CN114099661B - 复制型人3型腺病毒作为表达载体在制备猪用疫苗中的应用 - Google Patents

复制型人3型腺病毒作为表达载体在制备猪用疫苗中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种复制型人3型腺病毒作为表达载体在制备猪用疫苗中的应用。本发明首次尝试用复制型人3型腺病毒作为表达载体表达外源蛋白如病毒抗原以制备猪用疫苗。我们构建了多种型别的复制型人腺病毒载体，包括人3型、4型、7型、55型腺病毒载体，在E3区插入外源基因表达框EGFP，并用该四种复制型腺病毒载体感染猪细胞，比较发现人3型腺病毒载体在猪细胞内能够更高效地复制载体基因组，表达外源基因效率更高，且人3型腺病毒载体在猪细胞中产生的感染性子代滴度明显更低。

Description

复制型人3型腺病毒作为表达载体在制备猪用疫苗中的应用
技术领域
本发明涉及动物疫苗领域，特别是涉及一种复制型人3型腺病毒作为表达载体在制备猪用疫苗中的应用。
背景技术
畜牧业在中国农业中占有重要的地位，其中养猪业又是畜牧业中最大的行业。多年来猪肉产量一直居世界零线，中国猪肉的生产、需求和贸易状况对世界猪肉市场有着重要的影响，同时，养猪业也是中国农民收入的一个重要来源。目前，中国生猪饲养从单一的传统农户散养发展到农户散养、专业户饲养和集体规模化饲养3种方式并存。在实际生产过程中根据饲养区域和气候环境的不同，因地制宜而选择适宜的饲养模式。规模化饲养由于猪只集中，这对于控制和消灭传染病带来了有利的条件，但是猪只集中，也造成疫病容易发生的机会。因此，要保证大群猪只的健康，规模化猪场必须坚持“预防为主，防重于治”的方针。
而预防猪群中疾病发生常采用的方式就是疫苗免疫，疫苗是兽医学中最有效的预防工具，传统的疫苗包括灭活疫苗、弱毒疫苗和亚单位疫苗。灭活疫苗也称“死苗”，含有处理过不能复制的微生物，它们不能在细胞质中刺激蛋白产生，因此病毒抗原不能被MHC-I类分子呈递，不能产生细胞毒性CD8+T细胞。弱毒疫苗在诱导包括细胞毒性CD8+T细胞在内很大数量的相关效应机制方面通常效力较高，但弱毒疫苗有时有残余毒力，或通过突变成为有致病性的毒株重新出现。亚单位疫苗本身要比依靠整个微生物制备的疫苗安全，但是他们的免疫原性不强。为了降低免疫成本，理想的疫苗应该具有接种次数较少、免疫持续期较长的优点，且应该安全不引起副反应，以及确保疫苗病毒毒力不会返强。近期已采用基因工程技术改进和设计新型疫苗，例如腺病毒可诱导抗插入外源基因编码抗原的体液、黏膜和细胞免疫应答，已成为表达和运送外源免疫蛋白的候选载体之一，用于开发各种疫苗产品。目前，猪常用疫苗有猪瘟疫苗、猪丹毒疫苗、猪乙型脑炎疫苗、猪细小病毒疫苗、猪O型口蹄疫疫苗、猪圆环病毒疫苗、猪链球菌病疫苗、猪蓝耳病疫苗、猪流感疫苗、猪伪狂犬病疫苗等等
但是，在猪用疫苗领域，目前一般使用复制缺陷型腺病毒如人5型腺病毒作为猪用疫苗载体，这种载体在正常细胞和动物体内其基因组不能复制，导致其表达效率较低，使用剂量较高，因此免疫成本较高。
发明内容
基于此，本发明提供了复制型人3型腺病毒作为表达载体在制备猪用疫苗中的应用，其能够在猪体内更高效地表达外源基因且安全性较高。
本发明通过研究发现多种人B种腺病毒可以感染猪传代、原代细胞，其基因组在猪细胞内能够高效复制，复制效率与人细胞相近，但不能有效产生感染性子代，不能扩散到临近细胞。本发明首次尝试用复制型人3型腺病毒作为表达载体表达外源蛋白如病毒抗原以制备猪用疫苗。由于重组复制型人腺病毒其基因组能够在猪细胞内高效复制，能够更高效的表达外源基因，使用剂量相对复制缺陷型腺病毒载体疫苗可以更少，而同时由于人3型腺病毒载体在猪细胞内不能产生感染性子代病毒，为一过性感染，其安全性可以得到保障。我们构建了多种型别的复制型人腺病毒载体，包括人3型、4型、7型、55型腺病毒载体，在E3区插入外源基因表达框EGFP，并用该四种复制型腺病毒载体感染猪细胞，比较发现人3型腺病毒载体在猪细胞内能够更高效地复制载体基因组，表达外源基因效率更高，且人3型腺病毒载体在猪细胞中产生的感染性子代滴度明显更低。此外，人3型腺病毒主要感染婴幼儿，80％以上的成年人有预存抗人3型腺病毒抗体，对成人一般不致病，猪场是封闭管理，因此用复制型人3型腺病毒作为猪用疫苗载体具有安全性。实验数据表明，在复制型人3型腺病毒载体中插入猪圆环病毒抗原基因表达框，作为疫苗免疫小型猪，能够诱导出更强的抗体应答，产生高水平抗体，低剂量使用即能诱导高效价抗体应答，并表现出高安全性。因此，复制型人3型腺病毒用作猪用疫苗载体有高表达效率、高安全性、低使用剂量的优点。
本发明还提供了一种重组复制型人3型腺病毒，所述重组复制型人3型腺病毒为基因组中插入了猪相关蛋白基因的表达盒的复制型人3型腺病毒，所述猪相关蛋白基因编码的蛋白用于调控猪的免疫状况或生长状况。
在其中一个实施例中，所述猪相关蛋白基因为猪蓝耳病毒抗原基因、猪圆环病毒抗原基因、猪瘟病毒抗原基因、猪生长激素释放素基因或猪干扰素基因。
在其中一个实施例中，所述猪相关蛋白基因为猪圆环病毒2型ORF2基因，序列如SEQ ID NO：1所示。
在其中一个实施例中，所述表达盒所用启动子为CMV启动子。
在其中一个实施例中，所述表达盒所用终止子为SV40终止子。
本发明还提供了一种猪用疫苗，其包括如上所述的重组复制型人3型腺病毒以及佐剂。
在其中一个实施例中，所述佐剂包括稳定剂、络合剂、免疫增强剂和水中的一种或多种。
在其中一个实施例中，所述络合剂选自乙二胺四乙酸和聚丙烯酸钠中的一种或多种。
在其中一个实施例中，所述稳定剂选自可溶性的二价锰盐、二价钙盐、二价锌盐和二价铁盐中的一种或多种。
附图说明
图1为实施例1中四种复制型重组人腺病毒载体感染猪传代细胞PK15的结果，其中左列为可见光镜下的照片，右列为荧光镜下的照片(200X)；
图2为实施例1中四种复制型重组人腺病毒载体感染猪原代肾细胞的结果，其中左列为可见光镜下的照片，右列为荧光镜下的照片(200X)；
图3为实施例1中四种复制型重组人腺病毒载体感染感染猪原代肾细胞的免疫荧光强度检测结果；
图4为实施例1中四种复制型重组人腺病毒载体在各种细胞内的病毒基因组复制结果，其中A为293T细胞内的病毒基因组复制结果，B为PK15细胞内的病毒基因组复制结果，C为猪原代肾细胞内的病毒基因组复制结果；
图5为实施例1中四种复制型重组人腺病毒载体感染293T、PK15细胞后产生的感染性子代病毒滴度结果，其中A为TCID50数据，B为荧光计数数据；
图6为实施例1中rAd3EGFP感染PK15或293T细胞后纯化的病毒颗粒的SDS-PAGE检测结果；
图7为实施例3中重组腺病毒rAd3-PCV、rAd3EGFP、rAd5-PCV免疫小型猪血清抗体滴度的ELISA检测结果；其中A为包被PCV2-ORF2重组蛋白，免疫猪血清2倍梯度稀释，检测总抗体滴度结果，B为包被EGFP重组蛋白，免疫猪血清2倍梯度稀释，检测总抗体滴度结果；
图8为实施例3中不同剂量重组腺病毒rAd3-PCV、rAd5-PCV免疫小型猪血清抗体滴度的ELISA检测结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明提供了复制型人3型腺病毒作为表达载体在制备猪用疫苗中的应用，其能够在猪体内更高效地表达外源基因且安全性较高。
本发明通过研究发现多种人B种腺病毒可以感染猪传代、原代细胞，其基因组在猪细胞内能够高效复制，复制效率与人细胞相近，但不能有效产生感染性子代，不能扩散到临近细胞。本发明首次尝试用复制型人3型腺病毒作为表达载体表达外源蛋白如病毒抗原以制备猪用疫苗。由于重组复制型人腺病毒其基因组能够在猪细胞内高效复制，能够更高效的表达外源基因，使用剂量相对复制缺陷型腺病毒载体疫苗可以更少，而同时由于人3型腺病毒载体在猪细胞内不能产生感染性子代病毒，为一过性感染，其安全性可以得到保障。我们构建了多种型别的复制型人腺病毒载体，包括人3型、4型、7型、55型腺病毒载体，在E3区插入外源基因表达框EGFP，并用该四种复制型腺病毒载体感染猪细胞，比较发现人3型腺病毒载体在猪细胞内能够更高效地复制载体基因组，表达外源基因效率更高，且人3型腺病毒载体在猪细胞中产生的感染性子代滴度明显更低。此外，人3型腺病毒主要感染婴幼儿，80％以上的成年人有预存抗人3型腺病毒抗体，对成人一般不致病，猪场是封闭管理，因此用复制型人3型腺病毒作为猪用疫苗载体具有安全性。实验数据表明，在复制型人3型腺病毒载体中插入猪圆环病毒抗原基因表达框，作为疫苗免疫小型猪，能够诱导出更强的抗体应答，产生高水平抗体，低剂量使用即能诱导高效价抗体应答，并表现出高安全性。因此，复制型人3型腺病毒用作猪用疫苗载体有高表达效率、高安全性、低使用剂量的优点。
本发明一实施例的重组复制型人3型腺病毒，其为基因组中插入了猪相关蛋白基因的表达盒的复制型人3型腺病毒，上述猪相关蛋白基因编码的蛋白用于调控猪的免疫状况或生长状况。
可以理解，上述猪相关蛋白基因编码的蛋白可以是猪相关病毒抗原蛋白、猪源的激素蛋白或其他能够作用于猪的功能蛋白。
在一个具体示例中，上述猪相关蛋白基因为猪蓝耳病毒抗原基因、猪圆环病毒抗原基因、猪瘟病毒抗原基因、猪生长激素释放素基因或猪干扰素基因。可以理解，具体基因不限于此，可根据需要选择。
在一个具体示例中，上述猪相关蛋白基因为猪圆环病毒2型ORF2基因，序列如SEQID NO：1所示。猪圆环病毒是迄今发现的最小的动物病毒之一，现已知PCV有两个血清型，即PCV1和PCV2。PCV1为非致病性的病毒，PCV2为致病性的病毒。PCV2是断奶仔猪多系统衰竭综合征、皮炎与肾病综合征的主要病原。猪圆环病毒属于圆环病毒科圆环病毒属，病毒粒子大小为14～25nm，平均直径17nm，呈对称的二十面体，无囊膜，基因组为单股环状DNA，由脱氧核糖核酸组成，沉降系数为52S。PCV的复制为滚环复制方式，先经过一个双链的复制型(RF)，然后由双链的复制型转录和编码蛋白。PCV对外界的抵抗力较强，该病毒对氯仿不敏感，不凝集牛、羊、猪、鸡等多种动物和人的红细胞。PCV能在PK-15细胞上生长，但不能引起细胞病变，但感染的PK-15细胞内含有许多胞浆内包涵体，少数感染的细胞内含有核内包涵体。PCV-1基因组全长1759bp，PCV-2全长1768bp或1767bp，二者序列同源性小于80％，但PCV-1毒株间的核酸序列同源性大于99％，PCV-2毒株间的核序列同源性大于96％。PCV-1与PCV-2都有读码框ORF1，编码病毒复制蛋白。各毒株间的ORF1编码蛋白质序列间源性大于86％，在PCV各读码框编码的蛋白质中间源性最高。现已经证实，PCV有两个主要的阅读框，ORF1和ORF2，二者在长度上都大于600bp。ORF1是最大的阅读框，编码病毒的复制蛋白(Rep)，分子量大小为37KDa，与病毒的复制转录有关。ORF2编码病毒的结构蛋白，可以与PCV-2的抗血清反应。猪对PCV2具有较强的易感性，感染猪可自鼻液、粪便等废物中排出病毒，经口腔、呼吸道途径感染不同年龄的猪。怀孕母猪感染PCV2后，可经胎盘垂直传播感染仔猪。用PCV2人工感染试验猪后，其他未接种猪的同居感染率是100％，这说明该病毒可水平传播。猪在不同猪群间的移动是该病毒的主要传播途径，也可通过被污染的衣服和设备进行传播。
SEQ ID NO：1：
acgtatccaaggaggcgttaccggagaagaagacaccgcccccgcagccatcttggccagatcctccgccgccgcccctggctcgtccacccccgccaccgttaccgctggagaaggaaaaatggcatcttcaacacccgcctctcccgcaccttcggatatactatcaagaaaaccacagtcagaacgccctcctgggcggtggacatgatgagattcaatattaatgactttcttcccccaggagggggctcaaacccccgctctgtgccctttgaatactacagaataagaaaggttaaggttgaattctggccctgctccccgatcacccagggtgacaggggagtgggctccagtgctgttattctagatgataactttgtaacaaaggccacagccctcacctatgacccctatgtaaactactcctcccgccataccataacccagcccttctcctaccactcccgctactttacccccaaacctgtcctagattccactattgattacttccaaccaaacaacaaaagaaatcagctgtggctgagactacaaactactggaaatgtagaccacgtaggcctcggcactgcgttcgaaaacagtatatacgaccaggaatacaatatccgtgtaaccatgtatgtacaattcagagaatttaatcttaaagaccccccacttaacccttaa
在一个具体示例中，表达盒所用启动子为CMV启动子。在一个具体示例中，表达盒所用终止子为SV40。可以理解，启动子和终止子的具体种类不限于此，可根据需要选择，而且表达盒中还可以含有其他非必须的调控元件。
本发明一实施例的猪用疫苗，其包括如上所述的重组复制型人3型腺病毒以及佐剂。
在一个具体示例中，上述佐剂包括稳定剂、络合剂、免疫增强剂和水中的一种或多种。
可选地，免疫增强剂选自白蛋白多肽、扇贝多肽、赛弗诺多肽、淫羊藿黄酮、金橘黄酮、白花蛇舌草黄酮、大豆黄酮、沙棘黄酮、黄芪多糖、人参多糖、香菇多糖、锦灯笼多糖、灵芝菌丝体多糖、板蓝根多糖、枸杞多糖、当归多糖、灵芝多糖、红景天多糖、大枣多糖和壳聚糖中的一种或多种，能使低下的免疫功能提高，加速诱导免疫应答反应。可选地，稳定剂选自可溶性的二价锰盐、二价钙盐、二价锌盐和二价铁盐中的一种或多种，用来保护活性成分。可选地，络合剂选自乙二胺四乙酸和聚丙烯酸钠中的一种或多种。
在一个具体示例中，猪用疫苗还包括细胞因子，包括但不限于粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素α(IFNα)、干扰素β(IFNβ)、干扰素γ(IFNγ)、白细胞介素-1α(IL-1α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-7(IL-7)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-9(IL-9)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-11(IL-11)、白细胞介素-12(IL-12)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、肿瘤坏死因子β(TNFβ)、聚肌苷酸和聚胞苷酸、胞苷-磷酸-鸟苷寡脱氧核苷酸(CpG ODN)和转化生长因子β(TGFβ)。
在一些具体示例中，上述猪用疫苗可经由饮用水、经口鼻、喷雾剂、气雾剂、鼻内滴注、经皮、皮下或肌肉内注射施用至猪只。优选地，上述猪用疫苗通过经皮、经口鼻、皮下、肌肉内、喷雾剂或饮用水施用。在一些具体示例中，施用为初免-加强(prime-boost)方案，其包括至少一次初步施用和至少一次加强施用。
下面主要结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1复制型人腺病毒载体感染猪细胞
我们制备了复制型人3型、4型、7型、55型腺病毒载体，分别在E3区插入绿色荧光蛋白(EGFP)基因表达框，可以表达EGFP。用这几种复制型腺病毒载体感染猪细胞系PK15及猪原代细胞，对其基因组复制、EGFP表达、产生子代病毒等特性进行分析比较。
首先，我们用这四种复制型腺病毒载体感染猪细胞系PK15，结果如图1所示，发现这四种重组腺病毒接种猪细胞系PK15后都表现出明显病变，荧光显微镜下观察有强荧光。在此基础上，我们制备了五指山小型猪的肺、肾、肝原代细胞，并接种上述四种重组人腺病毒载体。结果如图2所示发现这四种重组腺病毒接种猪原代肾细胞后都表现出明显病变，荧光显微镜下观察有强荧光，且进一步如图3所示，四种重组腺病毒中rAd3EGFP(复制型人3型腺病毒载体)表达最强的EGFP荧光强度。rAd3EGFP接种猪肾、肝、肺原代细胞后均出现了明显病变，肾和肝细胞几乎100％的细胞有病变，肺原代细胞中的上皮型细胞都出现病变和荧光。
为进一步探讨重组腺病毒在猪细胞中的基因组复制情况，收集了感染细胞的病毒，进行Q-PCR检测。如图4所示为用上述四种重组腺病毒感染293细胞、PK15、猪原代肾细胞后的病毒基因组复制增长情况，结果表明尽管四种重组腺病毒中rAd3EGFP在人细胞293T细胞中基因组复制效率不是最高，但是其在感染猪细胞PK15、猪原代肾细胞后均有最高的基因组复制效率、最高的基因组拷贝数。
因此，上述四种复制型重组人腺病毒载体可以感染猪细胞，感染后病毒基因组在细胞内可以高效复制，表达外源基因，其中rAd3EGFP对猪细胞的感染效率最高、基因组复制效率最高。进一步地，如图5所示，我们研究发现四种复制型重组人腺病毒载体感染猪细胞PK15后产生的感染性子代颗粒数相对较低，且rAd3EGFP感染PK15后产生的感染性子代病毒滴度最低，较感染人293T细胞中产生的子代病毒滴度低约200倍。
为探讨rAd3EGFP感染猪细胞后产生成熟的感染性子代病毒能力受限的原因，进一步对PK15培养的rAd3EGFP病毒进行了分析，发现Ad3在PK15中大量培养后进行CsCl密度梯度离心有单一病毒带，不同于在293等细胞中培养的病毒离心后有两条病毒带。电镜检查发现在PK15中纯化的病毒粒子直径较小，仅约64nm，而正常的Ad3腺病毒粒子直径为75nm～80nm。如图6所示，SDS-PAGE电泳发现PK15细胞中纯化的Ad3病毒带型和人细胞如293细胞中纯化的病毒带型有较大差异，PK15细胞中培养的Ad3病毒约110kDa的六邻体条带很弱，说明在rAd3EGFP感染PK15后hexon等病毒衣壳蛋白不能有效表达，导致不能有效包装产生感染性子代颗粒。
综上可知，复制型人3型、4型、7型、55型腺病毒载体都可以感染猪细胞，并且病毒基因组可以在猪细胞中有效复制，但是其中人3型腺病毒载体rAd3EGFP在猪细胞中有最强的感染力、最高的基因组复制效率和外源基因表达效率，且产生的成熟感染性子代病毒滴度最低，因此适合被用作猪用疫苗载体。
实施例2表达猪圆环病毒抗原的重组人3型腺病毒载体rAd3-PCV的构建
(1)合成猪圆环病毒基因PCV-ORF2，PCR扩增，AgeI+HindIII酶切连接到psk-E3LR-CMV-EGFP载体，获得psk-E3LR-CMV-PCV-ORF2，扩增引物及目标序列如下所示。
PCV-ORF2-AgeI-F:GCTAccggtcgccaccatggtgacgtatccaaggaggcgtt
PCV-ORF2-HindIII-R:TCGaagcttttaagggttaagtggggggtc
GCTAccggtcgccaccatggtgacgtatccaaggaggcgttaccggagaagaagacaccgcccccgcagccatcttggccagatcctccgccgccgcccctggctcgtccacccccgccaccgttaccgctggagaaggaaaaatggcatcttcaacacccgcctctcccgcaccttcggatatactatcaagaaaaccacagtcagaacgccctcctgggcggtggacatgatgagattcaatattaatgactttcttcccccaggagggggctcaaacccccgctctgtgccctttgaatactacagaataagaaaggttaaggttgaattctggccctgctccccgatcacccagggtgacaggggagtgggctccagtgctgttattctagatgataactttgtaacaaaggccacagccctcacctatgacccctatgtaaactactcctcccgccataccataacccagcccttctcctaccactcccgctactttacccccaaacctgtcctagattccactattgattacttccaaccaaacaacaaaagaaatcagctgtggctgagactacaaactactggaaatgtagaccacgtaggcctcggcactgcgttcgaaaacagtatatacgaccaggaatacaatatccgtgtaaccatgtatgtacaattcagagaatttaatcttaaagaccccccacttaacccttaaaagcttCGA
(2)pAd3-dE3-egfp用AvrII+RsrII双酶切，回收大片段1；以pAd3-dE3-egfp为模板，pA3-AvrII-F/pA3E-27748-R引物对扩增片段2；以psk-E3LR-CMV-PCV-ORF2为模板，pA3-27742-cmv-F/pA3-RsrII-R引物对扩增片段3；片段1、2、3用exnase体外重组连接，转化TOP10感受态细胞，获得质粒pAd3-dE3-PCV-ORF2。
pA3-AvrII-F:tggccattgtgttctcctaggca
pA3E-27748-R：ggtagtccgtaggagggtctta
pA3-27742-cmv-F：ctcctacggactaccatcgatta
pA3-RsrII-R：gaatttttgtcgctgcggaccgagctc
(3)pAd3-dE3-PCV-ORF2质粒用AsisI酶切线性化后转染293T细胞，培养7～9天，拯救病毒rAd3-PCV，转接293T细胞，大量培养，CsCl梯度离心纯化。与rAd3EGFP相似，rAd3-PCV能够有效感染猪原代细胞，并有效复制基因组，但不能有效包装产生感染性子代病毒。
而目前常用作猪用疫苗载体的复制缺陷型腺病毒如人5型腺病毒载体，需要在互补细胞系如293T细胞中传代培养，在正常细胞和体内由于缺乏E1区基因导致其基因组不能复制，其表达效率较低，使用剂量较高，导致成本高，而且会产生抗载体免疫，再次使用时免疫效果会降低。而复制型人5型腺病毒在猪细胞中能够包装产生感染性子代病毒，产生感染性子代的能力没有受限，不适合作为猪用疫苗载体。例如将PCV-ORF2基因克隆入穿梭载体pAdTrack-CMV(KpnI+HindIII)，与pAdEASY1(本实验室保存)在大肠杆菌BJ5183中同源重组，获得重组质粒pAdEASY-PCV，线性化后转染293T细胞拯救制备了复制缺陷型重组腺病毒rAd5-PCV，该载体只能在互补细胞293T中复制，在正常细胞内基因组不能复制。rAd5-PCV基因组中同时插入了EGFP表达框，可以表达EGFP荧光蛋白。
实施例3重组人腺病毒免疫模型猪
将纯化的上述rAd3-PCV、rAd3EGFP、rAd5-PCV，以肌注和喷鼻两种免疫方式，注射量1×1010VPs/只动物，免疫五指山小型猪两次，每次免疫前、最后一次免疫后14天采集血清，间接ELISA检测抗体应答。结果如图7A所示，表明rAd3-PCV相对rAd5-PCV能够诱导出更高滴度的PCV特异性抗体，如图7B所示，rAd3-EGFP相对rAd5-PCV能够诱导出更高滴度的EGFP特异性抗体。进一步如图8所示，特别是以低剂量肌注免疫时，rAd3-PCV仍能有效诱导高滴度抗体产生，相较rAd5-PCV诱导产生更高滴度抗体，即rAd3-PCV可以用更低的免疫剂量产生高效免疫应答，具有更好的经济性。用定量PCR进行检测，rAd3-PCV肌注动物各脏器如肺、肝、肾、脑等组织中未检测到腺病毒；HE染色病理检查各组织未发现显著组织病变，提示rAd3-PCV候选猪用疫苗具有高安全性。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州市华南医学研究中心
<120> 复制型人3型腺病毒作为表达载体在制备猪用疫苗中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 699
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acgtatccaa ggaggcgtta ccggagaaga agacaccgcc cccgcagcca tcttggccag 60
atcctccgcc gccgcccctg gctcgtccac ccccgccacc gttaccgctg gagaaggaaa 120
aatggcatct tcaacacccg cctctcccgc accttcggat atactatcaa gaaaaccaca 180
gtcagaacgc cctcctgggc ggtggacatg atgagattca atattaatga ctttcttccc 240
ccaggagggg gctcaaaccc ccgctctgtg ccctttgaat actacagaat aagaaaggtt 300
aaggttgaat tctggccctg ctccccgatc acccagggtg acaggggagt gggctccagt 360
gctgttattc tagatgataa ctttgtaaca aaggccacag ccctcaccta tgacccctat 420
gtaaactact cctcccgcca taccataacc cagcccttct cctaccactc ccgctacttt 480
acccccaaac ctgtcctaga ttccactatt gattacttcc aaccaaacaa caaaagaaat 540
cagctgtggc tgagactaca aactactgga aatgtagacc acgtaggcct cggcactgcg 600
ttcgaaaaca gtatatacga ccaggaatac aatatccgtg taaccatgta tgtacaattc 660
agagaattta atcttaaaga ccccccactt aacccttaa 699

Claims (4)

1.一种重组复制型人3型腺病毒作为表达载体在制备猪用疫苗中的应用，其特征在于，所述重组复制型人3型腺病毒为基因组中插入了猪相关蛋白基因的表达盒的复制型人3型腺病毒，所述猪相关蛋白基因编码的蛋白用于调控猪的免疫状况或生长状况，所述猪相关蛋白基因为猪圆环病毒2型ORF2基因，序列如SEQ ID NO：1所示，所述表达盒所用启动子为CMV启动子，所述表达盒所用终止子为SV40终止子；所述猪用疫苗包括重组复制型人3型腺病毒以及佐剂。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述佐剂包括稳定剂、络合剂、免疫增强剂和水中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述络合剂选自乙二胺四乙酸和聚丙烯酸钠中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述稳定剂选自可溶性的二价锰盐、二价钙盐、二价锌盐和二价铁盐中的一种或多种。
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