CN101519648A

CN101519648A - 用于流感病毒m2离子通道阻断剂筛选的荧光细胞模型及其应用方法

Info

Publication number: CN101519648A
Application number: CN200910036424A
Authority: CN
Inventors: 陈凌; 李楚芳; 徐伟; 肖益平; 杨令芝
Original assignee: Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Current assignee: Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Priority date: 2009-01-05
Filing date: 2009-01-05
Publication date: 2009-09-02

Abstract

本发明提供了一种用于流感病毒M2离子通道阻断剂筛选的荧光细胞模型，该细胞模型是含pH敏感的荧光物质的细胞。同时，本发明还提供了利用该细胞模型筛选流感病毒M2离子通道阻断剂的方法。该方法是测定在酸性缓冲液条件下细胞模型中荧光值的变化。本发明优点在于，通过测定荧光值反映细胞内pH的变化，直接反映通过M2离子通道的H+流动情况，利用本发明的细胞模型建立的M2离子通道阻断剂筛选方法药物作用机制明确，方法简便、快速、直接，适合M2离子通道阻断剂的高通量准确筛选。

Description

用于流感病毒M2离子通道阻断剂筛选的荧光细胞模型及其应用方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及抗流感药物的筛选，更具体涉及流感病毒M2离子通道的荧光细胞模型及利用该细胞模型筛选M2离子通道阻断剂的方法。

背景技术

流感是由流行性感冒病毒引起的严重危害人类健康的一种急性病毒性呼吸道传染病。M2离子通道蛋白分布于流感病毒表面，是由97氨基酸组成的跨膜蛋白，四个M2离子通道蛋白单体通过二硫键和疏水作用形成四聚体，并构成一个离子通道，是抗流感药物的重要靶标。阻断M2离子通道的功能可以有效地抑制病毒感染细胞和复制，阻断病毒感染的扩散。目前临床上使用的M2离子通道阻断剂金刚胺和金刚乙胺在治疗流感中发挥了重要作用，但流感病毒对金刚胺和金刚乙胺产生了严重的抗药性。有必要建立新的M2离子通道阻断剂筛选模型，从化合物库中随机筛选，发现新的M2离子通道阻断剂，特别是发现对金刚烷胺耐药型M2离子通道有效的新阻断剂。

目前筛选抗流感药物方法包括体外实验和体内实验，体外实验有病毒抑制实验和噬斑实验：病毒抑制试验是利用化合物抑制病毒感染或复制，进而保护细胞，通过检测细胞活力达到筛选抗流感药物的目的；噬斑实验也是利用化合物抑制病毒感染或复制保护细胞，但通过检测噬斑数来筛选药物。体外实验即动物实验，以小鼠，雪貂等为对象，对动物给药后检测化合物是否具有保护作用。这些实验方法难以进行高通量筛选，且靶标不明，动物实验的成本又高，影响因素多。

M2作为离子通道，其高通量筛选方法的建立还有一定难度：首先由于M2离子通道在细胞上表达时对细胞有毒性作用，建立M2离子通道的模型困难；而且现有的离子通道研究方法有限，如电生理(膜片钳)，配体结合，离子流量测定等，而利用这些方法实现高通量还有一定难度。

发明内容

为了克服上述技术缺陷，本发明提供了一种用于流感病毒M2离子通道阻断剂筛选的荧光细胞模型。同时，本发明还提供了利用该细胞模型筛选流感病毒M2离子通道阻断剂的方法。

本发明的用于流感病毒M2离子通道阻断剂筛选的荧光细胞模型是含pH敏感的荧光物质的细胞。

优选的，所述的荧光物质为荧光指示剂或荧光蛋白。

优选的，所述的荧光指示剂包括荧光探针SNARF(seminaphthorhodafluors)、荧光探针SNARF-AM、8-羟基-1，3，6-三磺酸芘(HPTS，pyranine)、荧光素Fluoresceins、羧基荧光素carboxyfluoresceins、1，2，7-双-(羧乙基)-羧基-荧光素(BCECF)、双羧乙基碳氧荧光素四乙酰氧甲酯(BCECF-AM)。

优选的，所述的荧光蛋白包括绿色荧光蛋白、增强型黄色荧光蛋白或荧光蛋白pHluorin。

优选的，所述的所述的绿色荧光蛋白包括含有S65T突变的绿色荧光蛋白突变体。

优选的，所述的含有S65T突变的绿色荧光蛋白包括S65T绿色荧光蛋白突变体、增强型绿色荧光蛋白、F64L/S65T/T203Y/L231H绿色荧光蛋白突变体或C48S/S65T/H148C/T203C绿色荧光蛋白突变体。

本发明提供的M2离子通道阻断剂筛选的细胞模型，是指将pH敏感的荧光指示剂和荧光蛋白标记M2表达细胞，标记方法：一是将荧光指示剂微量注射入细胞内；二是荧光指示剂与细胞一起孵育，脂溶性的荧光指示剂如BCECF-AM等通过细胞膜进入细胞内；三是利用M2离子通道和荧光蛋白表达载体(如pEGFP-C1)共转染细胞，建立M2离子通道与荧光蛋白共表达的稳定细胞。

上述的细胞模型在流感病毒M2离子通道阻断剂筛选中的应用方法是测定在酸性缓冲液条件下所述细胞模型中荧光值的变化。优选的，酸性条件为pH值低于6.2的条件。

在低于pH6.2的酸性环境中M2离子通道打开，细胞外的H+通过M2离子通道迅速内流，导致细胞内pH下降，pH的变化引起荧光值的改变。如果存在M2离子通道阻断剂，在酸性环境中H+的内流收到抑制，细胞内pH下降减慢。通过检测细胞荧光值，反映M2离子通道的抑制情况，从而反映M2离子通道阻断剂的活性。

本发明中所用的pEGFP-C1表达质粒为Clontech公司的商业化产品，BCECF-AM为Invitrogen公司的商业化产品。

由于M2离子通道是H+通道，H+的流动将改变M2离子通道两端的pH值。M2离子通道表达于细胞膜上时，N端在膜外而C端在膜内。当细胞外pH下降至pH6.2以下时，M2离子通道打开，H+由胞外流向胞内，胞内pH随之下降。因此，可以利用荧光pH指示剂双羧乙基碳氧荧光素四乙酰氧甲酯(BCECF-AM)、增强型绿色荧光蛋白(GFP)等建立M2离子通道阻断剂筛选的细胞模型，测定细胞内荧光值反映pH的变化，同时也反映M2离子通道的打开情况。根据此原理可建立M2离子通道阻断剂的高通量筛选方法。

本发明的优点在于，通过测定荧光值反映细胞内pH的变化，直接反映通过M2离子通道的H+流动情况，利用该细胞模型建立的M2离子通道阻断剂筛选方法药物作用机制明确，方法简便、快速、直接，适合M2离子通道阻断剂的高通量准确筛选。

附图说明

图1为本发明的H5N1A型流感病毒M2离子通道的表达的一个优选实施例的结果图；

图2为本发明的细胞内增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的荧光强度与pH值相关的一个优选实施例的结果图；

图3为本发明的在酸性缓冲液中细胞内增强型绿色荧光蛋白(EGFP)荧光强度与M2离子通道相关的一个优选实施例的结果图；

图4为本发明的M2表达细胞中增强型绿色荧光蛋白(EGFP)荧光强度下降与未表达M2细胞之间的比较的一个优选实施例的结果图；

图5-1为本发明的M2离子通道的表达水平western blot的一个优选实施例的结果图；

图5-2为本发明的pH5.49时荧光强度下降的一个优选实施例的曲线图；

图6为本发明的细胞内源性酸敏感离子通道(ASICs)对M2离子通道活性检测的影响的一个优选实施例的结果图；

图7为本发明的金刚烷胺阻断M2离子通道的IC50(μmol/L)的一个优选实施例的结果图；

图8为本发明的金刚烷胺不能抑制耐药型M2离子通道活性的一个优选实施例的结果图；

图9为本发明的双羧乙基碳氧荧光素四乙酰氧甲酯(BCECF-AM)M2表达细胞中荧光强度下降与未表达M2细胞之间的的一个优选实施例的比较结果图；

图10为本发明的金刚烷胺抑制M2离子通道的剂量反应的一个优选实施例的曲线图。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例一：H5N1 A型流感病毒M2离子通道与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)共表达细胞的建立

1.H5N1 A型流感病毒M2离子通道蛋白基因的获得

以H5N1病毒株的共有氨基酸序列为模板，经过优化后，适合哺乳动物表达的基因序列由人工合成(广州复能基因有限公司)，命名为H5M2。同时还构建了H5N1流感病毒M2的耐药突变体(S31N-L26I双突变)表达质粒，该质粒命名为H5M2(S31N-L26I)。二者通过BamHI和XbaI酶切克隆于pcDNA4/TO质粒，该质粒在T-REx293细胞中需在四环素的诱导下才能表达目的基因。野生型H5M2基因序列为：

CGG GAT CCAT gtc cct gct gac aga ggt gga gac ccc cac cag gaa tga gtg gga gtg cag

gtg ctc tga ctc ctc tga CCC CCT GGT GGT GGC TGC CTC CAT C att ggc atc ctg

cat ctg atc ctg tgg att ctg gac agg ctg ttc ttc aag tgc atc tac agg agg ctg aag tat ggc ctg

aag agg ggc cct gcc aca gct ggc gtg cct gag tcc atg agg gag gag tac agg cag gag cag

cag tct gct gtg gat gtg gat gat ggc cac ttt gtg aac att gag ctg gag taa atc tag agc，

其跨膜区(aa25至aa42)序列CCC CTG GTG GTG GCT GCC TCC ATC ATTGGC ATC CTG CAT CTG ATC CTG TGG ATT

经点突变后为耐药型H5M2(S31N-L26I)的跨膜区基因序列：CCC ATT GTGGTG GCT GCC AAC ATC ATT GGC ATC CTG CAT CTG ATC CTG TGG ATT。

合成的引物序列为：

上游引物：5-cgggatccatgtccctgctga-3

下游引物：5-cggaattcttactccagctcaatgttca-3

2.EGFP基因的获得

为了建立EGFP与H5M2共表达的稳定细胞，本研究以质粒p-EGFP-C1为模板，通过PCR扩增EGFP基因，通过Bgl II和EcoR I酶切后连接到pQCXIP载体上。由于pQCXIP带有嘌呤霉素抗性基因，便于筛选EGFP表达的细胞克隆。EGFP序列为：

atg gtg agc aag ggc gag gag ctg ttc acc ggg gtg gtg ccc atc ctg gtc gag ctg gac

ggc gac gta aac ggc cac aag ttc agc gtg tcc ggc gag ggc gag ggc gat gcc acc tac

ggc aag ctg acc ctg aag ttc atc tgc acc acc ggc aag ctg ccc gtg ccc tgg ccc acc

ctc gtg acc acc ctg acc tac ggc gtg cag tgc ttc agc cgc tac ccc gac cac atg aag

cag cac gac ttc ttc aag tcc gcc atg ccc gaa ggc tac gtc cag gag cgc acc atc ttc

ttc aag gac gac ggc aac tac aag acc cgc gcc gag gtg aag ttc gag ggc gac acc ctg

gtg aac cgc atc gag ctg aag ggc atc gac ttc aag gag gac ggc aac atc ctg ggg cac

aag ctg gag tac aac tac aac agc cac aac gtc tat atc atg gcc gac aag cag aag aac

ggc atc aag gtg aac ttc aag atc cgc cac aac atc gag gac ggc agc gtg cag ctc gcc

gac cac tac cag cag aac acc ccc atc ggc gac ggc ccc gtg ctg ctg ccc gac aac cac

tac ctg agc acc cag tcc gcc ctg agc aaa gac ccc aac gag aag cgc gat cac atg gtc

ctg ctg gag ttc gtg acc gcc gcc ggg atc act ctc ggc atg gac gag ctg tac aag taa

EGFP的PCR扩增引物序列为：

上游引物：ggaagatctatggtgagcaagggcgaggag

下游引物：cggaattctacggatcccttgtacagctcgtccatgc(由invitrogen公司合成)。

与野生型GFP相比，EGFP的64位苯丙氨酸突变为亮氨酸，65位丝氨酸突变为苏氨酸，前者增强GFP的荧光强度，后者使得GFP蛋白对pH敏感。

3.建立共表达稳定细胞株

按以下操作步骤建立诱导型A型流感病毒M2离子通道的稳定细胞株：

1)取状态良好的T-REx293细胞2×10⁵个/孔铺于6孔板中，加2ml完全培养基(DMEM，10％FBS，青霉素100units/ml，链霉素100ug/ml)，置于37℃恒温培养箱中，5％CO₂培养24h。

2)转染前1h吸去细胞上清，沿壁缓缓加入不含青链霉素的DMEM培养基(含10％FBS)。

3)质粒pcDNA4/TO-H5M2(wild)，pcDNA4/TO-H5M2(S31N-L26I)各取2μg，分别与6μl的脂质体(lipofectamin)加入100μl的DMEM(Dulbecco′smodified eagle medium)中混匀，静置20分钟。

4)转染混合液轻轻滴入上述6孔板细胞培养孔中。

5)4-6h后换液，每孔用2ml完全培养基代替转染混合液。

6)24h后细胞按1:18传入10cm培养皿中，加入200μg/ml的zeocin(博来霉素)压稳定细胞株。

7)3天换液一次，并补加200μg/mL的zeocin，维持200μg/mL的zeocin培养3周，待单克隆细胞长到肉眼可见(单个克隆约400-600个细胞)时，挑出单细胞克隆至24孔板，放大培养后取样做Western Blot鉴定。结果见图1，图1表明M2离子通道蛋白在细胞中表达时以四聚体、二聚体、单体形式存在。

8)鉴定得到的稳定细胞株在2μg/ml的四环素诱导下可以稳定表达突变型或野生型M2，取每个稳定株1×10⁵个细胞至24孔板的一个孔中，置于37℃恒温培养箱中，5％CO₂培养24h。

9)24h后转染编码EGFP的质粒pQCXIP-EGFP，转染1h前培养基换成不含青链霉素的DMEM，但含10％FBS。

10)取2μg的pQCXIP-EGFP质粒DNA与6μl lipofectin-2000分别加入50μl无血清无抗生素的DMEM培养基中中，静置3min后将二者混匀，静置20分钟。

11)转染混合液轻轻滴入6孔板中。

12)4-6h后吸去上清，沿壁加入500μl完全培养基，36h后细胞按1:18传入10cm培养皿，加入终浓度为1μg/ml的嘌呤霉素。

13)3天换液一次，并补加嘌呤霉素，维持嘌呤霉素抗性2周。待单细胞克隆长至400-600个细胞，在荧光显微镜下鉴定EGFP的表达情况，挑取荧光比较强的细胞克隆放大培养。

4.稳定细胞株的鉴定

绿色荧光蛋白的鉴定直接在荧光显微镜下进行，M2离子通道的鉴定按以下步骤进行：

1)将上述T-REx293稳定株细胞按2×10⁵个/孔接入6孔板中，加入2μg/ml的四环素诱导表达24h后收取细胞，细胞置于37℃恒温培养箱中，5％CO₂培养24h。

2)细胞收至1.5ml EP管中，PBS(0.01M，pH7.2)洗细胞一次，离心去上清。

3)用1×上样缓冲液60μl重悬细胞，水浴煮沸10分钟。

4)各取样10μl进行SDS PAGE电泳(恒压80V)2h，半干转膜1h(恒流60mA)。

5)蛋白条带转至PVDF上，用10ml的5％脱脂乳(PBST中溶解)封闭1小时，100mL的PBST洗膜三次后加入自制抗M2多抗(血清用PBST按1:800稀释)，孵育1h，10mL的PBST洗膜三次，每次5min，加入HRP标记的羊抗鼠IgG二抗(1:2000)孵育1h，10mL的PBST洗膜三次。

6)加入等体积混合的化学发光A，B显色液，反应1min后暗室中用富士公司的医用X光胶片曝光。结果见图1.

5.GFP的表达及其对pH的敏感性

1)取2×10⁴个/孔T-REx293稳定株细胞至96孔板中，每孔加入100μl的完全培养基，置于37℃恒温培养箱中，5％CO₂培养24h。另增加一个转染pQCXIP空质粒的T-REx 293作为阴性对照。

2)24h后，吸去96孔板中细胞培养基

3)用含10μmol/L透膜剂nigericin的PBS缓冲液处理细胞10min

4)弃透膜PBS缓冲液，加入不同pH值的缓冲液(含20mmol/L MES的PBS缓冲液)，呈梯度，分别为pH7.28，pH6.3，pH5.91，pH5.52，pH5.2，pH4.89，pH4.58，每个浓度3个复孔，静置5min。

5)在荧光显微镜下镜检GFP表达及其对pH的反应。结果见图2，图2表明细胞内的EGFP的荧光强度与pH相关。

6.EGFP荧光强度与pH的关系

1)取2×10⁶个EGFP稳定细胞接种10cm培养皿中(野生型和突变型)，加10ml完全培养基置二氧化碳培养箱中37℃，5％CO₂恒温培养24h。无荧光表达细胞作为阴性对照。

2)24h后收集细胞，不用胰酶消化，弃上清，用1ml的PBS缓冲液将细胞轻轻吹下，收集至1.5ml的EP管中。

3)1000rcf离心1min，弃上清，将细胞分成四份，调整细胞浓度为1×10⁶、0.5×10⁶、0.25×10⁶、0.125×10⁶、0.0625×10⁶cell/ml，加入透膜剂nigericin(尼日利亚菌素)(终浓度10μmol/L)，混匀，静置5min。

4)将不同浓度的细胞分别取50μl/孔加入到黑色96孔板中，检测初始荧光值，设立无荧光细胞阴性对照孔(初始测得荧光值与阴性对照荧光值)。

5)加入等体积不同pH值的40mM MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonicacid)缓冲液，每个pH值设置3个复孔，10min后再次检测荧光值(第二次测得荧光值和阴性对照荧光值)。

荧光强度计算：即GFP荧光值的相对比值

在后续的实验中均以此公式计算荧光强度，并以荧光强度作图。

仪器：UVstar-Microplates Synergy HT，激发波长485nm，发射波长525nm.通过软件GraphPad分析得到荧光强度与pH值之间的关系曲线。结果见图3，图3表明在pH5至pH6.5之间EGFP的荧光强度与pH呈线性相关。

7.M2表达细胞中EGFP荧光强度与pH之间的曲线关系

1)取2×10⁶个细胞接入10cm培养皿中(野生型和突变型)，四环素2μg/ml诱导24h，加10ml完全培养基置二氧化碳培养箱中37℃，5％CO2恒温培养。

2)24h后收集细胞，不用胰酶消化，弃上清，用1ml的PBS缓冲液将细胞轻轻吹下，收集至1.5ml的EP管中

3)3000rpm离心1min，弃上清，用PBS缓冲液调整细胞浓度至2×10⁵(含0.5％BSA)，

4)取50μl/孔加入到黑色96孔板中，检测初始荧光值。

5)随后加入等体积的pH在2.3-8.07区间内的40mMMES缓冲液，每个pH值设置3个复孔，动力检测10分钟内荧光值变化曲线。结果见图4，图4表明M2离子通道表达细胞中荧光强度下降速度比无M2离子通道细胞快。

8.M2离子通道表达水平与细胞内GFP荧光强度的关系

1)取2×10⁶个细胞接入100mm培养皿(野生型和突变型)，四环素2μg/ml分别诱导0h，6h，12h，18h，24h，加2ml完全培养基置二氧化碳培养箱中37℃，5％CO2恒温培养。

2)24h后收集细胞，不用胰酶消化，吸取上清，用1ml的PBS缓冲液将细胞轻轻吹下，收集至1.5ml的EP管中。

3)3000rpm离心1min，弃上清，用PBS缓冲液调整细胞浓度至2×10⁵(含0.5％BSA)。

4)取50μl/孔加入到黑色96孔板中，检测初始荧光值。

5)随后加入等体积的pH值为4.57的40mMMES缓冲液(PBS缓冲液2倍稀释后pH值为5.49)，每个pH值设置3个复孔，动力检测10分钟内荧光值变化。

6)M2表达水平由Western blot鉴定。结果见图5，图5-1为M2离子通道的表达水平western blot结果；图5-2为pH5.49时荧光强度下降曲线；由此说明在M2离子通道表达细胞中，EGFP荧光强度的下降速度与M2离子通道的数量相关，也就是说，不同程度的阻断M2离子通道可以通过荧光强度反映出来。

9.细胞内源性酸敏感离子通道ASICs对M2离子通道活性检测的影响

在本研究中利用阿米洛利来抑制细胞内源性酸敏感离子通道ASICs。

1)取2×10⁶个细胞接种100mm培养皿(野生型和突变型)，分别由1μg/ml四环素诱导或不诱导，加10ml完全培养基置二氧化碳培养箱中37℃，5％CO2恒温培养。

2)24h后收集细胞，不用胰酶消化，吸取上清，用1ml的PBS缓冲液将细胞轻轻吹下，调整细胞浓度为2×10⁵/ml，分成2份，一份用40μmol/L的阿米洛利处理5min。

3)取50μl/孔加入到黑色96孔板中，检测初始荧光值。

4)随后加入等体积的pH值为4.57的40mMMES缓冲液(PBS缓冲液2倍稀释后pH值为5.49)，每个pH值设置3个复孔，动力检测10分钟内荧光值变化。

结果见图6，图6表明内源性酸敏感离子通道对M2离子通道的活性没有明显的影响。

10.金刚烷胺与金刚乙胺阻断M2离子通道的研究

1)分别取1×10⁶个T-REx293稳定株细胞接入2个10cm培养皿中(野生型和突变型)，四环素1μg/ml诱导24h，另外分别取相同稳定株细胞至2个10cm培养皿中(野生型和突变型)，不诱导，作为对照。加10ml完全培养基置二氧化碳培养箱中37℃，5％CO2恒温培养。

3)3000rpm离心1min，弃上清，转移至干净的培养皿中，用PBS缓冲液调整细胞浓度至4×10⁵(含0.5％BSA)。

4)取细胞30μl/孔加入黑色96孔板中。

5)稀释化合物金刚烷胺或金刚乙胺，起始浓度为0.5mmol/L，5倍倍比稀释，稀释至6×10^-6mmol/L。

6)在加入细胞的孔中每孔加入30μl不同浓度的金刚烷胺或金刚乙胺，作用5min，检测荧光值。设置未诱导M2表达的细胞作为对照。

7)而后迅速加入60μl含40mM MES的PBS缓冲液(pH4.57)，检测荧光值，间隔90s，动力法检测10min(溶液的最终pH为5.49)。

8)通过软件GraphPrism分析数据。结果见图7，图7表明，野生型M2离子通道能被金刚烷胺阻断，利用本方法测得IC50值为1.28±0.38μmol/L。而且在酸性缓冲液处理后的5分钟内测得的结果相近，给实验实施提供了足够时间。

11.建立M2阻断剂筛选方法：

1)取状态良好的GFP-M2 T-REx293稳定株细胞2×10⁶个接入10cm培养皿中(野生型和突变型)，四环素2μg/ml诱导培养24h；另外分别取相同稳定株细胞至2个10cm培养皿中(野生型和突变型)，不诱导，作为对照。加10ml完全培养基置二氧化碳培养箱中37℃，5％CO2恒温培养。

2)24h后收集细胞，不用胰酶消化，吸取上清，用1ml的PBS(0.01M，pH7.4)缓冲液将细胞轻轻吹下，收集至1.5ml的EP管中。

3)室温下3000rpm离心1min，弃上清，转移至干净的培养皿中，并加PBS稀释至6ml。

4)加PBS重悬细胞，调整细胞浓度至2×10⁵(含0.5％BSA)，取30μl/孔加入黑色96孔板中，

5)稀释化合物：金刚烷胺作为阳性对照，与化合物同样稀释。起始浓度为0.5mM，5倍倍比稀释，稀释至6.4×10^-6mM。96孔板中设置以下孔，诱导表达的细胞，未诱导的细胞，不表达GFP的T-REx293细胞作为阴性对照。

6)向每孔细胞中加入30μl不同浓度的化合物，作用5min后，检测初始荧光值。

7)实验设置未诱导的细胞作为对照

8)而后迅速加入60μl含40mM MES的PBS缓冲液，检测荧光值，间隔90s，动力法检测10min。

9)通过软件GraphPAD Prism分析数据。

12.金刚烷胺不能抑制耐药型M2离子通道和B型流感病毒的M2离子通道，因而在耐药M2离子通道与GFP共表达的细胞中，金刚烷胺不影响GFP荧光值的下降，结果见图8。进一步证实该模型的可靠性和准确性。此模型为筛选耐药型M2离子通道和B型流感病毒的M2离子通道的阻断剂提供可靠方法。

实施例二、荧光指示剂标记M2表达细胞模型

1.取状态良好的M2T-REx293稳定株细胞2×10⁶个接入10cm培养皿中(野生型和突变型)，四环素2μg/ml诱导培养24h；另外分别取相同稳定株细胞至2个10cm培养皿中(野生型和突变型)，不诱导，作为对照。加10ml完全培养基置二氧化碳培养箱中37℃，5％CO2恒温培养。

2.24h后收集细胞，不用胰酶消化，去上清，用1ml的PBS(0.01M，pH7.4)缓冲液将细胞轻轻吹下，收集至1.5ml的EP管中。pH7.4的PBS洗细胞三次。

3.用1ml Hanks缓冲液重悬细胞，加入双羧乙基碳氧荧光素四乙酰氧甲酯(BCECF-AM，终浓度5μmol/L)标记15min。BCECF-AM在细胞内经酯酶裂解生产能发荧光的BCECF。

4.用PBS(pH7.4)洗涤细胞3次，并用PBS(pH7.4)重悬细胞，浓度2×10＾5cell/ml.

5.化合物筛选

在96孔黑色板，每孔50μl细胞(1 x 10⁴cell/well)与50ul含化合物(不同浓度)的PBS混匀，静置15min。每孔中加入50μl PBS(150mM MES，pH5.06)并混匀，(最终MES浓度：50mM，pH5.4)，立即测定荧光值(动力学测定或1min后终点测定)。仪器：UVstar-Microplates Synergy HT，激发波长485nm，发射波长525nm.

6.数据分析

图9为在酸性条件下，BCECF荧光强度在M2表达细胞和无M2细胞中的比较。由图9可见，酸性缓冲液中BCECF荧光强度的下降速度在M2表达细胞中比无M2细胞快。

图10金刚烷胺抑制野生型M2离子通道与BCECF荧光强度的剂量反应曲线。图10中显示酸性条件处理后0，1，2，3，4，5分钟时间点测得的BCECF荧光强度与金刚烷胺浓度的相关性，表明BCECF可用于M2离子通道阻断剂的筛选。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.一种用于流感病毒M2离子通道阻断剂筛选的荧光细胞模型，其特征在于，该细胞模型是含pH敏感的荧光物质的细胞。

2、根据权利要求1所述的细胞模型，其特征在于，所述的荧光物质为荧光指示剂或荧光蛋白。

3、根据权利要求2所述的细胞模型，其特征在于，所述的荧光指示剂包括荧光探针SNARF、荧光探针SNARF-AM、8-羟基-1，3，6-三磺酸芘、荧光素Fluoresceins、羧基荧光素carboxyfluoresceins、1，2，7-双-(羧乙基)-羧基-荧光素或双羧乙基碳氧荧光素四乙酰氧甲酯。

4、根据权利要求2所述的细胞模型，其特征在于，所述的荧光蛋白包括绿色荧光蛋白、增强型黄色荧光蛋白或荧光蛋白pHluorin。

5、根据权利要求4所述的细胞模型，其特征在于，所述的绿色荧光蛋白包括含有S65T突变的绿色荧光蛋白突变体。

6、根据权利要求5所述的细胞模型，其特征在于，所述的含有S65T突变的绿色荧光蛋白包括S65T绿色荧光蛋白突变体、增强型绿色荧光蛋白、F64L/S65T/T203Y/L231H绿色荧光蛋白突变体或C48S/S65T/H148C/T203C绿色荧光蛋白突变体。

7、权利要求1-6之一所述的细胞模型在流感病毒M2离子通道阻断剂筛选中的应用方法，其特征在于，测定在酸性条件下所述细胞模型中荧光值的变化。

8、根据权利要求7所述的应用方法，其特征在于，所述的酸性条件为pH值低于6.2的条件。