TWI623549B - 肉毒桿菌毒素製造方法 - Google Patents

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Abstract

一種肉毒桿菌毒素（BTX）的製造方法，包含下列步驟。步驟a：以酸處理BTX製造菌株的培養物，形成含BTX沉澱物。步驟b：加第一緩衝液至含BTX沉澱物，再藉由選自由深床過濾、微過濾、超微過濾（UF）、無菌過濾、薄膜層析和離心所組成之群組的一或多個方法進行淨化。步驟c：將步驟b得到的含BTX溶液執行UF濾洗、硫酸銨沉澱或氫氯酸沉澱，再將經UF濾洗產生的滯留物稀釋於第二緩衝液，或將經硫酸銨或氫氯酸沉澱產生的沉澱物溶解於第三緩衝液。步驟d：將步驟c得到的滯留物稀釋液、硫酸銨沉澱物溶液或氫氯酸沉澱物溶液執行陰離子交換層析以純化BTX。

Description

肉毒桿菌毒素製造方法
本發明係關於一種肉毒桿菌毒素（Botulinum toxin，BTX）的製造方法，特別係關於一種包含下列步驟的BTX製造方法：步驟a：以酸處理BTX製造菌株的培養物，形成含BTX沉澱物；步驟b：加入第一緩衝液至含BTX沉澱物，再藉由選自由深床過濾（Depth filtration，DF）、微過濾（Microfiltration，MF）、超微過濾（Ultrafiltration，UF）、無菌過濾（Sterile filtration）、薄膜層析（Membrane chromatography，MC）和離心所組成之群組的一或多個方法以進行淨化；步驟c：將步驟b得到的含BTX溶液執行UF濾洗（Diafiltration）、硫酸銨沉澱或氫氯酸沉澱，再將經UF濾洗而產生的滯留物（Retentate）稀釋於第二緩衝液中，或將經硫酸銨沉澱或經氫氯酸沉澱而產生的沉澱物溶解於第三緩衝液中；以及步驟d：將步驟c得到的滯留物稀釋液、硫酸銨沉澱物溶液或氫氯酸沉澱物溶液執行陰離子交換層析（Anion-exchange chromatography，AEX）以純化BTX。
自1980年代以來，發現了各式各樣會分泌神經毒素的梭狀芽孢桿菌（Clostridium sp.）菌株，且於過去70年，這些菌株所分泌的毒素的特性已有所概述。
梭狀芽孢桿菌所產生的神經毒素，也就是肉毒桿菌毒素（Botulinum Toxin，BTX），基於血清學特性其被分為八種類型（A型至H型）。每一種毒素具有大小約150千道爾頓（kDa）的毒蛋白，且天生包含由幾個無毒蛋白與彼此結合所組成的複合物。中型複合物（300 kDa）係由毒蛋白及無毒無紅血球凝集素（Non-toxic non-hemagglutinin）蛋白所組成，而大型複合物（450 kDa）及超大型複合物（900 kDa）則係由中型複合物與紅血球凝集素所組成（Sugiyama, H., Microbiol. Rev., 44:419, 1980）。無毒蛋白為人所知的作用係保護毒素在腸中不因低酸鹼值或被多樣的蛋白酵素破壞。
毒素於細胞中被合成為分子量大約150 kDa的單一多肽，且接著在距離N端1/3的位置被胞內蛋白酵素或人工酵素（例如胰蛋白酵素）分裂為兩個單元：輕鍊（L；分子量：50 kDa）及重鍊（H；分子量：100 kDa）。分裂的毒素比起單一多肽的毒性有極大的提升。輕鍊及重鍊兩單元藉由雙硫鍵彼此互相聯結，且具有不同的功能。重鍊結合於標的細胞的受器（Park. M.K. et al., FEMS Microbiol. Lett., 72:243, 1990）且其功用為於低酸鹼值（pH4）的環境下與生物膜交互作用以形成通道（Mantecucco, C. et al., TIBS., 18:324, 1993），而輕鍊則具有生理活性（Pharmacological activity），從而使用介面活性劑或干擾素，與神經傳遞物在藉由例如電穿孔法引入細胞時的分泌物，使細胞具有可通透性（Poulain, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 85:4090, 1988）。
毒素抑制乙醯膽鹼於神經肌肉連會的膽鹼性突觸的胞外分泌以造成無力症狀（Asthenia）。即便是非常少量的毒素也顯示出毒性，被認為毒素具有酵素活性（Simpson, L. L. et al., Ann. Rev. Pharmaeol. Toxicol., 26:427, 1986）。
依據近年的報告，毒素具有金屬性蛋白（Metallopeptidase）的活性，且其基質係由小突觸泡蛋白（Synaptobrevin）、突觸前膜陣列蛋白（Syntaxin）及分子量25 kDa的突觸小體相關蛋白（Synaptosomal associated protein 25，SNAP25）等所組成。上述蛋白係胞外分泌機制複合物的單元蛋白。每一種毒素會以上述的三種蛋白為其基質，且已知地，B、D、F及G型的毒素會於特定位置分裂出小突觸泡蛋白，A及E型毒素則於特定位置分裂出SNAP25，而C型毒素於特定位置分裂出突觸前膜陣列蛋白（Binz, T. et al., J. Biol. Chem., 265:9153, 1994）。
具體來說，A型BTX可溶解於酸鹼值4.0～6.8的稀釋水溶液，且穩定的無毒蛋白可於酸鹼值約7或更高的環境下，自神經毒素分離出來，因此毒性將逐步地流失。 明確來說，毒性會隨著酸鹼值及溫度的上升而下降。
BTX對人體來說即便只有微量也是致命的，且容易大量製造。因此，BTX 與炭疽桿菌（Bacillus Anthracis）、鼠疫桿菌（Yersinia Pestis）及天花病毒（Smallpox virus）一同構成了四大生物恐怖武器（Bio-Terror weapon）。然而，當A型BTX被以不會系統性地影響人體的劑量注射於人體時，BTX可以麻痺注射位置的肌肉。依據這樣的特性，A型BTX可被廣泛地應用，包含除皺劑、治療痙攣性偏癱（Spastic Hemiplegia）及腦麻痺（Cerebral Palsy）的藥劑等。因此，A型BTX的需求增加，而為了迎合需求，製造BTX的方法的研究盛行。
BOTOX®（A型BTX的純化神經毒複合物）係現行典型的商業化產品，可從愛力根公司（Allergan，Inc.，USA）購買。100單位小管（100-unit vial）的BOTOX® 係由大約5奈克（ng）的A型BTX的純化神經毒複合物、0.5微克（mg）的人類血清白蛋白及0.9 mg的氯化鈉所組成，且可利用不含防腐劑的無菌鹽（注射0.9%的氯化鈉）重組。其他商業化產品包含可從Ipsen 公司（Ipsen Ltd.，UK）購買的Dysport® （A型梭狀BTX與HA的複合物，於含BTX的藥物組成中具有乳糖及人類血清白蛋白且可於使用前以0.9%的氯化鈉重組），以及可從Solstice Neurosciences 公司（Solstice Neurosciences，Inc.）購買的MyoBloc® （酸鹼值約5.6的血管注射劑溶液，包含B型BTX、人類血清白蛋白、丁二酸鈉及氯化鈉）。
習知用以製造BTX的方法包含酸沉澱、鹽析以及層析。
舉例來說，日本公開特許專利（Japanese Unexamined Patent Application Publication）JP1994-192296揭示一種藉由培養肉毒桿菌細菌，再執行酸沉澱、萃取、核酸酵素添加以及結晶化，以製造A型晶狀BTX的方法。此外，美國專利US5696077揭示一種藉由培養肉毒桿菌細菌，再執行酸沉澱、萃取、離子交換層析、凝膠過濾層析及結晶化，以製造B型晶狀BTX的方法。
Simpson et al.藉由純化BTX以製造A型BTX，而BTX的純化係藉由重力流層析（Gravity flow chromatography），接著高效液相層析（High performance liquid chromatography，HPLC）、以親和樹脂捕捉、粒徑排阻層析（Size exclusion chromatography）及包含兩種離子（陰離子及陽離子）交換管柱的使用的離子交換層析（Method in Enzymology，165:76，1988）。而Wang et al.則藉由沉澱及離子交換層析以純化A型BTX（Dermatol Las Faci Cosm Surg.，2002:58，2002）。
除此之外，美國專利US6818409揭示藉由離子交換及乳糖管柱（Lactose columns）以淨化BTX，而美國專利US7452697揭示藉由離子交換層析與疏水層析以製備A型BTX的方法。韓國公開專利KR2009-0091501揭示藉由酸沉澱與陰離子交換層析以純化BTX的方法，美國專利公開US2013-0156756 揭示藉由陰離子交換層析及陽離子交換層析以純化BTX的方法。
然而，於習知的方法中，陰離子交換層析會對BTX的膠體電泳帶型（Gel Banding Pattern）造成不利的影響（美國專利US7452697），且因為長時的純化流程，這些習知的方法難以商業化。另外，因為作為BTX製造菌株的肉毒桿菌係厭氧細菌，細菌的發酵需於無氧系統中執行，因而難以大量生產BTX。此外，藉由尚數純化方法而得的原料藥BTX（Active Ingredient BTX）無法明確地被分離或鑑別，因此有含雜質的問題。再者，於習知用以製造BTX的方法中，為了純化出高純度的BTX，過濾及透析的流程為必須，使得純化步驟複雜且困難。
另外，於習知用以製造BTX的方法中，酵素例如去氧核醣核酸酶（Deoxyribonuclease，DNase）或核醣核酸酶（Ribonuclease，RNase）被用以去除核酸例如去氧核醣核酸（Deoxyribonucleic Acid，DNA）或核醣核酸（Ribonucleic Acid，RNA）（請參照例如韓國專利KR10-1339349，以及如圖1所示的習知的BTX製造方法）。然而，因為酵素例如DNase或RNase係源自動物，這些酵素可能會含有多種造成疾病的基質，特別是動物來源的異常普里昂蛋白（Prion protein），也就是普遍認知會造成傳染性海綿腦病（Transmissible spongiform encephalopathy，TSE）的蛋白，因此習知的BTX製造方法於安全性上有所問題。
TSE係一種神經退行性失調，將導致嚴重的神經元退化，其包含感染人類及動物的例子像是牛腦海綿狀病變（Bovine spongiform encephalopathy，BSE）、羊搔癢症（Scrapie）、克雅二氏病（Creutzfeldt-Jakob disease，CJD）、格斯特曼綜合症（Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome）、庫魯病（Kuru）、傳染性貂腦病（Transmissible mink encephalopathy）、慢性消耗病（Chronic wasting disease）、貓科海綿狀腦病（Feline spongiform encephalopathy）等。其中根據研究，BSE能夠跨越種族的限制，甚至能感染人類。
引起TSE的媒介物不具免疫原性，且具有潛伏期長的特性。感染BSE的牛腦組織的組織病理學研究顯示因為神經元的損壞及異常蛋白纖維的沉積，於腦部形成了特殊海綿液泡（Special spongiform vacuole）。
已知的傳染性蛋白──異常普里昂蛋白係TSE的成因。異常普里昂蛋白不像一般病毒需要核酸，它是一個單由蛋白質所組成，不含核酸的傳染性粒子。就TSE而論，已知當異常普里昂蛋白（PrPsc）這個傳染性粒子與正常普里昂蛋白（PrPc）結合時，他會轉變為病原普里昂蛋白，並沉積於腦部（Prusiner SB, Alzheimer Dis Assoc Disord., 3:52-78, 1989）。
CJD係人類TSE中罕見的神經退行性失調，其傳染媒介物明顯係普里昂蛋白的同種型。當人感染到CJD時，於六個月內其身體狀況可能從顯然完好的狀況惡化至產生不動不語（Akinetic mutism）的症狀。因此，藉由動物衍生製品以取得含有生物製品例如BTX的藥物合成物時，將有潛在的風險感染普里昂蛋白相關的疾病，例如CJD。因此，若用動物衍生製品製造的藥物基質以製成藥物合成物，可能使病人有接收多種病原體或傳染媒介物的風險。
因此，藉由無動物製品（Animal product-free，APF）流程以製造BTX的方法係迫切需要的，以解決如普遍由動物衍生成份引起的TSE感染的安全性問題。
在如此的技術領域中，本發明人致力於發展能夠防止暴露於普里昂蛋白相關疾病（TSE）的風險，並提升BTX的純度，也因此發現當BTX製造菌株的培養物以酸處理產生BTX沉澱物，並藉由選自由深床過濾法（Depth filtration，DF）、微過濾法（Microfiltration，mF）、超微過濾法（Ultrafiltration，UF）、無菌過濾法（Sterile filtration）、薄膜層析法（Membrane chromatography，MC）和離心法所組成之群組的至少一種前處理流程以淨化BTX沉澱物，接著執行UF濾洗（Diafiltration）、硫酸銨沉澱或氫氯酸沉澱，再接著藉由陰/陽離子交換層析以執行純化時，使用動物製品的酵素處理步驟便可以省略，以排除引起普里昂蛋白相關疾病的風險，且BTX的純度亦可提升，以完成本發明。
技術問題
本發明的目的在於提供更有效率且安全的肉毒桿菌毒素（Botulinum toxin，BTX）製造方法，其中所述製造方法是於無動物製品（Animal product-free，APF）的條件下實施。
更詳細地說，本發明的目的在於提供一種肉毒桿菌毒素的製造方法，將藉由動物製品（Animal product，AP）以進行酵素處理的步驟，替換為藉由選自於由深床過濾（Depth filtration，DF）、微過濾（Microfiltration，MF）、超微過濾（Ultrafiltration，UF）、無菌過濾（Sterile filtration）、薄膜層析（Membrane chromatography，MC）和離心所組成之群組的至少一方法的肉毒桿菌毒素淨化（Clarification）步驟。上述方法群組中的方法為前處理步驟，後續進行選自由UF濾洗（Diafiltration）、硫酸銨沉澱和氫氯酸沉澱所組成的群組中的一步驟，再藉由陰/陽離子交換層析（Anion/Cation-exchange chromatography，AEX/CEX）進行進一步的純化（Purification），因而確保有高產量（high yield）。
技術解決方法
為了達成上述目的，本發明提供肉毒桿菌毒素（Botulinum toxin，BTX）的製造方法，包含下述步驟：
步驟a：以酸處理BTX製造菌株的培養物，形成含BTX沉澱物；
步驟b：加入第一緩衝液至含BTX沉澱物，再藉由選自由深床過濾（Depth filtration，DF）、微過濾（Microfiltration，MF）、超微過濾（Ultrafiltration，UF）、無菌過濾（Sterile filtration）、薄膜層析（Membrane chromatography，MC）和離心所組成之群組的一或多個方法以進行淨化；
步驟c：將步驟b得到的含BTX溶液執行UF濾洗（Diafiltration）、硫酸銨沉澱或氫氯酸沉澱，再將經UF濾洗而產生的滯留物（Retentate）稀釋於第二緩衝液中，或將經硫酸銨沉澱或經氫氯酸沉澱而產生的沉澱物溶解於第三緩衝液中；以及
步驟d：將步驟c得到的滯留物稀釋液、硫酸銨沉澱物溶液或氫氯酸沉澱物溶液執行陰離子交換層析（Anion-exchange chromatography，AEX）以純化BTX。
實現本發明的最佳模式
除非特別指定，所有於此使用的技術及科學詞彙皆與任何熟習相關技藝者的一般認知相同。大體而言，下述的命名及實驗方法，皆為本發明相關技藝已知且普遍使用的。
本發明試圖發展用以取代習知流程中使用動物製品的酵素處理步驟的步驟，以發展無動物製品（Animal product-free，APF）且低分子量的肉毒桿菌毒素（Botulinum toxin，BTX）純化流程，因此執行了使用深床濾器的過濾流程、習知的氫氯酸沉澱流程、使用硫酸銨的流程，以及使用超微過濾（Ultrafiltration，UF）系統的流程，結果顯示得到的BTX純度高於藉由習知技術所得到的BTX純度。這樣的結果表示，依據本發明的上述方法能夠以安全的方式在無TSE的環境下自菌株的培養物製造出高純度的BTX。
於此使用的「流程（Process）」及「分離（Separation）」係可替換的用字，意指出於純化步驟中，用以達成特定目的（例如BTX的純化）的至少一方法或系統。
於本發明的一實施例中，當以選自由深床過濾（Depth filtration，DF）、微過濾（Microfiltration，MF）、超微過濾（Ultrafiltration，UF）、無菌過濾（Sterile filtration）、薄膜層析（Membrane chromatography，MC）和離心所組成之群組的至少一方法執行淨化，且接著執行UF濾洗（Diafiltration）、硫酸銨沉澱或氫氯酸沉澱時，即便僅藉由AEX流程亦能得到良好的BTX純度。
因此，於一方面，本發明係關於BTX的製造方法，特別關於包含下列步驟的BTX製造方法：
步驟a：以酸處理BTX製造菌株的培養物，形成含BTX沉澱物；
步驟b：加入第一緩衝液至含BTX沉澱物，再藉由選自由深床過濾（Depth filtration，DF）、微過濾（Microfiltration，MF）、超微過濾（Ultrafiltration，UF）、無菌過濾（Sterile filtration）、薄膜層析（Membrane chromatography，MC）和離心所組成之群組的一或多個方法以進行淨化；
步驟c：將步驟b得到的含BTX溶液執行UF濾洗（Diafiltration）、硫酸銨沉澱或氫氯酸沉澱，再將經UF濾洗而產生的滯留物（Retentate）稀釋於第二緩衝液中，或將經硫酸銨沉澱或經氫氯酸沉澱而產生的沉澱物溶解於第三緩衝液中；以及
步驟d：步驟c得到的滯留物稀釋液、硫酸銨沉澱物溶液或氫氯酸沉澱物溶液執行陰離子交換層析（Anion-exchange chromatography，AEX）以純化BTX。
依據本發明的一實施例的製造方法，純化的BTX可以係7S或19S的形態（分子量150～900 千道爾頓（kDa））。
於本發明的一實施例中，BTX製造菌株係肉毒桿菌（Clostridium Botulinum）或其突變菌株，但不限於此，且顯然地，本發明所屬領域具有通常知識者得以藉由任何能夠製造BTX的菌株以執行BTX製造方法。
於此，「BTX」不只包含肉毒桿菌或其突變菌株所生產的神經毒素（neurotoxins，NTXs），更包含修飾的、重組的及亞型（Chimeric）的BTX。重組BTX可以重組的方式產生輕鍊及/或重鍊。此外，「BTX」包含BTX血清型A、B、C、D、E、F及G、BTX複合物（即300、600及900 kDa的複合物）以及純BTX（即150 kDa的神經毒分子），於本發明的實踐上皆有所用處。
NTXs （7S）係BTX主要的成份，且會與培養物或食品中的無毒成分結合並成為大型複合物（Oguma et al., "Structure and function of Clostridium botulinum progenitor toxin.", J. Toxical-Toxin Reviews, 18:17-34, 1999）。製造BTX血清型A的A型菌株會製造三種類型的先驅毒素，分別被命名為LL （19S、900 kDa）、 L （16S、500 kDa）及M （12S、300 kDa）毒素，且皆被視為充份活化的毒素。而B型、C型及D型菌株則製造L及M兩種類型的毒素。此外，E型、F型及G型菌株僅製造一種類型的毒素，E型與F型菌株製造M毒素，G型菌株則製造L毒素。M毒素係由NTX （7S、150 kDa）及無紅血球凝集素（Hemagglutinin，HA）活性顯示的無毒成分所組成，其中無HA活性顯示的無毒成分稱為無毒無HA（Non-toxic non-HA，NTNH）。
於此，「製造出的BTX」係指當培養或發酵的流程中收集BTX時，自附有BTX的其他蛋白質或雜質分離或大致分離的純BTX或是BTX複合物。因此，製造產出的BTX的純度至少有90%，更好地能到至少95%，最好地能到至少98%。更具體地說，於本發明一實施例中，製造產出的BTX可以係純度至少98%的BTX A型蛋白。
用以製造BTX的肉毒桿菌菌株（Clostridium botulinum strain）培養可以本發明所屬領域的習知方法及習知的培養基以實現。
作為並非用以限制的例子，用以培養肉毒桿菌菌株的培養基可包含酪蛋白水解物（Casein hydrolysate）、酵母萃取物（Yeast extract）、葡萄糖以及其他類似物，且肉毒桿菌菌株的培養是在氣溫攝氏25到40度間的環境下，執行90到180小時，且執行100到150小時更佳。
步驟a的酸沉澱可於培養後藉由加入酸至菌株的培養物以執行，其中又以硫酸或氫氯酸為更佳，如此一來培養物的酸鹼值可達到3.0～4.5，其中又以3.3～4.0為更佳，又以3.4～3.6為最佳。
步驟a的酸沉澱係依據下述原理：當去除培養後殘留的肉毒細菌時，添加酸於包含多種蛋白的培養物會使培養物的酸鹼值下降，使得蛋白達到等電點（Isoelectric point，pI）而沉澱。廣義地說，它包含了結晶化，且沉澱方法係一個粗略地於混合狀態分離出欲求的物質，不像結晶化著重於純化出高純度的欲求物質。於沉澱方法中，與欲求物質具有相似結構的雜質亦會沉澱。於此，酸鹼值被調整為約3.0～4.5。BTX的回收率（Recovery rate）隨著酸鹼值下降而上升。若酸鹼值為3.0或更低，BTX本身將受到影響，而若酸鹼值為4.5或更高，BTX的回收率則將下降。因為這些因素，酸鹼值應於上述的範圍內較佳。尤其是酸鹼值3.4～3.6為最佳，因為在這酸鹼值範圍內，BTX的回收率最高。當BTX菌株培養物的酸鹼值在酸添加後位於合適的範圍，將會持續於培養物中加入酸直到酸鹼值的變化不再明顯，接著擺放培養物於室溫中10到30小時，接著再去除上層液。
於本發明的一實施例中，步驟a中的酸沉澱（形成該含BTX沉澱物）可執行一或多次。
於此，「淨化（Clarification）」意指於溶解液中再溶解（Re-dissolving）沉澱物或其類似物，接著去除溶液中的雜質，此雜質係於再溶解時所產生的。本發明一實施例的「淨化」步驟一般可藉由一或多個步驟以執行，包含例如過濾、沉澱、絮凝（Flocculation）及沉降中的單一步驟或多種步驟的組合。更詳細地說，淨化步驟可以藉由選自由深床過濾（Depth filtration，DF）、微過濾（Microfiltration，MF）、超微過濾（Ultrafiltration，UF）、無菌過濾（Sterile filtration）、薄膜層析（Membrane chromatography，MC）和離心所組成之群組的至少一方法以執行。透過本發明一實施例的淨化步驟，將能移除再溶解的毒素沉澱物所包含的雜質，特別是核酸雜質、寄主細胞DNA （HCD）、細胞碎片以及內毒素。
本發明的一些實施例提供了習知淨化步驟的改良，而淨化步驟一般用於多種的純化方案。純化步驟一般牽涉到一或多個非欲求的物質的去除，且通常於擷取欲求目標分子的步驟前執行。另一方面，淨化步驟係去除試樣中可溶解及不易溶解的成份，於後續的純化流程中，所述可溶解及不易溶解的成份可能導致無菌濾器產生汙垢，因此淨化步驟可使得整體純化流程更具經濟效益。除此之外，例如沉澱亦係可用以提升淨化效能的方法。因為使用刺激反應（Stimulus-responsive）的聚合物或小分子，有需多方法可執行雜質的沉澱，例如絮凝、酸鹼值調節（酸性沉澱）、溫度變動、相位改變，或上述方法的組合。
於此，「DF」意指藉由一系列孔洞漸小的濾器，從溶液去除粒子（例如雜質）。「深床濾器（Depth filter）」於此用以作為深床的濾材以執行過濾。這樣的濾器包含纖維聯結的隨機陣列所組成的附合物，也就是多條曲折迂迴的流道。藉由纖維陣列的誘捕（Entrapment）或吸收，能於這些濾器中分離粒子。對細胞培養的培養液及其他原料的生物處理來說，最常見的深床濾器媒介物係由助濾器如DE以及帶正電的樹脂固著劑。深床濾器媒介物不像純粹的濾器，其將粒子遍布留存於多孔的媒介物中，多孔的媒介物可保留大於孔徑以及小於孔徑的粒子。其中粒子的保留被認為同時牽涉於藉由疏水性、離子的或其他交互作用的粒徑篩析以及吸附。商業可得的深床濾器包括Millistak+ 莢式深床濾器系統（Pod depth filter system）、XOHC 媒介物（Millipore Corporation）、Zeta Plus™ 深床濾器（3M Purification Inc.）等。於本發明的一實施例中，DF可使用平行排列的兩個或多個深床濾器以執行。於此實施例中，商業可得的深床濾器包括Millistak+ 迷你DOHC （Millipore Corporation）以及XOHC濾器（Millipore Corporation）。
於本發明的一實施例中，深床濾器的孔徑一般係0.01～20微米，其中又以0.1～8微米更佳，深床濾器係用以去除大於上述孔徑的絮凝細胞碎片以及膠狀微粒，以及包含小於上述孔徑的微粒的細胞生物質（Cellular biomass），且深床濾器可包含具有各種孔徑的孔層的多孔深床濾器媒介物。
因此，於本發明的一實施例中，DF可輕易地從BTX沉澱物去除雜質如核酸、細胞碎片、內毒素等。
於此，「MF」或「UF」意指藉由膜上的孔洞於特定壓力下依據混合溶液的溶質的大小及結構將目標溶質（例如BTX）分餾（Fractionate）的流程。舉例來說，溶液的淨化步驟可以於表壓力5~40磅力每平方英寸(psig)且溫度攝氏4~60度的環境下，藉由聚碸(Polysulfone，PS)膜以0.1微米大小或750kDa的截留分子量(Molecular Weight Cut-Off，MWCO)分離以執行。
一般來說，MF係於UF前執行，且用以自溶液分離0.1~10微米尺寸的粒子。MF一般用以分離分子量1×105克/莫耳(g/mol)的聚合物。此外，MF也可用以去除沉積物、原生動物、大型細菌等等。於本發明的一實施例中，MF可輕易地用以去除聚合物或細胞碎片。一般來說，MF流程係藉由壓力幫浦或真空幫浦以0.1~5公尺/秒(m/s)的速率執行，其中又以1~3m/s更佳，並以50~600千帕(kPa)的壓力執行，其中又以100~400kPa更佳。
UF係用以自溶液分離尺寸為0.01~0.1微米的粒子，且對應於聚合物的粒子的分子量一般係1×103~1×105Da。UF係用以去除蛋白質、內毒素、病毒、矽土(Silica)等等的物質。於本發明的一實施例中，當使用100~300kDa MWCO的UF膜時，可去除BTX沉澱物的雜質，且濃縮BTX。
於此，「無菌過濾」係藉由微型濾器或膜濾器執行的流程，其可以代替加熱、光滲或化學處理，且可安全地淨化含有目標物質(例如生物製品、BTX等)。為了去除溶液中可能含有的微生物，使用的微型濾器的孔徑為0.1~0.3微米，其中又以0.15~0.25微米更佳，以0.2~0.22微米為最佳，且為了去除並去活化病毒等，淨化流程可使用孔徑為20~50奈米的奈米濾器。此外，為了去除微生物、病毒等，淨化流程可藉由膜濾器以執行，其中膜濾器具有特定的孔徑且係由纖維素酯或聚醚(Polyethersulfone，PES)所構成。
於本發明的一實施例中，「MC」對照於「樹脂層析(Resin chromatography)」，可被用以作為分離目標物質(例如BTX)的流程。樹脂層析一般係使用球面多孔樹脂且係基於溶液的擴散大於對流，然而，MC則是使用平面且有大孔洞的膜，並立基於溶液的對流大於擴散。因此，MC的溶液分離效率相對較高，且病毒、質體、大型蛋白複合物等較易通過膜，使得分離相較容易。商業可得性的MC包含Mustang Q膜層析膠囊(Membrane chromatography capsule）（Pall Corporation）、Sartobind Q（Sartorius Stedim Biotech GmbH），但不限於此。
於本發明的一實施例中，離心可以較佳12,000～15,000 g的離心力執行。
於本發明的一實施例中，步驟b的BTX淨化包含加入磷酸鹽緩衝液以溶解步驟a所產生的毒素沉澱物，並淨化沉澱物，其中，又以磷酸鈉緩衝液更佳。於此，磷酸鹽緩衝液的酸鹼值大約是3.0～8.0，其中又以4.0～7.0為更佳，且溶液的酸鹼值最後會被調整到4.5～6.5，其中以5.5～6.2為佳，4.8～5.8為更佳。毒素的淨化可於所述的酸鹼值範圍內執行。
於本發明的一實施例中，步驟c的BTX的稀釋或溶解包含加入磷酸鹽緩衝液至步驟b所產生的毒素以稀釋滯留物或溶解沉澱物的步驟，其中又以磷酸鈉緩衝液為更佳。於此，磷酸鹽緩衝液的酸鹼值大約為4.0～8.5較佳，且可加入鹼以調整酸鹼值，最終至4.5～8，其中，以5.5～7.5為佳，以6～7為更佳。毒素的稀釋或溶解可於所述的酸鹼值範圍內執行。
於本發明的一實施例中，步驟b的BTX的DF可以蠕動幫浦執行，而步驟c的UF濾洗、硫酸銨沉澱或氫氯酸沉澱可執行一或多次。
於此，「UF濾洗」意指以上述UF執行的濾洗，然而並不限於此。「濾洗」意指利用可滲透濾器去除或收集目標物質（溶液）的任何成份的技術方法，其中可滲透濾器可以依據成份的分子量（分子大小）完成分離，因而使目標物質的純度提升。
硫酸銨沉澱的步驟對應於鹽析流程，於鹽析流程中，易溶解於水的鹽類（硫酸銨等）被加至蛋白混合物以提升離子強度，藉此形成蛋白沉澱物。若欲求蛋白主要沉澱於含濃度30%（溶質重量/溶液體積，w/v）的硫酸銨的飽和液，則可藉由使除了欲求蛋白之外的蛋白沉澱於30%（w/v）或更低濃度的硫酸銨飽和液，再加入硫酸銨於濃度30%（w/v）的飽和溶液以沉澱欲求蛋白，接著再以離心收集欲求蛋白。通常來說，會以鹽析作為純化的初始方法。而使用的硫酸銨溶液的硫酸銨濃度為10～50% （w/v），其中以20～40% （w/v）為佳。此外，步驟c的氫氯酸沉澱可藉由加入氫氯酸使酸鹼值達2～5的步驟以執行，其中又以2.5～4.5為佳。
步驟d的AEX可於於酸鹼值2～9且導電率2～40毫西門子/公分（Millisiemens per centimeter，mS/cm）的溶液中執行。其中酸鹼值又以3～8為佳，導電率以3～30 mS/cm為佳。於步驟d中，BTX可收集為穿流（Flow-through，FT）片段的含有BTX的片段（FT模式），其中穿流片段係由AEX所洗堤出來的。或者，BTX也可收集為含有BTX與AEX樹脂聯結的片段。而最終純化的BTX可具有7S 或19S的形態。
「FT」、「FT流程」或「FT純化」於此為可替換用字，意指分離流程，其中於分離流程中，與一或多種雜質同時被包含於生物製藥配方中的至少一目標分子（例如BTX）流經濾材，且雜質通常會附著於濾材而目標分子則不會，也就是會流經濾材的意思。
「導電率」代表水溶液導通兩電極間的電流的能力。於溶液中，電流隨著離子的傳輸而流。因此，隨著水溶液中存在的離子數量的上升，溶液將具有越高的導電率。導電率量測的基本單位係西門子 （Siemen）或姆歐（mho）、姆歐/公分（mho/cm）或毫西門子/公分（mS/cm），且可藉由導電率計以量測，例如Orion的多種型號的導電率計。由於電解導電率係溶液中承載電流的離子的量，溶液的導電率將隨著溶液離子濃度改變而改變。舉例來說，可藉由改變緩衝試劑的濃度及/或溶液中鹽類（例如氯化鈉、乙酸鈉或氯化鉀）的濃度以達到欲得的導電率。尤其是調整各種緩衝液中的鹽類濃度以達到欲得的導電率。
於本發明的一實施例中，步驟d的AEX所使用的管柱緩衝液（Column buffer）可以係磷酸鈉緩衝液、檸檬酸緩衝液或三羥甲基氨基甲烷-氯化氫（Tris-HCl）緩衝液，但不限於此。管柱緩衝液的濃度被調整至15～70毫莫耳/升（mM），其中又以約20～60 mM為佳。而管柱緩衝液的酸鹼值則被調整至2～9，其中又以3～8為佳，且流動相（Mobile phase）的流速控制在0.5～5.0毫升/分鐘（mL/min），其中又以1.0～3.0 mL/min為佳。於此，緩衝液的導電率被調整至2～40 mS/cm，其中又以3～30 mS/cm為佳，且在管柱的平衡完成後將試樣裝入管柱中。
除此之外，於本發明的一實施例中，當經步驟a至d所得到的含有BTX的AEX片段的酸鹼值被往上調整且再執行一次AEX，再接著執行陽離子交換層析（Cation exchange chromatography，CEX）時，即可取得高純度的BTX，特別是純肉毒神經毒素（Botulinum neurotoxin）。
另一方面，本發明的一實施例提供的BTX的製造方法，於步驟d後更包含下列步驟：
步驟e：調高含有BTX的AEX片段的酸鹼值；
步驟f：藉由另一AEX以純化步驟e中的酸鹼值經調整的AEX片段；以及
步驟h：藉由CEX以純化經步驟f而產生的稀釋的BTX。
更佳地是，此方法於步驟f及步驟h間更包含步驟g：加入第四緩衝液至純化的AEX片段以稀釋BTX 。
於本發明的一實施例中，當附加執行步驟e至h時，為了方便解釋，將稱步驟d的AEX流程為「第一AEX流程」，而步驟f的AEX流程則稱為「第二AEX流程」。除非另外指定，步驟d的AEX 流程就係指步驟d的第一AEX。此外，除非另外指定，舉例中的TQ及其類似詞意指第一AEX流程，HQ則意指第二AEX流程，且XS意指CEX流程。
於本發明的一實施例中，溶液的「酸鹼值」意指溶液的酸度或鹼度，關聯於水試樣的離子化（Ionization）。水的酸鹼值為中性，也就是7。大部分的酸鹼值的讀數範圍係0 到14。氫離子濃度高於水的溶液（酸鹼值小於7）為酸性；而氫離子濃度低於水的溶液（酸鹼值大於7）則為鹼性（basic或alkaline）。酸鹼值可藉由酸鹼計來量測。緩衝液的酸鹼值可以藉由酸如氯化氫，或鹼類如氫氧化納以調整。
於本發明的一實施例中，於步驟e中，AEX片段的酸鹼值可以向上調整一或多次，且步驟e中的AEX片段酸鹼值的向上調整可以藉由選自由UF濾洗法、酸鹼值滴定法、透析法及緩衝液置換管柱層析法（Buffer exchange column chromatography）所組成之群組的至少一方法以執行。理想上，步驟e中的AEX片段酸鹼值的向上調整可利用Tris-HCl緩衝液執行。於此，Tris-HCl緩衝液的酸鹼值為7.0～8.5，其中又以7.3～8.3為佳。因此，酸鹼值可被調整至7.0～8.5，其中又以 7.3～8.3為佳，以7.7～7.9為更佳。
步驟f中的第二AEX可於酸鹼值2～9且導電率2～40 mS/cm的環境中執行，其中酸鹼值又以3～8為佳，導電率則以3～30 mS/cm為佳。於步驟f中，BTX可收集為穿流片段的含有BTX的片段（穿流模式），其中穿流片段係由AEX所洗堤出來的。或者，BTX也可收集為含有BTX與AEX樹脂聯結的片段。
於本發明的一實施例中，步驟g的第四緩衝液以磷酸鈉緩衝液為佳，且其酸鹼值為6～8，其中又以6.5～7.5為佳。
於本發明的一實施例中，步驟h的CEX可於酸鹼值2～9的環境中執行，其中又以3～8為佳。於步驟h的CEX中，BTX可收集為含有BTX與CEX樹脂聯結的片段，且最後純BTX的形態為7S（分子量：150 kDa）。
於本發明一實施例的BTX製造方法中，用於AEX流程的樹脂包含二乙胺（Diethylaminoethyl，DEAE）、季胺基乙基（Quaternary aminoethy，QAE）及四級胺（Quaternary amine，Q）類，但不限於此。更佳地是使用樹脂TQ650、HQ、XQ等等。
於本發明一實施例的BTX製造方法中，用於AEX流程的樹脂最好包含羧甲基（Carboxymethyl，CM）、磺乙基（Sulfoethyl，SE）、磺丙基（Sulfopropyl，SP）、磷酸鹽（Phosphate，P）及磺酸鹽（Sulfonate，S），但不限於此。更佳地是使用樹脂HS、XS等。
纖維素離子交換樹脂例如DE23™、DE32™、DE52™、CM-23™、CM-32™及CM-52™可自廠商（GE Healthcare，Lindesnes，Norway）取得，且以塞法戴克斯（SEPHADEX）為基底及交聯式的離子交換器亦為已知。舉例來說，DEAE-、QAE-、 CM-、SP-SEPHADEX以及DEAE-、Q-、CM-以及S- SEPHAROSE以及塞法戴克斯速流（SEPHAROSE Fast Flow）皆可自廠商（GE Healthcare Bio-Sciences）取得。除此之外， DEAE及CM衍生的（derivatized）乙二醇甲基丙烯酸酯共聚合物（Ethylene glycol-methacrylate copolymer），例如TOYOPEARL™ DEAE-650S或M，及TOYOPEARL™ CM-650S 或M，皆可自廠商（Tosoh Bioscience LLC，King of Prussia，PA）取得。
實施例
以下在實施方式中詳細敘述本發明之詳細特徵以及優點，其內容足以使任何熟習相關技藝者了解本發明之技術內容並據以實施，且根據本說明書所揭露之內容、申請專利範圍及圖式，任何熟習相關技藝者可輕易地理解本發明相關之目的及優點。以下之實施例係進一步詳細說明本發明之觀點，但非以任何觀點限制本發明之範疇。
實施例 1 ：肉毒桿菌菌株的培養
用以培養製造BTX的肉毒桿菌菌株的培養基的組成包含2%的酪蛋白水解物、1%的酵母萃取物、1%的葡萄糖及0.5%的巰基乙酸培養液，且被置於攝氏120度的高溫下滅菌30分鐘。接著，注入20微升的肉毒桿菌（韓國疾病控制及預防中心（Korean Centers for Disease Control and Prevention Accession）No.：4-029-CBB-IS-001）於含有10毫升培養基的培養管中，且肉毒桿菌需於攝氏35度的無氧環境下經第一次種菌培養（靜止培養）22至30小時。當確認了菌株於第一次種菌培養流程中的生長時，注入8毫升的第一次種菌培養物至含有800毫升無菌培養基的培養瓶中，且於攝氏35度的無氧環境下經第二次種菌培養（靜止培養）8-15小時，其中無菌培養基具有相同的培養基成份。當確認了菌株於第二次種菌培養流程中的生長時，注入800毫升的第二次種菌培養物至含有10升無菌培養基的培養瓶中，且置於攝氏35度的無氧環境下4至6天，其中無菌培養基具有相同的滅菌過的培養基成份。
實施例 2 ： BTX 的製造
2-1: 硫酸沉澱及酸鹼中和
硫酸沉澱的步驟為蛋白質分離的流程，於此流程中，當去除培養後殘留的肉毒細菌時，硫酸被加入含有多種蛋白質的培養物中以降低培養物的酸鹼值，使得蛋白達到等電點（Isoelectric point，pI）而沉澱。主培養如例1所述，且在主培養完成之後，將收集培養基於10升的培養容器（10升的不銹鋼罐）。接著，將5當量濃度（N）的硫酸加入培養物中以使酸鹼值達3.4～3.6，接著可靜置培養物於室溫中待12～20小時，如此一來培養物便會分離為上層液及沉澱物。而上層液會被去除，留下2.5～3.0升的硫酸沉澱物。
去除上層液後留下的硫酸沉澱物可以下列方法執行酸鹼中和例如透過酸鹼值滴定執行。將700毫升的1 M磷酸鈉（酸鹼值5.3）於硫酸沉澱物中，接著攪拌。加入5N的氫氧化納以調整硫酸沉澱物酸鹼值至5.9～6.1。收集酸鹼中和的硫酸沉澱物。
2-2 ：前處理流程
1 ） 習知流程
以習知流程處理例2-1所產生的硫酸沉澱物。具體來說，去除沉澱物中留存的DNA及RNA，加入60毫升的0.4M 鹽酸苯甲脒（Benzamidine HCl）、100毫克的DNase以及300毫克的RNase，並為了萃取BTX，培養（incubate）沉澱物溶液約3～7小時。接著，將培養後的沉澱物溶液於攝氏4度進行離心15分鐘，且離心率為12,000 x g，接著再收集上層液。加入1N的氫氯酸使上層液的酸鹼值低至3.4～3.6，再靜置上層液於氣溫攝氏3～5度的環境中12～20小時，藉此執行氫氯酸沉澱的流程。將上述流程所形成的氫氯酸沉澱物於攝氏4度進行離心15分鐘，且離心率為12,000 x g，以去除上層液，且將剩餘的毒素顆粒溶解於30毫升的磷酸鈉緩衝液（酸鹼值6.5）中。
2 ） DF 流程
使用Zeta Plus™包膠膠囊式深床濾器（Encapsulated Capsule depth filter，3M，BC0025S60SP05A）連接於蠕動幫浦，有效地過濾例2-1所產生的硫酸沉澱物。
i ） 接續於 DF 的 UF
將深床濾液以50 mM的磷酸鈉（酸鹼值6.5）及UF系統（PALL，切向流過濾卡閘（Tangential Flow Filtration cassette，TFF cassette）30 kDa）濾洗10次，再將最中體積調整至30毫升。
ii ） 接續於 DF 的硫酸銨沉澱
加入硫酸銨於深床濾液中使其濃度達30%（w/v），再靜置濾液於溫度攝氏3～5度的環境中12～20小時。接著，將溶液於攝氏4度進行離心15分鐘，且離心率為12,000 x g，以去除上層液，接著將離心後的顆粒再溶解於30毫升的50 mM磷酸鈉緩衝液（酸鹼值6.5）中。
iii ） 接續於 DF 的氫氯酸沉澱
加入1N的氫氯酸於深床濾液中使濾液的酸鹼值低至3.4～3.6，再靜置溶液於溫度攝氏3～5度的環境中12～20小時。接下來，將溶液於攝氏4度進行離心15分鐘，且離心率為12,000 x g，以去除上層液，接著將離心後的顆粒再溶解於30毫升的50 mM磷酸鈉緩衝液（酸鹼值6.5）中。
2-3 ：純化流程
以TQ流程（第一AEX流程）純化BTX，再以使用高效液相層析儀（High-performance liquid chromatography，HPLC，Waters e2695）的粒徑排阻層析（Size exclusion chromatography，SEC）方法量測BTX的純度。於此，使用的移動相（Mobile phase）係100 mM的磷酸鈉（酸鹼值6.5），且TSKgel G4000SWxl （Tosoh Bioscience，P/N 08542）管柱連接於保護管柱（Tosoh Bioscience，P/N 08543），並將20 微克的肉毒桿菌毒蛋白裝入管柱中，使其以1毫升/分鐘的速率流動30分鐘。
為了能視覺上地量測於TQ流程（第一AEX流程）、HQ流程（第二AEX流程）及XS流程（CEX流程）中的每一BTX純化步驟（流程）所收集到的試樣中所含的BTX的混合狀態/純度/含量，將執行蛋白質電泳（SDS-PAGE）。詳細地說，將被認為含有BTX的試樣以布拉德福蛋白質定量法量化，而後將每一試樣取特定數量（例如40 微克蛋白）並適當地加熱及/或溶解，以變性蛋白執行4-12%的SDS-PAGE。以適當的染劑（硝酸銀或考馬斯藍（Coomassie blue））將電泳膠染色，接著便能視覺上地量測每一純化步驟中的BTX的純度。
2-3-1 : TQ 純化 （ AEX 穿流（ FT ））
在完成例2-2的前處理流程後，為了去除大部分的除了BTX之外的大型雜質，將以下述方法執行力用離子交換樹脂的層析法。
（1）將TQ填入XK 26/40的管柱至30～34公分的高度，再架置管柱於AKTA Prime Plus中。.
（2） 將管柱以平衡/洗提溶液（50 mM磷酸鈉，酸鹼值6.4-6.6，且導電率10±5 mS/cm）平衡。
（3） 取10毫升的例2-2的習知流程所前處理的試樣，注入管柱中並使試樣以2毫升/分鐘的速率流動。完成注入後，將160～180毫升的平衡/洗提溶液注入，從而收集片段直到位於紫外光波長280奈米的尖峰（Peak）下降至基準線（片段係以SDS-PAGE分析）。
（4）在收集片段後，為了恢復管柱，將200毫升或更多的清洗液（50 mM 磷酸鈉，酸鹼值6.4~6.6，1M氯化鈉）以5毫升/分鐘的流速注入，以清洗管柱。
（5）依據上述（2）到（4）的程序，TQ 純化係以取代習知流程的其他三種方法（接續於DF的UF、接續於DF的硫酸銨沉澱及接續於DF的氫氯酸沉澱）進行試樣的前處理。於此，為了得到高純度的BTX，酸鹼值應維持在6.4～6.6，且導電率維持在10±5 mS/cm。
如此一來可得知，BTX不會被TQ樹脂所吸收，且大部分的大型雜質會被吸收而去除，因此可以製造出高純度的BTX。此外，結果產生的BTX的形態係19S （分子量：約900 kDa）。
2-3-2 ： HQ 純化 （ AEX ，結合模式）
在完成TQ 純化後，為了更純化BTX，將使用HQ離子交換樹脂以執行層析法（下述稱為「HQ流程」）。於HQ流程中，將TQ純化所產生的試樣以結合模式或穿流模式純化。於此，「HQ（結合）」意指基於可與目標物質結合的HQ樹脂的待電量的差異以分離（或洗提）目標物質（例如BTX）的流程，而「HQ（穿流）」則意指基於可與混合目標物質（例如BTX）的雜質結合的HQ樹脂的帶電量差異，目標物質會流過HQ樹脂而不與HQ樹脂結合，因而自試樣被分離出來。
HQ （結合）純化 （ AEX ，結合模式）
（1） 於基於習知流程的前處理後，將經TQ純化的試樣以25 mM的Tris-HCl緩衝液（酸鹼值7.7～7.9）並使用UF系統（PALL，TFF cassette 30 kDa MWCO）濾洗10次。試樣的最終酸鹼值係7.7～7.9，且會將其體積調整至30毫升。
（2） 將填有HQ 樹脂的管柱連接至AKTA Prime Plus。
（3） 以25 mM的Tris-HCl緩衝液（酸鹼值7.7～7.9）平衡管柱。
（4） 將（1）製備的試樣以2.5毫升/分鐘的流速注入平衡的管柱，且以40毫升的25 mM Tris-HCl緩衝液（酸鹼值7.7～7.9）清洗，接著以20 管柱容積（Colume volume, CV）及10% 的梯度洗提。而後繼續收集對應於第一尖峰的片段（片段係以SDS-PAGE分析）。
（5）在收集片段後，為了恢復管柱，將120毫升或更多的清洗液（25 mM Tris-HCl，酸鹼值7.7-7.9，1M氯化鈉）以2.5毫升/分鐘的流速注入，以清洗管柱。
（6）上述（1）到（5）的程序係執行於基於其他三種方法（接續於DF的UF、接續於DF的硫酸銨沉澱及接續於DF的氫氯酸沉澱）處理後的TQ純化試樣，而非係基於習知方法前處理後的TQ純化試樣。
因此可以製造出高純度的BTX，且結果產生的BTX的形態為7S（分子量：約150 kDa）（圖2及3）。
2-3-3 ： HQ 純化（ AEX ，結合模式）與 XS 純化（結合模式）
完成例2-3-2的HQ純化後，為了更純化BTX，將執行XS CEX（結合模式）。
詳細來說，XS 流程係以下列方法執行。
（1） 以50 mM的磷酸鈉緩衝液（酸鹼值6.9～7.1）將基於例2-2的習知流程前處理後的HQ純化試樣稀釋至1/4。
（2） 將填有XS 樹脂的管柱連接至AKTA Prime Plus。
（3）以50 mM 磷酸鈉（酸鹼值6.9～7.1）平衡管柱。
（4） 將（1）稀釋的HQ純化試樣以1.6毫升/分鐘的流速注入平衡的管柱，且以50毫升的50 mM 磷酸鈉緩衝液（酸鹼值6.9～7.1）清洗。接著以20 管柱容積（Colume volume, CV）及12% 的梯度洗提試樣。而後繼續收集對應於第一尖峰的片段（片段係以SDS-PAGE分析）。
（5）在收集片段後，為了恢復管柱，將20毫升或更多的清洗液（50 mM 磷酸鈉，酸鹼值6.9～7.1，1M氯化鈉）以1.6毫升/分鐘的流速注入，以清洗管柱。
（6）上述（1）到（5）的程序係執行於基於其他三種方法（TQ純化係在接續於DF的UF、接續於DF的硫酸銨沉澱及接續於DF的氫氯酸沉澱之後）處理後的TQ及HQ純化試樣，而非係基於習知方法前處理後的HQ純化試樣。
因此可以製造出高純度的BTX，且結果產生的BTX的形態為7S（分子量：約150 kDa）（圖4及5）。
2-3-4 ： HQ 純化（ AEX ， FT 模式）與 XS 純化 （結合模式）
依據上述例2-3-3的BTX製造方法，於HQ（AEX）純化流程中，係以FT模式取代結合模式以製造BTX。
HQ （ AEX ， FT 模式）流程
HQ 純化 （AEX，FT模式）係以下述方法執行。
於基於習知流程的前處理後，將經TQ純化的試樣以25 mM的Tris-HCl緩衝液（酸鹼值7.7～7.9，導電率7.0-7.5 mS/cm）並使用UF系統（PALL，TFF cassette 30 kDa MWCO）濾洗10次。試樣的最終酸鹼值係7.7～7.9，且會將其體積調整至30毫升。接下來，將試樣執行HQ（FT模式）流程。
（1）將填有HQ樹脂連接至AKTA Prime Plus。
（2）以25 mM的Tris-HCl緩衝液（酸鹼值7.7～7.9，導電率7.0-7.5 mS/cm）平衡管柱。
（3）將TQ純化的試樣以1.5毫升/分鐘的流速注入平衡的管柱，且以40毫升的25 mM Tris-HCl緩衝液（酸鹼值7.7～7.9，導電率7.0-7.5 mS/cm）清洗。收集對應於尖峰的片段（片段係以SDS-PAGE分析）。
（4）在收集片段後，為了恢復管柱，將40毫升或更多的清洗液（25 mM Tris-HCl，酸鹼值7.7-7.9，1M氯化鈉）以1.5毫升/分鐘的流速注入，以清洗管柱。
以 HQ （ FT ）試樣執行 XS 流程
為了提升BTX的純度，將經HQ（FT）流程純化的試樣執行XS （結合）流程。
（1） 以50 mM的磷酸鈉緩衝液（酸鹼值6.9～7.1）將經HQ（FT）流程純化的試樣稀釋至1/4。
（2） 將填有XS 樹脂的管柱連接至AKTA Prime Plus。
（3）以50 mM 磷酸鈉（酸鹼值6.9～7.1）平衡管柱。
（4） 將（1）稀釋的HQ純化試樣以1.5毫升/分鐘的流速注入平衡的管柱，且以50毫升的50 mM 磷酸鈉緩衝液（酸鹼值6.9～7.1）清洗。接著以60管柱容積（Colume volume, CV）及12%的梯度洗提試樣。而後繼續收集對應於第一尖峰的片段（片段係以SDS-PAGE分析）。
（5）在收集片段後，為了恢復管柱，將20毫升或更多的清洗液（50 mM 磷酸鈉，酸鹼值6.9～7.1，1M氯化鈉）以1.5毫升/分鐘的流速注入，以清洗管柱。
如此一來，如圖6及7所示，製造出的BTX的形態為7S（分子量：約150 kDa），且其純度為98%或更高。
請一併參照，如圖2至7所示，藉由例2的習知流程或接續於DF的氫氯酸沉澱流程後的AEX純化 （TQ （結合或穿流模式） 純化）得到含有BTX的試樣，而於上述含有BTX的試樣中，雜質除了天生於毒素19S觀察到的138 kDa （無毒無紅血球凝集素，NTNH）、 98 kDa （重鍊）、 52 kDa （輕鍊）、 50 kDa （紅血球凝集素，HA）、 33 kDa （HA）、 20 kDa （HA）及17 kDa （HA）之外，被發現的量最少。
再者，於藉由接續於DF的UF濾洗後的AEX（TQ （結合或穿流模式） 純化）所得的含有BTX的試樣中，發現約13 kDa的雜質蛋白帶。
此外，於藉由接續於DF的硫酸銨沉澱後的AEX（TQ （結合或穿流模式） 純化）所得的含有BTX的試樣中，發現約37 kDa的雜質蛋白帶。
然而，由為了純化低分子量（Low-molecular-weight）BTX而於溶解毒素複合物後的執行的HQ及XS流程的結果可得知，不論係經四種前處理流程（習知流程、接續於DF的UF、接續於DF的硫酸銨沉澱以及接續於DF的氫氯酸沉澱）的任一種，沒有雜質蛋白被發現於經前處理後含有BTX的試樣中，只有發現具有98 kDa（重鍊）以及52 kDa（輕鍊）的低分子量BTX。
尤其能夠取代執行於含有BTX的試樣以分離BTX 19S的酵素處理及萃取流程的最有效率流程係AEX 純化（TQ （結合或穿流模式） 純化），執行於硫酸沉澱、DF及氫氯酸沉澱任一之後。
另一方面，於分離BTX　7S（低分子量BTX）的流程中，當AEX （HQ （結合模式或FT模式））及CEX（XS （結合模式））於四種前處理步驟（習知流程、接續於DF的UF、接續於DF的硫酸銨沉澱以及接續於DF的氫氯酸沉澱）其中之任一後接續執行時，將顯示出最高的純化效能。
產業利用性
依據本發明所提供的新穎的BTX的製造方法，實現動物衍生成份入侵的基本預防，藉此確保安全性的提升。此外，本發明所提供的方法實現以簡單流程製造高純度的BTX，指示所述方法具有相當的經濟效益且有效率。以本發明的方法製造出的BTX相較於習知方法具有相對較高的純度，藉此具有提升的能力以於地方實現。因此減少了可能導致副作用的BTX的系統循環（Systemic circulation），因而提升安全性。於是，本發明中的BTX可用於各種目的，包含神經肌肉失調的治療、去除皺紋以及痙攣性偏癱及腦麻痺的治療。
雖然本發明以前述之實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明。在不脫離本發明之精神和範圍內，所為之更動與潤飾，均屬本發明之專利保護範圍。關於本發明所界定之保護範圍請參考所附之申請專利範圍。
無
圖1係依據本發明一實施例與習知技術所繪示的肉毒桿菌毒素（Botulinum toxin，BTX）製造方法的比較示意圖。 圖2顯示用以純化BTX的第一陰離子交換層析（Anion-exchange Chromatography，AEX）純化步驟與第二AEX純化步驟的層析圖。 圖3顯示在第一AEX純化步驟與第二AEX純化步驟後藉由十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析BTX純度的結果。 圖4顯示用以取得BTX的第一AEX純化、第二AEX純化（結合模式）及陽離子交換層析（Cation-exchange chromatography，CEX）步驟的層析圖。 圖5顯示在第一AEX純化、第二AEX純化（結合模式）及CEX步驟後藉由SDS-PAGE分析BTX純度的結果。 圖6顯示用以取得BTX的第一AEX純化、第二AEX純化（穿流模式）及CEX步驟的層析圖。 圖7顯示在第一AEX純化、第二AEX純化（穿流模式）及CEX步驟後藉由SDS-PAGE分析BTX純度的結果。

Claims (28)

  1. 一種肉毒桿菌毒素的製造方法，包含：步驟a：以一酸處理一肉毒桿菌毒素製造菌株的一培養物，使該培養物的酸鹼值達到3.0至4.5，以形成一含肉毒桿菌毒素沉澱物；步驟b：加入一第一緩衝液至該步驟a中的該含肉毒桿菌毒素沉澱物，再藉由選自由深床過濾(Depth filtration，DF)、微過濾(Microfiltration，MF)、超微過濾(Ultrafiltration，UF)、無菌過濾(Sterile filtration)、薄膜層析(Membrane chromatography，MC)和離心所組成之群組的一或多個方法進行淨化；步驟c：將步驟b得到的一含肉毒桿菌毒素溶液執行一UF濾洗(Diafiltration)、一硫酸銨沉澱或一氫氯酸沉澱，再將經該UF濾洗而產生的一滯留物(Retentate)稀釋於一第二緩衝液中，或將經該硫酸銨沉澱或經該氫氯酸沉澱而產生的一沉澱物溶解於一第三緩衝液中；以及步驟d：將步驟c中得到的一滯留物稀釋液、一硫酸銨沉澱物溶液或一氫氯酸沉澱物溶液執行陰離子交換層析(Anion-exchange chromatography，AEX)以純化該肉毒桿菌毒素；其中，該肉毒桿菌毒素的製造方法未使用去氧核醣核酸酶與核醣核酸酶。
  2. 如請求項1所述的製造方法，其中該肉毒桿菌毒素製造菌株係一肉毒桿菌(Clostridium Botulinum)或該肉毒桿菌的一突變菌株。
  3. 如請求項1所述的製造方法，其中該肉毒桿菌毒素係選自於由肉毒桿菌毒素血清型A、B、C、D、E、F及G所組成的群組。
  4. 如請求項1所述的製造方法，其中純化的該肉毒桿菌毒素係純度至少98%的一肉毒桿菌毒素A型蛋白。
  5. 如請求項1所述的製造方法，其中該步驟a中的該酸的處理係藉由加入硫酸或氫氯酸至該肉毒桿菌毒素製造菌株的該培養物，使該培養物的酸鹼值達到3.0至4.5以進行。
  6. 如請求項1所述的製造方法，其中該步驟a中的以該酸形成該含肉毒桿菌毒素沉澱物被執行一或多次。
  7. 如請求項1所述的製造方法，其中該步驟b中的該DF係藉由一蠕動幫浦以進行，且用以執行該DF中的一過濾器具有一標稱孔尺寸0.01至20微米(μm)。
  8. 如請求項1所述的製造方法，其中該步驟c中的該UF濾洗、該硫酸銨沉澱或該氫氯酸沉澱執行一或多次。
  9. 如請求項1所述的製造方法，其中該步驟c中的用以執行該硫酸銨沉澱的一硫酸銨被加入至該含肉毒桿菌毒素溶液以達到溶質重量/溶液體積百分比(w/v)10%至50%。
  10. 如請求項1所述的製造方法，其中該步驟c中的該氫氯酸沉澱係藉由加入氫氯酸使該含肉毒桿菌毒素溶液酸鹼值達到2至5以進行。
  11. 如請求項1所述的製造方法，其中該步驟b中的該第一緩衝液及該步驟c中的該第二緩衝液與該第三緩衝液係一磷酸鈉緩衝液。
  12. 如請求項11所述的製造方法，其中該步驟b中的該磷酸鈉緩衝液的酸鹼值係4.5至6.5，且該步驟c中的該磷酸鈉緩衝液的酸鹼值係6至7。
  13. 如請求項1所述的製造方法，其中該步驟d中的該AEX係於酸鹼值2至9且導電率2至40毫西門子/公分(Millisiemens per centimeter，mS/cm)的溶液中進行。
  14. 如請求項1所述的製造方法，其中該步驟d中被收集的該肉毒桿菌毒素為由該AEX所流洗出的一穿流(FT)片段的一含肉毒桿菌毒素片段。
  15. 如請求項1所述的製造方法，其中被純化的該肉毒桿菌毒素的形態係7S或19S。
  16. 如請求項1所述的製造方法，在該步驟d之後更包含：步驟e：調高含有該肉毒桿菌毒素的一AEX片段的酸鹼值；步驟f：藉由另一AEX以純化步驟e中的酸鹼值經調整的該AEX片段；以及步驟h：藉由陽離子交換層析(Cation exchange chromatography，CEX)以純化經該步驟f而產生的稀釋的該肉毒桿菌毒素。
  17. 如請求項16所述的製造方法，其中該步驟e中的該AEX片段的該酸鹼值調高執行一或多次。
  18. 如請求項16所述的製造方法，於該步驟f與該步驟h之間更包含：步驟g：加入一第四緩衝液至純化的該AEX片段以稀釋該肉毒桿菌毒素。
  19. 如請求項16所述的製造方法，其中調高該AEX片段的該酸鹼值的步驟係藉由選自由UF濾洗、酸鹼值滴定、透析及緩衝液置換管柱層析(Buffer exchange column chromatography)所組成之群組的一或多個方法以實現。
  20. 如請求項18所述的製造方法，其中該步驟g中的該第四緩衝液係一磷酸鈉緩衝液。
  21. 如請求項20所述的製造方法，其中該步驟g中的該磷酸鈉緩衝液的酸鹼值係6.5至7.5。
  22. 如請求項19所述的製造方法，其中該步驟e中的該AEX片段的該酸鹼值調高係使用一三羥甲基氨基甲烷-氫氯酸(Tris-HCl)緩衝液進行。
  23. 如請求項22所述的製造方法，其中該步驟e中的該Tris-HCl緩衝液的酸鹼值係7.3至8.3。
  24. 如請求項16所述的製造方法，其中該步驟f中的該AEX係於酸鹼值2至9且導電率2至40mS/cm的溶液中執行。
  25. 如請求項16所述的製造方法，其中該步驟f中被收集的該肉毒桿菌毒素為由該AEX所流洗出的一穿流(FT)片段的一含肉毒桿菌毒素片段，或者為聯結AEX樹脂且含有該肉毒桿菌毒素的一片段。
  26. 如請求項16所述的製造方法，其中該步驟h中的該CEX係於酸鹼值2至9且導電率介於2至40mS/cm之間的溶液中執行。
  27. 如請求項16所述的製造方法，其中該步驟h中被收集的該肉毒桿菌毒素為聯結CEX樹脂且含有該肉毒桿菌毒素的一片段。
  28. 如請求項16所述的製造方法，其中最終純化的該肉毒桿菌毒素的形態係7S。
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