TW202104246A - 純化肉毒桿菌毒素的方法 - Google Patents
純化肉毒桿菌毒素的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- TW202104246A TW202104246A TW109112678A TW109112678A TW202104246A TW 202104246 A TW202104246 A TW 202104246A TW 109112678 A TW109112678 A TW 109112678A TW 109112678 A TW109112678 A TW 109112678A TW 202104246 A TW202104246 A TW 202104246A
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- botulinum toxin
- column
- item
- patent application
- scope
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/32—Bonded phase chromatography
- B01D15/325—Reversed phase
- B01D15/327—Reversed phase with hydrophobic interaction
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
- B01D15/361—Ion-exchange
- B01D15/362—Cation-exchange
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
- B01D15/361—Ion-exchange
- B01D15/363—Anion-exchange
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/18—Ion-exchange chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/20—Partition-, reverse-phase or hydrophobic interaction chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
- C12Y304/24069—Bontoxilysin (3.4.24.69), i.e. botulinum neurotoxin
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本發明公開一種用於純化一肉毒桿菌毒素的方法,該方法包括:(a)預先處理含有一肉毒桿菌毒素的一培養基溶液、(b)利用陽離子交換層析法來純化預先處理完成的該肉毒桿菌毒素、(c)使用疏水層析法來純化該肉毒桿菌毒素,以及(d)使用陰離子交換層析法萃取該肉毒桿菌毒素。該方法能夠純化高純度和高活性的一肉毒桿菌毒素,因此可用於肉毒桿菌毒素的生產。
Description
本發明涉及一種用於純化一肉毒桿菌毒素的方法,更具體地涉及一種透過陽離子交換層析法、疏水層析法(hydrophobic chromatography)和陰離子交換層析法的一簡單程序就能夠得到一高純度和活性的肉毒桿菌毒素的純化方法。
肉毒桿菌毒素是由丁酸梭菌(Clostridium butyricum
)、巴氏梭菌(Clostridium baraffi
)、肉毒桿菌(Clostridium botulinum
)等細菌產生的一種神經毒蛋白。肉毒桿菌毒素可阻斷神經肌肉的傳導,造成人類和動物的神經麻痺疾病。特別地,A型肉毒桿菌毒素對於人類而言具有很強的致死性。除了A型肉毒桿菌毒素,還有B型、C1型、D型、E型、F型、G型和H型等6種鑑定出的肉毒桿菌毒素。每一種肉毒桿菌毒素的類型都可以透過相應的類型特異性抗體來區分,不同種類的肉毒桿菌毒素所造成的麻痹的嚴重程度和受其影響的動物種類不同。
肉毒桿菌毒素的蛋白分子的分子量約為150kD,包括一條約為50kD的輕鏈和一條與該輕鏈共軛的重鏈,該重鏈約為100kD。然而,從肉毒桿菌釋放的肉毒桿菌毒素是以150kD的毒素蛋白與至少一種非毒素蛋白的複合物的形式釋放的。例如,肉毒桿菌毒素以900kD、500kD和300kD的複合物形式釋放。
肉毒桿菌毒素對於人類而言可能是非常致命的,但最近開發出的肉毒桿菌毒素可以治療多種症狀,包括以骨骼肌過度活動(skeletal muscle hyperactivity)為特徵的神經肌肉疾病。例如,Botox®
是Allergan公司商業化開發的一個肉毒桿菌毒素A的商標,用於緩解或治療眼瞼痙攣、斜視、頸椎肌張力障礙和眉間(面部)皺紋,目前正在研究開發適用於其他血清型的應用以及在臨床上利用這些血清型。
臨床使用的肉毒桿菌毒素一般是從細胞培養物中分離出來的。在這種情況下,使用了多種純化方法。
例如,肉毒桿菌毒素透過一系列的沉澱和切向流過濾步驟(tangential flow filtration steps)以一復合形式來進行純化[參見: Schantz E.J.等人,Microbiol. Rev.
1992年3月,56(l):80-99]。然而,這個方法通常提供低於約10%的一相對低的產率。其他使用的方法包括粒徑篩析層析法、離子交換法和/或親和性層析法[參見:例如,Schmidt J.J.等人,Anal. Biochem.
156:213,1986年;Kannan K.等人,Mov. Disord.
2000;15(Suppl 2):20(2000);Wang Y. C.,Dermatol. Las. Faci. Cosm. Surg.
2002:58 ,2002;和美國專利第2003/0008367號]。
另一種方法是透過重組方法獨立合成肉毒桿菌毒素的重鍊或輕鏈之一,而不是合成具有生物活性的完整的肉毒桿菌毒素蛋白[參見,例如,Zhou L.等人,Biochemistry
,34(46):15175,(1995年);和Johnson S.K.等人,Protein Expr. and Purif.
;32:1-9,(2003年)]。然而,這些方法不利地需要另外的步驟,即重新形成一完整且具有生物活性的肉毒桿菌毒素蛋白。
最近的方法涉及使用疏水相互作用的層析法、混合模式和/或離子交換層析法來純化作為複合物的肉毒桿菌毒素(參見:美國專利第7,452,697號和第7,354,740號)。
然而,在技術領域中仍然需要一種用於分離穩定且具有生物活性的完整肉毒桿菌毒素的改良的純化方法。相應地,經由廣泛努力,本發明人開發了一種利用簡化方式分離高純度和活性的肉毒桿菌毒素的純化方法,本發明人發現,可以使用陽離子交換層析法、疏水層析法和陰離子交換層析法的簡化流程來純化高純度和活性的肉毒桿菌毒素,特別地,使用一SP管柱作為一陽離子交換樹脂、使用一苯基管柱作為一疏水性樹脂以及使用一Q管柱作為一陰離子交換樹脂,可以將一肉毒桿菌毒素純化至99%或以上的純度。基於該發現,本發明已經完成。
先前技術:
專利文件:美國專利公開第2003/0008367號、美國專利第7,452,697號、美國專利第7,354,740號;
非專利文件:Schantz E J等人,肉毒桿菌毒素和其他微生物神經毒素在醫學上的特性和用途,Microbiol. Rev. 1992年3月;56(l):80-99;
Schmidt J.J.等人,利用高效離子交換層析法純化E型肉毒桿菌神經毒素,Anal. Biochem. 1986年7月; 156(1):213-219;
Kannan K.等人,NeuroBloc(B型肉毒桿菌毒素)的生化評估方法的開發。Mov. Disord. 2000年;15(Suppl 2):20;
Wang Y. C.,用於注射的A型肉毒桿菌毒素(BTXA)的製備、品質和其臨床用途,Dermatol. Las. Faci. Cosm. Surg. 2002年;58;
Zhou L.等人,A型肉毒桿菌神經毒素的輕鏈的表達和純化:在與重鏈重組後,單突變消除了其對SNAP-25的切割和神經毒性,生物化學,1995年;34(46):15175-81;
Johnson S.K.等人,嗜甲醇酵母菌中表達的肉毒桿菌神經毒素血清型F的重組重鏈片段C的發酵和純化的規模化研究,蛋白實驗和純化,2003年;32:1-9。
因此,針對上述問題,本發明的目的是使用一種簡單流程來純化具有高純度和活性的肉毒桿菌毒素的方法。
根據本發明的一個方面,上述和其他目的可以透過一種純化肉毒桿菌毒素的方法來達成,該方法包括:(a)預先處理含有一肉毒桿菌毒素的一培養基溶液;(b)利用陽離子交換層析法來純化預先處理完成的該肉毒桿菌毒素;(c)利用疏水層析法來純化該肉毒桿菌毒素以及(d)利用陽離子交換層析法來純化該肉毒桿菌毒素。
本發明的效果:本發明可以提高純化後的肉毒桿菌毒素的純度,並且可以僅使用包括陽離子交換層析法、疏水層析法和陰離子交換層析法的一簡單流程來維持肉毒桿菌毒素的活性,因此可用於肉毒桿菌毒素的生產。
除非另有定義,否則本文中使用的所有技術和科學術語具有與本發明所涉及的領域的通常知識者所理解含義相同的含義。一般來說,本文使用的命名法是本領域中眾所周知的,並且也是常用的。
在本發明中,確定的是當透過使用一系列的陽離子交換層析法(cation exchange chromatography)、疏水層析法(hydrophobic chromatography)和陰離子交換層析法(anion exchange chromatography)的純化過程來純化肉毒桿菌毒素培養液時,與透過常規方法製備的肉毒桿菌毒素相比,可以分離並純化出約900 kDa的一均勻形式的肉毒桿菌毒素。特別地,確定的是當使用一SP管柱作為一陽離子交換樹脂、一苯基管柱作為一疏水樹脂以及使用一Q管柱作為一陰離子交換樹脂時,肉毒桿菌毒素可以純化到99%或更高的純度。
因此,根據本發明的一個方面,本發明涉及一種純化一肉毒桿菌毒素的方法,該方法包括:(a)預先處理含有一肉毒桿菌毒素的一培養基溶液;(b)利用陽離子交換層析法來純化預先處理完成的該肉毒桿菌毒素;(c)利用疏水層析法來純化該肉毒桿菌毒素;以及(d)利用陽離子交換層析法來純化該肉毒桿菌毒素。
在本發明中,該陽離子交換樹脂較佳地為一SP管柱,該疏水層析樹脂較佳地為一苯基管柱,以及該陰離子交換樹脂較佳地為一Q管柱。
在本發明中,該SP管柱是填充有包含一磺丙基官能基(sulfopropyl functional group)的材料的一管柱,該苯基管柱是填充有包含一苯基(phenyl group)的材料的一管柱,以及該Q管柱是填充有包含一四級銨(Q)官能基的材料的一管柱。
在本發明的步驟(a)中,含有肉毒桿菌毒素的培養液可以是使用本領域公知的常規方法獲得的肉毒桿菌菌株的培養液,也可以是透過使用用於培養的一常規培養基來進行培養而獲得含有肉毒桿菌毒素的培養液,特別地,使用不包括動物來源的成分的一培養基,較佳地為例如:一PYG培養基(包含3%的馬鈴薯蛋白腖、1%的酵母萃取物和1%的葡萄糖)。
本發明中使用的產生毒素的肉毒桿菌菌株可以是肉毒桿菌或其變種,最佳的菌株是A型肉毒桿菌、NCTC13319,但不限於上述的菌株。對於本領域中具有通常知識者而言,顯然可以使用任何能夠產生肉毒桿菌毒素的菌株。
在一個具體的實施例中,本發明的步驟(a)中的該培養液的預先處理可以是經過滅菌(例如:透過深度過濾和/或滅菌過濾)的培養液的酸沉澱或超濾,但不限於上述的方式。
酸沉澱可以是使用硫酸的沉澱或使用鹽酸的沉澱,但不限於此。即,本發明的步驟(a)中的酸沉澱可以是在一個實施例中使用酸(例如:硫酸)或在另一個實施例中使用鹽酸對含有肉毒桿菌毒素的培養液進行酸沉澱,在完成培養之後,將pH值調節至3.0至4.5,較佳的pH值為為3.3至4.0,以及最佳的pH值為3.4至3.6。
超濾膜(ultrafiltration membrane)可以是一盒型膜或一中空纖維膜,但不限於此。即,在本發明的步驟(a)中,該超濾可以是使用尺寸為50kDa至500kDa,較佳地為100kDa至300kDa的膜來進行超濾,從而收集含有一肉毒桿菌毒素的培養液。
此外,可以選擇性地使用去氧核糖糖酸酶(DNase)、核糖糖酸酶(RNase)、核酸酶和/或全能核酸酶(Benzonase)以便在預先處理期間去除核酸,但是本發明不限於使用上述多種酶。
為了增加所得肉毒桿菌毒素的純度,本發明可以包括額外的純化步驟。本發明中的純化是從酸沉澱中去除雜質的步驟,並且可以透過常規方法來進行,例如:已知的微過濾、超過濾、精密過濾或深度過濾。在本發明的一個實施例中,可以使用0.1至0.4微米的中空纖維膜來進行微過濾。
在本發明的步驟(b)中,該陽離子交換層析法包括將溶解在一緩衝液中的預先處理完成的肉毒桿菌毒素與一陽離子交換層析管柱結合,該緩衝液具有一合適的濃度和pH值以使該肉毒毒素與該管柱結合,然後使用具有增加鹽濃度的一緩衝液來進行洗脫。在該陽離子交換層析法中,去除了一非複合形式的一肉毒桿菌毒素。
在本發明的一種用於純化肉毒桿菌毒素的方法中,較佳地,用於陽離子交換層析的管柱為填充有一樹脂(具有一官能基)的一管柱,該管柱是選自於由羧甲基(CM)、磺乙基(SE)、磺丙基(SP)、磷酸鹽(P)和磺酸鹽(S)所組成的群組。
在本發明中,從去除雜質並保持該肉毒桿菌毒素的高活性的觀點來看,陽離子交換層析法可以使用一SP管柱,較佳的SP管柱為一SP瓊脂糖HP管柱(SP sepharose HP column)、SP瓊脂糖FF管柱、卡普托S管柱(Capto S column)或其相似物,並且更佳地為一SP瓊脂糖HP管柱,但不限於此。
在本發明中,該SP瓊脂糖HP管柱是填充含有一磺丙基官能基的一樹脂的一管柱,該樹脂具有一6%的球形交聯瓊脂糖基質形式,並且基於核糖核酸酶A,具有55毫克/毫升的一DBC,粒徑為34微米。
步驟(b)中的該肉毒桿菌毒素溶解在一pH值為4.5至5.3的一10至30毫莫耳的檸檬酸鈉緩衝液中,然後注入該SP管柱中。
利用一pH值為4.5至5.5的一10至30毫莫耳的檸檬酸鈉緩衝液來洗脫步驟(b)中的該肉毒桿菌毒素,該檸檬酸緩衝液補充有0.5至1.5莫耳的氯化鈉,但不限於此。
在本發明的步驟(c)中,該疏水層析法包括將溶解於一緩衝液經由步驟(b)的該陽離子交換層析法而洗脫的含有一肉毒桿菌毒素的溶液與一疏水層析管柱結合,該緩衝液具有一適合的濃度以及使該溶液結合到該疏水層析管柱的pH值,並且使用具有一增加的鹽濃度的一緩衝液來進行洗脫。在該疏水層析法中,進一步去除非複合形式的一肉毒桿菌毒素。
在本發明的用於純化肉毒桿菌毒素的方法中,用於疏水層析法的該管柱是填充有一樹脂的一管柱,該樹脂具有一官能基,該官能基選自於由乙醚、異丙基、丁基、辛基和苯基所組成的群組,但不限於此。
在本發明中,為了有效分離該非複合的蛋白質,可以使用一苯基管柱來進行該疏水層析法,較佳地為一苯基瓊脂糖HP管柱、一苯基瓊脂糖FF(快速流動)管柱、一卡普托苯基管柱或其相似物,並且更佳地為一苯基瓊脂糖HP管柱,但不限於此。
在本發明中,該苯基瓊脂糖HP管柱是填充一樹脂的一管柱,該樹脂具有6%的高度交聯的瓊脂糖基質形式並且具有25微莫耳苯基/毫升的取代度和一粒徑為34微米。
在步驟(c)中,該肉毒桿菌毒素溶於一pH值為5.7至6.7的一30至70毫莫耳的磷酸鈉緩衝液中,其中該磷酸鈉緩衝液補充有1.8至2.2莫耳的氯化鈉,並且該磷酸鈉緩衝液可注入一苯基管柱中,但不限於此。
在步驟(c)中,利用一pH值為5.7至6.7的一30至70毫莫耳的磷酸鈉緩衝液來洗脫步驟(c)中的該肉毒桿菌毒素,但不限於此。
在步驟(d)中,該陰離子交換層析法包括將溶解於一緩衝液經由該疏水層析法而洗脫的該肉毒桿菌毒素與一陰離子交換層析管柱結合,該緩衝液具有一適合的濃度以及使該肉毒桿菌毒素結合到該管柱的pH值,並且使用具有一增加的鹽濃度的一緩衝液來進行洗脫。在該陰離子交換層析法中,去除其他雜質並且增加900kDa的肉毒桿菌毒素的純度。
在本發明的用於純化肉毒桿菌毒素的方法中,用於該陰離子交換層析法的該管柱是填充有一樹脂的一管柱,該樹脂具有一官能基,該官能基選自於由二乙氨乙基(DEAE)、四氨基乙基(QAE)和四級銨(Q)所組成的群組,但不限於此。
在本發明中,為了去除其他雜質並且特別增加900kDa的肉毒桿菌毒素的純度,可以使用一Q管來進行該陰離子交換層析法,較佳地為一卡普托Q伊普瑞斯管柱(Capto Q ImpRes column)、托以爾波超級Q650M管柱(Toyopearl Super Q 650M column)、一Q瓊脂糖FF管柱(Q sepharose FF column)、一Q 瓊脂糖高性能管柱(Q Sepharose HP)或其相似物,並且更加地為一卡普托Q伊普瑞斯管柱。
本發明中使用的該卡普托Q伊普瑞斯管柱是填充有一樹脂的一管柱,該樹脂具有一高流動性的瓊脂糖基質(包含四級銨(Q)的官能基),基於BSA的總離子容量為0.15至0.18毫莫耳(Cl-)/毫升,以及一粒徑為40微米。
在步驟(d)中,該肉毒桿菌毒素溶於一pH值為5.7至6.7的一40至60毫莫耳的磷酸鈉緩衝液中,然後注入一Q管柱中,但不限於此。
在步驟(d)中,可以用一pH值為5.7至6.7的一40至60毫莫耳的磷酸鈉緩衝液來洗脫該肉毒桿菌毒素,該緩衝液補充有0.8至1.2莫耳的氯化鈉,但不限於此。
經由上述方法純化的肉毒桿菌毒素可以是純度至少為99%的A型肉毒桿菌毒素,並且純化的肉毒桿菌毒素可以具有比透過常規方法純化的肉毒桿菌毒素更高的純度。
該肉毒桿菌毒素可衍生自A型肉毒桿菌、NCTC13319,但不限於上述的菌株。
如本文所用,術語「分餾(fraction)」是指包含至少一個目標分子的一組穿透物質(passing-through substances),透過一分離方法分離和收集各別的目標分子,其中生物藥劑中包含該至少一個目標分子(例如:肉毒桿菌毒素)和一種或多種雜質,該生物藥劑穿過結合到一種或多種雜質的一物質,並且該目標分子通常不與該物質結合(即,流經該物質)或與該雜質結合,然後被洗脫。
如本文所用,術語「純化(purification)」是指透過從某種物質中去除共存的雜質來提高純度的操作,並且在本說明書中,純化是指從一肉毒桿菌的培養物中分離出當生長過度的肉毒桿菌死亡時產生的肉毒桿菌毒素,以及是指在肉毒桿菌毒素生產過程中提高純度的過程。
例子:在下文中,將參考多個例子以更詳細地描述本發明。然而,對於本領域的通常知識者而言,顯而易見的是提供的這些例子僅利用舉例的方式來說明本發明,而不應解釋為限制本發明的範圍。
例子1:樣品和實驗材料的製備
1-1、樣品製備
本發明中使用的肉毒桿菌菌株是A型肉毒桿菌、NCTC13319,並且該菌株主要接種到500毫升的PYG培養基(馬鈴薯蛋白腖3%、酵母萃取物1%、葡萄糖1%)中,並且在厭氧條件下於34±1°C在ReadytoProcess WAVE 25培養箱中放置12到24小時。培養後,當該菌株的生長達到對數期時,將100毫升的菌株接種到5公升的PYG培養基中,並在厭氧條件下在ReadytoProcess WAVE 25培養箱中培養40至72小時。使用一滅菌過濾器對該培養液進行滅菌,僅回收該培養液。使用3N的硫酸將該培養液滴定至pH值為3.5,觀察沉澱,然後將實驗結果以冷藏狀態保存16小時或以上。
1-2、實驗材料的製備
本發明的實驗材料如下:純淨水(超純水或品質等於或高於超純水的水)、丁基瓊脂糖HP(GE Healthcare,175432)、Q-瓊脂糖-HP(GE Healthcare,171014)、苯基瓊脂糖HP(GE Healthcare,171082)、 Q-瓊脂糖-FF(GE Healthcare,170510)、SP-瓊脂糖-FF(GE Healthcare,170729)、DEAE-FF(GE Healthcare,170709)、SP-瓊脂糖-HP(GE Healthcare,171087)、卡普托Q伊普瑞斯管柱(GE Healthcare,175470)、檸檬酸(Merck,1.37002.5000)、脫水檸檬酸三鈉(Merck,1.37042.5000)、磷酸二氫鈉(Merck,1.06349.1000)、磷酸氫二鈉(Merck,1.06585)以及氯化鈉(Merck,1.37017.5000)。
例子2:肉毒桿菌毒素的純化
2-1、微過濾
微過濾設備,打開AKTA flux 6切向流過濾系統(GE Healthcare),並且將0.2 微米的中空纖維連接至該過濾系統。將5公升的蒸餾水加入該微過濾系統中,並且以0.3巴的TMP將設備和中空纖維洗滌兩次。將例子1-1中製備的5公升的肉毒桿菌毒素培養液的該硫酸沉澱物注入該微過濾設備中,並在0.3的TMP下以兩步驟濃縮至1公升,並且在將2公升的DW添加至該濃縮物之後,重複5次以進一步從3公升濃縮至1公升。加入500毫升的200毫莫耳的檸檬酸鈉(pH值為5.5),並透過循環萃取1小時30分鐘。經由該微過濾設備的一滲透線(permeate line)回收該萃取物,並將300kDa切斷的中空纖維連接到該微過濾設備。將萃取物加入該微過濾設備中,並以0.3巴的一TMP濃縮至500毫升、回收並在4°C下保存。
2-2、陽離子交換層析法
將SP-HP樹脂堆疊在一HiScale 50/20管柱(GE Healthcare,28964445)中,堆疊的一高度為8至12公分,並且安裝在一AKTA純化系統中。經由流動一平衡/洗滌緩衝液(20毫莫耳的檸檬酸鈉,pH值為4.8)來平衡該管柱。利用1莫耳的檸檬酸將例子2-1中製備的樣品的pH值調節至4.8,並在2,000毫升的蒸餾水中稀釋5倍。以15毫升/分鐘的速度注入該樣品。注入樣品後,利用380毫升的平衡/洗滌緩衝液(20毫莫耳的檸檬酸鈉,pH值為4.8)來洗滌該管柱。洗滌後,根據步驟(1)5 CV、30%的梯度(線性梯度)和步驟(2)3 CV、100%的梯度(階段式梯度)注入該平衡/洗脫緩衝液,並且依序獲得多個50毫升的分餾物(參見表1)。依序獲得總共31個分餾物,並透過SDS-PAGE鑑定每個分餾物。
表1
管柱樹脂 | SP瓊脂糖HP |
管柱容積 | 190毫升 |
結合和洗滌緩衝液 | 20毫莫耳的檸檬酸鈉,pH值為4.8 |
洗脫緩衝液 | 20毫莫耳的檸檬酸鈉/1莫耳的氯化鈉,pH值為4.8 |
結果如圖1所示。從總共31個分餾物的分餾物10至21中檢測到HA33,並從相應分餾物中純化出900kDa的複合物形式的肉毒桿菌毒素。
2-3、疏水層析法
將苯基-HP樹脂堆疊在一HiScale 26/20管柱(GE Healthcare,28964514)中,堆疊的高度為7至11公分,並且安裝在AKTA純化系統中。經由流動一平衡/洗滌緩衝液(50毫莫耳的磷酸鈉、2莫耳的氯化鈉,pH值為6.2)來平衡該管柱。收集到總共600毫升從例子2-2的該SP瓊脂糖HP管柱洗脫的分餾物10至21,並且利用1莫耳的磷酸氫二鈉溶液將pH值調節至6.2。在pH值為6.2的情況下,以8毫升/分鐘的速度注入添加了600毫升的50毫莫耳的磷酸鈉和4莫耳的氯化鈉的樣品。注入後,利用94毫升的平衡/洗滌緩衝液(50毫莫耳的磷酸鈉,2莫耳的氯化鈉,pH值為6.2)來洗滌管柱。洗滌後,根據步驟(1)10 CV、100%的梯度(線性梯度)和步驟(2)3 CV、100%的梯度(階段式梯度)注入該平衡/洗脫緩衝液,並且依序獲得總共27個23毫升的分餾物,並透過SDS-PAGE來鑑定每個分餾物。
表2
管柱樹脂 | 苯基瓊脂糖HP |
管柱體積 | 47毫升 |
結合和洗滌緩衝液 | 50毫莫耳的磷酸鈉/2莫耳的氯化鈉,pH值為6.2 |
洗脫緩衝液 | 50毫莫耳的磷酸鈉,pH值為6.2 |
結果如圖2所示,在總共27個分餾物中,從分餾物16至23中檢測出900kDa的複合肉毒桿菌毒素。
2-4、陰離子交換層析法
將卡普托Q伊普瑞斯樹脂(樹脂)堆疊在一Omnifit 6.6/25管柱(Diba,006EZ0625AA)中,堆疊的高度為8至12公分,並且安裝在AKTA純化系統中。從例子2-3的該苯基瓊脂糖HP管柱中洗脫的分餾物16至23共168毫升,使用一透析膜(Spectra/Por,132680),利用50毫莫耳的磷酸鈉(pH值為6.2)緩衝液進行100次透析過濾(DF)。經由流動一平衡/洗滌緩衝液(50 毫莫耳的磷酸鈉,pH值為6.2)來平衡該管柱。以1毫升/分鐘的速度注入例子2-3中製備的樣品。注入後,利用18毫升的平衡/洗滌緩衝液(50毫莫耳的磷酸鈉,pH值為6.2)來洗滌管柱。洗滌後,根據步驟(1) 2 CV、15%的階段式梯度、步驟(2) 2 CV、20%的階段式梯度、步驟(3)2 CV、30%的階段式梯度和步驟(4)2 CV、100%的階段式梯度注入一平衡/洗脫緩衝液,並且進行洗脫。依序獲得總共29個1毫升的分餾物,並透過SDS-PAGE來鑑定每個分餾物。
表3
管柱樹脂 | 卡普托Q伊普瑞斯 |
管柱體積 | 3.6毫升 |
結合和洗滌緩衝液 | 50毫莫耳的磷酸鈉,pH值為6.2 |
洗脫緩衝液 | 50毫莫耳的磷酸鈉/1莫耳的氯化鈉,pH值為6.2 |
結果如圖3所示,在總共29個分餾物中,在分餾物7至10中檢測到不含雜質(紅色圓圈)的900kDa的一複合肉毒桿菌毒素。
例子3、標準產品與純化產品的比較
將例子2中純化的含有肉毒桿菌毒素的分餾物7至10和一市售的肉毒桿菌毒素C-BoNT / A1(目錄號3102,miprolab)在50毫莫耳的磷酸鈉緩衝液(pH值為6.2)中分別稀釋至1毫克/毫升的濃度。在表4所示的還原和非還原條件下製備用於上樣(loading)的樣品。在具有4至20%順式甘胺酸(Invitrogen,NP04200BOX)的10孔Novex楔型孔盤中對樣品進行電泳,添加約30毫升的Instant Blue染色試劑,並在振盪器上染色60分鐘。完全去除染色試劑,在振盪器上將樣品洗滌5次或更多次,並且在振盪器上添加約30毫升的純淨水,持續30分鐘。當背景(background)被充分去除並且可以檢測到條帶(band)時,使用圖像分析儀分析凝膠。
表4
還原條件 | 非還原條件 | |
肉毒桿菌毒素(1毫克/毫升) | 3微升 | 3微升 |
LDS樣品緩衝液(4x) | 5微升 | 5微升 |
樣品還原劑(10x) | 2微升 | 0微升 |
純淨水 | 10微升 | 12微升 |
總容積 | 20微升 |
結果如圖4所示,經由本發明的純化方法純化的肉毒桿菌毒素在與市售肉毒桿菌毒素相同的位置被鑑定,這表明本發明的純化方法只能準確地純化感興趣的目標蛋白。
例子4、本發明的肉毒桿菌毒素的標準產物和純化產物之間活性的比較
比較經由例子2純化的該肉毒桿菌毒素和一市售的肉毒桿菌毒素Botoxin(Allergan公司,100單位)之間的活性。
根據每個樣品的濃度,將每個樣品首先稀釋2×105
至3×105
倍,然後將1.45毫升的樣品在4.4毫升的生理鹽水中稀釋。以上述相同的方式稀釋10組後,將0.1毫升的樣品以腹膜內注射的方式注射到每組10隻的雌性ICR小鼠(18至22克)中,並檢測3天的致死率。透過概率統計分析獲得LD50
。
結果顯示,由本發明純化的1奈克的該肉毒桿菌毒素和Allergan公司的該肉毒桿菌毒素的活性分別為40.73單位和25.32單位,並且根據本發明的純化方法可以在不降低肉毒桿菌的活性的情況下進行。
例子5、純度與其他公司的純化流程的比較
本發明分析了根據由肉毒桿菌毒素的領先製造商Allergan公司提交的韓國專利申請第10-2013-0092024號中描述的純化方法,以及利用該方法純化的肉毒桿菌毒素的純度。結果, 如圖5所示,除了主峰外,還檢測到較小的雜質,並且900 kDa的蛋白質並沒有與150 kDa、300 kDa或500 kDa的蛋白質有效分離。
此外,分析了根據Allergan公司提交的美國專利申請第11 / 932789號的純化方法純化的肉毒桿菌毒素的純度。結果,除了主峰之外,還檢測到較大的雜質,如圖6所示。這意味著形成了不希望的沉澱物,並且可以預期純化過程會影響蛋白質結構。
另一方面,從圖7的結果可以看出,本發明僅能特異性純化約900kDa的毒素,並且純化過程中毒素的修飾也減至最小。
在表5所示的條件下,透過HPLC來分析純化的肉毒桿菌毒素的純度。
表5
項目 | 條件 |
管柱 | PROTEIN KW-804 |
尺寸 | 8毫米 × 300毫米 |
固定相 | 用於層析法R的矽膠 (7微米) |
溫度 | 25℃ |
流動相 | 50毫莫耳的磷酸鈉,pH值為6.0,0.15 莫耳的氯化鈉 |
流動速率 | 1.0毫升/分鐘 |
運行時間 | 30分鐘 |
檢測器 | UV檢測器,278奈米 |
注射量 | 20 微升 |
例子6、先前專利中的三步驟層析法與本發明的純化流程的比較
比較了先前公開的專利(美國專利公開第2019-0201505號和美國專利第7,452,697號)中使用用於純化肉毒桿菌毒素的樹脂的純化方法和本發明中使用不同類型的樹脂的純化方法的純度和滴定量(表6)。
根據表5的方法,透過HPLC來檢測純度,並基於一小鼠試驗以蛋白質濃度為1毫克/毫升的3天死亡小鼠的數量的結果,使用CombiStats透過Probit統計分析來計算滴定量。
表6
第一管柱的樹脂 | 第二管柱的樹脂 | 第三管柱的樹脂 | |
本發明 (實驗例子) | SP瓊脂糖HP | 苯基瓊脂糖HP | 卡普托Q伊普瑞斯 |
美國專利2019-0201505 (比較例子1) | 丁基瓊脂糖HP | Q瓊脂糖HP | 苯基瓊脂糖HP |
US 7452697 (比較例子 2) | Q瓊脂糖FF | 丁基瓊脂糖HP | SP瓊脂糖HP |
實驗例子和比較例子中分別使用的管柱的類型和純化條件示於表7至表8中。
表7
比較例子1(丁基-HP→Q-HP→苯基-HP)
管柱 | 丁基-HP (直徑:0.66公分,高度:12公分) |
管柱容積 | 4.11毫升 |
結合和洗滌緩衝液 | 50毫莫耳的磷酸鈉/2莫耳的氯化鈉,pH值為6.2 |
洗脫緩衝液 | 50毫莫耳的磷酸鈉,pH值為6.2 |
洗脫狀態 | 2至0莫耳的氯化鈉 10CV,0莫耳的氯化鈉 5CV |
管柱 | Q-HP (直徑:0.66公分,高度:10公分) |
管柱容積 | 3.42毫升 |
結合和洗滌緩衝液 | 50毫莫耳的磷酸鈉,pH值為6.0 |
洗脫緩衝液 | 50毫莫耳的磷酸鈉/1莫耳的氯化鈉,pH值為6.0 |
洗脫狀態 | 0.15莫耳的氯化鈉 3CV,0.20莫耳的氯化鈉 2CV,0.30莫耳的氯化鈉 2CV,1莫耳的氯化鈉 2CV |
管柱 | 苯基-HP (直徑:0.66公分,高度:12公分) |
管柱容積 | 4.11毫升 |
結合和洗滌緩衝液 | 50毫莫耳的磷酸鈉/2莫耳的氯化鈉,pH值為6.2 |
洗脫緩衝液 | 50毫莫耳的磷酸鈉,pH值為6.2 |
洗脫狀態 | 2至0莫耳的氯化鈉 10CV,0莫耳的氯化鈉 5CV |
表8
比較例子2(Q-FF(FT)→丁基-HP→SP-HP)
管柱 | Q-FF (直徑:2.6公分,高度:10公分) |
管柱容積 | 53毫升 |
結合和洗滌緩衝液 | 50毫莫耳的磷酸鈉,pH值為6.0 |
洗脫緩衝液 | 50毫莫耳的磷酸鈉/1莫耳的氯化鈉,pH值為6.0 |
洗脫狀態 | 0.15莫耳的氯化鈉 3CV,0.20莫耳的氯化鈉 2CV,0.30莫耳的氯化鈉 2CV,1莫耳的氯化鈉 2CV |
管柱 | 丁基-HP (直徑:0.66公分,高度:12公分) |
管柱容積 | 4.11毫升 |
結合和洗滌緩衝液 | 50毫莫耳的磷酸鈉/2莫耳的氯化鈉,pH值為6.2 |
洗脫緩衝液 | 50毫莫耳的磷酸鈉 ,pH值為6.2 |
洗脫狀態 | 2至0莫耳的氯化鈉 10CV,0莫耳的氯化鈉 5CV |
管柱 | SP-HP(直徑:0.66公分,高度:12.5公分) |
管柱容積 | 4.27毫升 |
結合和洗滌緩衝液 | 20毫莫耳的檸檬酸鈉,pH值為4.8 |
洗脫緩衝液 | 20毫莫耳的檸檬酸鈉/1莫耳的氯化鈉,pH值為4.8 |
洗脫狀態 | 0至0.3莫耳的氯化鈉 5CV,1莫耳的氯化鈉 3CV |
結果,從表9中可以看出,根據實驗例子純化的肉毒桿菌毒素是本發明的純化方法,產生了99.4%的高純度,並且根據比較例子1純化的肉毒毒素的純度和滴定量皆低於實驗例子。比較例子2具有非常低的純度和滴定量。因此,這些結果表明,經由本發明的方法純化的肉毒桿菌毒素具有比經由常規方法純化的肉毒桿菌毒素明顯更高的純度和滴定量。
表9
純度 (SEC-HPLC,%) | 滴定量 (單位/毫克) | |
本發明 (實驗例子) | 99.4 | 4.04 × 107 |
US 2019-0201505 比較例子1 | 93.3 | 3.78 × 107 |
US 7452697 比較例子 2 | 45.2 | 低於1.0 × 107 |
儘管已經詳細描述了本發明的特定配置,但是本領域中具有通常知識者將理解,提供該描述是為了舉例說明的目的而提出的多個較佳實施例,並且不應被解釋為限制本發明的範圍。因此,本發明的實質範圍由所附申請專利範圍和其等同物限定。
在以下結合多個附圖所進行的詳細描述中,將更清楚地理解本發明的上述內容及其他目的、特徵和本發明的其他優點,其中:
圖1示出根據本發明的一個實施例中,經過陽離子交換層析之後的一洗脫液中的一肉毒桿菌毒素的FPLC和SDS-PAGE分析的結果;
圖2示出根據本發明的一個實施例中,經過疏水層析之後的一洗脫液中的一肉毒桿菌毒素的FPLC和SDS-PAGE分析的結果;
圖3示出根據本發明的一個實施例中,經過陰離子交換層析之後的一洗脫液中的一肉毒桿菌毒素的FPLC和SDS-PAGE分析的結果
圖4示出用於確定根據本發明的一肉毒桿菌毒素和一市售的肉毒桿菌毒素的純化效果的SDS-PAGE分析的結果;
圖5示出透過韓國專利申請第10-2013-0092024號的一種純化方法來純化肉毒桿菌毒素的純度的結果;
圖6示出透過美國專利申請第11/932789號的一種純化方法來純化肉毒桿菌毒素的純度的測定結果;以及
圖7示出根據本發明的純化的肉毒桿菌毒素的純度的測定結果。
Claims (14)
- 一種用於純化一肉毒桿菌毒素的方法,該方法包括: (a)預先處理含有一肉毒桿菌毒素的一培養基溶液; (b)利用陽離子交換層析法來純化預先處理完成的該肉毒桿菌毒素; (c)利用疏水層析法來純化該肉毒桿菌毒素;以及 (c)利用陽離子交換層析法來純化該肉毒桿菌毒素。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中使用一SP管柱進行步驟(b)中的該陽離子交換層析法。
- 如申請專利範圍第2項所述之方法,其中該SP管柱是選自於由一SP瓊脂糖HP管柱、一SP瓊脂糖FF管柱和一卡普托S管柱所組成的群組。
- 如申請專利範圍第2項所述之方法,其中將步驟(b)中的肉毒桿菌毒素溶於一pH值為4.5至5.5的一10至30毫莫耳的檸檬酸鈉緩衝液中,然後注入該SP管柱中。
- 如申請專利範圍第2項所述之方法,其中利用一pH值為4.5至5.5的一30至70毫莫耳的檸檬酸鈉緩衝液來洗脫步驟(b)中的該肉毒桿菌毒素,其中該檸檬酸鈉緩衝液補充有0.5至1.5莫耳的氯化鈉。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中使用一苯基管柱來進行步驟(c)中的該疏水層析法。
- 如申請專利範圍第6項所述之方法,其中該苯基管柱是選自於由一苯基瓊脂糖HP管柱、一苯基瓊脂糖FF(快速流動)管柱和一卡普托苯基管柱所組成的群組。
- 如申請專利範圍第6項所述之方法,其中將步驟(c)中的該肉毒桿菌毒素溶於一pH值為5.7至6.7的一30至70毫莫耳的磷酸鈉緩衝液中,其中該磷酸鈉緩衝液補充有1.8至2.2莫耳的氯化鈉。
- 如申請專利範圍第6項所述之方法,其中利用一pH值為5.7至6.7的一30至70毫莫耳的磷酸鈉緩衝液來洗脫步驟(c)中的該肉毒桿菌毒素。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中使用一Q管柱來進行步驟(d)中的該陽離子交換層析法。
- 如申請專利範圍第10項所述之方法,其中該Q管柱是選自於由一卡普托Q伊普瑞斯管柱、一托以爾波超級Q650M管柱、一Q瓊脂糖FF管柱和一Q 瓊脂糖HP管柱所組成的群組。
- 如申請專利範圍第10項所述之方法,其中將步驟(d)中的該肉毒桿菌毒素溶於一pH值為5.7至6.7的一40至60毫莫耳的磷酸鈉緩衝液中,然後注入該Q管柱中。
- 如申請專利範圍第10項所述之方法,其中利用一pH值為5.7至6.7的一40至60毫莫耳的磷酸鈉緩衝液來洗脫步驟(d)中的該肉毒桿菌毒素,其中該磷酸鈉緩衝液補充有0.8至1.2莫耳的氯化鈉。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中該純化的肉毒桿菌毒素是具有一99%或更高純度的A型肉毒桿菌毒素。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR20190043869 | 2019-04-15 | ||
KR10-2019-0043869 | 2019-04-15 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
TW202104246A true TW202104246A (zh) | 2021-02-01 |
TWI748411B TWI748411B (zh) | 2021-12-01 |
Family
ID=72837523
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
TW109112678A TWI748411B (zh) | 2019-04-15 | 2020-04-15 | 純化肉毒桿菌毒素的方法 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20220204957A1 (zh) |
EP (1) | EP3957648A4 (zh) |
KR (2) | KR102447441B1 (zh) |
CN (1) | CN114245801A (zh) |
BR (1) | BR112021020533A2 (zh) |
MX (1) | MX2021012523A (zh) |
TW (1) | TWI748411B (zh) |
WO (1) | WO2020213929A1 (zh) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20230007129A (ko) * | 2021-07-05 | 2023-01-12 | 주식회사 파마리서치바이오 | 클로스트리디움 보툴리눔 독소 복합체 단백질의 정제방법 |
KR20230009178A (ko) * | 2021-07-08 | 2023-01-17 | 주식회사 파마리서치바이오 | 비-독소 단백질이 제거된 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 단백질의 정제방법 |
KR102512757B1 (ko) | 2021-07-22 | 2023-03-22 | (주)이니바이오 | 정제 수율이 향상된 보툴리눔 독소 복합체 정제방법 |
WO2024101624A1 (ko) * | 2022-11-08 | 2024-05-16 | (주)제테마 | 보툴리눔 독소의 정제방법 |
Family Cites Families (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7214787B1 (en) * | 1993-09-21 | 2007-05-08 | United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Recombinant vaccine against botulinum neurotoxin |
TWI241195B (en) | 2000-04-10 | 2005-10-11 | Shionogi & Co | Preventive agent for bile acidic diarrhea |
JP2003009897A (ja) | 2001-07-03 | 2003-01-14 | Keiji Oguma | ボツリヌス毒素の分離・精製法 |
US7452697B2 (en) * | 2003-09-25 | 2008-11-18 | Allergan, Inc. | Chromatographic method and system for purifying a botulinum toxin |
WO2006042542A2 (en) * | 2004-10-19 | 2006-04-27 | Statens Serum Institut | Production of tetanus, diphtheria, and pertussis toxins and toxoids using fermentation media containing no components of animal or soy origin |
JP5006803B2 (ja) * | 2005-03-03 | 2012-08-22 | アラーガン、インコーポレイテッド | クロストリジウム・バクテリアの培地およびクロストリジウム毒素を得るための方法 |
AU2012201519B2 (en) * | 2005-03-03 | 2014-06-26 | Allergan, Inc. | Animal product free system and process for purifying a botulinum toxin |
KR20090120222A (ko) * | 2008-05-19 | 2009-11-24 | (주)메디톡스 | 식물 유래 성분 함유 배지 및 가요성 폐쇄 용기를 이용하여클로스트리디움 보툴리눔 독소를 생산하는 방법 |
US8129139B2 (en) * | 2009-07-13 | 2012-03-06 | Allergan, Inc. | Process for obtaining botulinum neurotoxin |
JP2011074025A (ja) * | 2009-09-30 | 2011-04-14 | Chemo-Sero-Therapeutic Research Inst | ボツリヌス毒素の精製方法 |
CA2773396C (en) * | 2009-10-21 | 2020-12-15 | Revance Therapeutics, Inc. | Methods and systems for purifying non-complexed botulinum neurotoxin |
KR20130092024A (ko) | 2012-02-09 | 2013-08-20 | 권지성 | 멜로디 유아용 소변기 |
KR101339349B1 (ko) * | 2013-08-02 | 2013-12-09 | 주식회사 대웅 | 보툴리눔 독소의 제조방법 |
GB201407525D0 (en) | 2014-04-29 | 2014-06-11 | Syntaxin Ltd | Manufacture of recombinant clostridium botulinum neurotoxins |
KR101775682B1 (ko) * | 2015-11-30 | 2017-09-06 | 주식회사 대웅 | 보툴리눔 독소의 제조방법 |
KR102463881B1 (ko) * | 2016-10-04 | 2022-11-07 | (주)메디톡스 | 보툴리눔 독소 함유 용액으로부터 보툴리눔 독소를 분리하는 방법 |
EP3615669A4 (en) * | 2017-04-28 | 2021-05-12 | Bonti, Inc. | BOTULINIC NEUROTOXINS PRODUCTION PROCESSES |
-
2020
- 2020-04-13 KR KR1020200044717A patent/KR102447441B1/ko active IP Right Grant
- 2020-04-13 KR KR1020200044719A patent/KR102516203B1/ko active IP Right Grant
- 2020-04-14 EP EP20791857.4A patent/EP3957648A4/en active Pending
- 2020-04-14 MX MX2021012523A patent/MX2021012523A/es unknown
- 2020-04-14 WO PCT/KR2020/005042 patent/WO2020213929A1/ko unknown
- 2020-04-14 US US17/603,359 patent/US20220204957A1/en active Pending
- 2020-04-14 CN CN202080034458.2A patent/CN114245801A/zh active Pending
- 2020-04-14 BR BR112021020533A patent/BR112021020533A2/pt unknown
- 2020-04-15 TW TW109112678A patent/TWI748411B/zh active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP3957648A1 (en) | 2022-02-23 |
BR112021020533A2 (pt) | 2021-12-14 |
MX2021012523A (es) | 2022-01-24 |
KR102516203B1 (ko) | 2023-03-30 |
TWI748411B (zh) | 2021-12-01 |
CN114245801A (zh) | 2022-03-25 |
KR102447441B1 (ko) | 2022-09-27 |
US20220204957A1 (en) | 2022-06-30 |
KR20200121246A (ko) | 2020-10-23 |
WO2020213929A1 (ko) | 2020-10-22 |
EP3957648A4 (en) | 2023-02-08 |
KR20200121248A (ko) | 2020-10-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
TWI748411B (zh) | 純化肉毒桿菌毒素的方法 | |
US11466262B2 (en) | Methods and systems for purifying non-complexed botulinum neurotoxin | |
KR20070116710A (ko) | 보툴리눔 독소를 정제하기 위한 동물 산물이 없는 시스템및 프로세스 | |
TWI797442B (zh) | 純化肉毒桿菌毒素的方法 | |
KR20160127028A (ko) | 다당류를 정제하는 신규한 다운스트림 방법 | |
KR101853463B1 (ko) | 보툴리눔 독소의 정제 방법 | |
RU2795197C1 (ru) | Способ очистки ботулинического токсина | |
RU2805226C2 (ru) | Способ очистки ботулинического токсина | |
Sadeesh Kumar et al. | Screening and characterization of fibrinolytic protease producing Bacillus circulans from mangrove sediments Pitchavaram, South East Coast of India | |
KR20210020363A (ko) | 보툴리눔 독소의 제조방법 | |
RU2492231C2 (ru) | Способ выделения бактериоцинов | |
An et al. | Applications of Ultrafiltration-nanofiltration Membrane Continuous Combination Technology for Refining of Milk-Derived Oligosaccharides | |
CN116947934A (zh) | 一种二步分离纯化甘油葡糖苷的方法 | |
DD284484A5 (de) | Verfahren zur synthese von hybridstreptokinasen mit fibrinbindungsdomaenen |