BR112015029973B1

BR112015029973B1 - Método para produção de toxina botulínica

Info

Publication number: BR112015029973B1
Application number: BR112015029973-3A
Authority: BR
Inventors: Chung Sei Kim; Kwan Young Song; Kyoung Min Min; Yeong Duk An
Original assignee: Daewoong Co., Ltd
Priority date: 2013-08-02
Filing date: 2014-05-07
Publication date: 2023-01-17
Also published as: DK2920199T3; CY1120410T1; EP2920199B1; JP2016521968A; CA2912553C; NO2920199T3; KR101339349B1; JP2017141237A; BR112015029973A2; AR096541A1; RU2015151186A; MX362821B; PL2920199T3; CA2912553A1; SG11201509486VA; EP2920199A1; AU2014297167A1; WO2015016462A1; LT2920199T; PH12015501855B1

Abstract

MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE TOXINA BOTULÍNICA, mais particularmente, a um método de preparação de toxina botulínica, compreendendo as etapas de: (a) tratar uma cultura de uma cepa produtora de toxina botulínica com ácido para precipitar uma toxina botulínica; (b) adicionar tampão toxina botulínica precipitada, seguido pelo tratamento com um inibidor de protease e nuclease, assim extraindo a toxina botulínica; (c) tratar a toxina botulínica extraída com ácido para precipitar a toxina botulínica e dissolver o precipitado em tampão; e (d) purificar a toxina botulínica por cromatografia de troca aniônica. O uso do método da toxina da invenção torna possível produzir uma toxina botulínica de alta pureza por um processo simples, sugerindo que o método é muito econômico e eficiente. A toxina botulínica produzida pelo método da invenção tem alta pureza comparado às toxinas botulínicas produzidas por métodos convencionais e, portanto, tem uma capacidade aumentada para agir em uma área local. Portanto, a circulação sistemática da toxina botulínica, que pode resultar em efeitos colaterais, é reduzida para aumentar a segurança. De acordo, a toxina botulínica da invenção pode ser utilizada para vários propósitos, incluindo tratamento de distúrbios neuromusculares, remoção de rugas e tratamento de hemiplegia espástica e paralisia cerebral.

Description

Campo da Técnica

[001] A presente invenção refere-se a um método para a produção de uma toxina botulínica e, mais particularmente, a um método para a preparação de toxina botulínica, o método compreendendo as etapas de: (a) tratar uma cultura de uma cepa produtora de toxina botulínica com ácido para precipitar uma toxina botulínica; (b) adicionar tampão ao precipitado de toxina botulínica, seguido pelo tratamento com um inibidor de protease e nuclease, assim extraindo a toxina botulínica; (c) tratar a toxina botulínica extraída com ácido para precipitar a toxina botulínica e dissolver o precipitado em tampão; e (d) purificar a toxina botulínica por cromatografia de troca aniônica.

Estado da Técnica

[002] Uma variedade de cepas de Clostridium sp. que secretam neurotoxinas foi descoberta em 1890 e a caracterização de toxinas que são secretadas a partir destas cepas foi feita durante os últimos 70 anos (Schant, E. J. et al., Microbiol. Rev., 56:80, 1992).

[003] Neurotoxinas derivadas de cepas de Clostridium sp., isto é, toxinas botulínicas, são classificadas em sete tipos (tipos A a G) dependendo de suas propriedades sorológicas. Cada uma das toxinas tem uma proteína toxina tendo um tamanho de cerca de 150 KDa e naturalmente contém um complexo de várias proteínas não tóxicas. Um complexo médio (300 kDa) é composto de uma proteína toxina e uma proteína não hemaglutinina e não tóxica, e um complexo grande (450 kDa) e um complexo muito grande (900 kDa) são compostos do complexo médio ligado à hemaglutinina (Sugiyama, H., Microbiol. Rev., 44: 419, 1980). Tais proteínas hemaglutinina não tóxicas são conhecidas por funcionar para proteger a toxina de um baixo pH e várias proteases nos intestinos.

[004] A toxina é sintetizada como um único polipeptídeo tendo um peso molecular de cerca de 150 kDa nas células e então clivada na posição de 1/3 iniciando da extremidade N-terminal e pela ação de protease intercelular ou tratamento com uma enzima artificial tal como tripsina em duas unidades: uma cadeia leve (L; peso molecular: 50 kDa) e uma cadeia pesada (H; peso molecular: 100 kDa). A toxina clivada tem a toxicidade fortemente aumentada comparada ao polipeptídeo único. As duas unidades são ligadas uma à outra por uma ligação dissulfeto e tem diferentes funções. A cadeia pesada se liga ao um receptor de uma célula alvo (Park. M.K., et al., FEMS Microbiol. Lett., 72:243, 1990) e funciona para interagir com uma biomembrana em pH baixo (pH 4) para formar um canal (Mantecucco, C. et al., TIBS., 18:324, 1993), e a cadeia leve tem atividade farmacológica e, portanto, confere permeabilidade às células utilizando um detergente ou interfere com a secreção de um neurotransmissor quando introduzido dentro de células por, por exemplo, eletroporação (Poulain, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 85:4090, 1988).

[005] A toxina inibe a exocitose da acetilcolina na pré-sinapse colinérgica de uma junção neuromuscular para causar astenia. Foi considerado que o tratamento com uma quantidade muito pequena da toxina exibe toxicidade, sugerindo que a toxina tem qualquer atividade enzimática (Simpson, L. L. et al., Ann. Rev. Pharmaeol. Toxicol., 26:427, 1986).

[006] De acordo com um relatório recente, a toxina tem atividade metalopeptidase e seu substrato é composto de sinaptobrevina, sintaxina, uma proteína associada sinaptossomal de 25 KDa (SNAP25) ou similar, que são as unidades de proteínas de um complexo maquinário de exocitose. Cada tipo de toxina usa uma das três proteínas descritas acima como seus substratos, e sabe- se que toxinas tipo B, D, F e G clivam sinaptobrevina em um sítio específico, toxinas tipo A e E clivam SNAP25 em um sítio específico, e o tipo C cliva sintaxina em um sítio específico (Binz, T. et al., J. Biol. Chem., 265:9153, 1994).

[007] Particularmente, a toxina botulínica tipo A é conhecida por ser solúvel em uma solução aquosa diluída em um pH de 4,0-6,8. Sabe-se que uma proteína não tóxica estável é separada da neurotoxina em um pH de cerca de 7 ou maior, e como resultado, a toxicidade é gradualmente perdida. Particularmente, sabe-se que a toxicidade diminui à medida que o pH e a temperatura aumentam.

[008] A toxina botulínica é fatal ao corpo humano mesmo em pequenas quantidades e é fácil para produzir em grandes quantidades. Portanto, constitui-se quatro grandes armas bioterroristas juntamente com Bacillus anthracis, Yersinia pestis e vírus da varíola. Entretanto, foi descoberto que, quando a toxina botulínica tipo A é injetada em uma dose que não afeta sistematicamente o corpo humano, ela pode paralisar o músculo local no local injetado. Baseado em suas características, a toxina botulínica tipo A pode ser utilizada em uma ampla faixa de aplicações, incluindo agentes de remoção de rugas, agentes para tratar hemiplegia espástica e paralisia cerebral, etc. Assim, a demanda por toxina botulínica tipo A tem aumentado e estudos em métodos de produção de toxina botulínica para atender a demanda foram ativamente conduzidos.

[009] Um produto comercial típico atualmente é o BOTOX® (um complexo de neurotoxina purificada de toxina botulínica tipo A) que é comercialmente disponível pela Allergan, Inc., USA. Um frasco de 100 unidades de BOTOX® é composto de cerca de 5 ng de um complexo de neurotoxina purificado de toxina botulínica tipo A, 0,5 mg de albumina sérica humana e 0,9 mg de cloreto de sódio e é reconstituída utilizando solução salina estéril sem conservante (injeção de 0,9% de cloreto de sódio). Outros produtos comerciais incluem Dysport® (um complexo de toxina de Clostridium botulinum tipo A e hemaglutinina, que tem lactose e albumina sérica humana em uma composição farmacêutica contendo toxina botulínica e é reconstituída utilizando 0,9% de cloreto de sódio antes do uso) que é comercialmente disponível de Ipsen Ltd., UK, MyoBloc™ (uma solução injetável (um pH de cerca de 5,6) compreendendo toxina botulínica tipo B, albumina sérica humana, succinato de sódio e cloreto de sódio) que é comercialmente disponível pela Solstice Neurosciences, Inc. Métodos convencionais utilizados para produzir toxinas botulínicas incluem um método de precipitação por ácido, um método de precipitação por sal e um método cromatográfico.

[010] Po r exemplo, a publicação da Patente Japonesa 1994-192296 divulga um método para produzir uma toxina botulínica tipo A cristalina pela cultura da bactéria Clostridium botulinum, seguido pela precipitação com ácido, extração, adição de nuclease e cristalização. Ainda, a Patente US 5696077 divulga um método de uma toxina botulínica tipo B cristalina pela cultura da bactéria Clostridium botulinum, seguido por precipitação com ácido, extração, cromatografia de troca iônica, cromatografia de filtração em gel e cristalização.

[011] Simpson et al. produziram uma toxina botulínica tipo A pela purificação da neurotoxina botulínica por cromatografia de fluxo de gravidade, seguido por HPLC, captura utilizando resina de afinidade, cromatografia por exclusão de tamanho e cromatografia de troca iônica (aniônica e catiônica) incluindo o uso de duas colunas de troca iônica diferentes (Method in Enzymology, 165:76, 1988), e Wang et al. utilizaram precipitação e cromatografia iônica para purificar uma toxina botulínica tipo A (Dermatol Las Faci Cosm Surg., 2002:58, 2002).

[012] Além disso, a patente US6818409 divulga o uso de troca iônica e colunas de lactose para purificar a toxina botulínica, e a patente US7452697 divulga uma toxina botulínica tipo A por cromatografia de troca iônica e cromatografia hidrofóbica. A Publicação da Patente Coreana 2009-0091501 divulga um método de purificação da toxina botulínica por precipitação com ácido e cromatografia de troca aniônica, e a publicação US20130156756 divulga um método de purificação da toxina botulínica por cromatografia de troca aniônica e cromatografia de troca catiônica.

[013] O pedido de patente US2011008843 intitulado Process for Obtaining Botulinum Neurotoxin refere-se a sistemas e processos para a obtenção de uma neurotoxina de Clostridium, métodos para produzir uma composição farmacêutica a partir da mesma e usos terapêuticos e cosméticos de composição farmacêutica assim obtida.

[014] O pedido de patente US2005238669 intitulado Animal Product Free System and Process for Purifying a Botulinum Toxin bem como o pedido US2006228780 intitulado Chromatographic Method and System for Purifying a Botulinum Toxin referem-se a sistemas e processos para purificar uma toxina de Clostridium, em particular a processos cromatográficos para purificar neurotoxina botulínica.

[015] O pedido de patente KR20030060150 intitulado Purification Method of Clostridium Botulinum Type A Toxin refere-se a um método de purificação da toxina A de Clostridium botulinum, compreendendo as etapas de: (a) obtenção de um precipitado pela adição de ácido sulfúrico à solução de cultura da cepa A de Clostridium botulinum a um pH de 3 a 4; (b) dissolver o precipitado obtido com uma solução tampão e, em seguida, precipitar o lisado com sulfato de amônio, obtendo assim um precipitado; (c) suspender o precipitado com uma solução tampão de fosfato e, em seguida, tratar a hidrolase de RNA para remover o material insolubilizado, seguido por precipitação do sobrenadante com sulfato de amônio para obter um precipitado; (d) dissolver o precipitado obtido em uma solução tampão e, em seguida, realizar a cromatografia de troca iônica para obter apenas frações com um valor de A260 / 280 de 0,6 ou mais; (e) realizar cromatografia de permeação em gel na fração obtida.

[016] A publicação WO2011050072 cujo título é Methods and Systems for Purifying Non-Complexed Botulinum Neurotoxin refere- se geralmente a métodos e sistemas cromatográficos para purificação de neurotoxina botulínica de culturas de células para produzir um produto de alta pureza e alta potência

[017] Ent retanto, os métodos convencionais têm problemas em que o uso da cromatografia de troca aniônica afeta adversamente o padrão de bandas de gel de toxinas botulínicas (Patente US7452697) e nesta estes métodos convencionais são difíceis de aplicar comercialmente, devido a um longo tempo de purificação. Em adição, devido ao fato de que Clostridium botulinum que é uma cepa produtora de toxina botulínica ser uma bactéria anaeróbica, existe um problema em que a fermentação da bactéria deve ser realizada em um sistema anaeróbico e, portanto, é difícil para produzir as toxinas botulínicas em grandes quantidades. Em adição, existe um problema em que o ingrediente ativo da toxina botulínica purificada pelo método de purificação descrito acima não é claramente separado e identificado e, portanto, contém impurezas. Adicionalmente, os métodos convencionais para a produção de toxinas botulínicas têm um problema em que a filtração ou processo de diálise é necessariamente realizado para purificar uma toxina botulínica de alta pureza, sugerindo que o processo de purificação é complexo e difícil.

[018] As sim, os presentes inventores fizeram um esforço intenso para resolver os problemas acima descritos, que ocorrem na técnica anterior, e, como resultado, demonstraram que quando uma cultura de cepa produtora de toxina botulínica é tratada com ácido para formar um precipitado de toxina botulínica e o precipitado formado é purificado por cromatografia de troca aniônica, as etapas de filtração, diálise e precipitação em etanol podem ser omitidas e o processo para a produção da toxina botulínica é muito fácil e uma toxina botulínica tendo uma pureza de 98% ou maior pode ser produzida por este método de produção, assim completando a presente invenção.

Descrição Resumida da Invenção

[019] É um objetivo da presente invenção prover um método de produzir uma toxina botulínica de alta pureza por um processo simples.

[020] Para alcançar o objetivo acima, a presente invenção provê um método para a produção da toxina botulínica, compreendendo as etapas de: (a) tratar uma cultura de uma cepa produtora de toxina botulínica com ácido para precipitar uma toxina botulínica; (b) adicionar tampão à toxina botulínica precipitada, seguido pelo tratamento com um inibidor de protease e nuclease, assim extraindo a toxina botulínica; (c) tratar a toxina botulínica extraída com ácido para precipitar a toxina botulínica e dissolver o precipitado em um tampão; e (d) purificar a toxina botulínica por cromatografia de troca aniônica.

Breve Descrição das Figuras

[021] A FIG. 1 é uma vista esquemática mostrando um processo de produção de toxina botulínica de acordo com a presente invenção.

[022] A FIG. 2 mostra os resultados da medição de pureza de uma toxina botulínica após a realização da purificação por cromatografia de troca aniônica primária.

[023] A FIG. 3 mostra os resultados da medição de pureza de uma toxina botulínica após a realização de purificação por cromatografia de troca aniônica secundária.

[024] A FIG. 4 mostra os resultados da medição do aumento ou diminuição na amplitude do potencial de ação no músculo do composto causado pelo tratamento com uma toxina botulínica produzida pelo método da presente invenção e BOTOX® (Allergan). N: sem injeção; S: injeção de salina; B2: BTX-A-1, duas unidades; D2: BTX-A-2, duas unidades; B4: BTX-A-1, quatro unidades; D4: BTX-A-2, quatro unidades; B8: BTX-A-1, oito unidades; e D8: BTX-A-2, oito unidades.

[025] A FIG. 5 mostra os resultados da medição das velocidades de condução causadas pelo tratamento com uma toxina botulínica produzida pelo método da presente invenção e BOTOX® (Allergan). N: sem injeção; S: injeção de salina; B2: BTX-A-1, duas unidades; D2: BTX-A-2, duas unidades; B4: BTX-A-1, quatro unidades; D4: BTX-A-2, quatro unidades; B8: BTX-A-1, oito unidades; e D8: BTX-A-2, oito unidades.

Descrição Detalhada da Invenção e Modalidades Preferidas

[026] A menos que seja definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos utilizados aqui têm o mesmo significado como comumente entendido por um especialista na técnica à qual a presente invenção pertence. Geralmente, a nomenclatura utilizada aqui e os métodos experimentais são aqueles bem conhecidos e comumente empregados na técnica.

[027] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método para produção de toxina botulínica, compreendendo as etapas de: (a) tratar uma cultura de uma cepa produtora de toxina botulínica com ácido para precipitar uma toxina botulínica; (b) adicionar tampão à toxina botulínica precipitada, seguido pelo tratamento com um inibidor de protease e nuclease, assim extraindo a toxina botulínica; (c) tratar a toxina botulínica extraída com ácido para precipitar a toxina botulínica e dissolver o precipitado em tampão; e (d) purificar a toxina botulínica por cromatografia de troca aniônica (FIG. 1).

[028] A toxina botulínica resultante produzida pelo método da presente invenção pode ser armazenada por vários modos, incluindo armazenamento congelado e armazenamento liofilizado.

[029] O método da presente invenção pode ainda compreender, após a etapa (d), as etapas de: (e) tratar a fração de cromatografia de troca aniônica contendo a toxina botulínica com sulfato de amônio para forma um precipitado e dissolver o precipitado em tampão; e (f) purificar a toxina botulínica por cromatografia de troca aniônica.

[030] Na presente invenção, a cepa produtora de toxina botulínica é preferencialmente Clostridium botulinum, mas não está limitado a esta, e será evidente aos especialistas na técnica que qualquer cepa capaz de produzir toxina botulínica pode ser utilizada na presente invenção.

[031] Como utilizado aqui, o termo “toxina botulínica” pretende incluir não apenas a neurotoxina produzida pela cepa Clostridium botulinum, mas também toxinas botulínicas modificadas, recombinantes, híbridas e quiméricas. Uma toxina botulínica recombinante pode ser uma cadeia leve e/ou cadeia pesada produzida por espécies não Clostridium em uma maneira recombinante. Em adição, o termo “toxina botulínica” como utilizado aqui, pretende incluir os sorotipos de toxina botulínica A, B, C, D, E, F e G, complexos de toxina botulínica (isto é, complexos de 300, 600 e 900 kDa), e uma toxina botulínica pura (isto é, molécula neurotóxica de 150 kDa), que são todos úteis na prática da presente invenção.

[032] Como utilizado aqui, o termo “toxina botulínica produzida” significa uma toxina botulínica pura ou um complexo de toxinas botulínicas, que é separado ou substancialmente separado de outras proteínas ou impurezas que podem ser acompanhadas pela toxina botulínica quando a toxina botulínica é coletada de uma cultura ou processo de fermentação. Portanto, a toxina botulínica produzida tem uma pureza de pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 95% e mais preferencialmente pelo menos 98%. Particularmente, a toxina botulínica produzida na presente invenção pode ser uma toxina botulínica tipo A tendo uma pureza de pelo menos 98%.

[033] A cultura da cepa de Clostridium botulinum para produzir a toxina botulínica pode ser realizada utilizando um método convencional conhecido na técnica e um meio convencional que pode ser utilizado para a cultura.

[034] A título de exemplo sem limitação, um meio para a cultura de cepa de Clostridium botulinum pode incluir uma caseína hidrolisada, um extrato de levedura, glicose e similares, e a cultura é realizada na temperatura de 25 a 40°C por 90 a 180 horas, e preferencialmente 100 a 150 horas.

[035] A precipitação com ácido da etapa (a) pode ser realizada pela adição de ácido, preferencialmente ácido sulfúrico ou ácido clorídrico, a uma cultura da cepa, até que a cultura atinja um pH de 3,0 a 4,5, preferencialmente 3,3 a 4,0 e mais preferencialmente 3,4 a 3,6, como medido por um sensor de pH.

[036] A precipitação com ácido da etapa (a) é baseado no princípio em que a adição do ácido a uma cultura contendo muitos tipos de proteínas reduz o pH da cultura ao mesmo tempo matando a bactéria botulínica que permanece após a cultura de modo que as proteínas alcançam o ponto isoelétrico para precipitar. Isso inclui a cristalização em um sentido amplo e o método de precipitação é um método de separação grosseira de um material desejado em um estado de mistura, ao contrário da cristalização focada na purificação do material desejado com alta pureza. No método de precipitação, impurezas tendo uma estrutura similar ao material desejado também são precipitadas. Aqui, o pH é ajustado para cerca de 3,0 a 4,5. A taxa de recuperação da toxina botulínica aumenta a medida que o pH diminui. Se o pH é 3,0 ou menor, irá afetar a própria toxina botulínica, e se o pH é 4,5 ou maior, a taxa de recuperação da toxina botulínica irá diminuir. Por estas razões, o pH é preferencialmente dentro da faixa especificada acima.

[037] Particularmente, o pH é mais preferencialmente 3,4 a 3,6, porque a taxa de recuperação da toxina botulínica é a maior nesta faixa de pH. Quando o pH da cultura da cepa botulínica alcança uma faixa adequada após a adição do ácido, o ácido é adicionado à cultura até que a mudança no pH não ocorra mais, e então a cultura é deixada repousar em temperatura ambiente por 15 a 30 horas, seguido pela remoção do sobrenadante.

[038] A etapa (b) de extração da toxina botulínica compreende a etapa de dissolver a toxina resultante da etapa (a) em tampão fosfato, preferencialmente tampão fosfato de sódio e removendo o precipitado. Aqui, o pH do tampão fosfato é preferencialmente cerca de 4,0 a cerca de 7,0. O pH resultante pode ser ajustado para 4,5 a 6,5, preferencialmente 5,0 a 6,0, pela adição de uma base, preferencialmente hidróxido de sódio, e a extração da toxina pode ser realizada na faixa de pH especificada acima.

[039] Além disso, a nuclease que é utilizada na etapa (b) pode ser DNase e RNase, o inibidor de protease que é utilizado na etapa (b) é preferencialmente benzamidina HCl, mas não é limitado a este, e qualquer material capaz de inibir a atividade da protease, conhecido na técnica, pode ser utilizado na presente invenção. Pelo tratamento com nuclease na etapa (b) da extração de toxina botulínica, impurezas tais como DNA e RNA contidos no precipitado formado pelo ácido na etapa (a) podem ser degradadas. Se a etapa do tratamento com a enzima é conduzida por 1,5 horas ou menos, a degradação do DNA e RNA pode ser insuficiente. Por esta razão, a etapa do tratamento com a enzima é conduzida por 1,5 a 7 horas, preferencialmente 3 a 6 horas, e DNase e RNase são preferencialmente adicionadas na concentração de 0,05 a 1,0 g/l, preferencialmente 0,1 a 0,5 g/l.

[040] Devido ao extrato obtido pelo tratamento enzimático conter a toxina botulínica e uma proteína tendo polaridade similar à da toxina botulínica, a etapa de precipitação da proteína com ácido clorídrico deve ser realizada. Especificamente, a etapa (c) de precipitação com ácido clorídrico é preferencialmente realizada pela centrifugação do extrato tratado enzimaticamente, ajustando o pH do sobrenadante para um pH de 2,5 a 4,5, preferencialmente 3,0 a 4,0, pela adição de ácido clorídrico (HCl), e então precipitando a proteína no sobrenadante com ácido clorídrico em um refrigerador a 4°C. Particularmente, o pH na etapa de precipitação com ácido clorídrico é mais preferencialmente ajustado para 3,3 a 3,8 a fim de manter a atividade e taxa de recuperação da toxina em altos níveis. Se a etapa de precipitação com ácido clorídrico é conduzida na faixa de pH descrita acima, o título da toxina botulínica será tão alto quanto 90% ou mais e a coagulação da proteína irá diminuir significativamente. Depois, o precipitado com ácido clorídrico pode ser dissolvido em tampão, e a etapa subsequente pode ser realizada.

[041] A etapa (d) é a etapa mais importante sendo realizada por cromatografia utilizando uma resina de troca aniônica após completar a etapa de precipitação com ácido clorídrico a fim de remover a maioria das principais impurezas diferentes da toxina botulínica tipo A. A resina de troca aniônica que é utilizada na etapa (d) pode ser uma resina substituída com um grupo dietilaminoetil (DEAE) ou quaternário de amônia (Q), mas não é limitado a estes. Por exemplo, a resina de troca aniônica pode ser DEAE-Sephadex como descrito na patente US 5696077, na publicação WO96/05222 e na patente US5846929. Preferencialmente, é qualquer uma das resinas de troca aniônica tendo um grupo de amônia quaternária fortemente básico ou um grupo dietilaminoetil (DEAE) fracamente básico.

[042] Exemplos de grupos de troca aniônica fortemente básicos que podem ser utilizados na presente invenção podem incluir Q Sepharose Fast Flow, Q Sepharose High Performance, Resource Q, Source 15Q, Source 30Q, Mono Q, Mini Q, Capto Q, Capto Q ImpRes, Q HyperCel, Q Cermic HyperD F, Nuvia Q, UNOsphere Q, Macro-Prep High Q, Macro-Prep 25 Q, Fractogel EMD TMAE(S), Fractogel EMD TMAE Hicap (M), Fractogel EMD TMAE (M), Eshmono Q, Toyopearl QAE-550C, Toyopearl SuperQ-650C, Toyopearl GigaCap Q-650M, Toyopearl Q-600C AR, Toyopearl SuperQ-650M, Toyopearl SuperQ- 650S, TSKgel SuperQ-5PW (30), TSKgel SuperQ-5PW (20) ou TSKgel SuperQ-5PW, mas não está limitado a estas e resinas de troca aniônica conhecidas na técnica podem ser utilizadas.

[043] O tampão da coluna que é utilizado na etapa (d) pode ser tampão fosfato de sódio ou tampão citrato. Preferencialmente, o tampão fosfato de sódio é utilizado. A concentração do tampão da coluna é controlada para 30 a 70 mM, preferencialmente cerca de 40 a 60 mM. O Ph da coluna é controlado para cerca de 3,5 a 7,5, e a taxa de fluxo da fase móvel é controlada para 0,5 a 5,0 rn^/min, preferencialmente 1,0 a 3,0 irf/min. Ainda, a condutividade do tampão é ajustada para 3 a 30 mS/cm, e a amostra é injetada após completar o equilíbrio da coluna. A toxina é eluída como flow-through, e a maior parte das principais impurezas é absorvida. Especificamente, na etapa (d) de purificação por cromatografia de troca aniônica, a toxina botulínica tipo A não é adsorvida pela resina de troca aniônica, e a maioria das principais impurezas é removida por adsorção.

[044] Na presente invenção, a cromatografia de troca aniônica na etapa (d) é preferencialmente realizada em um pH de 3,5 a 7,5, preferencialmente 4,5 a 7,0 e uma condutividade de 3 a 30 mS/cm, preferencialmente 5 a 20 mS/cm.

[045] De modo a remover completamente as impurezas restantes após a cromatografia de troca aniônica da etapa (d), o método para produzir a toxina botulínica de acordo com a presente invenção pode, se necessário, ainda compreender as etapas de: (e) tratar a fração de cromatografia de troca aniônica contendo a toxina botulínica com sulfato de amônio ((NH4)2SO4) para formar um precipitado e dissolver o precipitado em tampão; e (f) purificar a toxina botulínica através de uma cromatografia de troca aniônica secundária.

[046] Na etapa (e), a fração de cromatografia de troca aniônica contendo a toxina botulínica é tratada com sulfato de amônio para formar um precipitado e o precipitado formado é dissolvido em tampão. A etapa de precipitação com sulfato de amônio corresponde a um processo de dessalinização em que um sal (sulfato de amônio, etc.) que se dissolve facilmente em água é adicionado a uma mistura de proteína para aumentar a força iônica para assim formar um precipitado de proteína. Se uma proteína desejada precipita principalmente até a saturação com 30%(p/v) de sulfato de amônio, a proteína desejada pode ser precipitada pela precipitação de outras proteínas além da proteína desejada em uma concentração de saturação de sulfato de amônio de 30% (p/v) ou menor, e então adicionando o sulfato de amônio para uma concentração de saturação de 30% (p/v) e pode ser coletada por centrifugação. A operação de dessalinização é frequentemente utilizada como meios iniciais. A solução de sulfato de amônio utilizada na etapa (e) pode ser uma concentração de sulfato de amônio de 10% a 50% (p/v), preferencialmente 20% a 40% (p/v).

[047] Após, na etapa (f), a toxina botulínica pode ser purificada por cromatografia de troca aniônica. A purificação da toxina botulínica de alta pureza de acordo com a presente invenção é principalmente realizada por cromatografia de troca aniônica (cromatografia de troca aniônica primária) da etapa (d), e cromatografia de troca aniônica (cromatografia de troca aniônica secundária) na etapa (f) é realizada de modo a remover as impurezas restantes e pode ser realizada no mesmo modo que a cromatografia de troca aniônica da etapa (d).

[048] A fração resultante contendo a proteína botulínica tipo A obtida pelo método de purificação descrito acima, pode ser esterilizada e filtrada para preparar um líquido bruto. O líquido bruto preparado pode ser congelado e armazenado até o uso.

[049] Em outro aspecto, a presente invenção é direcionada a uma toxina botulínica produzida pelo método da presente invenção. A pureza da toxina botulínica purificada por HPLC foi analisada e, como resultado, pode ser observado que a pureza da toxina botulínica após a primeira cromatografia de troca aniônica foi 98,38% (FIG. 2), que é maior que a pureza do BOTOX® (cerca de 95%) comercialmente disponível pela Allergan Inc., sugerindo que a maioria das impurezas foi removida na etapa de cromatografia de troca aniônica primária. Também foi demonstrado que a pureza da toxina botulínica após a cromatografia de troca aniônica secundária foi 98,99% (FIG. 3).

[050] Além disso, o método para a produção da toxina botulínica de acordo com a presente invenção tem a vantagem de as etapas de filtração, diálise e precipitação em etanol poderem ser omitidas e, portanto, o processo para a produção da toxina botulínica é fácil e simples. Particularmente, o método da presente invenção tem uma vantagem de que as etapas de filtração e precipitação em etanol no método para a produção do BOTOX® da Allergan Inc. (Publicação US20120156756; método não APF) podem ser omitidas e, portanto, o número de etapas de purificação pode ser reduzido (de cinco etapas para três etapas) para reduzir o período para produção de um líquido bruto da toxina botulínica (de 4 semanas para 2 semanas).

[051] Em outro exemplo da presente invenção, um experimento para comparação com a segurança do BOTOX® (Allergan, Inc.) foi realizado de modo a confirmar a segurança da toxina botulínica tipo A (DWP450) produzida pelo método da presente invenção. Como resultado, foi demonstrado que a toxina botulínica (DWP450) produzida pelo método da presente invenção mostrou um valor NOAEL de 60 U/kg para fêmeas, sugerindo que é duas vezes mais seguro que o BOTOX® (Allergan, Inc.), mostrando um valor NOAEL de 30 U/kg. A segurança duas vezes maior da toxina botulínica produzida pelo método da presente invenção, provavelmente é devido à toxina botulínica da presente invenção ter maior pureza e, portanto, tem uma capacidade aumentada para atuar em uma área local de modo que a circulação sistêmica da toxina botulínica, que pode resultar em efeitos colaterais, é reduzida.

[052] A toxina botulínica produzida pelo método da presente invenção é utilizada como ingrediente ativo em uma composição farmacêutica. A toxina botulínica pode ser utilizada para tratamento de distúrbios neuromusculares caracterizados por músculos esqueléticos hiperativos. Além disso, pode ser utilizada para várias condições, incluindo dor de cabeça, enxaqueca, dor de cabeça por tensão, dor de cabeça por sinusite, dor de cabeça cervicogênica, distúrbio de transpiração, hiperidrose axilar, hipeidrose plantar, síndrome de Frey, linha de pele hipercinética, ruga facial, linhas glabelares, pés de galinha, linhas de marionete, dobra nasolabial, distúrbio de pele, acalasia, estrabismo, fissura anal crônica, blefaroespasmo, dor muscoesquelética, fibromialgia, pancreatite, taquicardia, alargamento prostático, prostatite, retenção urinária, incontinência urinária, bexiga hiperativa, espasmo hemifacial, tremores, mioclonia, distúrbios gastrointestinais, diabetes, sialorreia, dissinergia do esfíncter detrusor, espasticidade pós-acidente vascular cerebral, paralisia cerebral juvenil, espasmo de músculo liso, restenose, distonia focal, epilepsia, distonia cervical, distúrbio de tireoide, hipercalcemia, distúrbio obsessivo compulsivo, dor artrítica, síndrome de Raynaud, estrias de distensão, adesão peritoneal, vasoespasmos, rinorreia, contratura muscular, lesão muscular, distonia laringeal, câimbras e síndrome do túnel do carpo e câimbra do escritor.

[053] Como utilizado aqui, o termo “composição farmacêutica” significa uma formulação compreendendo a toxina botulínica como um ingrediente ativo e a formulação pode compreender pelo menos um ingrediente adicional (excipiente) na composição farmacêutica em adição ao ingrediente ativo neurotoxina botulínica. O ingrediente adicional pode ser selecionado do grupo que consiste em albumina, albumina sérica humana, albumina sérica recombinante, gelatina, sacarose, trealose, amido hidroxietil, colágeno, lactose, cloreto de sódio de sacarose, polissacarídeo, caprilato, polivinilpirrolidona e sódio, mas não está limitado a estes. Ainda, um método para preparar uma composição farmacêutica compreendendo a toxina botulínica como ingrediente ativo compreende uma etapa de combinar a toxina botulínica com um ingrediente adicional (excipiente) e a etapa de combinação pode ser selecionada do grupo de processos que consiste em secagem por congelamento, liofilização e secagem à vácuo.

[054] Além disso, uma composição farmacêutica é uma formulação que é adequada para diagnóstico, administração farmacêutica ou cosmética (por exemplo, por injeção intramuscular ou subcutânea ou pela inserção de um depósito ou implante) a um sujeito, tal como um paciente humano. A composição farmacêutica por ser: em uma condição liofilizada ou seca à vácuo, uma solução formada após a reconstituição da composição farmacêutica liofilizada ou seca à vácuo com solução salina ou água, ou; como uma solução que não requer reconstituição. O ingrediente ativo pode ser um dos sorotipos de toxina botulínica A, B, C1, D, E, F ou G ou uma toxina botulínica, todos os quais podem ser preparados nativamente pela bactéria Clostridial. Como informado, uma composição farmacêutica pode ser líquida ou sólida, por exemplo seca à vácuo. Métodos exemplares para formular uma composição farmacêutica com ingrediente ativo toxina botulínica são divulgados na publicação US2003-0118598, de 5 de novembro de 2002.

[055] Em outro exemplo da presente invenção, de modo a confirmar o efeito da proteína toxina botulínica tipo A (DWP450) produzida pelo método da presente invenção, a amplitude do potencial de ação muscular do composto (CMAP) e as velocidades de condução (tC) foram medidas. No experimento, duas proteínas toxina botulínica tipo A diferentes, BTX-A-1 (BOTOX®, Allergan Inc., Califórnia, USA) e BTX-A-2 (DWP450) produzida pelo Exemplo 2 da presente invenção, foram utilizadas em quatro grupos divididos. No grupo 1, 0,08 ffl£ de cloreto de sódio (NaCl) foi administrado a um músculo TA e outro músculo não foi tratado. No grupo 2, 0,02 m£ do BTX-A-1 (duas unidades) foi administrado a um músculo TA e 0,02 m£ do BTX-A-2 (duas unidades) foi administrado a outro músculo TA. No grupo 3, 0,04 ffl£ do BTX-A-1 (quatro unidades) foi administrado a um músculo TA e 0,04 ffl£ do BTX-A-2 (quatro unidades) foi administrada a outro músculo TA. No grupo 4, 0,08 m£ do BTX-A-1 (oito unidades) foi administrado a um músculo TA e 0,08 m£ do BTX-A-2 (oito unidades) foi administrado a outro músculo.

[056] Uma unidade da toxina botulínica é definida como o LD50 sobre injeção intraperitoneal em camundongos fêmeas Swiss Webster pesando cerca de 18 a 20 gramas cada. Uma unidade de toxina botulínica é a quantidade de toxina botulínica que mata 50% de um grupo de camundongos fêmea Swiss Webster.

[057] As amplitudes do potencial de ação no músculo do composto (CMAP) causadas pela administração do BTX-A-1 e BTX-A-2 foram medidas e, como resultado, em uma taxa de estímulo lenta de 2 Hz, os grupos administrado com BTX-A-1 e BTX-A-2 mostraram um efeito paralítico no músculo TA (dY) em 3 dias, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas e 4 semanas após a administração (FIG. 4A), e em uma taxa de estímulo rápido de 20 Hz, os grupos administrados com BTX-A-1 e BTX-A-2 mostraram um efeito paralítico no músculo TA (dY) em 3 dias, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas e 4 semanas após a administração (FIG. 4B). Não houve diferença significativa (p < 0,05) entre BTX-A-1 e BTX-A-2 na taxa de estímulo lento de 2Hz e uma taxa de estímulo rápido de 20 Hz, e o efeito paralítico no músculo TA (dY) nos grupos administrados com BTX-A-1 e BTX-A-2 foi relacionado à dosagem de toxina botulínica administrada.

[058] As velocidades de condução (tC) causadas pela administração do BTX-A-1 e BTX-A-2 foram medidas e, como resultado, foi observado que os grupos administrados com BTX-A-1 e BTX-A-2 não induziram um atraso na condução de velocidade de condução na taxa de estímulo lento de 2 Hz e taxa de estímulo rápido de 20 Hz (FIG. 5).

[059] Especificamente, a toxina botulínica produzida pelo método da presente invenção exibe um efeito similar àquele do comercialmente disponível BOTOX® (Allergan, Inc.) e é duas vezes mais seguro, devido a sua pureza maior levando a uma diminuição na propriedade de circulação sistemática da toxina botulínica. Portanto, pode ser utilizado para vários propósitos, incluindo o tratamento de distúrbios neuromusculares, remoção de rugas e tratamento de hemiplegia espástica e paralisia cerebral.

EXEMPLOS

[060] Daqui em diante, a presente invenção será descrita em maiores detalhes com referência aos exemplos. Será óbvio para uma pessoa tendo conhecimento na técnica que estes exemplos são apenas ilustrativos e não devem ser interpretados como limitantes do escopo da presente invenção.

Exemplo 1: Cultura de cepa de Clostridium botulinum 1-1: Composição do meio utilizado na cultura \

[061] um meio tendo uma composição compreendendo 2% de caseína hidrolisada, 1% de extrato de levedura, 1% de glicose e 0,5% tioglicolato foi utilizado para a cultura de inoculação e a cultura principal da cepa de Clostridium botulinum de modo a produzir toxina botulínica.

1-2 : Cultura semente da cepa de Clostridium botulinum

[062] 20 ^ de Clostridium botulinum (o Korean Centers para Controle de Doença e Prevenção No. de Acessão: 4-029-CBB-IS-001) foi inoculado em um tubo de cultura contendo 10 ml de um meio estéril tendo a composição descrita no Exemplo 1-1 e foi submetido a uma cultura semente primária (cultura estacionária) a 35°C por 22 a 30 horas sob condições anaeróbicas. Quando o crescimento da cepa na cultura semente primária foi confirmada, 8 ml da cultura semente primária foi inoculada em um frasco de cultura de 11 contendo 800 ml de um meio estéril tendo o mesmo meio da composição e foi submetido à cultura semente secundária (cultura estacionária) a 35°C por 8 a 15 horas sob condições anaeróbicas.

1-3: Cultura principal da cepa de Clostridium botulinum

[063] De modo a produzir uma toxina botulínica pela cultura da cepa de Clostridium botulinum, foi realizada a cultura principal da cepa. Especificamente, 9,3 l de um meio contendo a composição descrita no Exemplo 1-1 foi preparado e colocado em um incubador de 101, seguido pela esterilização do meio. Foi fornecido nitrogênio para criar condições anaeróbicas e o crescimento da cepa foi realizado na temperatura de 35°C e uma velocidade de agitação de 50 rpm.

[064] A cepa no frasco de cultura de 11 submetida à cultura semente secundária no Exemplo 1-2 foi inoculada em um incubador de 101 através de uma linha de inoculação conectada à porta de inoculação do incubador de 101. A cepa de Clostridium botulinum no incubador de 101 foi cultivada sob condições de 35°C e 50 rpm e o conjunto de condições de cultura foi mantido. Quando a cepa foi cultivada por 100 horas ou mais, a cultura principal foi completada.

Exemplo 2: Produção da toxina botulínica 2-1: Etapa de precipitação com ácido sulfúrico

[065] A etapa de precipitação com ácido sulfúrico é um processo de separação de proteína em que o ácido sulfúrico é adicionado à cultura, contendo vários tipos de proteínas, para reduzir o pH da cultura de modo que as proteínas alcancem o ponto isoelétrico para precipitar. A cultura principal foi realizada como descrito no Exemplo 1-3 e após completar a cultura principal, ácido sulfúrico 5N foi adicionado à cultura por um bombeamento automático de modo a atingir um pH de 3,4 a 3,6 como medido pelo sensor de pH do incubador de 101 e então a cultura foi transferida a um container de 201 (AS ONE, Cat. No AS5.372,06) através da linha de coleta do incubador, e o container de 201 contendo o precipitado de ácido sulfúrico foi transferido a uma cabine de segurança biológica(BSC). Então, a precipitação com ácido sulfúrico foi realizada na BSC.

2-2: Tratamento enzimático e extração da toxina

[066] Após a remoção do sobrenadante do precipitado de ácido sulfúrico, 700 ml do tampão fosfato de sódio 1M (pH 5,3) foi adicionado ao precipitado. Então, a solução foi ajustada para um pH de 5,0 a 6,0 pela adição de hidróxido de sódio 5N (NaOH). Para remover o DNA e o RNA do precipitado, 60 ml de benzamidina HCl 0,4M, 1 g de DNase e 1 g de RNase foram adicionadas e reagiram com a solução por cerca de 5 horas para extrair a toxina botulínica.

2-3: Precipitação com ácido clorídrico e dissolução da toxina

[067] A cultura incluindo o extrato da toxina foi centrifugada em 4°C a 12000 x g por 15 minutos para separá-la em pellets e sobrenadante, e o sobrenadante separado foi transferido a um frasco de 101 fresco (AS ONE, Cat. No AS5.372,04) e então ajustado para um pH de 3,4 a 3,6 pela adição de ácido clorídrico 1N (HCl) e submetido à precipitação com ácido clorídrico em um refrigerador a 4°C. O precipitado de ácido hidroclorídrico foi centrifugado em 4°C a 12000 x g por 15 minutos e o sobrenadante foi removido, após isso 50 ml do tampão fosfato de sódio (pH 6,5) foi adicionado aos pellets de toxina para dissolver a toxina.

2-4: Cromatografia de troca aniônica primária

[068] Após completar o processo de precipitação, de modo a remover a maioria das principais impurezas diferentes da toxina botulínica tipo A, a cromatografia foi realizada utilizando uma resina de troca iônica. Especificamente, a resina de troca aniônica (Toyopearl SuperQ-650M, Tosoh Bioscience, P/N 17228) foi acondicionada em uma coluna, após o qual a amostra que precipitou no Exemplo 2-3 foi injetada na coluna e a toxina foi eluída com tampão de eluição fosfato de sódio 50 mM. Na etapa de purificação primária, a proteína toxina botulínica tipo A não foi absorvida pela resina de troca aniônica e a maior parte das principais impurezas foi removida por absorção. Para a purificação da toxina botulínica de alta pureza, a amostra foi mantida em um pH de 4,5 a 7,0 e a condutividade de 5 a 20 mS/cm.

2-5: Precipitação de sulfato de amônio

[069] Frações contendo a proteína toxina botulínica tipo A purificada por cromatografia de troca aniônica foram coletadas e sulfato de amônio foi adicionado a uma concentração de 20 a 40% (p/v) para precipitar a proteína toxina botulínica tipo A novamente. A proteína toxina botulínica tipo A precipitada foi dissolvida novamente em fosfato de sódio 50 mM (pH 6,5).

2-6: Cromatografia de troca aniônica secundária

[070] Após completar o processo de precipitação com sulfato de amônio, de modo a remover impurezas menores diferentes da toxina botulínica tipo A, a cromatografia utilizando resina de troca iônica foi realizada mais uma vez. Especificamente, a resina de troca aniônica (Toyopearl SuperQ-650M, Tosoh Bioscience, P/N 17228) foi acondicionada em uma coluna, após a qual o precipitado de sulfato de amônio dissolvido no Exemplo 2-5 foi injetado na coluna e a toxina foi eluída com tampão de eluição fosfato de sódio 50 mM. Neste momento, a proteína toxina botulínica tipo A não foi absorvida, e as impurezas menores foram removidas por absorção.

[071] A purificação da toxina botulínica de alta pureza é principalmente atingida na etapa de cromatografia de troca aniônica primária, e a etapa de purificação de cromatografia de troca aniônica secundária é realizada de modo a remover impurezas restantes. Para a purificação da toxina botulínica de alta pureza, o precipitado de sulfato de amônio foi mantido em um pH de 4,5 a 7,0 e uma condutividade de 5 a 20 mS/cm.

2-7: Preparação do líquido bruto

[072] Frações contendo a proteína toxina botulínica tipo A purificada por cromatografia de troca aniônica no Exemplo 2-6 foram coletadas, esterilizadas e filtradas através de um filtro de 0,2μm para preparar o líquido bruto. O líquido bruto preparado foi armazenado abaixo de -70°C. A proteína toxina botulínica tipo A produzida foi chamada de “DWP450”.

Exemplo 3: Análise da pureza da toxina botulínica purificada

[073] O HPLC (e2695, Waters) foi realizado por SEC (cromatografia de exclusão de tamanho). A fase móvel utilizada foi tampão fosfato de sódio (pH 6,5) e uma coluna TSKgel G4000SWXL (Tosoh Bioscience, P/N 08542) foi conectada a uma coluna de proteção (Tosoh Bioscience, P/N 08543) para P/N 08542, e 20 yg da proteína toxina botulínica tipo A foi colocada na coluna e deixada fluir na taxa de 1 ml/min por 30 minutos. Como resultado, foi demonstrado que a pureza da toxina botulínica após a cromatografia de troca aniônica primária foi 98,38% (FIG. 2) e a pureza da toxina botulínica após a cromatografia de troca aniônica secundária foi 98,99% (FIG. 3).

Exemplo 4: Avaliação da segurança da toxina botulínica purificada

[074] De modo a confirmar a segurança da proteína toxina botulínica tipo A (DWP450) purificada no Exemplo 2, um teste para comparação com a segurança do BOTOX® (Allergan, Inc.) foi realizado.

[075] Ratos macho brancos SD (Sprague-Dawley) foram divididos dentro dos cinco grupos seguintes, cada um consistindo em 10 machos e 10 fêmeas: um grupo administrado com 30 U/kg de um material de teste (DWP450); um grupo administrado com 60 U/kg do material de teste; um grupo administrado com 30 U/kg de um material comparativo (BOTOX® disponível pela Allergan, Inc.); um grupo administrado com 60 U/kg do material comparativo; e um grupo controle (solução salina). Cada um dos materiais de teste, material comparativo e solução salina foram administrados intramuscularmente um total de cinco vezes, uma vez por semanas, por 5 semanas.

[076] Nos grupos administrados com 60 U/kg do material de teste e 60 U/kg do material comparativo (BOTOX®), cinco fêmeas e cinco machos foram adicionalmente adicionados e um teste de toxicidade comparativo foi realizado por um período de recuperação de 12 semanas de modo a avaliar a reversibilidade da toxicidade (Tabela 1). Tabela 1: Avaliação da segurança da toxina botulínica purificada

[077] Como resultado, foi demonstrado que a toxina botulínica (DWP450) produzida pelo método da presente invenção mostrou um valor NOAEL de 60 U/kg para fêmeas, sugerindo que é duas vezes mais seguro que o BOTOX® (Allergan, Inc.), mostrando um valor NOAEL de 30 U/kg. A segurança duas vezes maior da toxina botulínica da presente invenção, parece ser devido à toxina botulínica da presente invenção ter maior pureza e, portanto, tem capacidade aumentada para agir em um sítio local de modo que a circulação sistêmica da toxina botulínica, que poderia resultar em efeito colaterais, foi reduzida.

Exemplo 5: Avaliação do efeito da toxina botulínica purificada

[078] De modo a avaliar o efeito da proteína toxina botulínica tipo A (DWP450) purificada no Exemplo 2, as amplitudes do potencial de ação muscular do composto (CMAP) e as velocidades de condução (tC) foram medidas.

[079] Especificamente, 24 ratos brancos SD (Sprague-Dawley) foram divididos aleatoriamente em quatro grupos, cada um consistindo em seis ratos. Duas proteínas toxina botulínica tipo A diferentes, BTX-A-1 (BOTOX®, Allergan Inc., California, USA) e BTX-A-2 (DWP450) purificada no Exemplo 2, foram utilizadas. As duas formulações tiveram características substancialmente idênticas como mostrado na Tabela 2 abaixo e a toxina botulínica diluída com solução salina 0,9% foi utilizada em todos os procedimentos. Os ratos foram anestesiados por injeção intraperitoneal de 10 mg/kg de cloridrato de quetamina, e então BTX-A-1 e BTX-A-2 foram administrados ao músculo tibial anterior (TA) dos ratos. Tabela 2: Comparação das características entre BTX-A-1 e BTX-A-2

[080] No grupo 1, 0,08 m£ de cloreto de sódio (NaCl) foi administrado a um músculo TA e o outro músculo TA não foi tratado. No grupo 2, 0,02 m£ do BTX-A-1 (duas unidades) foi administrada a um músculo TA e 0,02 m£ do BTX-A-2 (duas unidades) foi administrado a outro músculo TA. No grupo 3, 0,04 m£ do BTX- A-1 (quatro unidades) foi administrado a um músculo TA e 0,04 m£ do BTX-A-2 (quatro unidades) foi administrado a outro músculo TA. No grupo 4, 0,08 m£ do BTX-A-1 (oito unidades) foi administrado a um músculo TA e 0,08 m£ do BTX-A-2 (oito unidades) foi administrado a outro músculo.

[081] O nível de atraso em CMAPs e velocidades de condução foram medidos utilizando CyberAmp380 e Digidata1320 (Axon Instruments. Inc, USA). Os eletrodos utilizados foram ligados à pele utilizando um clip alligator. O eletrodo negativo foi ligado ao músculo poplíteo e o eletrodo positivo foi ligado ao espaço retropúbico e o trocanter maior do fêmur. O eletrodo de registro foi ligado ao músculo do ventre do músculo da tíbia anterior e o eletrodo de registro de referência foi ligado ao tendão calcâneo anterior esquerdo e à sola.

[082] Um estímulo elétrico de 1 a 5 mA foi aplicado em uma taxa de estímulo lento de 2 Hz e uma taxa de estímulo rápido de 20 Hz. O efeito paralítico no músculo TA foi determinado pela medida da amplitude pico-a-pico de CMAPs (dY), e o atraso na condução de velocidade foi determinada pela medida do espaço de tempo entre o ponto de estímulo e o ponto de pico negativo.

[083] A análise por estímulo elétrico foi realizada antes da administração do BTX-A-1 e BTX-A-2 e em 3 dias, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas e 4 semanas após a administração e os CMAPs e as velocidades de condução causadas pela administração do BTX-A- 1 e BTX-A-2 foram analisadas por ANOVA utilizando SAS (Versão 9.2, SAS Institute Inc., USA).

[084] Como resultado, foi observado que, na taxa de estímulo lento de 2 Hz, os grupos administrados com BTX-A-1 e BTX-A-2 mostraram um efeito paralítico no músculo TA (dY) em 3 dias, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas e 4 semanas após a administração (FIG. 4A), e na taxa de estímulo rápido de 20 Hz, os grupos administrados com BTX-A-1 e BTX-A-2 mostraram um efeito paralítico no músculo TA (dY) em 3 dias, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas e 4 semanas após a administração (FIG. 4B).

[085] Não houve diferença significativa (p < 0,05) entre BTX-A-1 e BTX-A-2 na taxa de estímulo lento de 2Hz e uma taxa de estímulo rápido de 20 Hz, e o efeito paralítico no músculo TA (dY) nos grupos administrados com BTX-A-1 e BTX-A-2 foi relacionado à dosagem de toxina botulínica administrada.

[086] As velocidades de condução (tC) causadas pela administração do BTX-A-1 e BTX-A-2 foram medidas e, como resultado, foi demonstrado que os grupos administrados com BTX- A-1 e BTX-A-2 não induziram um atraso na velocidade de condução na taxa de estímulo lento de 2 Hz e uma taxa de estímulo rápido de 20 Hz.

[087] Especificamente, foi demonstrado que a toxina botulínica produzida pelo método da presente invenção exibiu um efeito similar ao com comercialmente disponível BOTOX® (Allergan, Inc.).

Aplicabilidade Industrial

[088] O uso do método inventivo para a produção de uma toxina botulínica torna possível produzir uma toxina botulínica de alta pureza por um processo simples, sugerindo que o método inventivo é muito econômico e eficiente. A toxina botulínica produzida pelo método da presente invenção tem alta pureza comparada às toxinas botulínicas produzidas por métodos convencionais e, portanto, tem uma capacidade aumentada para agir em uma área local. Portanto, a circulação sistêmica da toxina botulínica, que pode resultar em efeitos colaterais, é reduzida para aumentar a segurança. Assim, a toxina botulínica da presente invenção pode ser utilizada para vários propósitos, incluindo tratamento de distúrbios neuromusculares, remoção de rugas e tratamento de hemiplegia espástica e paralisia cerebral.

[089] Apesar de a presente invenção ter sido descrita em detalhes com referência para às característica específicas, será aparente aos especialistas na técnicas que esta descrição é apenas para uma modalidade preferida e não limita o escopo da presente invenção. Portanto, o escopo substancial da presente invenção será definido pelas reivindicações em anexo e equivalentes das mesmas.

Claims

1. Método para produção da toxina botulínica, caracterizado por compreender as etapas de: (a) tratar a cultura da cepa produtora de toxina botulínica com ácido para precipitar a toxina botulínica; (b) adicionar tampão à toxina botulínica precipitada, seguido pelo tratamento com um inibidor de protease e nuclease, assim extraindo a toxina botulínica; (c) tratar a toxina botulínica extraída com ácido para precipitar a toxina botulínica e dissolver o precipitado em tampão; (d) purificar a toxina por cromatografia de troca aniônica; e onde o tratamento com ácido da etapa (c) compreende a adição, à toxina botulínica extraída, de ácido sulfúrico ou ácido clorídrico, onde o pH da toxina botulínica extraída atinge um pH de 2,5 a 4,5.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cepa produtora da toxina botulínica é Clostridium botulinum.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a toxina botulínica purificada é uma proteína toxina botulínica tipo A tendo pureza de pelo menos 98%.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de precipitação com ácido (a) é realizada pela adição de ácido sulfúrico ou ácido clorídrico à cultura da cepa, de modo que a cultura alcance um pH de 3,0 a 4,5.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o inibidor de protease na etapa (b) é benzamidina HCl.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a nuclease na etapa (b) é DNase e RNase.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a extração da toxina botulínica na etapa (b) é realizada em um pH de 4,5 a 6,5.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tampão na etapa (c) é tampão fosfato de sódio.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cromatografia de troca aniônica na etapa (d) é realizada em um pH de 3,5 a 7,5, e uma condutividade de 3-30 mS/cm.

10. Método, de acordo com qualquer a reivindicações 1, caracterizado por compreender ainda, após a etapa (d), as etapas de: (e) tratar a fração de cromatografia de troca aniônica contendo a toxina botulínica com sulfato de amônio para formar um precipitado e dissolver o precipitado em tampão; e; (f) purificar a toxina botulínica por cromatografia de troca aniônica.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o sulfato de amônia na etapa (e) é adicionado na concentração de 10 a 50% (p/v).

12. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o tampão na etapa (e) é tampão fosfato de sódio.

13. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a cromatografia de troca aniônica na etapa (e) é realizada em um pH de 3,5 a 7,5, e uma condutividade de 3 a 30 mS/cm.