混合，转化0.1ml BJ5183感受态细胞，冰浴30min后，42℃热冲击60sec，迅速冰浴1min，加入1ml无抗性培养基，37℃孵育45min，涂布到含有Amp抗生素LB琼脂固体平板。37℃孵育12-16h，挑取单克隆，到含有Amp抗生素LB液体培养基，利用碱裂解方法提取质粒(《分子克隆实验指南》第2页)，电泳选择是大质粒的克隆，再次转化XL-Blue感受态细胞，方法同BJ5183的转化操作相同。

提取的质粒经过酶切鉴定得到正确的质粒克隆，如图3-1、图3-2、图3-3所示，酶切大小分别为：

pAd-PA+NP Mlu I：18418，7907，5845，4305，1797，1134；

pAd-PA+NP XbaI：25489，12013，1904；

pAd5-PB1+M MluI：18009，7907，5845，4305，1797，1134；

pAd5-PB1+M XbaI：25489，12142，1366；

pAd-HA+NA coR I+Xba I：16742，9321，5958，2255，2019，1752，770；

pAd5-PB2+NS baI+EcoRI：16742，10340，5958，2019，1802，1229，770。

病毒的拯救与生产参见：Shiver，J.W.，Fu，T.M.，Chen，L.，Casimiro，D.R.，etal.(2002).Replication-incompetent adenoiral vaccine vector elicits effectiveanti-immunodeficiency-virus immunity.Nature 415(6869)，331-5。该文献中文名为不完全复制腺病毒疫苗载体产生的有效的抗免疫缺陷病毒的免疫性。

实施例3：串联启动子效率比较

6孔培养板，293细胞，90％融合度，利用Lipotransfectamine2000转染试剂(Invitrogen公司)，分别转染pShuttle-IN-PB1+EGFP，pShuttle-IN-EGFP+PB1质粒各4ug。转染方法遵照操作说明。转染后24小时进行，使用流式细胞仪检测EGFP的表达水平具体方法参照文献，Hoffmann，E.，Neumann，G.，Hobom，G.，Webster，R.G.，and Kawaoka，Y.(2000a).″Ambisense″approach for the generationofinfluenza A virus ： vRNA and mRNA synthesis from one template.Virology 267(2)，310-7。该文献的中文名为：产生A型流感病毒的“双义”方法：从同一模板合成病毒RNA和信使RNA。得到的结果如图2-1，图2-2所示，表明两个串联启动子的启动效率一致。

实施例4：pPolI-1194HA与pPol I-1194NA质粒的构建。

VN-1194HA与VN-1194NA序列，进行合成(TaKaRa生物公司，大连)。本实验室保存。宜VN-1194HA为模板，以SapI-H5-1与SapI-H5-1025R为引物对，扩增得到HA序列中碱性裂解位点上游的序列；以SapI-H5-1020与SapI-H5-1778R为引物对，扩增得到碱性裂解位点下游序列，两个片段经过Sap I酶切，连接插入到Sap I酶切后的pPolI质粒，得到pPol I-VN-1194HA，其中核酸序列所对应的氨基酸序列中的碱性裂解位点RRRKK被去除，突变为一个I氨基酸，表达得到的HA蛋白被减毒。构建质粒测序鉴定，表明RRRKK被去除，构建成功，如图4所示。

SapI-H5-1：5’-GATCGCTCTTCAGCCAGCAAAAGCAG-3’

SapI-H5-1025R：5’-GATCGCTCTTCACGAGTCTCTCTTTGAGG-3’

SapI-H5-1020：5’-GATCGCTCTTCGTCGAGGATTATTTGGAGC-3’

SapI-H5-1778R：5’-CATCGCTCTTCTATTAGTAGAAACAAGGGTGT-3’

同样方法，VN-1194NA为模板，以SapI-N1-1与SapI-N1-1398R为引物对，扩增得到，含有Sap I酶切位点的片段，片段经过Sap I酶切，连接插入到Sap I酶切后的pPol I质粒，得到pPol I-VN-1194NA。

SapI-N1-1：5’-5′-GATCGCTCTTCGGCCAGCAAAAGCAGGAG-3’

SapI-N1-1398R：5’-CATCGCTCTTCTATTAGTAGAAACAAG-3’

实施例5：流感病毒的拯救示意图

如图5所示为流感病毒的拯救示意图。将使用四个腺病毒载体Ad5-IN-PB2+NS，Ad5-IN-PB1+M，Ad5-IN-PA+NP，Ad5-IN-HA+NA感染Vero细胞，或者利用质粒转染和腺病毒感染相结合的流感病毒种子疫苗株制备方法：两个质粒转染Vero细胞，其中一个质粒携带流感病毒H5N1越南株(VN)1194的HA基因(其中HA的改造过程中去除了碱性裂解位点RRKK，改为I)，另一个携带NA基因。转染更换为新鲜培养基后，用Ad5-IN-PB2+NS、Ad5-IN-PB1+M和Ad5-IN-PA+NP三个腺病毒共同感染转染有HA和NA质粒的细胞。

使用含10％FBS的高糖DMEM完全培养基进行Vero细胞的传代培养。24孔培养板中，80-90％饱和度的Vero细胞用不同浓度的上述腺病毒进行感染，3h后，含病毒的培养基更换为10％FBS的高糖DMEM完全培养基，6-8h后，去除细胞培养上清，并用Hanks培养液彻底洗去残留的培养基，然后加入0.5ml含有1ug/ml的TPCK胰酶(Fluka公司)。此后每隔24小时，加入0.5ul 1mg/ml的TPCK胰酶，保证培养上清的TPCK终浓度为1ug/ml。12h，24h，36h，48h，60h分别收集培养上清。取200ul接种10日龄鸡胚，48h后测定鸡胚尿囊液中的HA效价，并进行RT-PCR鉴定。

实施例6：H5N1流感疫苗株种子病毒的生产

两个1.5ml离心管中分别加入600ul OptiMEM I(Gibico公司)，然后一份中分别加入2ug pPol I-1194HA与2ug pPol I-1194NA质粒并充分混匀；另外一份加入8ul LIPOFECTAMINE 2000(Invitrogen公司)转染试剂，并充分混匀。室温静止5min后将DNA溶液和转染试剂溶液混合。室温静止20min-30min。与此同时，70-90％饱和度的Vero细胞，用0.25％胰酶EDTA消化处理，得到单个细胞悬液，计数后，10⁶个细胞分装到1.5ml离心管，300g离心5min，弃去离心上清，用1ml Hanks洗液重悬细胞，再次离心一次300g离心5min，弃上清。用含有DNA和转染试剂的混合液重悬细胞。然后加入到六孔板的培养孔中。6h后，细胞已经完全贴壁，更换为新鲜培养基。转染后12h，培养液更新为含有病毒剂量200-400 VP/AdV/Cell。以下步骤同实施例5。

实施例7：重组PR8病毒与减毒H5N1(VN1194)病毒的PCR检测

各取200ul鸡胚尿囊液，按照标准的方法Trizol方法(《分子克隆实验指南》第518页)进行病毒RNA提取，提取后用流感病毒的通用引物Uni12进行反转录，反转录条件：42℃孵育1h，然后用针对NA片段的特异性引物SapI-N1-1与SapI-N1-1398R(同实施例5 pPol I-1194NA质粒构建)进行PCR扩增，扩增得到的PCR产物进行Bgl II与EcoR V酶切鉴定，结果如图6所示。图6中PR8NA表示PR8病毒的NA片段，VN-NA表示减毒H5N1(VN1194)病毒的NA片段，E表示用EcoR V酶切，B表示用Bgl II酶切。

引物序列：Uni12：AGCAAAAGCAGG。

以上实施例仅用以说明本发明的优选技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (9)

1、一种流感病毒疫苗种子株的制备方法，其特征在于，该方法为：将拯救组合物感染或转染到至少一个宿主细胞中，其中，

拯救组合物包含四个分别携带两个流感病毒片段的腺病毒载体，或

三个分别携带两个流感病毒片段的腺病毒载体和两个分别携带HA基因和NA基因的质粒。

2、如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的宿主细胞为哺乳动物细胞株。

3、如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的宿主细胞为Vero细胞。

4、如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的四个分别携带两个流感病毒片段的腺病毒载体为Ad5-IN-PB2+NS、Ad5-IN-PB1+M、Ad5-IN-PA+NP和Ad5-IN-HA+NA。

5、如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的三个分别携带两个流感病毒片段的腺病毒载体为Ad5-IN-PB2+NS、Ad5-IN-PB1+M和Ad5-IN-PA+NP。

6、如权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述的腺病毒载体包含一种具有启动效率一致的串连hCMV/hPol I双向启动子DNA结构。

7、如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的携带HA基因的质粒为pPolI-VN-1194HA质粒。

8、如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的pPolI-VN-1194HA质粒，其HA氨基酸序列中的碱性裂解位点由RRRKK突变为I。

9、如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的流感病毒包括甲型、乙型、丙型流感病毒。

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