KR101329332B1 - 웨스트나일 바이러스에 대한 중화항체 검출방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 웨스트나일 바이러스에 대한 중화항체 검출방법 및 웨스트나일병의 진단을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.
본 발명의 웨스트나일 바이러스에 대한 중화항체의 검출방법을 이용할 경우, 차폐시설 내 작업 시간을 단축하여 고 위험 병원체에 노출될 수 있는 작업자의 위험성을 줄이고, 실험 절차를 간소화하여 포르말린 등과 같은 유독 폐기물 사용을 절감할 수 있을 뿐 아니라, 숙련자가 아닌 실험자도 쉽게 웨스트나일 바이러스에 대한 중화항체 여부를 판정하고, 한 번에 대량의 시료 처리가 가능하다.

Description

웨스트나일 바이러스에 대한 중화항체 검출방법 {Method for detection of neutralizaing antibody against West Nile virus}
본 발명은 웨스트나일 바이러스에 대한 중화항체 검출방법 및 웨스트나일병의 진단을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.
웨스트나일열은 철새 등의 야생조류로부터 모기에 의해 매개되어 전파되는 바이러스성 전염병으로, 사람과 말에서 치명적인 뇌염 등을 유발하는 인수공통전염병이다. 플라비바이러스속의 웨스트나일 바이러스에 의해 유발되며, 1999 년에 뉴욕에 최초 발생한 후 미주대륙 전역으로 확산되어, 미국에서만 지난 10년간 약 3 만여 명의 환자 및 약 1200 여명의 사망자가 발생하였다. 미국에서의 웨스트나일열 발생과 확산은 새로운 바이러스가 미발생지역에 유입되어 막대한 사회적, 경제적 피해를 일으키는 전형을 보여주었으며, 많은 국가들에게 해외악성전염병에 대한 경계를 강화하는 경각심을 불러일으키게 된 계기가 되었다. 최근 한반도 주변에서도 웨스트나일 바이러스의 활동성이 지속적으로 보고되어, 웨스트나일열의 우리나라 유입 위험도가 점증하고 있다. 한반도 인근의 연해주 블라디보스토크 지역에 서식하는 독수리 등 야생조류에서 웨스트나일 바이러스 항원이 검출되고, 양성항체가 확인되고 있으며, 최근 일본 홋카이도 지역에서 채취된 러시아, 우리나라, 일본 등을 경유하는 철새류에서도 웨스트나일 바이러스 양성항체가 검출되고 있다.
웨스트나일 바이러스는 실험실에서 취급할 시 생물학적 안전 등급 3등급에 준하는 차폐 시설에서 취급하여야 하는 고 위험 병원체이다. 웨스트나일 바이러스의 진단 및 연구를 위하여, 살아있는 바이러스를 배양하고, 생존력이 유지되고 있는 바이러스의 존재 유무를 확인하고 평가하는 일은 모든 바이러스 실험의 기본이다. 현재 바이러스 역가 검정에 사용되는 표준검정 시험법은 PRNT(plaque reduction neutralization test) 이다. 그러나 PRNT법은 검사하고자 하는 가검 혈청과 바이러스 용액을 반응시키고, 이 반응물을 감수성 세포에 감작시킨 후, 한천 오버레이를 두 번 도포하여 결과를 눈으로 직접 판독하거나, 한천 오버레이를 한번 도포하고 포르말린 등으로 고정, 크리스탈 바이올렛 등으로 염색한 후 눈으로 직접 판독하여야 하는 번거로움이 있다. 또한, 사용 시약의 양이 많기 때문에, 유독성 폐기물의 발생이 많고 작업이 까다로운 단점이 있다.
따라서, 웨스트나일 바이러스에 대한 혈청학적 및 면역학적 연구 수행에 필요한 중화항체 실험을 수행하는 경우, 차폐 시설 내 작업 시간을 단축하여 웨스트나일 바이러스와 같은 고위험 병원체에 노출될 수 있는 작업자의 위험성을 줄이고, 실험절차를 간소화하여 포르말린 등과 같은 유독 폐기물 사용을 절감하는 것이 매우 중요한 과제였다. 또한 숙련자가 아닌 실험자도 쉽게 웨스트 나일바이러스에 대한 중화항체의 존재 여부를 판독하고, 한 번에 대량의 시료 처리가 가능한 검출방법에 대한 연구가 계속되었다.
따라서 본 발명자들은 상기과 같은 문제점을 해결한 웨스트나일 바이러스에 대 한 중화항체의 검출방법에 대한 연구를 계속하던 중, 고농도의 포도당이 포함된 배지에서 웨스트나일 바이러스에 대한 중화항체의 유무에 따라 pH가 변화하여 흡광도의 변화를 일으킴을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
국내 특허 출원번호 :10-2008-0067293
본 발명의 목적은 웨스트나일 바이러스에 대한 중화항체 검출방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 웨스트나일병의 진단 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 웨스트나일병의 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 데 있다.
상기 과제를 해결하기 위해 본 발명은 (a) 8 내지 12 g/L의 포도당을 포함하는 DMEM 배지로 이루어진 웨스트나일 바이러스의 중화시험 배지에서 웨스트나일 바이러스와 가검물을 반응시키는 단계;
(b) 상기 (a)단계의 반응물을 웨스트나일 바이러스 감수성 세포에 감작시키는 단계;
(c) 상기 (b)단계의 반응물의 상층액을 제거하고, (a) 단계의 웨스트나일 바이러스 중화시험 배지를 사용하여 배양하는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계의 배양 배지의 흡광도를 측정하는 단계;를 포함하는 웨스트나일 바이러스에 대한 중화항체의 검출방법을 제공한다.
또한 본 발명은 8 내지 12 g/L의 포도당을 포함하는 DMEM 배지로 이루어진 웨스트나일 바이러스의 중화시험 배지를 포함하는 웨스트나일병 진단 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 키트를 이용하는 것을 특징으로 하는 웨스트나일병의 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명의 웨스트나일 바이러스에 대한 중화항체의 검출방법을 이용할 경우, 차폐시설 내 작업 시간을 단축하여 고위험 병원체에 노출될 수 있는 작업자의 위험성을 줄이고, 실험 절차를 간소화하여 포르말린 등과 같은 유독 폐기물 사용을 절감할 수 있다. 또한, 숙련자가 아닌 실험자도 쉽게 웨스트나일 바이러스에 대한 중화항체 여부를 판정하고, 한 번에 대량의 시료 처리가 가능하다.
도 1은 본 발명의 웨스트나일 바이러스 중화시험 배지를 이용하여 웨스트나일 바이러스에 대한 중화항체를 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 표준화된 시험법을 위하여 반응 적정시간을 확인한 결과이다.
도 3은 토끼에서 항체 역가를 비교한 결과이다.
도 4는 닭에서 항체 역가를 비교한 결과이다.
도 5는 마우스에서 항체 역가를 비교한 결과이다.
도 6은 야외에서 확보된 혈청에서 항체 역가를 비교한 결과이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 8 내지 12 g/L의 포도당을 포함하는 DMEM( Dulbeco's Modified Eagle's Medium) 배지로 이루어진 웨스트나일 바이러스의 중화시험 배지에서 웨스트나일 바이러스와 가검물을 반응시키는 단계;
(b) 상기 (a)단계의 반응물을 웨스트나일 바이러스 감수성 세포에 감작시키는 단계;
(c) 상기 (b)단계의 반응물의 상층액을 제거하고, 상기 (a) 단계의 웨스트나일 바이러스 중화시험 배지에서 배양하는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계의 배양 배지의 흡광도를 측정하는 단계;를 포함하는 웨스트나일 바이러스에 대한 중화항체의 검출방법을 제공한다.
본 발명에서 용어 ‘가검물’은 동물이나 사람에서 채취한 혈액에서 분리된 혈청 시료를 지칭하는 것이다. 상기 가검물은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수득할 수 있으며, 바람직하게는 채취한 혈액에서 원심분리 과정을 통해 혈청을 수득할 수 있다.
상기 (a) 단계에서 웨스트나일 바이러스의 중화시험 배지는 페놀레드, BTB 용액, 메틸오렌지 용액으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 pH 지시약을 포함하며, pH 지시약의 범위는 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 웨스트나일 바이러스에 대한 중화항체의 검출방법은 종래의 12-웰(well) 또는 24웰 플레이트를 이용할 수 있으며, 96 웰 이상의 다수 웰 플레이트의 사용이 가능하여, 짧은 시간 내에 대량의 시료 처리가 가능하다.
상기 (b) 단계의 웨스트나일 바이러스 감수성세포는 웨스트나일 바이러스가 숙주로 하는 임의의 동물의 세포일 수 있으며, 바람직하게는 원숭이 신장세포 (예, Vero 세포)일 수 있다.
상기 (c) 단계에서 배양은 5일 내지 7일, 바람직하게는 7일 동안 이루어질 수 있다. 또한, 상기 배양은 1 ~ 10% CO2, 바람직하게는 5% CO2 배양기 내에서 이루어질 수 있다. 상기 배양 배지가 CO2 배양기 밖에 위치할 경우 빠르게 염기화가 진행되므로, 배양 배지를 CO2 배양기에서 꺼낸 후 1시간 이내, 바람직하게는 30분 이내에 배양 배지의 흡광도를 측정하여야 정확한 웨스트나일 바이러스에 대한 중화항체 존재여부를 판정할 수 있다.
상기 (d) 단계에서, 흡광도 측정은 당업계에서 공지된 통상의 방법에 따라 실시할 수 있다. 한 양태로, 페놀레드를 pH 지시약으로 이용할 경우, 560nm에서 흡광도 변화를 측정하여 웨스트나일 바이러스에 대한 중화항체 유무를 판정할 수 있다. 이 때, 가검물에 웨스트나일 바이러스에 대한 중화항체가 존재하는 양성혈청의 경우에는 웨스트나일 바이러스 중화시험 배지는 적자색으로 유지되고, 가검물에 웨스트나일 바이러스에 대한 중화항체가 존재하지 않는 음성혈청의 경우에는 웨스트나일 바이러스 중화시험 배지의 pH가 저하되어 노란색으로 변화한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 8 내지 12 g/L의 포도당을 포함하는 DMEM 배지로 이루어진 웨스트나일 바이러스의 중화시험 배지를 포함하는 웨스트나일병 진단 키트를 제공한다.
상기 웨스트나일병 진단 키트는 페놀레드, BTB 용액, 메틸오렌지용액으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 pH 지시약을 더 포함할 수 있으며, pH 지시약의 범위는 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 키트를 이용하는 것을 특징으로 하는 웨스트나일병의 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 가검혈청에서 웨스트네일 바이러스의 중화항체 검출
검사하고자 하는 가검혈청과 100 PFU(plaque-forming unit)의 바이러스 용액을 37℃에서 1 시간 동안 반응하고, 상기 반응물을 웨스트나일 바이러스 감수성 세포인 원숭이신장세포주 (Vero)에서 37℃, 5% 이산화탄소 공기조성에서 1시간 동안 감작시켰다. 이 후, 상층액을 제거하고 10 g/L의 포도당를 포함하는 DMEM의 배지를 사용하여 일주일 동안 반응시킨 후, 페놀레드를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
실험 결과, 웨스트나일바이러스 중화항체가 존재하는 혈청이 사용된 경우 (도 1의 오른쪽 하단)와 웨스트나일바이러스에 면역되지 않은 혈청이 사용된 경우(도 1의 왼쪽상단)에 따라 상이한 흡광도를 나타냄을 확인하였다 (도 1). 특히, 배지에 10 g/L의 포도당을 첨가할 경우 가장 뛰어난 결과를 나타내었다.
실시예 2. 표준화된 시험법을 위한 반응 적정시간의 평가
미국 웨스트나일바이러스 표준연구소에서 분양받은 512배 역가의 표준 양성혈청을 순차적으로 희석하고 100 PFU (plaque-forming unit)의 바이러스 용액과 37℃에서 1시간 동안 반응하였다. 상기 반응물을 웨스트나일 바이러스 감수성 세포인 원숭이신장세포주(Vero)에 37℃에서 1시간 동안 감작시켰다. 이 후, 상층액을 제거하고 10 g/L의 포도당를 포함하는 DMEM의 배지를 사용하여 일주일 동안 반응시킨 후, 페놀레드를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
실험 결과, 512배 희석배수에서 전체 반응 well 가운데 3개는 pH 7.2 이상으로 유지되고, 5개는 pH 6.2 이하로 판독이 됨을 확인하였다. 이를 통해 전체 적용한 well의 50%이상에서 페놀레드 지시약이 변화되는 지점을 최종 역가로 판정하고자 하였을 때, 기존의 PRNT시험법으로 결정된 역가(512)와 일치함을 확인하였다.
실시예 3. 감염동물에서 기존 PRNT 시험법과 본 발명의 검출방법과의 비교 실험
3-1. 토끼에서 항체 역가 비교
토끼 여섯 마리를 웨스트나일 바이러스로 감염을 유도하고, 접종 후 0, 6, 8, 10, 14일후에 혈액을 채취하였다. 혈청을 분리하고, 혈청 내에 웨스트나일 바이러스에 대한 중화항체 수준을 평가하였다. 기존 gold standard로 사용하고 있는 PRNT 시험법과 본 발명의 실시예 1과 동일한 방법을 병용하여 일자별로 채취한 가검물에서의 항체 역가 수준 결과를 비교하였다.
실험 결과 도 3에 나타낸 바와 같이, PRNT 시험법과 본 발명의 검출방법의 실험 결과가 대부분 일치하는 것으로 확인되었으며, 이를 통해 두 시험법의 민감도는 유사한 것으로 확인되었다.
3-2. 닭에서 항체 역가 비교
닭 네 마리를 웨스트나일 바이러스로 감염을 유도하고, 실험예 3-1과 동일한 방법으로 실험을 수행하였다.
실험 결과 도 4에 나타낸 바와 같이, PRNT 시험법과 본 발명의 검출방법의 실험 결과가 대부분 일치하는 것으로 확인되었으며, 이를 통해 두 시험법의 민감도는 유사한 것으로 확인되었다.
3-3. 마우스에서 항체 역가 비교
마우스 네 마리를 웨스트나일 바이러스로 감염을 유도하고, 실험예 3-1과 동일한 방법으로 실험을 수행하였다.
실험 결과 도 5에 나타낸 바와 같이, PRNT 시험법과 본 발명의 검출방법의 실험 결과가 대부분 일치하는 것으로 확인되었으며, 이를 통해 두 시험법의 민감도는 유사한 것으로 확인되었다. 또한, 웨스트나일 바이러스 뉴욕주(NY385-99)와 우간다 분리주(B956)을 모두 사용하였을 때, 분리주간의 차이도 관찰되지 않았다.
3-4. 야외에서 확보된 혈청에서 항체 역가 비교
야외에서 확보된 웨스트나일바이러스 양성 및 음성혈청을, 실험예 3-1과 동일한 방법으로 실험을 수행하였다.
실험 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 기존의 gold standard 시험법인 PRNT에 의해 음성과 양성으로 판정된 시료들에 대하여, 본 발명의 검출방법을 이용한 평가시험을 수행한 결과, 웨스트나일 바이러스에 대한 중화항체가 없는 닭 음성혈청에서는 98.8%의 특이도를 보였다. 또한, 웨스트나일 바이러스에 대한 중화항체가 없는 말 음성혈청에서는 99.7%의 특이도를, 웨스트나일 바이러스에 대한 중화항체가 존재하는 말 양성혈청에서는 100%의 특이도를 확인하였으며, 100%의 민감도를 확인하였다.
상기 실험 결과를 통하여, 웨스트나일 바이러스에 감염된 세포 배양 상층액이 산성화 되는 현상을 이용한 본 발명의 웨스트나일 바이러스에 대한 중화항체의 검출방법을 이용할 경우, 검사시약을 절약하고, 작업시간을 단축하며, 동일한 시간에 대량의 시료를 처리할 수 있음을 확인하여, 기존의 방법에 비해 현저한 효과가 있음을 확인하였다.

Claims (7)

  1. (a) 8 내지 12 g/L의 포도당을 포함하는 DMEM (Dulbeco`s modified Eagle`s medium)배지로 이루어진 웨스트나일 바이러스의 중화시험 배지에서 웨스트나일 바이러스와 가검물을 반응시키는 단계;
    (b) 상기 (a)단계의 반응물을 웨스트나일 바이러스 감수성 세포에 감작시키는 단계;
    (c) 상기 (b)단계의 반응물의 상층액을 제거하고, 상기 (a) 단계의 웨스트나일 바이러스 중화시험 배지에서 배양하는 단계; 및
    (d) 상기 (c) 단계의 배양 배지의 흡광도를 측정하는 단계;를 포함하는 웨스트나일 바이러스에 대한 중화항체의 검출방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 웨스트나일 바이러스의 중화시험 배지는 pH 지시약인 페놀레드를 포함하는 것을 특징으로 하는 웨스트나일 바이러스에 대한 중화항체의 검출방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서의 웨스트나일 바이러스 감수성 세포는 원숭이 신장세포인 것을 특징으로 하는 웨스트나일 바이러스에 대한 중화항체의 검출방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서의 배양은 5일 내지 7일 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 웨스트나일 바이러스에 대한 중화항체의 검출방법.
  5. 8 내지 12 g/L의 포도당을 포함하는 DMEM 배지로 이루어진 웨스트나일 바이러스의 중화시험 배지를 포함하는 웨스트나일병 진단 키트.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 배지는 pH 지시약인 페놀레드를 포함하는 것을 특징으로 하는 웨스트나일병 진단 키트.
  7. 제5항의 키트를 이용하는 것을 특징으로 하는 웨스트나일병의 진단을 위한 정보제공방법.
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KR20210145690A (ko) 2020-05-25 2021-12-02 (주) 솔 바이러스 진단 방법 및 장치

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