JP6574528B2 - ボツリヌス毒素の製造方法 - Google Patents

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Description

本発明は、動物由来成分を含まない（Ａｎｉｍａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｆｒｅｅ、ＡＰＦ）工程を用いるボツリヌス毒素の製造方法に関し、より詳しくは（ａ）ボツリヌス毒素の生産菌株培養液を酸で処理して酸沈殿させるステップと、（ｂ）前記ステップ（ａ）におけるボツリヌス毒素を含む沈殿物に緩衝液を添加した後、深層濾過（ｄｅｐｔｈ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＤＦ）、精密濾過（ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＭＦ）、限外濾過（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＵＦ）、滅菌濾過（ｓｔｅｒｉｌｅ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、メンブレンクロマトグラフィー（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＭＣ）、および遠心分離（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）からなる群から選択される１つ以上の方法により浄化（ｃｌａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）するステップと、（ｃ）前記ステップ（ｂ）における浄化されたボツリヌス毒素を含む溶液に対して、ＵＦダイアフィルトレーション（ＵＦ ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、硫酸アンモニウム沈殿、または塩酸沈殿を行った後、前記ＵＦダイアフィルトレーションの透析残留物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を緩衝液に希釈するか、硫酸アンモニウム沈殿または塩酸沈殿の沈殿物を緩衝液に溶解させるステップと、（ｄ）前記ステップ（ｃ）における希釈された透析残留物、硫酸アンモニウム沈殿物の溶解物、または塩酸沈殿物の溶解物に対して、陰イオン交換クロマトグラフィー（Ａｎｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＡＥＸ）を用いてボツリヌス毒素を精製するステップと、を含む、ボツリヌス毒素の製造方法に関する。
神経毒性を持つ毒素を分泌する種々のクロストリジウム属菌株が１８９０年代から今まで発見されて、過去７０年間これらの菌株が分泌する毒素に対する特性解明がなされてきた（Ｓｃｈａｎｔ，Ｅ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，５６：８０，１９９２）。
前記クロストリジウム属菌株から由来した神経毒性を持つ毒素、すなわちボツリヌス毒素（ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｏｘｉｎ）は、その血清学的特徴によりＡ〜Ｇ型の七つの型に区分される。各毒素は、約１５０ｋＤａ程度の毒素タンパク質を有しているが、自然的には種々の非毒性タンパク質と結合されている複合体からなっている。中間（Ｍｅｄｉｕｍ）複合体（３００ｋＤａ）は、毒素タンパク質と非毒性−非ヘマグルチニンタンパク質からなり、大きい（Ｌａｒｇｅ；４５０ｋＤａ）複合体および巨大（Ｌａｒｇｅ−Ｌａｒｇｅ；９００ｋＤａ）複合体は、中間複合体がヘマグルチニンと結合されている形態を有している（Ｓｕｇｉｙａｍａ，Ｈ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、４４：４１９，１９８０）。このような非毒性非ヘマグルチニンタンパク質は腸内で低いｐＨと各種タンパク質加水分解酵素から毒素を保護する機能をすると知られている。
前記毒素は、細胞内で分子量が約１５０ｋＤａである一つのポリペプチドで合成された後、細胞内タンパク質分解酵素の作用やトリプシンのような人為的な酵素処理によってＮ末端から１／３になる位置で切断されて、二つ単位体である軽鎖（Ｌ：ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）（分子量；５０ｋＤａ）および重鎖（Ｈ：ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）（分子量；１００ｋＤａ）に分けられる。このように分けられた毒素は、単一ポリペプチドである時に比べてその毒性が大きく増加する。二つの単位体は、二硫化結合によって連結されていて、それぞれは異なる機能を有する。重鎖は目標物（ｔａｒｇｅｔ）になる細胞の受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）と結合して（Ｐａｒｋ．Ｍ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，７２：２４３，１９９０）、低いｐＨ（ｐＨ４）で生体膜と反応してチャネル（ｃｈａｎｎｅｌ）を形成する機能を有して（Ｍａｎｔｅｃｕｃｃｏ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，ＴＩＢＳ．，１８：３２４，１９９３）、軽鎖は薬理活性を持っていて洗剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）を使って細胞に透過性を与えたり、電気穿孔（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）等で細胞内投入された時に神経伝達物質の分泌を妨げる（Ｐｏｕｌａｉｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８５：４０９０，１９８８）。
前記毒素は、神経筋接合部（ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）のコリン性前シナプス（ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ ｐｒｅｓｙｎａｐｓｅ）でアセチルコリンのエキソサイトーシス（ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ）を阻害して無力症を引き起こす。極微量の毒素を処理しても毒性が現れることからこの毒素は何らかの酵素活性を持つと考えられられてきた（Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｌ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｅｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，２６：４２７，１９８６）。
最近明らかになったところによると、毒素はメタロペプチダーゼ活性（ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を持っていて、その基質は、エキソサイトーシス装置複合体（ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ ｍａｃｈｉｎａｒｙ ｃｏｍｐｌｅｘ）をなす単位タンパク質であるシナプトブレビン（Ｓｙｎａｐｔｏｂｒｅｖｉｎ）、シンタキシン（Ｓｙｎｔａｘｉｎ）、２５ｋＤａのシナプトソーム関連タンパク質（Ｓｙｎａｐｔｏｓｏｍａｌ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ２５ＫＤａ）（ＳＮＡＰ２５）等である。各型の毒素は、この三つのタンパク質中一つを基質としているが、Ｂ、Ｄ、ＦおよびＧ型は、シナプトブレビンを、ＡとＥ型はＳＮＡＰ２５を、Ｃ型はシンタキシンを特定部位で切断すると知られている（Ｂｉｎｚ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：９１５３，１９９４）。
特に、ボツリヌス毒素Ａ型は、ｐＨ４．０〜６．８の薄い水溶液に溶解性であると知られている。約７以上のｐＨで安定化非−毒素タンパク質が神経毒素から分離されて、その結果毒性が徐々に失われるが、特にｐＨおよび温度が上昇するにつれ毒性が減少すると知られている。
前記ボツリヌス毒素は、少量で体に致命的で大量生産が容易であるため、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、ペスト（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、天然痘（ｓｍａｌｌｐｏｘ ｖｉｒｕｓ）と共に４大生物テロ武器で使われることができる毒素である。しかし、前記ボツリヌス毒素（ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｏｘｉｎ）中Ａ型毒素の場合には、全身的には体に影響を及ぼさない容量以下で注射すると、前記注射部位の局所筋肉を麻痺させることができると明らかになり、このような特性を利用してシワ除去剤、強直性片麻痺および脳性麻痺の治療剤などで広範囲に使用することができるので、需要が急増していて需要に合わせてボツリヌス毒素の生産方法に対する研究が盛んに行われている。
現在代表的に商用化されている製品は、米国アラガン（Ａｌｌｅｒｇａｎ）社のＢＯＴＯＸＲ（ボツリヌス毒素Ａ型精製された神経毒素複合体）で、それぞれのＢＯＴＯＸＲの１００ユニットバイアルは、約５ｎｇの精製されたボツリヌス毒素Ａ型複合体、０．５ｍｇヒト血清アルブミン、および０．９ｍｇ塩化ナトリウムで構成されて、真空−乾燥形態で提供されて、保存剤なしに（０．９％塩化ナトリウム注入）滅菌生理食塩水を利用して復元させる。他の商用化された製品は、英国Iｐｓｅｎ社のＤｙｓｐｏｒｔＲ（ボツリヌス毒素薬剤学的組成物中ラクトースおよびヒト血清アルブミンを有するクロストリジウムボツリヌスＡ型毒素ヘマグルチニン複合体、使用前に０．９％塩化ナトリウムを利用して復元される）およびＳｏｌｓｔｉｃｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＭｙｏＢｌｏｃＴＭ（ボツリヌス毒素Ｂ型、ヒト血清アルブミン、コハク酸ナトリウム、および塩化ナトリウムを含む薬ｐＨ５．６注射溶液）等がある。
従来のボツリヌス毒素を製造するためには、酸沈殿法、塩による析出法、およびクロマトグラフィー法などが用いられてきた。
例えば、日本特許出願公開第１９９４−１９２２９６号には、クロストリジウムボツリヌス菌株を培養した後、酸沈殿、抽出、核酸除去剤の添加、および結晶化ステップを経て結晶型（ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ）のボツリヌスＡ型毒素を製造する方法が開示されている。また、米国特許登録第５６９６０７７号には、クロストリジウムボツリヌス菌株を培養し、それを酸沈殿、抽出、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル浸透クロマトグラフィー、および結晶化ステップを経てボツリヌスＢ型毒素を製造する方法が開示されている。
一方、Ｓｉｍｐｓｏｎ等は、重力流クロマトグラフィーを用いたボツリヌス神経毒素の精製、ＨＰＬＣ、親和性樹脂を用いた捕獲ステップ、サイズ排除クロマトグラフィー、および２つの異なるイオン交換カラムの使用を含むイオン（陰イオンおよび陽イオン）交換クロマトグラフィーを用いてボツリヌスＡ型毒素を製造しており（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１６５：７６，１９８８）、Ｗａｎｇ等は、ボツリヌス毒素Ａ型を精製するための沈殿とイオンクロマトグラフィー方法を用いた(Dermatol Las Faci Cosm Surg., 2002:58, 2002)。
また、米国特許登録第６８１８４０９号には、ボツリヌス毒素を精製するためのイオン交換およびラクトースカラムの使用が開示されており、米国特許登録第７４５２６９７号には、イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性クロマトグラフィーを用いてボツリヌスＡ型毒素を製造する方法が開示されている。韓国特許出願公開第２００９−００９１５０１号には、酸沈殿および陰イオン交換クロマトグラフィー方法を用いてボツリヌス毒素を精製する方法が、米国特許出願公開第２０１３−０１５６７５６号には、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび陽イオン交換クロマトグラフィー方法を用いたボツリヌス毒素の精製方法が開示されている。
しかし、従来の方法における陰イオン交換クロマトグラフィーの使用は、ボツリヌス毒素のゲルバンドパターン（ｇｅｌ ｂａｎｄｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎ）に有害な影響を与え（米国特許登録第７４５２６９７号）、精製期間が長いため、商業的に適用しにくいなどの問題が残っている。また、ボツリヌス毒素の生産菌株であるクロストリジウムボツリヌスは嫌気性菌株であって、嫌気性施設内で醗酵を行わなければならないため、大量生産が困難であるという問題があり、上記の精製方法により精製された有効成分である前記ボツリヌス毒素が明確に分離同定されないため、不純物が含まれるという問題があった。また、従来のボツリヌス毒素の製造方法は、高純度のボツリヌス毒素を精製するために濾過または透析工程などが必須に含まれるため、精製過程が複雑で且つ難しいという問題があった。
また、従来のボツリヌス毒素の製造工程では、ＤＮＡやＲＮＡのような核酸を除去するために、ＤＮａｓｅやＲＮａｓｅなどの酵素を用いてきた（韓国特許登録第１０−１３３９３４９号および図１のボツリヌス毒素の従来の製造方法などを参照）。しかしながら、ＤＮａｓｅやＲＮａｓｅなどの酵素は動物由来のものであるため、各種疾病の原因となる物質、特に、伝染性海綿状脳症の誘発因子として知られている動物由来の異常プリオン（ａｂｎｏｒｍａｌ ｐｒｉｏｎ）などが含まれている可能性が排除できないため、安全性の点における問題を有している。
伝染性海綿状脳症（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ Ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ：ＴＳＥ）は、致命的な神経の退行性疾患を引き起こす一種の退行性神経疾患で、ＢＳＥ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ、牛海綿状脳症（狂牛病））、スクレイピー（Ｓｃｒａｐｉｅ）、クロイツフェルト・ヤコブ病（Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ−Ｊａｃｏｂ Ｄｉｓｅａｓｅ，ＣＪＤ）、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群（Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、クールー病（Ｋｕｒｕ）、伝染性ミンク脳症（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ Ｍｉｎｋ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）、シカの慢性消耗病（Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｗａｓｔｉｎｇ Ｄｉｓｅａｓｅ）、ネコ海綿状脳症（Ｆｅｌｉｎｅ Ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）等のヒトおよび動物で発病して、牛海綿状脳症の場合、種間障壁（ｓｐｅｃｉｅｓ ｂａｒｒｉｅｒ）を越えてヒトにも発病すると報告されている。
伝染性海綿状脳症の原因体は、免疫原性がなく、長い潜伏期を有する特徴がある。牛海綿状脳症、すなわち狂牛病に感染した牛の脳の事後分析から、神経細胞の破壊と異常タンパク質繊維の沈積によって脳にスポンジ（海綿状）形態の特異なパターンの空胞が形成されたことを確認することができる。
伝染性海綿状脳症の原因と考えられる病原体は、異常プリオン（ａｂｎｏｒｍａｌ ｐｒｉｏｎ）と呼ばれる感染タンパク質である。核酸を必要とする一般ウイルスの場合とは異なり、異常プリオンは、核酸を含まずタンパク質のみからなる感染粒子である。伝染性海綿状脳症は、正常プリオン（ＰｒＰｃ）に感染性因子である異常プリオン（ＰｒＰｓｃ）が結合するようになると病原性プリオンに転換されて、このような病原性プリオンが脳に蓄積されると知られている（Ｐｒｕｓｉｎｅｒ ＳＢ，Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｄｉｓ Ａｓｓｏｃ Ｄｉｓｏｒｄ．，３：５２−７８，１９８９）。
クロイツフェルト・ヤコブ病は、ヒト伝染性海綿状脳症（伝染性海面両脳症、Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ Ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ：ＴＳＥ）の珍しい神経退行性疾患で、伝染性物質は、プリオンタンパク質の異常な変異体であることは明らかである。クロイツフェルト・ヤコブ病がある個体は、明らかに完全な健康状態から６ヶ月以内に無動無言症（ａｋｉｎｅｔｉｃ ｍｕｔｉｓｍ）に悪化され得る。したがって、動物由来産物を使用して得られるボツリヌス毒素のような生物製剤を含む薬剤学的組成物を投与する場合、クロイツフェルト・ヤコブ病のような、プリオン媒介疾患を得るようになる危険性が存在する。したがって、動物由来成分を使用して産生した原液を利用して医薬品を製造する場合、患者が様々な病原体または感染性物質を受け入れるようになる危険性が存在する。
したがって、全世界的に、かかる動物由来成分による伝染性海綿状脳症の感染などの安全性問題を解決するために、動物由来成分が含まれていない（Ａｎｉｍａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｆｒｅｅ：ＡＰＦ）工程を用いたボツリヌス毒素の製造方法の必要性が強く求められている状況である。
このような技術的背景の下で、本発明者らは、プリオン媒介疾患（伝染性海綿状脳症（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ Ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ：ＴＳＥ））に露出する危険を予防し、ボツリヌス毒素の純度を向上させることができる方法を開発するために鋭意努力した結果、ボツリヌス毒素の生産菌株培養液を酸で処理してボツリヌス毒素を酸沈殿させた後、形成された沈殿物を、前処理工程である深層濾過（ｄｅｐｔｈ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＤＦ）、精密濾過（ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＭＦ）、限外濾過（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＵＦ）、滅菌濾過（ｓｔｅｒｉｌｅ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、メンブレンクロマトグラフィー（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＭＣ）、および遠心分離（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）からなる群から選択される１つ以上の技法を用いたボツリヌス毒素の浄化（ｃｌａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）とともに、ＵＦダイアフィルトレーション（ＵＦ ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、硫酸アンモニウム沈殿、または塩酸沈殿から選択される１つの方法と陰イオン／陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製すると、動物由来産物が用いられる酵素処理ステップが省略可能であるため、プリオン媒介疾患が得られる危険性がなく、ボツリヌス毒素の純度を向上させることができることを確認し、本発明を成すに至った。
本発明の目的は、動物由来産物がない（ＡＰＦ（Ａｎｉｍａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｆｒｅｅ）条件で行われることができるより効率よくかつ安全なボツリヌス毒素の製造方法を提供するところにある。
より具体的に、本発明の目的は、前処理工程でＡＰ（Ａｎｉｍａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ）を用いる酵素処理ステップを深層濾過（ｄｅｐｔｈ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＤＦ）、精密濾過（ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＭＦ）、限外濾過（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＵＦ）、滅菌濾過（ｓｔｅｒｉｌｅ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、メンブレンクロマトグラフィー（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＭＣ）、および遠心分離（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）からなる群から選択される１つ以上の技法を用いたボツリヌス毒素の浄化（ｃｌａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）とともに、ＵＦダイアフィルトレーション（ＵＦ ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、硫酸アンモニウム沈殿、または塩酸沈殿から選択される１つの方法に代替し、 次いで、陰イオン交換クロマトグラフィーをさらに行うことによって、非常に高い収率で安全性が保障されるボツリヌス毒素を製造する方法を提供するところにある。
前記目的を達成するために、本発明は、（ａ）ボツリヌス毒素の生産菌株培養液を酸で処理して酸沈殿させるステップと、（ｂ）前記ステップ（ａ）におけるボツリヌス毒素を含む沈殿物に緩衝液を添加した後、深層濾過（ｄｅｐｔｈ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＤＦ）、精密濾過（ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＭＦ）、限外濾過（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＵＦ）、滅菌濾過（ｓｔｅｒｉｌｅ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、メンブレンクロマトグラフィー（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＭＣ）、および遠心分離（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）からなる群から選択される１つ以上の方法により浄化（ｃｌａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）するステップと、（ｃ）前記ステップ（ｂ）における浄化されたボツリヌス毒素を含む溶液に対して、ＵＦダイアフィルトレーション（ＵＦ ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、硫酸アンモニウム沈殿、または塩酸沈殿を行った後、前記ＵＦダイアフィルトレーションの透析残留物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を緩衝液に希釈するか、硫酸アンモニウム沈殿または塩酸沈殿の沈殿物を緩衝液に溶解させるステップと、（ｄ）前記ステップ（ｃ）における希釈された透析残留物、硫酸アンモニウム沈殿物の溶解物、または塩酸沈殿物の溶解物に対して、陰イオン交換クロマトグラフィー（Ａｎｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＡＥＸ）を用いてボツリヌス毒素を精製するステップと、を含む、ボツリヌス毒素の製造方法を提供する。
本発明によるボツリヌス毒素の製造過程と従来の製造過程を比較した模式図である。 ボツリヌス毒素の陰イオン交換クロマトグラフィー精製（ＡＥＸ）ステップのクロマトグラムを示したものである。 陰イオン交換クロマトグラフィー精製（ＡＥＸ）ステップの後、ボツリヌス毒素の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果を示したものである。 ボツリヌス毒素の一次陰イオン交換クロマトグラフィー精製（ＡＥＸ）ステップ、二次陰イオン交換クロマトグラフィー精製（ＡＥＸ、ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅ）ステップ、および陽イオン交換クロマトグラフィー精製（ＣＥＸ）ステップのクロマトグラムを示したものである。 一次陰イオン交換クロマトグラフィー精製（ＡＥＸ）ステップ、二次陰イオン交換クロマトグラフィー精製（ＡＥＸ、ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅ）ステップ、および陽イオン交換クロマトグラフィー精製（ＣＥＸ）ステップの後、ボツリヌス毒素の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果を示したものである。 ボツリヌス毒素の一次陰イオン交換クロマトグラフィー精製（ＡＥＸ）ステップ、二次陰イオン交換クロマトグラフィー精製（ＡＥＸ、ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｏｄｅ）ステップ、および陽イオン交換クロマトグラフィー精製（ＣＥＸ）ステップのクロマトグラムを示したものである。 一次陰イオン交換クロマトグラフィー精製（ＡＥＸ）ステップ、二次陰イオン交換クロマトグラフィー精製（ＡＥＸ、ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｏｄｅ）ステップ、および陽イオン交換クロマトグラフィー精製（ＣＥＸ）ステップの後、ボツリヌス毒素の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果を示したものである。
他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。
本発明は、ＡＰＦ（Ａｎｉｍａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｆｒｅｅ）および低分子のボツリヌス毒素工程を開発するために、従来の工程のうち、ＡＰ（Ａｎｉｍａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ）を用いる酵素処理ステップに代替可能な工程を開発しようとした。したがって、深層フィルタ（Ｄｅｐｔｈ ｆｉｌｔｅｒ）を用いた濾過（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）および従来の塩酸沈殿工程の他に、硫酸アンモニウムを用いた工程およびＵＦシステムを用いた工程をともに行った結果、従来の方法により生産されたボツリヌス毒素に比べて高い純度を示すことを確認し、前記方法を用いると、ＴＳＥフリー（ＴＳＥ−ｆｒｅｅ）の条件で菌株の培養物から高純度のボツリヌス毒素を安全に製造することができた。
本発明で相互交換的に用いられる用語「工程」または「分離」は、精製工程で特定の結果（例えば、ボツリヌス毒素の精製）を達成するための１つ以上の方法または装置の利用を指し示す。
本発明の一様態において、深層濾過（ｄｅｐｔｈ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＤＦ）、精密濾過（ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＭＦ）、限外濾過（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＵＦ）、滅菌濾過（ｓｔｅｒｉｌｅ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、メンブレンクロマトグラフィー（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＭＣ）、および遠心分離（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）からなる群から選択される１つ以上の技法によりボツリヌス毒素を浄化（ｃｌａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）した後、ＵＦダイアフィルトレーション（ＵＦ ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）または酸沈殿を行った場合、陰イオン交換クロマトグラフィー精製（Ａｎｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＡＥＸ）工程だけでも、満足のいくレベルの純度を有するボツリヌス毒素を製造することができた。
したがって、一観点において、本発明は、ボツリヌス毒素の製造方法に関し、より詳細には、
（ａ）ボツリヌス毒素の生産菌株培養液を酸で処理して酸沈殿させるステップと、
（ｂ）前記ステップ（ａ）におけるボツリヌス毒素を含む沈殿物に緩衝液を添加した後、深層濾過（ｄｅｐｔｈ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＤＦ）、精密濾過（ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＭＦ）、限外濾過（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＵＦ）、滅菌濾過（ｓｔｅｒｉｌｅ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、メンブレンクロマトグラフィー（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＭＣ）、および遠心分離（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）からなる群から選択される１つ以上の方法により浄化（ｃｌａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）するステップと、
（ｃ）前記ステップ（ｂ）における浄化されたボツリヌス毒素を含む溶液に対して、ＵＦダイアフィルトレーション（ＵＦ ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、硫酸アンモニウム沈殿、または塩酸沈殿を行った後、前記ＵＦダイアフィルトレーションの透析残留物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を緩衝液に希釈するか、硫酸アンモニウム沈殿または塩酸沈殿の沈殿物を緩衝液に溶解させるステップと、
（ｄ）前記ステップ（ｃ）における希釈された透析残留物、硫酸アンモニウム沈殿物の溶解物、または塩酸沈殿物の溶解物に対して、陰イオン交換クロマトグラフィー（Ａｎｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＡＥＸ）を用いてボツリヌス毒素を精製するステップと、
を含む、ボツリヌス毒素の製造方法に関する。
本発明の製造方法により精製されたボツリヌス毒素は、７Ｓまたは１９Ｓの構成形態（分子量では約１５０〜９００ｋＤａ）を有することを特徴とする。
本発明において、ボツリヌス毒素の生産菌株は、クロストリジウムボツリヌス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）またはその変異体であることが好ましいが、これに限定されるものではなく、ボツリヌス毒素の生産が可能な菌株であれば何れも使用可能であることは、通常の技術者にとって明らかである。
本発明の「ボツリヌス毒素」とは、クロストリジウムボツリヌス菌株またはその変異体により生成された神経毒素（Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ、ＮＴＸｓ）だけでなく、変形、組換え、ハイブリッド、およびキメラボツリヌス毒素を意味する。組換えボツリヌス毒素は、非−クロストリジウム種によって組換えにより製造された軽鎖および／または重鎖を有することができる。また、本発明の「ボツリヌス毒素」は、ボツリヌス毒素血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧを包括し、ボツリヌス毒素複合体（すなわち、３００、６００、および９００ｋＤａ複合体）だけでなく、純粋ボツリヌス毒素（すなわち、約１５０ｋＤａ神経毒性分子）の両方を包括して、これらは何れも本発明の実施において有用である。
ボツリヌス毒素の主成分であるＮＴＸｓ（７Ｓ）は、菌株培養用培地または食品で非毒素成分と結合されて大きい複合体を成す(Oguma et al., "Structure and function of Clostridium botulinum progenitor toxin.", J. Toxical-Toxin Reviews, 18:17-34, 1999)。ボツリヌス毒素血清型Ａを生成するＡ型菌株（Ｔｙｐｅ Ａ ｓｔｒａｉｎ）は３つの構成形態（ｆｏｒｍ）の前駆体毒素（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｔｏｘｉｎｓ）を生成し、これはＬＬ（１９Ｓ、９００ｋＤａ）、Ｌ（１６Ｓ、５００ｋＤａ）、およびＭ（１２Ｓ、３００ｋＤａ）毒素である。これらは何れも完全に活性化したものと見なされる。これに対し、Ｂ型、Ｃ型、およびＤ型菌株は、２つの構成形態であるＬおよびＭを生成する。また、Ｅ型、Ｆ型、およびＧ型は単一形態の毒素のみを生成するが、Ｅ型およびＦ型はＭ毒素を生成し、Ｇ型はＬ毒素を生成する。Ｍ毒素は、ＮＴＸ（７Ｓ、１５０ｋＤａ）およびヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ、ＨＡ）活性を示さない非毒素成分(Non-Toxic Non-HA, NTNH)で構成されている。
本発明の「製造されたボツリヌス毒素」とは、ボツリヌス毒素が培養または醗酵工程より得られる際に、ボツリヌス毒素に同伴し得る他のタンパク質および不純物から分離されるか実質的に分離された純粋ボツリヌス毒素、またはボツリヌス毒素複合体を意味する。したがって、製造されたボツリヌス毒素は、少なくとも９０％、好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の純度を有する。特に好ましくは、本発明において、製造されたボツリヌス毒素は、純度９８％以上のボツリヌス毒素Ａ型タンパク質であることを特徴とする。
ボツリヌス毒素を製造するためのクロストリジウムボツリヌス菌株の培養は、当業界に公知の通常の方法を用いて行われ、培養のために使用可能な通常の培地を用いて培養可能である。
非制限的な例として、クロストリジウムボツリヌス菌株の培養のための培地には、カゼイン加水分解物（Ｃａｓｅｉｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ）、酵母抽出物、グルコースなどが含まれてもよく、２５〜４０℃の温度で９０〜１８０時間、好ましくは１００〜１５０時間培養する。
本発明において、前記ステップ（ａ）での酸沈殿ステップは、培養を終了した後、ｐＨが３．０〜４．５、好ましくはｐＨが３．３〜４．０、最も好ましくはｐＨが３．４〜３．６となるように、酸、好ましくは硫酸または塩酸を添加することによって行われることができる。
本発明において、前記ステップ（ａ）での酸沈殿ステップは、ボツリヌス菌株を培養した後に残っている菌株を全て死滅させ、多くの種類のタンパク質溶液に酸を加えることでｐＨを低下させることにより、タンパク質が等電点に達することとなって沈殿される原理を用いたステップである。広い意味では結晶化も含まれ、純粋に精製するのに重点を置いた結晶化に比べて、沈殿法は、混合された状態で目的物を粗く分離する方法である。通常、沈殿法は、目的の物質と構造的に類似の不純物がともに沈殿される。この際、ｐＨを約３．０〜４．５に調節する。前記ボツリヌス毒素の回収率はｐＨが低いほど高くなるが、ｐＨが３．０以下になる場合には、前記ボツリヌス毒素自体に影響を与えることとなり、ｐＨが４．５以上になる場合には、前記ボツリヌス毒素の回収率が低くなるため、上記の範囲内で行われることが好ましい。特に、ｐＨが３．４〜３．６である際に、前記ボツリヌス毒素の回収率が最も高いため、最も好ましい。ボツリヌス菌株の培養液に酸を徐々に加えた後、ｐＨが適切な範囲に達すると、それ以上のｐＨ変化を示さない時まで添加した後、常温で１５時間〜３０時間放置してから、上澄液を除去する。
本発明において、前記ステップ（ａ）での酸沈殿は、１回またはそれ以上の回数で行われることを特徴とする。
本発明で用いられた用語「浄化（ｃｌａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」とは、沈殿物などを緩衝液を用いて再溶解させた後、再溶解された溶液中に含まれている不純物を除去することを意味する。本発明における「浄化」ステップは、一般に、以下の単独またはその様々な組み合わせを含む、例えば、濾過、析出、凝集、および沈降の１つ以上のステップ、より詳細には、深層濾過（ｄｅｐｔｈ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＤＦ）、精密濾過（ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＭＦ）、限外濾過（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＵＦ）、滅菌濾過（ｓｔｅｒｉｌｅ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、メンブレンクロマトグラフィー（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＭＣ）、および遠心分離（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）からなる群から選択される１つ以上の技法を用いて行われることができ、本発明における浄化ステップにより、再溶解された毒素沈殿物などに含まれている不純物、特に、核酸不純物、ＨＣＤ、細胞破壊片（ｃｅｌｌ ｄｅｂｒｉｓ）、および内毒素（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）などが除去されることができる。
本発明の一部の実施様態において、本発明は、様々な精製計画において一般に用いられる通常の浄化ステップに対して、改善点を提供する。浄化ステップは、一般に、１つ以上の好ましくない個体を除去することを含み、また、所望の標的分子の捕獲を含むステップの前に典型的に実施される。浄化の他の主な要旨は、後続の精製工程で滅菌フィルタの詰まりを引き起こし得るサンプル中の可溶性および不溶性成分を除去することで、全体の精製工程をより経済的とすることである。また、浄化効率を向上させる方法、例えば、析出が用いられることができる。不純物の析出は、凝集、ｐＨ調節（酸析出）、温度変動、刺激−感受性重合体または小分子による相変化などのような様々な方法またはこれらの方法の組み合わせにより実施されることができる。
本発明において「深層濾過（ｄｅｐｔｈ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＤＦ）」とは、減少する気孔のサイズに応じた一連のフィルタ（ｆｉｌｔｅｒｓ）を用いて溶液から粒子（例えば、不純物）を除去することを意味し、本発明で用いられた用語「深層フィルタ（ｄｅｐｔｈ ｆｉｌｔｅｒ）」は、フィルタ物質の深層内で濾過を果たす。前記フィルタは、流動チャンネルの複雑で蛇行した迷路を形成する任意の繊維マトリックスで構成されており、前記繊維マトリックスによる捕獲または繊維マトリックスに対する吸着により粒子の分離が行われる。細胞培養ブロス（ｂｒｏｔｈ）およびその他の供給原料をバイオ加工（ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）するために最もよく用いられる深層フィルタの媒質は、セルロース繊維、ＤＥなどのような濾過助剤、および陽に荷電した樹脂結合剤からなる。絶対フィルタと異なって、深層フィルタの媒質は、多孔性媒質によって粒子を保持し、気孔のサイズより大きくまたより小さい粒子の滞留を許容する。粒子の滞留は、サイズ排除および疎水性、イオン性およびその他の相互作用による吸着の両方を含むことができる。 商業的に購入可能な深層フィルタとしては、例えば、Millistak+ Pod depth filter system, XOHC media(Millipore Corporation), Zeta PlusTM Depth Filter(3M Purification Inc.) 等がある。本発明において、深層濾過は、２つ以上の深層フィルタを配列して重ねて用いることができて、この場合、商業的に購入可能なMillistak+ mini DOHC(Millipore Corporation)及びXOHC filters(Millipore Corporation) を使用することができる。
本発明において、深層フィルタは、一般に０．０１〜２０μｍ、好ましくは０．１〜８μｍの公称孔径（ｎｏｍｉｎａｌ ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ）を有し、それより大きいサイズを有する凝集された細胞破壊片およびコロイド状微粒子、またはそれより小さい粒子を始めとする凝集された細胞性バイオマスの除去および複数の等級化された層を有する多孔性深層フィルタ媒質を含むことができる。
したがって、本発明で深層濾過を用いる場合、ボツリヌス毒素沈殿液に含まれている不純物（例えば、核酸）、細胞破壊片、内毒素（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）などを容易に除去することができる。
本発明において、「精密濾過（ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＭＦ）」または「限外濾過（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＵＦ）」とは、所定の圧力下で、混合溶液の構成要素である溶質（ｓｏｌｕｔｅ）のサイズおよび構造に応じて、膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）の気孔（ｐｏｒｅ）を介して標的溶質（例えば、ボツリヌス毒素）を分画する工程である。一例として、０．１μｍまたは７５０ｋＤａの分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ、ＭＷＣＯ）分離用ＰＳ（ｐｏｌｙｓｕｌｆｏｎｅ）膜を用いて５〜４０ｐｓｉｇおよび４〜６０℃の条件で行うことで、溶液の浄化が可能である。
一般に、精密濾過は、限外濾過に先立つ工程であって、溶液から０．１〜１０μｍの粒子を分離するのに用いられ、これは、一般に１ｘ１０５ｇ／ｍｏｌの分子量を有する高分子を分離するのに用いられる。また、精密濾過は、沈殿物（ｓｅｄｉｍｅｎｔ）、原生動物、大きいバクテリアなどの除去に用いられる。本発明において精密濾過は、高分子、細胞破壊片の除去に容易に用いられることができる。一般に、精密濾過工程は、０．１〜５、好ましくは１〜３ｍ／ｓの速度、５０〜６００ｋＰａ、好ましくは１００〜４００ｋＰａの圧力で圧力ポンプまたは真空ポンプを用いて行う。
限外濾過は、溶液から０．０１〜０．１μｍの粒子を分離するのに用いられ、これは、一般に１ｘ１０３〜１ｘ１０５Ｄａの分子量を有する高分子に対応する。限外濾過は、タンパク質、内毒素（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）、ウイルス、シリカ（ｓｉｌｉｃａ）などの除去に用いられる。本発明において、１００〜３００ＫのＭＷＣＯ用限外濾過分離用膜を用いる場合、ボツリヌス毒素沈殿液に含まれている不純物は除去し、ボツリヌス毒素は濃縮させることができる。
「滅菌濾過（ｓｔｅｒｉｌｅ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）」とは、精密濾過またはメンブレンフィルタを用いる工程であって、加熱、放射線の照射、化学的処理を代替し、標的物質が含まれた溶液（例えば、生物製剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）、ボツリヌス毒素など）を安全に浄化させることができる方法である。溶液に含まれ得る微生物を除去するためには、０．１〜０．３μｍ、好ましくは０．１５〜０．２５μｍ、最も好ましくは０．２μｍの気孔を有する精密フィルタ（ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｅｒ）を用いて除去し、ウイルスの除去および不活性化のためには、２０〜５０ｎｍの気孔を有するナノフィルタ（ｎａｎｏｆｉｌｔｅｒ）を用いる。メンブレンフィルタも同様に、微生物、ウイルスなどの除去のために、特定の気孔を有し、セルロースエステル（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｅｓｔｅｒ）またはＰＥＳ（ｐｏｌｙｅｔｈｅｒｓｕｌｆｏｎｅ）からなるメンブレンフィルタを用いて浄化工程を行うことができる。
本発明において、「メンブレンクロマトグラフィー（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＭＣ）」は、「樹脂クロマトグラフィー（ｒｅｓｉｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）」と対比される標的物質（例えば、ボツリヌス毒素）の分離方式を用いる。樹脂クロマトグラフィーは、一般に、球状の形態および気孔（ｐｏｒｅ）を有する樹脂を用い、溶液の対流（ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ）に比べて拡散（ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）の比重が大きい分離方式を利用するのに対し、メンブレンクロマトグラフィーは、平面の形態およびマクロ孔（ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ）を有する膜を用い、拡散に比べて対流の比重が大きいため、溶液の分離効率が高い。したがって、ウイルス、プラスミド、巨大タンパク質複合体などの膜への接近が容易であるため、分離が容易である。商業的に購入可能なメンブレンクロマトグラフィーとしては、Mustang Q membrane chromatography capsule(Pall Corporation), Sartobind Q(Sartorius Stedim Biotech GmbH) 等が使用されるが、これに限定されない。
本発明において、遠心分離（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）は、好ましくは２０，０００ｇ、より好ましくは３０，０００ｇ、さらに好ましくは５０，０００ｇ、さらに好ましくは７０，０００ｇ、最も好ましくは９０，０００ｇ以上の遠心力で行われることができ、他の好ましくは実施態様で、遠心力は２００，０００ｇ、１５０，０００ｇ、１２０，０００ｇ、１００，０００ｇまたは９０，０００ｇ未満である。
本発明において、前記ステップ（ｂ）によるボツリヌス毒素の浄化ステップは、前記ステップ（ａ）で得た毒素にリン酸緩衝液、好ましくはリン酸ナトリウム緩衝液（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）を加えて溶解し、沈殿を浄化するステップを含む。この際、リン酸緩衝液のｐＨは約３．０〜８．０、好ましくは４．０〜７．０であり、塩基を添加して最終ｐＨを４．５〜６．５、好ましくは５．５〜６．２、より好ましくは４．８〜５．８になるように調節して、毒素浄化を前記ｐＨ範囲で行うことができる。
本発明において、前記ステップ（ｃ）によるボツリヌス毒素の希釈または溶解ステップは、前記ステップ（ｂ）で得た毒素にリン酸緩衝液、好ましくはリン酸ナトリウム緩衝液（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）を加えて透析残留物を希釈するか、沈殿物を溶解させるステップを含む。この際、リン酸緩衝液のｐＨは約４．０〜８．５が好ましく、塩基を添加して最終ｐＨを４．５〜８．０、好ましくは５．５〜７．５、より好ましくは６．０〜７．５になるように調節して、毒素の希釈または溶解を前記ｐＨ範囲で行うことができる。
本発明において、前記ステップ（ｂ）でのボツリヌス毒素の深層濾過（ｄｅｐｔｈ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＤＦ）は、蠕動ポンプ（ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ ｐｕｍｐ）を用いることを特徴とする。また、前記ステップ（ｃ）でのＵＦダイアフィルトレーション（ＵＦ ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、硫酸アンモニウム沈殿、または塩酸沈殿は、１回またはそれ以上の回数で行うことを特徴とする。
本発明において、「ＵＦダイアフィルトレーション（ＵＦ ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）」とは、上述の限外濾過（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＵＦ）を用いてダイアフィルトレーションを行うことを意味するが、これに限定されるものではない。「ダイアフィルトレーション」とは、標的物質（溶液）に含まれている成分（例えば、粒子）を除去または得る技法であって、成分の分子量（分子サイズ）に応じて分離可能な透過性フィルタ（ｐｅｒｍｅａｂｌｅ ｆｉｌｔｅｒ）を用いることを特徴とする、標的物質の純度を高める技法を意味する。
本発明において、前記硫酸アンモニウム沈殿ステップは塩析（ｓａｌｔｉｎｇ ｏｕｔ）に該当することであって、前記塩析は、水に溶解しやすい塩（硫酸アンモニウムなど）をタンパク質混合液に加えてイオン強度を増加させることでタンパク質を沈殿させることである。もし、目的とするタンパク質が硫酸アンモニウム３０％（ｗ／ｖ）飽和時に主に沈積するということを知っている場合、予め３０％（ｗ／ｖ）飽和以下の硫酸アンモニウム濃度で目的以外のタンパク質を沈殿させて除去し、次に、３０％（ｗ／ｖ）飽和となるように硫酸アンモニウムを加えて目的とするタンパク質を沈殿させ、それを遠心分離により集めることができる。塩析操作は、精製の初期手段としてよく用いられる。この時に用いられる硫酸アンモニウムは、１０〜５０％（ｗ／ｖ）、好ましくは２０〜４０％（ｗ／ｖ）濃度の溶液を用いることができる。前記ステップ（ｃ）での塩酸沈殿は、ｐＨ２〜５、好ましくは２．５〜４．５となるように塩酸を添加して行われることを特徴とする。
前記ステップ（ｄ）での陰イオン交換クロマトグラフィーは、ｐＨ２〜９、好ましくはｐＨ３〜８、伝導度（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）２〜４０ｍＳ／ｃｍ、好ましくは３〜３０ｍＳ／ｃｍの条件で行われることを特徴とする。前記ステップ（ｄ）でのボツリヌス毒素は、陰イオン交換クロマトグラフィーより溶出されるＦＴ（ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ）を、ボツリヌス毒素が含まれた分画（ｆｒａｃｔｉｏｎ）として得るか（ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｏｄｅ）、陰イオン交換クロマトグラフィーの樹脂（ｒｅｓｉｎ）に結合されたボツリヌス毒素が含まれた分画として得ること（ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅ）を特徴とする。また、最終的に精製されたボツリヌス毒素は、７Ｓまたは１９Ｓの構成形態を有することを特徴とする。
本発明において相互交換的に用いられる用語「ＦＴ（ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ）」、「フロースルー工程」、または「フロースルー精製」は、１つ以上の不純物とともにバイオ医薬製剤に含有された少なくとも１つの標的分子（例えば、ボツリヌス毒素）が１つ以上の不純物と結合する物質を介して通過し、前記標的分子は通常結合しない（すなわち、フロースルーする）分離方法を意味する。
用語「伝導度」とは、２つの電極の間の電流を通電させる水溶液の能力を意味する。溶液中では、イオンの輸送によって電流が流れる。したがって、水溶液中に存在するイオン量を増加させると、溶液はより高い伝導度を有することになるはずである。伝導度の基本測定単位はジーメンス（Ｓｉｅｍｅｎ）（またはｍｈｏ）、ｍｈｏ（ｍＳ／ｃｍ）であり、伝導度測定機、例えば、各種モデルのオリオン（Ｏｒｉｏｎ）伝導度測定機を用いて測定することができる。電気伝導度は、電流を運ぶことができる溶液中のイオンの能力であるため、溶液のイオン濃度を変化させることで、溶液の伝導度を変更させることができる。例えば、所望の伝導度を得るために、溶液中の緩衝剤の濃度および／または塩（例えば、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、または塩化カリウム）の濃度を変化させることができる。好ましくは、各種緩衝液の塩の濃度を変更することで、所望の伝導度を得ることができる
本発明において、前記ステップ（ｄ）における陰イオン交換クロマトグラフィーのカラム緩衝液としては、リン酸ナトリウム、クエン酸、またはＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液が使用可能であるが、これに限定されるものではない。カラム緩衝液の濃度は、１５〜７０ｍＭに調節し、好ましくは約２０〜６０ｍＭに調節する。カラム緩衝液のｐＨは２〜９、好ましくは３〜８となるように調節し、移動相の流速は０．５〜５．０ｍＬ／分に調節し、好ましくは１．０〜３．０ｍＬ／分に調節する。この際、緩衝液の伝導度は２〜４０ｍＳ／ｃｍ、好ましくは３〜３０ｍＳ／ｃｍとなるようにし、カラムの平衡化が終わると、試料を注入する。
また、本発明では、前記ステップ（ａ）〜（ｄ）の工程を経て得られたボツリヌス毒素を含む陰イオン交換クロマトグラフィー分画のｐＨを上向き調節し、さらに陰イオン交換クロマトグラフィーを行った後、陽イオン交換クロマトグラフィー（Ｃａｔｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＣＥＸ）を行うと、非常に高い純度のボツリヌス毒素、特に低分子量のボツリヌス毒素を得ることができることを確認することができた。
したがって、本発明の他の様態は、
前記ステップ（ｄ）の後に、
（ｅ）ボツリヌス毒素が含まれている陰イオン交換クロマトグラフィー分画のｐＨを上向き調節するステップと、
（ｆ）前記ステップ（ｅ）でｐＨが上向き調節された陰イオン交換クロマトグラフィー分画を陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製するステップと、
（ｈ）前記ステップ（ｆ）で希釈されたボツリヌス毒素を陽イオン交換クロマトグラフィー（Ｃａｔｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＣＥＸ）を用いて精製するステップと、
をさらに含むボツリヌス毒素の製造方法を提供する。
好ましくは、前記ステップ（ｆ）とステップ（ｈ）との間に、
（ｇ）精製された陰イオン交換クロマトグラフィー分画に緩衝液を添加してボツリヌス毒素を希釈するステップをさらに含むことができる。
本発明では、説明の便宜上、前記ステップ（ｅ）〜（ｈ）がさらに用いられる場合、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）工程を区分するために、前記ステップ（ｄ）のＡＥＸ工程を一次陰イオン交換クロマトグラフィー、前記ステップ（ｆ）のＡＥＸ工程を二次陰イオン交換クロマトグラフィー工程と称し、何ら説明がない場合には、ステップ（ｄ）のＡＥＸ工程の一次陰イオン交換クロマトグラフィーを意味する。また、実施例などでのＴＱは一次陰イオン交換クロマトグラフィー工程を、ＨＱは二次陰イオン交換クロマトグラフィー工程を、そしてＸＳは陽イオン交換クロマトグラフィー工程を意味する。
本発明において、溶液の「ｐＨ」は、水サンプルのイオン化に関連して酸性度またはアルカリ度を測定する。水のｐＨは中性、すなわちｐＨ７である。殆どのｐＨの読取値が０〜１４の範囲である。水よりも高い［Ｈ＋］を有する溶液（ｐＨ７未満）は酸性であり、水よりも低い［Ｈ＋］を有する溶液（ｐＨ７超過）は塩基性またはアルカリ性である。ｐＨはｐＨ計測器を用いて測定されることができる。緩衝剤のｐＨは、ＨＣｌまたはＮａＯＨなどの酸または塩基を用いて調整することができる。
本発明において、前記ステップ（ｅ）での陰イオン交換クロマトグラフィー分画のｐＨの上向き調節は、１回またはそれ以上の回数で行われることを特徴とする。また、前記ステップ（ｅ）でのｐＨの上向き調節では、ＵＦダイアフィルトレーション（ＵＦ ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、ｐＨ滴定（ｐＨ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）、透析（ｄｉａｌｙｓｉｓ）、および緩衝液交換カラムクロマトグラフィー（ｂｕｆｆｅｒ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）からなる群から選択される１つ以上の技法を用いることを特徴とする。好ましくは、前記ステップ（ｅ）での陰イオン交換クロマトグラフィー分画のｐＨの上向き調節は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を用いて行われ、この際、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液のｐＨは７．０〜８．５、好ましくは７．３〜８．３の値を有する。
本発明において、前記ステップ（ｆ）での二次陰イオン交換クロマトグラフィーは、ｐＨ２〜９、好ましくはｐＨ３〜８、伝導度（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）２〜４０ｍＳ／ｃｍ、好ましくは３〜３０ｍＳ／ｃｍの条件で行われることを特徴とする。前記ステップ（ｆ）でのボツリヌス毒素は、陰イオン交換クロマトグラフィーより溶出されるＦＴ（ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ）を、ボツリヌス毒素が含まれた分画（ｆｒａｃｔｉｏｎ）として得るか（ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｏｄｅ）、陰イオン交換クロマトグラフィーの樹脂（ｒｅｓｉｎ）に結合されたボツリヌス毒素が含まれた分画として得ること（ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅ）を特徴とする。
本発明において、好ましくは、前記ステップ（ｇ）での緩衝液はリン酸ナトリウム緩衝液であり、ｐＨは６〜８、好ましくは６．５〜７．５の値を有する。
本発明において、前記ステップ（ｈ）での陽イオン交換クロマトグラフィーは、ｐＨ２〜９、好ましくはｐＨ３〜８、伝導度（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）２〜４０ｍＳ／ｃｍ、好ましくは３〜３０ｍＳ／ｃｍの条件で行われることを特徴とする。前記ステップ（ｈ）での陽イオン交換クロマトグラフィーでボツリヌス毒素は、陽イオン交換クロマトグラフィーの樹脂（ｒｅｓｉｎ）に結合されたボツリヌス毒素が含まれた分画として得ることを特徴とする。また、最終的に精製されたボツリヌス毒素の構成形態は、７Ｓ（分子量:１５０ｋＤａ）であることを特徴とする。
本発明によるボツリヌス毒素の製造方法において、陰イオン交換クロマトグラフィーに用いられる樹脂は、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、４級アミノエチル（ＱＡＥ）、および４級アミン（Ｑ）グループを含むが、これに限定されるものではない。好ましくは、ＴＱ６５０、ＨＱ、ＸＱなどが用いられることができる。
本発明によるボツリヌス毒素の製造方法において、陽イオン交換クロマトグラフィーに用いられる樹脂は、カルボキシメチル(CM),スルホエチレ(SE),スルホプロピル(SP),ホスフェート(P)およびスルホネート(S)を含むが好ましいが、これに限定されるものではない。好ましくは、ＨＳ、ＸＳなどが用いられることができる。
製造元
セルロースイオン交換樹脂としては、例えば、ＤＥ２３ＴＭ、ＤＥ３２ＴＭ、ＤＥ５２ＴＭ、ＣＭ−２３ＴＭ、ＣＭ−３２ＴＭ、およびＣＭ−５２ＴＭが製造元[GE Healthcare, Lindesnes, Norway]から市販されており、ＳＥＰＨＡＤＥＸ−ベースおよび架橋結合されたイオン交換剤も公知されている。例えば、ＤＥＡＥ−、ＱＡＥ−、ＣＭ−、およびＳＰ−ＳＥＰＨＡＤＥＸおよびＤＥＡＥ−、Ｑ−、ＣＭ−およびＳ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥおよびＳＥＰＨＡＲＯＳＥ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗが何れも製造元[GE Healthcare Bio-Sciences]から市販されている。さらに、ＤＥＡＥおよびＣＭ誘導体化されたエチレングリコール−メタクリレート共重合体(例えば、TOYOPEARLTM DEAE-650SまたはMおよびTOYOPEARLTM CM-650SまたはM)が製造元[Tosoh Bioscience LLC, King of Prussia, PA]から市販されている。
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。
実施例１：クロストリジウムボツリヌス菌株の培養
ボツリヌス毒素を生産するためのクロストリジウムボツリヌス菌株は、２％のカゼイン加水分解物（Ｃａｓｅｉｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ）、１％の酵母抽出物（Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）、１％のグルコース、および０．５％のチオグリコール酸塩培地（Ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌｌａｔｅ ｍｅｄｉｕｍ）の組成を有する培地を１２１℃で３０分間滅菌した後、前記培地１０ｍＬが入っている培養容器に２０μＬのクロストリジウムボツリヌス（疾病管理本部管理番号：４−０２９−ＣＢＢ−ＩＳ−００１）を接種し、３５℃で嫌気的条件で２２〜３０時間一次種培養（静置培養）した。一次種培養で菌株の成長が確認されると、同じ培地組成を有する８００ｍＬの滅菌された培地がそれぞれ入っている培養容器に８ｍＬの一次種培養液を接種し、３５℃で嫌気的条件で３日間二次種培養（静置培養）した。
実施例２：ボツリヌス毒素の製造
２−１：硫酸沈殿およびｐＨ中和
硫酸沈殿ステップは、ボツリヌス菌を培養した後に残っている菌を全部死滅させ、多くの種類のタンパク質が含まれている培養液に硫酸を添加することでｐＨを低下させることにより、タンパク質が等電点に達することとなって沈殿されるタンパク質を分離する方法であって、実施例１の方法で本培養を実施し、培養が終了すると、１０Ｌの培養容器（１０Ｌ ＳＵＳ Ｐｏｔ）に培養された培養液を集めた後、ｐＨ３．４〜３．６となるように５Ｎの硫酸を添加し、常温で１２〜２０時間放置することで、上澄液と沈殿物が分離されるようにした。前記上澄液を除去し、最終的に２．５〜３．０Ｌの硫酸沈殿液を残した。
前記上澄液が除去された硫酸沈殿液のｐＨ中和方法は、次のとおりである。すなわち、硫酸沈殿液に１Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ５．３）７００ｍＬを添加し、撹拌した後、５ＮのＮａＯＨを添加して硫酸沈殿液のｐＨを５．９〜６．１に調節した。上記のようにｐＨを中和させた硫酸沈殿液を得て、４等分した。
２−２：前処理工程
１）従来工程
実施例２−１の４等分した硫酸沈殿液のうち１つを、従来の工程により前処理した。すなわち、沈殿物に残っているＤＮＡおよびＲＮＡを除去するために、０．４Ｍのベンザミジン塩酸（ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ ＨＣｌ）６０ｍＬ、ＤＮａｓｅ０．２５ｇ、ＲＮａｓｅ０．２５ｇを添加し、ボツリヌス毒素を抽出するために約３〜７時間反応させた。前記毒素抽出培養液を、４℃、１５分、１２，０００ｘｇで遠心分離した後、上澄液を得た。前記上澄液に１Ｎの塩酸を添加してｐＨを３．４〜３．６に低めた後、３〜５℃で１２〜２０時間放置することで、塩酸沈殿過程を行った。前記過程により形成された塩酸沈殿液を４℃、１２，０００ｘｇで１５分間遠心分離して上澄液を除去した後、毒素沈殿物（ｐｅｌｌｅｔ）に５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）緩衝液３０ｍＬを添加して毒素沈殿物を溶解させた。
２）深層フィルタ（Ｄｅｐｔｈ ｆｉｌｔｅｒ）濾過工程
実施例２−１の４等分した硫酸沈殿液のうち残りの３／４の硫酸沈殿液は、蠕動ポンプ（ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ ｐｕｍｐ）にＺｅｔａ ＰｌｕｓＴＭ Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ Ｃａｐｓｕｌｅ ｄｅｐｔｈ ｆｉｌｔｅｒ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ（３Ｍ、ＢＣ００２５Ｓ６０ＳＰ０５Ａ）を連結して濾過（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）した。
ｉ）深層フィルタ（Ｄｅｐｔｈ ｆｉｌｔｅｒ）濾過後、ＵＦ
ＵＦシステム（ＰＡＬＬ、ＴＦＦ ｃａｓｓｅｔｔｅ ３０ｋＤａ）を用いて、深層フィルタの濾過液に対して５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）でダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を１０回行った後、最終体積を３０ｍＬとなるようにした。
ｉｉ）深層フィルタ（Ｄｅｐｔｈ ｆｉｌｔｅｒ）濾過後、硫酸アンモニウム（Ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ）沈殿
深層フィルタの濾過液に硫酸アンモニウムを３０％（ｗ／ｖ）となるように添加し、３〜５℃で１２〜２０時間放置した。次に、４℃、１５分、１２，０００ｘｇで遠心分離して上澄液を除去した後、遠心分離ペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）３０ｍＬに再溶解した。
ｉｉｉ）深層フィルタ（Ｄｅｐｔｈ ｆｉｌｔｅｒ）濾過後、塩酸（Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｃ ａｃｉｄ）沈殿
深層フィルタの濾過液に１ＮのＨＣｌ（塩酸）を添加してｐＨを３．４〜３．６に低めた後、３〜５℃で１２〜２０時間放置した。次に、４℃、１５分、１２，０００ｘｇで遠心分離して上澄液を除去した後、遠心分離ペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）３０ｍＬに再溶解した。
２−３：精製工程
ＴＱ工程（一次陰イオン交換クロマトグラフィー工程）により精製されたボツリヌス毒素の純度の測定は、ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ社、ｅ２６９５）を用いてＳＥＣ（ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）方法により行った。ここで、移動相としては１００ｍＭのリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ６．５）を使用し、Ｐ／Ｎ０８５４２に対するガードカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｐ／Ｎ０８５４３）にＴＳＫｇｅｌ Ｇ４０００ＳＷＸＬ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｐ／Ｎ０８５４２）カラムを連結し、ボツリヌス毒素タンパク質２０μｇをロード（ｌｏａｄｉｎｇ）して１ｍＬ／ｍｉｎで３０分間流した。
ＴＱ工程（一次陰イオン交換クロマトグラフィー工程）、ＨＱ工程（二次陰イオン交換クロマトグラフィー工程）、およびＸＳ工程（陽イオン交換クロマトグラフィー工程）により精製されたボツリヌス毒素の各精製（工程）ステップで回収した試料に含まれたボツリヌス毒素の混合状態／純度／含量を視覚的に確認するために、タンパク質の電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。すなわち、ボツリヌス毒素が含まれていると推定される試料をブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）方法により定量した後、各試料の所定の定量（例えば、４０μｇタンパク質）を取り、適宜加熱および／または溶解させることで変性されたタンパク質を用いて、１０％〜１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。電気泳動されたゲルは、適切な染色剤（硝酸銀またはクーマシーブルー）で染色した後、各精製ステップでのボツリヌス毒素の純度を視覚的に確認した。
２−３−１：ＴＱ精製（陰イオン交換クロマトグラフィー（Ａｎｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ：ＡＥＸ ＦＴ））
実施例２−２の前処理工程が終わった後、ボツリヌス毒素を除いた殆どの主要不純物を除去するために、イオン交換樹脂を用いて下記のようにクロマトグラフィーを行った。
（１）ＸＫ ２６／４０にＴＱ樹脂（ｒｅｓｉｎ）をカラムに高さ３０〜３４ｃｍとなるようにパッキング（ｐａｃｋｉｎｇ）した後、ＡＫＴＡ Ｐｒｉｍｅ Ｐｌｕｓに取り付けた。
（２）平衡／溶出緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５、１０ｍＳ／ｃｍ）を流してカラムを平衡化した。
（３）実施例２−２の従来工程により前処理された試料を前記カラムに１０ｍＬずつ分画し、２ｍＬ／分で注入した。注入が終わると、１６０〜１８０ｍＬの平衡／溶出緩衝液を注入し、ＵＶ２８０ｎｍ波長でピークが上昇してから基準値（Ｂａｓｅｌｉｎｅ）に下がるまでの分画（ｆｒａｃｔｉｏｎ）を順に得た（前記分画は、ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した）。
（４）分画を得た後、カラムの再生のために、洗浄緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５、１ＭのＮａＣｌ）を５ｍＬ／分で２００ｍＬ以上注入して洗浄した。
（５）前記（２）〜（４）の過程を、従来工程により前処理された試料の代わりに、他の３つの方法により前処理された試料（深層フィルタ濾過後ＵＦ／硫酸アンモニウム沈殿／塩酸沈殿）を用いてＴＱ精製を行った。この際、高純度のボツリヌス毒素を精製するために、ｐＨは６．４〜６．６、伝導度（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）は１０±５ｍＳ／ｃｍに維持されるようにした。
その結果、ボツリヌス毒素はＴＱ樹脂に吸着されず、殆どの主要不純物は吸着されて除去されるため、高い純度を有するボツリヌス毒素の生産が可能であり、最終ボツリヌス毒素の構成形態は１９Ｓ（分子量：約９００ｋＤａ）であることを確認した。
２−３−２：ＨＱ精製（陰イオン交換クロマトグラフィー（Ａｎｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＡＥＸ、ｂｉｄｉｎｇ ｍｏｄｅ）
ＴＱ精製が終わった後、ボツリヌス毒素をさらに精製するために、ＨＱイオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィー（以下、ＨＱ工程）を行った。この際、ＨＱ工程は、バインディングまたはＦＴ（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）方式によりＴＱ精製試料を精製した。本発明において、ＨＱ（バインディング）とは、標的物質（例えば、ボツリヌス毒素）と結合可能なＨＱ樹脂（ｒｅｓｉｎ）の電荷量差によって標的物質を分離（溶出）する方式であり、また、ＨＱ（ＦＴ）とは、標的物質（例えば、ボツリヌス毒素）と混合され得る不純物と結合可能なＨＱ樹脂（ｒｅｓｉｎ）の電荷量差によってＨＱ樹脂と結合せずに流れ出る（Ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ、ＦＴ）標的物質を試料から分離する方式である。
ＨＱ（バインディング）精製（ＡＥＸ、ｂｉｄｉｎｇ ｍｏｄｅ）
（１）従来工程により前処理した後にＴＱ精製された試料に対して、ＵＦシステム（ＰＡＬＬ、ＴＦＦ ｃａｓｓｅｔｔｅ ３０ｋＤａ）を用いて、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．８）でダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を１０回行い、最終ｐＨを７．７〜７．９、体積を３０ｍＬとなるようにして準備した。
（２）ＨＱ樹脂（ｒｅｓｉｎ）をＡＫＴＡ Ｐｒｉｍｅ Ｐｌｕｓに取り付けた。
（３）２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８緩衝液を流してカラムを平衡化した。
（４）１２ｍＬずつ分画設定し、前記（１）で準備した試料を２．５ｍＬ／分で前記平衡化したカラムに注入し、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．８）４０ｍＬで洗浄した後、２０ＣＶ、１０％の勾配（ｇｒａｄｉｅｎｔ）で溶出（ｅｌｕｔｉｏｎ）した。一番目のピークの分画を順に得た（前記分画はＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した）。この際、高純度のボツリヌス毒素を精製するためにｐＨを７．８に調節した。
（５）分画を得た後、カラムの再生のために、洗浄緩衝液（２５ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．８、１ＭのＮａＣｌ）を２．５ｍＬ／分で１２０ｍＬ以上注入して洗浄した。
（６）前記（１）〜（５）の過程を、従来工程により前処理した後にＴＱ精製された試料の代わりに、他の３つの方法により前処理されてＴＱ精製された試料（深層フィルタ濾過後ＵＦ／硫酸アンモニウム沈殿／塩酸沈積した後、ＴＱ精製された試料）を用いて行った。
その結果、高い純度を有するボツリヌス毒素の生産が可能であり、最終ボツリヌス毒素は７Ｓ（分子量：約１５０ｋＤａ）であることを確認した（図２および図３）。
２−３−３：ＨＱ精製（ＡＥＸ、ｂｉｄｉｎｇ ｍｏｄｅ）およびＸＳ精製（ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅ）
前記実施例２−３−２によるＨＱ精製が終わった後、ボツリヌス毒素をさらに精製するために、ＸＳ陽イオン交換クロマトグラフィー（Ｃａｔｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＣＥＸ、ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅ）をさらに行った。
具体的なＸＳ工程は、次のとおりである。
（１）実施例２−２の従来工程により前処理した後にＨＱ精製された試料を、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）緩衝液を用いて１／４に希釈した。
（２）ＸＳ樹脂（ｒｅｓｉｎ）をＡＫＴＡ Ｐｒｉｍｅ Ｐｌｕｓに取り付けた。
（３）平衡／溶出緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）を流してカラムを平衡化した。
（４）１４ｍＬずつ分画設定し、前記（１）で希釈された、ＨＱ精製された試料を１．６ｍＬ／分で前記平衡化したカラムに注入し、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）緩衝液５０ｍＬで洗浄した後、分画を６ｍＬに設定し、２０ＣＶ、１２％の勾配（ｇｒａｄｉｅｎｔ）で溶出（ｅｌｕｔｉｏｎ）した。一番目のピークの分画を順に得た（前記分画はＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した）。この際、高純度のボツリヌス毒素を精製するためにｐＨを７．０に調節した.。
（５）分画を得た後、カラムの再生のために、洗浄緩衝液（２５ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、１ＭのＮａＣｌ）を１．６ｍＬ／分で２０ｍＬ以上注入して洗浄した。
（６）前記（１）〜（５）の過程を、従来工程により前処理した後にＴＱ精製された試料の代わりに、他の３つの方法により前処理されてＴＱ精製された試料（深層フィルタ濾過後ＵＦ／硫酸アンモニウム沈殿／塩酸沈積した後、ＴＱ精製およＨＱ精製された試料）を用いて行った。
その結果、高い純度を有するボツリヌス毒素の生産が可能であり、最終ボツリヌス毒素は７Ｓ（分子量：約１５０ｋＤａ）であることを確認した（図４および図５）。
２−３−４：ＨＱ精製（ＡＥＸ、ＦＴ ｍｏｄｅ）およびＸＳ精製（ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅ）
前記実施例２−３−３のようなボツリヌス毒素の製造方法において、ＨＱ工程（ＡＥＸ）を用いた精製方法で、ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅをｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｏｄｅで代替してボツリヌス毒素を製造した。
ＨＱ（ＡＥＸ、ＦＴ ｍｏｄｅ）工程
ＨＱ精製（ＡＥＸ、ＦＴ ｍｏｄｅ）は、次のような方法により行われた。
ＵＦシステム（ＰＡＬＬ、ＴＦＦ ｃａｓｓｅｔｔｅ ３０ｋＤａ）を用いて、従来工程により前処理した後にＴＱ精製された試料に対して２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．８）でダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を１０回行い、最終ｐＨを７．７〜７．９、体積を３０ｍＬとなるようにして準備した後、ＨＱ（ＦＴ ｍｏｄｅ）工程を行った。
ｉ．ＨＱをＡＫＴＡ Ｐｒｉｍｅ Ｐｌｕｓに取り付けた。
ｉｉ．２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７、伝導度７．８ｍＳ／ｃｍ緩衝液を流してカラムを平衡化した。
ｉｉｉ．１ｍＬずつ分画設定し、ＴＱ試料を１．５ｍＬ／分で注入し、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、伝導度７．３ｍＳ／ｃｍ緩衝液４０ｍＬで溶出した。ピークの分画を集めて回収した（前記分画はＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した）。
ｉｖ．分画を得た後、カラムの再生のために、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１ＭのＮａＣｌ緩衝液を１．５ｍＬ／分で４０ｍＬ以上注入して洗浄した。
ＨＱ（ＦＴ）試料を用いたＸＳ工程
ボツリヌス毒素の純度を向上させるために、ＨＱ（ＦＴ）工程により精製された試料に対してＸＳ（バインディング）工程を行って精製した。
（１）ＨＱ（ＦＴ）工程により精製された試料を、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）緩衝液を用いて１／４に希釈した。
（２）ＸＳ樹脂（ｒｅｓｉｎ）をＡＫＴＡ Ｐｒｉｍｅ Ｐｌｕｓに取り付けた。
（３）５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）緩衝液を流してカラムを平衡化した。
（４）１４ｍＬずつ分画設定し、前記（１）で希釈された、ＨＱ精製された試料を１．５ｍＬ／分で注入し、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）緩衝液５０ｍＬで洗浄した後、分画を６ｍＬに設定し、６０ＣＶ、１２％の勾配（ｇｒａｄｉｅｎｔ）で溶出（ｅｌｕｔｉｏｎ）した。一番目のピークの分画を集めて回収した（前記分画はＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した）。
（５）分画を得た後、カラムの再生のために、洗浄緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、１ＭのＮａＣｌ）を１．５ｍＬ／分で２０ｍＬ以上注入して洗浄した。
その結果、図６および図７に示されたように、７Ｓ（分子量：約１５０ｋＤａ）、純度９８％以上のボツリヌス毒素を製造することができることが確認された。
まとめると、図２〜図７に示されたように、実施例２の従来工程、または深層フィルタ（ｄｅｐｔｈ ｆｉｌｔｅｒ）で濾過してから塩酸沈殿工程を行った後、陰イオン交換クロマトグラフィー精製（ＴＱ（バインディングまたはＦＴ）精製）により得たボツリヌス毒素を含有する試料は、毒素１９Ｓで本来観察される１３８ｋＤａ（ＮＴＮＨ）、９８ｋＤａ（重鎖（Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ））、５２ｋＤａ（軽鎖（Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ））、５０ｋＤａ（ＨＡ）、３３ｋＤａ（ＨＡ）、２０ｋＤａ（ＨＡ）、１７ｋＤａ（ＨＡ）以外の不純物が最も少なく観察された。
また、深層フィルタ（ｄｅｐｔｈ ｆｉｌｔｅｒ）で濾過した後、ＵＦ工程（ＵＦダイアフィルトレーション（ＵＦ ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ））および陰イオン交換クロマトグラフィー精製（ＴＱ（バインディングまたはＦＴ）精製）により得たボツリヌス毒素を含有する試料は、約１３ｋＤａの不純物タンパク質バンドが観察された。
また、深層フィルタ（ｄｅｐｔｈ ｆｉｌｔｅｒ）で濾過した後、硫酸アンモニウム沈殿および陰イオン交換クロマトグラフィー精製（ＴＱ（バインディングまたはＦＴ）精製）により得たボツリヌス毒素を含有する試料は、３７ｋＤａの不純物タンパク質バンドが観察された。
これに対し、低分子ボツリヌス毒素を精製する工程である、解離後にＨＱからＸＳに繋がる精製の結果では、４つの前処理工程（従来工程または深層フィルタ（ｄｅｐｔｈ ｆｉｌｔｅｒ）濾過後ＵＦ／硫酸アンモニウム沈殿／塩酸沈殿）の種類にかかわらず、ボツリヌス毒素を含有する試料は何れも不純物タンパク質バンドが観察されず、９８ｋＤａ（重鎖（Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ））、５２ｋＤａ（軽鎖（Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ））の低分子ボツリヌス毒素のみが観察された。
特に、ボツリヌス毒素である１９Ｓを分離するために、ボツリヌス毒素を含有する試料の酵素処理および抽出工程に代替可能な最も効率の高い工程は、硫酸沈殿工程、深層フィルタ（ｄｅｐｔｈ ｆｉｌｔｅｒ）を用いた濾過（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）および塩酸沈殿を行った後、陰イオン交換クロマトグラフィー精製（ＴＱ（バインディングまたはＦＴ）精製）を順に行うことであるということが確認された。
これに対し、ボツリヌス毒素である７Ｓ（低分子ボツリヌス毒素）を分離するための工程は、４つの前処理工程（従来工程または深層フィルタ（ｄｅｐｔｈ ｆｉｌｔｅｒ）濾過後ＵＦ／硫酸アンモニウム沈殿／塩酸沈殿）の後、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＱ（ｂｉｎｄｎｇ ｍｏｄｅまたはＦＴ ｍｏｄｅ））を適用し、次いで、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＸＳ（ｂｉｎｄｎｇ ｍｏｄｅ））を適用する場合に、何れも精製効率が高いことが確認された。
本発明による新しいボツリヌス毒素の製造方法は、動物由来成分の流入が根本的に遮断され、安全性が非常に優れて、簡単な工程により高純度のボツリヌス毒素を製造することができるため、非常に経済的で且つ効率的であり、従来の方法により生産されたボツリヌス毒素に比べて純度が高く、局所作用力が増加するため、副作用として現われ得るボツリヌス毒素の全身循環性が低くなって安全性が増加する利点がある。したがって、神経筋肉障害、シワ除去剤、強直性片麻痺および脳性麻痺の治療などに多様に用いられることができる。
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
一態様において、本発明は以下を提供する。
[項目１]
次のステップを含む、ボツリヌス毒素の製造方法。
（ａ）ボツリヌス毒素の生産菌株培養液を酸で処理してボツリヌス毒素を含む沈殿を生成させるステップと、
（ｂ）前記ステップ（ａ）におけるボツリヌス毒素を含む沈殿物に緩衝液を添加した後、深層濾過（ｄｅｐｔｈ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＤＦ）、精密濾過（ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＭＦ）、限外濾過（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＵＦ）、滅菌濾過（ｓｔｅｒｉｌｅ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、メンブレンクロマトグラフィー（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＭＣ）、および遠心分離からなる群から選択される１つ以上の方法により浄化（ｃｌａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）するステップと、
（ｃ）前記ステップ（ｂ）における浄化されたボツリヌス毒素を含む溶液に対して、ＵＦダイアフィルトレーション（ＵＦ ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、硫酸アンモニウム沈殿、または塩酸沈殿を行った後、前記ＵＦダイアフィルトレーションの透析残留物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を緩衝液に希釈するか、硫酸アンモニウム沈殿または塩酸沈殿の沈殿物を緩衝液に溶解させるステップと、
（ｄ）前記ステップ（ｃ）における希釈された透析残留物、硫酸アンモニウム沈殿物の溶解物、または塩酸沈殿物の溶解物に対して、陰イオン交換クロマトグラフィー（Ａｎｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＡＥＸ）を用いてボツリヌス毒素を精製するステップ。
[項目２]
前記ボツリヌス毒素の生産菌株は、クロストリジウムボツリヌス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）またはその変異体であることを特徴とする項目１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目３]
前記ボツリヌス毒素は、ボツリヌス毒素血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧで構成された群から選択されるボツリヌス毒素であることを特徴とする項目１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目４]
精製されたボツリヌス毒素は、純度９８％以上のボツリヌス毒素Ａ型タンパク質であることを特徴とする項目１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目５]
前記ステップ（ａ）での酸処理は、前記ボツリヌス毒素の生産菌株培養液に、硫酸または塩酸を添加し、培養液のｐＨが３．０〜４．５となるようにすることによって行われることを特徴とする項目１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目６]
前記ステップ（ａ）での酸沈殿は、１回またはそれ以上の回数で行われることを特徴とする項目１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目７]
前記ステップ（ｂ）での深層濾過（ｄｅｐｔｈ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＤＦ）は、蠕動ポンプ（ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ ｐｕｍｐ）を用いることを特徴とし、深層濾過に使用されるフィルタは、０．０１〜２０μｍの公称孔径（ｎｏｍｉｎａｌ ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ）を有することを特徴とする項目１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目８]
前記ステップ（ｃ）でのＵＦダイアフィルトレーション（ＵＦ ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、硫酸アンモニウム沈殿、または塩酸沈殿は、１回またはそれ以上の回数で行うことを特徴とする項目１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目９]
前記ステップ（ｃ）における硫酸アンモニウム沈殿での硫酸アンモニウムは、１０〜５０％（ｗ／ｖ）の濃度となるように、ボツリヌス毒素含有溶液に添加することを特徴と
する項目１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目１０]
前記ステップ（ｃ）での塩酸沈殿は、ｐＨ２〜５となるように塩酸を添加して行われることを特徴とする項目１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目１１]
前記ステップ（ｂ）及び（ｃ）での緩衝液は、リン酸ナトリウム緩衝液であることを特徴とする項目１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目１２]
前記ステップ（ｂ）でのリン酸ナトリウム緩衝液は、ｐＨ４．５〜６．５であり、前記ステップ（ｃ）でのリン酸ナトリウム緩衝液はｐＨ６〜７であることを特徴とする項目１１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目１３]
前記ステップ（ｄ）における陰イオン交換クロマトグラフィーは、ｐＨ２〜９および伝導度（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）２〜４０ｍＳ／ｃｍの条件で行われることを特徴とする項目１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目１４]
前記ステップ（ｄ）でのボツリヌス毒素は、陰イオン交換クロマトグラフィーより溶出されるＦＴ（ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ）の、ボツリヌス毒素が含まれた分画として得られることを特徴とする項目１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目１５]
精製されたボツリヌス毒素は、７Ｓまたは１９Ｓの構成形態を有することを特徴とする項目１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目１６]
前記ステップ（ｄ）の後に、次のステップをさらに含むことを特徴とする項目１に記載のボツリヌス毒素の製造方法：
（ｅ）ボツリヌス毒素が含まれている陰イオン交換クロマトグラフィー分画のｐＨを上向き調節するステップと、
（ｆ）前記ステップ（ｅ）でｐＨが調節された陰イオン交換クロマトグラフィー分画を、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製するステップと、
（ｈ）前記ステップ（ｆ）で希釈されたボツリヌス毒素を、陽イオン交換クロマトグラフィー（Ｃａｔｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＣＥＸ）を用いて精製するステップ。
[項目１７]
前記ステップ（ｅ）での陰イオン交換クロマトグラフィー分画のｐＨの上向き調節は、１回またはそれ以上の回数で行われることを特徴とする項目１６に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目１８]
前記ステップ（ｆ）とステップ（ｈ）との間に、
（ｇ）精製された陰イオン交換クロマトグラフィー分画に緩衝液を添加してボツリヌス毒素を希釈するステップをさらに含むことを特徴とする項目１６に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目１９]
前記ステップ（ｅ）でのｐＨの上向き調節では、ＵＦダイアフィルトレーション（ＵＦ ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、ｐＨ滴定（ｐＨ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）、透析、および緩衝液交換カラムクロマトグラフィー（ｂｕｆｆｅｒ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）からなる群から選択される１つ以上の技法を用いることを特徴とする項目１６に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目２０]
前記ステップ（ｇ）での緩衝液は、リン酸ナトリウム緩衝液であることを特徴とする項目１８に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目２１]
前記ステップ（ｇ）でのリン酸ナトリウム緩衝液はｐＨ６．５〜７．５であることを特徴とする項目２０に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目２２]
前記ステップ（ｅ）での陰イオン交換クロマトグラフィー分画のｐＨの上向き調節は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を用いて行われことを特徴とする項目１９に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目２３]
前記ステップ（ｅ）でのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液は、ｐＨ７．３〜８．３であることを特徴とする項目２２に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目２４]
前記ステップ（ｆ）での陰イオン交換クロマトグラフィーは、ｐＨ２〜９および伝導度（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）２〜４０ｍＳ／ｃｍの条件で行われることを特徴とする項目１６に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目２５]
前記ステップ（ｆ）でのボツリヌス毒素は、陰イオン交換クロマトグラフィーより溶出されるＦＴ（ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ）のボツリヌス毒素を含む分画、または、陰イオン交換クロマトグラフィーの樹脂に結合されたボツリヌス毒素を含む分画として得られることを特徴とする項目１６に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目２６]
前記ステップ（ｈ）での陽イオン交換クロマトグラフィーは、ｐＨ２〜９および伝導度（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）２〜４０ｍＳ／ｃｍの条件で行われることを特徴とする項目１６に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目２７]
前記ステップ（ｈ）でのボツリヌス毒素は、陽イオン交換クロマトグラフィーの樹脂に結合されたボツリヌス毒素を含む分画として得られることを特徴とする項目１６に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
[項目２８]
最終的に精製されたボツリヌス毒素は、７Ｓの構成形態を有することを特徴とする項目１６に記載のボツリヌス毒素の製造方法。

Claims (27)

  1. 次のステップを含む、ボツリヌス毒素の製造方法。
    （ａ）ボツリヌス毒素の生産菌株培養液を酸で処理してボツリヌス毒素を含む沈殿を生成させるステップと、
    （ｂ）前記ステップ（ａ）におけるボツリヌス毒素を含む沈殿物に緩衝液を添加した後、深層濾過（ｄｅｐｔｈ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＤＦ）、精密濾過（ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＭＦ）、限外濾過（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＵＦ）、滅菌濾過（ｓｔｅｒｉｌｅ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、およびメンブレンクロマトグラフィー（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＭＣ）からなる群から選択される１つ以上の方法により浄化（ｃｌａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）するステップと、
    （ｃ）前記ステップ（ｂ）における浄化されたボツリヌス毒素を含む溶液に対して、塩酸沈殿を行った後、塩酸沈殿の沈殿物を緩衝液に溶解させるステップと、
    （ｄ）前記ステップ（ｃ）における塩酸沈殿物の溶解物に対して、陰イオン交換クロマトグラフィー（Ａｎｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＡＥＸ）を用いてボツリヌス毒素を精製するステップ。
  2. 前記ボツリヌス毒素の生産菌株は、クロストリジウムボツリヌス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）またはその変異体であることを特徴とする請求項１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
  3. 前記ボツリヌス毒素は、ボツリヌス毒素血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧで構成された群から選択されるボツリヌス毒素であることを特徴とする請求項１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
  4. 精製されたボツリヌス毒素は、純度９８％以上のボツリヌス毒素Ａ型タンパク質であることを特徴とする請求項１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
  5. 前記ステップ（ａ）での酸処理は、前記ボツリヌス毒素の生産菌株培養液に、硫酸または塩酸を添加し、培養液のｐＨが３．０〜４．５となるようにすることによって行われることを特徴とする請求項１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
  6. 前記ステップ（ａ）での酸沈殿は、１回またはそれ以上の回数で行われることを特徴とする請求項１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
  7. 前記ステップ（ｂ）での深層濾過（ｄｅｐｔｈ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＤＦ）は、蠕動ポンプ（ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ ｐｕｍｐ）を用いることを特徴とし、深層濾過に使用されるフィルタは、０．０１〜２０μｍの公称孔径（ｎｏｍｉｎａｌ ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ）を有することを特徴とする請求項１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
  8. 前記ステップ（ｃ）での塩酸沈殿は、１回またはそれ以上の回数で行うことを特徴とする請求項１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
  9. 前記ステップ（ｃ）での塩酸沈殿は、ｐＨ２〜５となるように塩酸を添加して行われることを特徴とする請求項１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
  10. 前記ステップ（ｂ）及び（ｃ）での緩衝液は、リン酸ナトリウム緩衝液であることを特徴とする請求項１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
  11. 前記ステップ（ｂ）でのリン酸ナトリウム緩衝液は、ｐＨ４．５〜６．５であり、前記ステップ（ｃ）でのリン酸ナトリウム緩衝液はｐＨ６〜７であることを特徴とする請求項１０に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
  12. 前記ステップ（ｄ）における陰イオン交換クロマトグラフィーは、ｐＨ２〜９および伝導度（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）２〜４０ｍＳ／ｃｍの条件で行われることを特徴とする請求項１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
  13. 前記ステップ（ｄ）でのボツリヌス毒素は、陰イオン交換クロマトグラフィーより溶出されるＦＴ（ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ）の、ボツリヌス毒素が含まれた分画として得られることを特徴とする請求項１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
  14. 精製されたボツリヌス毒素は、７Ｓまたは１９Ｓの構成形態を有することを特徴とする請求項１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
  15. 前記ステップ（ｄ）の後に、次のステップをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のボツリヌス毒素の製造方法：
    （ｅ）ボツリヌス毒素が含まれている陰イオン交換クロマトグラフィー分画のｐＨを上向き調節するステップと、
    （ｆ）前記ステップ（ｅ）でｐＨが調節された陰イオン交換クロマトグラフィー分画を、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製するステップと、
    （ｈ）前記ステップ（ｆ）で希釈されたボツリヌス毒素を、陽イオン交換クロマトグラフィー（Ｃａｔｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＣＥＸ）を用いて精製するステップ。
  16. 前記ステップ（ｅ）での陰イオン交換クロマトグラフィー分画のｐＨの上向き調節は、１回またはそれ以上の回数で行われることを特徴とする請求項１５に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
  17. 前記ステップ（ｆ）とステップ（ｈ）との間に、
    （ｇ）精製された陰イオン交換クロマトグラフィー分画に緩衝液を添加してボツリヌス毒素を希釈するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１５に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
  18. 前記ステップ（ｅ）でのｐＨの上向き調節では、ＵＦダイアフィルトレーション（ＵＦ ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、ｐＨ滴定（ｐＨ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）、透析、および緩衝液交換カラムクロマトグラフィー（ｂｕｆｆｅｒ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）からなる群から選択される１つ以上の技法を用いることを特徴とする請求項１５に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
  19. 前記ステップ（ｇ）での緩衝液は、リン酸ナトリウム緩衝液であることを特徴とする請求項１７に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
  20. 前記ステップ（ｇ）でのリン酸ナトリウム緩衝液はｐＨ６．５〜７．５であることを特徴とする請求項１９に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
  21. 前記ステップ（ｅ）での陰イオン交換クロマトグラフィー分画のｐＨの上向き調節は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を用いて行われことを特徴とする請求項１８に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
  22. 前記ステップ（ｅ）でのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液は、ｐＨ７．３〜８．３であることを特徴とする請求項２１に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
  23. 前記ステップ（ｆ）での陰イオン交換クロマトグラフィーは、ｐＨ２〜９および伝導度（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）２〜４０ｍＳ／ｃｍの条件で行われることを特徴とする請求項１５に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
  24. 前記ステップ（ｆ）でのボツリヌス毒素は、陰イオン交換クロマトグラフィーより溶出されるＦＴ（ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ）のボツリヌス毒素を含む分画、または、陰イオン交換クロマトグラフィーの樹脂に結合されたボツリヌス毒素を含む分画として得られることを特徴とする請求項１５に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
  25. 前記ステップ（ｈ）での陽イオン交換クロマトグラフィーは、ｐＨ２〜９および伝導度（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）２〜４０ｍＳ／ｃｍの条件で行われることを特徴とする請求項１５に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
  26. 前記ステップ（ｈ）でのボツリヌス毒素は、陽イオン交換クロマトグラフィーの樹脂に結合されたボツリヌス毒素を含む分画として得られることを特徴とする請求項１５に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
  27. 最終的に精製されたボツリヌス毒素は、７Ｓの構成形態を有することを特徴とする請求項１５に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
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