KR20030086475A

KR20030086475A - 스트렙토키나제의 정제방법

Info

Publication number: KR20030086475A
Application number: KR1020030066020A
Authority: KR
Inventors: 강기권; 한재갑; 민경현
Original assignee: 대상 주식회사
Priority date: 2003-09-23
Filing date: 2003-09-23
Publication date: 2003-11-10

Abstract

본 발명은 (a) 스트렙토코코스 속 균주의 배양액에서 균체를 제거하는 단계; (b) 균체가 제거된 배양액을 음이온 교환수지에 통과시켜 스트렙토도르나제를 제거하는 단계; (c) 단계(b)에서 얻어진 용액을 농축하고 양이온 교환수지에 통과시켜 불순물을 제거하는 단계; (d) 단계(c)에서 얻어진 용액의 농축액에 콜레스테롤을 가하여 스트렙토리신을 제거하는 단계; 및 (e) 단계(d)에서 얻어진 용액을 한외여과하여 내독소 및 발열물질을 제거하는 단계를 포함하는 스트렙토키나제의 정제방법을 제공한다.

Description

스트렙토키나제의 정제방법{Process for the purification of streptokinase}

본 발명은 스트렙토키나제의 정제방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 스트렙토코코스 속 균주의 배양액으로부터 스트렙토도르나제, 스트렙토리신, 내독소, 및 발열물질과 같은 인체에 해로운 물질을 제거함으로써 스트렙토키나제를 정제하는 방법에 관한 것이다.

스트렙토키나제는 용혈성(hemolytic) 스트렙토코코스(Streptococcus) 속 미생물에 의해 생산되는 단백질의 일종으로 분자량이 46,000 내지 50,000 정도인 폴리펩티드이며 혈액성분인 플라스미노겐을 플라스민으로 활성화시키는 능력을 가지고 있어 트롬빈을 분해하는 혈전용해인자로 작용한다. 이러한 이유로 스트렙토키나제는 87년 정맥주사제용으로 FDA의 승인을 받아 미국, 유럽, 남미 등지에서 급성심근경색 및 급성동맥폐색증 등에 적용되는 혈전용해제용 의약품으로 년간 7천만달러 정도의 세계시장 규모를 형성하고 있으며 최근에는 임상효과와 내성이 우수한스트렙토키나제 복합체 생산 및 개발이 이루어짐으로서 스트렙토키나제 원료 사용량이 증대되고 있다.

스트렙토키나제를 주사제로 사용하기 위해서는 최종적으로 정제된 최종산물에 스트렙토도르나제 뿐만 아니라 여러 가지 불순물들, 특히 인체에 악영향을 미치는 스트렙토리신(용혈독소), 내독소, 발열물질 등이 제거되고 스트렙토키나제 만이 고농도로 존재하여야 한다.

종래의 스트렙토키나제를 정제하는 방법들을 살펴보면, 용해도, 전기적인 성질, 분자크기 및 모양의 차이, 비특이적인 물리적 상호작용 등을 이용하여 스트렙토키나제를 정제하는 방법들이 있다(미국특허 3,098,015; 미국특허 3,226,304). 또한, 스트렙토키나제의 아미노산 서열 중에 시스틴 잔기가 없다는 사실에 기초하여 개발된 정제방법(EP 365,278 A2, 1989) 또는 페닐세파로즈와 같은 소수성 리간드를 포함하는 매트릭스로 구성되는 겔을 이용하여 스트렙토키나제를 정제하는 방법(EP 362,696 A1, 1990) 등이 알려져 있다.

그러나, 이러한 종래의 방법들은 스트렙토키나제의 과다한 손실은 물론 스트렙토리신, 내독소 등의 인체에 유해한 불순물을 효과적으로 제거하지 못함으로써 임상적 목적으로 사용하기에는 어려운 단점을 지니고 있다.

따라서, 본 발명은 스트렙토코코스 속 균주의 배양액으로부터 스트렙토도르나제, 스트렙토리신, 내독소, 및 발열물질과 같은 인체에 해로운 물질을 제거함으로써 스트렙토키나제를 정제하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 본 발명의 스트렙토키나제 정제방법을 간단하게 나타낸 순서도이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 스트렙토코코스 속 균주의 배양액에서 균체를 제거하는 단계; (b) 균체가 제거된 배양액을 음이온 교환수지에 통과시켜 스트렙토도르나제를 제거하는 단계; (c) 단계(b)에서 얻어진 용액을 농축하고 양이온 교환수지에 통과시켜 불순물을 제거하는 단계; (d) 단계(c)에서 얻어진 용액의 농축액에 콜레스테롤을 가하여 스트렙토리신을 제거하는 단계; 및 (e) 단계(d)에서 얻어진 용액을 한외여과하여 내독소 및 발열물질을 제거하는 단계를 포함하는 스트렙토키나제의 정제방법을 제공한다.

상기 스트렙토도르나제를 제거하는 단계에서, 음이온 교환수지로는 DEAE(diethylaminoethyl) 이온교환기를 사용한 수지를 사용할 수 있으며, pH7.2, 0.15M의 인산염 완충액을 통과시켜 스트렙토키나제를 용리한 다음, NaCl을 약 0.12M 함유한 pH7.2, 0.15M의 인산염 완충액을 통과시켜 스트렙토도르나제를 용리할 수 있다.

상기 스트렙토키나제 용리액 중의 불순물을 제거하기 위한 양이온 교환수지 처리단계에서는 CM(carboxymethyl) 이온교환기를 사용한 수지를 양이온 교환수지로 사용할 수 있다.

상기 스트렙토리신을 제거하기 위하여 콜레스테롤을 가하는 단계는 콜레스테롤-함유 에탄올 용액을 가하여 용액 대비 콜레스테롤의 농도가 0.005 w/v% 내지 0.05 w/v% 농도가 되도록 조절하여 수행할 수 있으며, 콜레스테롤을 가한 후, 반응온도를 35℃ 내지 47℃로 하여 10 내지 20분간 유지시킴으로써 바람직하게 수행될수 있다.

단계(e)의 한외여과는 막의 분자량 한계 100,000 및 10,000의 여과막을 번갈아 사용함으로써 바람직하게 수행될 수 있다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

스트렙토코코스 속 균주의 배양액에서 균체를 제거하는 단계는 통상의 방법 즉, 스트렙토코코스 속 균주의 배양액을 원심분리, 미세여과, 또는 이들을 조합하여 수행할 수 있다. 원심분리는 약 8,000rpm의 속도로 수행할 수 있다. 원심분리 속도와 시간에 따른 온도상승으로 효소의 활성도가 낮아질 수 있는 위험요소를 없애주기 위해 온도는 약 4℃로 유지시키는 것이 바람직하다. 원심분리 과정에서 효과적으로 제거하지 못한 균체 및 균체 파쇄물은 막공(pore size)의 크기가 약 0.2㎛인 미세여과(microfiltration) 장치를 이용함으로써 제거할 수 있다. 균체가 제거된 여과액은 막의 분자량 한계 약 10,000∼30,000의 한외여과막을 사용하여 한외여과함으로써 농축시켜 다음 공정을 수행하는 것이 바람직하다.

상기에서 얻어진 농축액을 음이온 교환수지에 통과시킴으로써 스트렙토도르나제를 제거할 수 있다. 스트렙토키나제를 생산하는 스트렙토코코스속 미생물들은 배양액 내에 스트렙토키나제 뿐 아니라 스트렙토도르나제도 함께 분비한다. 따라서 주사제로 사용될 수 있는 고순도의 스트렙토키나제를 얻기 위해서는 스트렙토도르나제를 제거해야 하며, 본 공정단계에서 스트렙토도르나제의 제거가 수행된다.

스트렙토도르나제 제거공정에 사용되는 음이온 교환수지로는 DEAE(diethylaminoethyl) 이온교환기를 가진 수지가 바람직하다. 균체가 제거된 배양액을 DEAE 이온교환기를 가진 음이온교환수지에 통과시키면 수지에 스트렙토키나제와 스트렙토도르나제가 흡착되며, pH 및 농도가 서로 다른 인산염 완충액을 순차적으로 적용하여 용리시킴으로써 스트렙토키나제와 스트렙토도르나제를 분리할 수 있다. 해당 분리과정은 우선, 약 pH7.2, 0.03∼0.05M의 인산염 완충액을 통과시켜 수지를 수세한 후, 약 pH7.2, 0.15M의 인산염 완충액을 통과시켜 스트렙토키나제를 용리한 다음, NaCl을 약 0.12M 함유한 pH7.2, 0.15M의 인산염 완충액을 통과시켜 스트렙토도르나제를 제거할 수 있다.

상기 음이온 교환수지 처리공정으로부터 얻어진 용액은 막의 분자량 한계가 약 10,000 인 한외여과막을 사용하여 농축한 다음, 양이온 교환수지에 통과시켜 불순물을 제거하는 공정을 수행한다. 본 발명의 정제방법에 사용될 수 있는 양이온 교환수지로는 CM(carboxy methyl) 이온교환기를 가진 수지를 사용하는 것이 바람직하다. 한편, CM(carboxy methyl) 이온교환기를 가진 수지는 양이온에 대한 친화력과 교환용량이 pH5.0 이하일 경우 감소되고, 농축액의 단백질 농도가 높아 pH5.5 이하에서 침전물이 다량 생성되므로, 상기 농축액을 양이온 교환수지에 통과시키기 전에 약 pH5.5, 0.03M의 인산염 완충액을 사용하여 농축액의 액성을 변경시켜 주는 것이 바람직하다. 양이온 교환수지 처리공정을 수행한 후에는, 막의 분자량 한계가 약 10,000 인 한외여과막을 사용하여 재농축하여 다음 공정을 수행하는 것이 바람직하다.

본 발명의 정제방법은 상기에서 얻어진 농축액에 콜레스테롤을 가하여 스트렙토리신을 제거하는 단계를 포함한다. 콜레스테롤은 물에는 잘 용해되지 않으므로가온한 에탄올에 녹여 가하는 것이 바람직하며, 따라서 콜레스테롤-함유 에탄올 용액을 가하여 용액 대비 콜레스테롤의 농도가 0.005 w/v% 내지 0.05 w/v% 농도가 되도록 조절하는 것이 바람직하다. 콜레스테롤을 가한 후, 반응온도를 35℃ 내지 47℃로 하여 10 내지 20분간 유지시킴으로써 바람직하게 수행될 수 있으며, 상기 콜레스테롤 처리가 완료되면 급속냉각시킨다. 콜레스테롤 처리에 의해 스트렙토키나제의 수율은 처리 전과 비교할 때 약 99% 이상을 나타내며, 스트렙토리신은 스트렙토키나제 1,000,000 IU 당 0.1IU 정도의 수준을 나타낸다. 콜레스테롤 처리공정 수행 후 DEAE 이온교환기를 가진 음이온 교환수지 등을 사용하여 콜레스테롤을 제거할 수 있다.

본 발명의 제조방법은 상기에서 얻어진 용액을 한외여과하여 내독소 및 발열물질을 제거하는 단계를 포함한다. 상기 한외여과 공정은 막의 분자량 한계 약 100,000 및 10,000의 여과막을 번갈아 사용함으로써 바람직하게 수행될 수 있다. 내독소 및 발열물질의 분자량은 보통 100,000이상이고 스트렙토키나제의 분자량은 보통 46,000 내지 50,000정도이기 때문에 막의 분자량 한계가 100,000 및 10,000∼40,000 정도(바람직하게는 약 10,000)의 한외여과 막을 번갈아 사용하면 불순물 등은 막을 통과하지 못하고 제거되며 스트렙토키나제를 분리 및 농축할 수 있다. 이 과정에서 사용되는 완충액은 약 pH7.2, 0.06M의 인산염 완충액을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 본 발명에 따른 정제방법은 필요할 경우, 원하는 제품규격(예를들어, 스트렙토도르나제 1 IU 이하/스트렙토키나제 10,000 IU, 스트렙토리신 1 IU 이하/스트렙토키나제 1,000,000 IU, 세균 내독소 8 IU 이하/스트렙토키나제 1,000,000 IU, 발열물질 불검출 등)이 얻어질 때까지 모든 또는 일부의 단계를 반복하여 수행할 수 있다.

본 발명의 정제방법으로 제조된 스트렙토키나제 정제 농축액은 보통 스트렙토키나제를 2,000,000 내지 4,000,000 IU/㎖ 포함하게 되며 활성 특이도는 120,000 IU 이상/㎎ 단백질을 나타낸다.

이상의 본 발명의 스트렙토키나제 정제방법을 간단한 순서도로 나타내면 도 1과 같다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예

대한민국 특허 제139,589호에서 개시한 방법에 따라, 스트렙토코코스속 균주를 배양하였다. 배양액을 원심분리기에서 8,000 rpm의 속도로 4℃에서 원심분리를 수행하여 균체를 제거하였다. 얻어진 분리액을 막공의 크기가 0.22 ㎛인 미세여과 장치를 이용하여 남아 있는 균체 및 균체 파쇄물을 제거하였다. 균체가 제거된 배양액은 막의 분자량 한계 약 20,000의 한외여과막을 사용하여 한외여과하여 농축시켰다.

상기 농축액을 DEAE 이온교환기를 가진 수지탑에 통과시켰다. pH 7.2, 0.03M의 인산염 완충액을 통과시켜 수지를 수세한 후, pH 7.2, 0.15M의 인산염 완충액을 통과시켜 스트렙토키나제를 용리시킨 다음, pH 7.2, 0.15M의 인산염 완충액에 약 0.12M의 소금을 첨가한 용액을 수지에 통과시켜 스트렙토도르나제를 용출시켰다.

상기 스트렙토키나제 용리액을 막의 분자량 한계가 10,000인 한외여과막을 사용하여 농축시킨 다음, 농축액에 pH5.5, 0.03M 인산염 완충액을 넣어 농축액의 pH가 5.5∼6.0이 되도록 정용여과(diafiltration)하면서 조정한 후, CM 이온교환기를 가진 양이온 교환수지에 통과시켜 불순물을 흡착, 제거하였다. 이를 다시 막의 분자량 한계가 약 10,000 인 한외여과막을 사용하여 재농축하였다.

얻어진 농축액을 항온조에 넣고, 항온조의 내부온도를 42℃로 맞춘 뒤, 0.2x스트렙토키나제의 농도(1,000,000 IU/ml)x액량(L)의 콜레스테롤과 콜레스테롤양의 100배의 에탄올을 교반용해시킨 용액을 넣고 15분간 유지시킨 다음, 급속냉각시켰다. 용액을 DEAE 이온교환기를 사용한 음이온 교환수지에 통과시켜 콜레스테롤을 제거하였다.

통과되어 나온 용리액을 막의 분자량 한계가 100,000 및 10,000의 한외여과막을 번갈아 통과시켜 내독소 및 발열물질를 제거하고 농축하였다(막의 분자량 한계가 100,000 한외여과막을 사용한 한외여과: 2회, 막의 분자량 한계가 10,000의 한외여과막을 사용한 농축: 2회). 한외여과시 pH 7.2, 0.06M 인산염 완충액을 사용하였다.

얻어진 농축액 중 스트렙토키나제의 함유량은 약 4,000,000 IU/㎖ 이었으며, 그 활성 특이도는 약 125,000 IU/㎎ 단백질이었다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 따르면 스트렙토코코스 속 균주 배양액으로부터 스트렙토도르나제, 불순물, 스트렙토리신, 내독소, 및 발열물질과 같은 인체에 해로운 물질을 제거하고 농축함으로써 주사용으로 사용될 수 있는 스트렙토키나제를 제조할 수 있다.

Claims

(a) 스트렙토코코스 속 균주의 배양액에서 균체를 제거하는 단계;

(b) 균체가 제거된 배양액을 음이온 교환수지에 통과시켜 스트렙토도르나제를 제거하는 단계;

(c) 단계(b)에서 얻어진 용액을 농축하고 양이온 교환수지에 통과시켜 불순물을 제거하는 단계;

(d) 단계(c)에서 얻어진 용액의 농축액에 콜레스테롤을 가하여 스트렙토리신을 제거하는 단계; 및

(e) 단계(d)에서 얻어진 용액을 한외여과하여 내독소 및 발열물질을 제거하는 단계를 포함하는 스트렙토키나제의 정제방법.
제1항에 있어서, 단계(b)에서 상기 음이온 교환수지는 DEAE(diethylaminoethyl) 이온교환기를 가진 수지인 것을 특징으로 하는 정제방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단계(b)가 pH7.2, 0.15M의 인산염 완충액을 통과시켜 스트렙토키나제를 용리한 다음, NaCl을 0.12M 함유한 pH7.2, 0.15M의 인산염 완충액을 통과시켜 스트렙토도르나제를 용출시켜 제거하는 것을 특징으로 하는 정제방법.
제1항에 있어서, 단계(c)에서 상기 양이온 교환수지는 CM(carboxymethyl) 이온교환기를 가진 수지인 것을 특징으로 하는 정제방법.
제1항에 있어서, 단계(d)에서 콜레스테롤을 가하는 단계가 용액 중 콜레스테롤의 농도가 0.005 w/v% 내지 0.05 w/v% 로 되도록 콜레스테롤-함유 에탄올 용액을 가하여 수행되는 것을 특징으로 하는 정제방법.
제1항 또는 제5항에 있어서, 콜레스테롤을 가한 후, 반응온도를 35℃ 내지 47℃로 하여 10 내지 20분간 유지하는 것을 특징으로 하는 정제방법.
제1항에 있어서, 단계(e)에서 상기 한외여과가 막의 분자량 한계 100,000 및 10,000의 여과막을 번갈아 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 정제방법.