KR20220140697A

KR20220140697A - 보툴리눔 독소를 정제하는 방법

Info

Publication number: KR20220140697A
Application number: KR1020227020766A
Authority: KR
Inventors: 울프 스탈; 피터 프랭크; 앤더스 자스타드; 세바스티안 물; 존 놀린; 레나 노르퀴스트; 시몬 아버그
Original assignee: 갈더마 홀딩 소시에떼 아노님; 입센 바이오팜 리미티드
Priority date: 2019-12-20
Filing date: 2020-12-19
Publication date: 2022-10-18
Also published as: BR112022009935A2; TW202136286A; WO2021124295A1; IL293891A; JP2023507653A; US20230029456A1; EP4077358A1; MX2022007599A; CN114945582A; CA3158252A1; AU2020404611A1

Abstract

본 기술은 세포 배양물로부터 수득된 보툴리눔 독소 조성물을 정제하기 위한 상업적-규모의 방법에 관한 것이다. 본 개시내용에 따른 정제 방법은, 보툴리눔 독소 복합체 및 동물성 생성물이 없거나, 본질적으로 없거나, 또는 실질적으로 없고 보툴리눔 독소 단백질 분자를 침전 또는 동결건조함에 없이, 용액에 보툴리눔 독소 단백질 분자(~150kDa)를 포함하는 고-순도 보툴리눔 독소 조성물을 생성하는 일련의 여과 및 크로마토그래피 분리 단계를 기반으로 한다. 본 개시내용에 따른 정제 방법은 침전, 동결건조 또는 원심분리 단계를 사용하지 않아, 최종 사용자에 의한 재구성에 대한 필요 없이 용액에 고도로 순수하고, 고도로 활성인, 유리 보툴리눔 독소 단백질 분자(~150kDa)의 생산을 허용한다.

Description

보툴리눔 독소를 정제하는 방법

관련 출원에 대한 교차-참조

이 출원은 2019년 12월 20일에 출원된 미국 가출원 번호 62/951,828에 대해 35 U.S.C.§119(e) 하에서 우선권을 주장하며, 이는 그 전체로 본 명세서에 참고로 포함된다.

분야

본 기술은 일반적으로 신경독소 단백질 분자를 정제하는 분야에 관한 것이다. 특히, 본 기술은 보툴리눔 독소를 정제하는 방법에 관한 것이다. 이로부터 정제된 보툴리늄 독소는 치료법에 사용하기에 적합하고, 특히 원하는 치료 또는 미적 효과를 달성하기 위해 환자에게 투여하기에 적합하다.

본 기술의 배경에 대한 다음의 설명은 단순히 본 기술을 이해하는 데 도움으로 제공되고 본 기술에 대한 선행 기술을 기술하거나 구성하는 것으로 인정되지 않는다.

일반적으로 면역학적으로 구별되는 7가지 보툴리눔 신경독소가 특성화되었으며 - 보툴리눔 신경독소 혈청형 A, B, C, D, E, F 및 G - 그 각각이 유형-특이적 항체로 중화에 의해 구별된다. 일 예로서, BOTOX®는 Allergan, Inc.(캘리포니아주 어바인 소재)에서 상업적으로 이용가능한 보툴리눔 독소 유형 A 정제 신경독소 복합체의 상표이다. BOTOX®는 잔주름과 주름의 모양을 일시적으로 줄이는 인기있는 주사-기반 미용 치료법이다.

유형-A 독소를 포함하는 보툴리눔 독소는 통상적으로 C. 보툴리눔 발효로부터 생산되며, 이는 보툴리눔 독소 분자에 부가하여 전체 박테리아, 용해된 박테리아, 배양 배지 영양소 및 발효 부산물을 함유하는 배양 용액을 생성할 수 있다. C. 보툴리눔 배양 용액을 여과하여 전체 및/또는 용해된 세포 성분, 및 선택적으로 다른 발효 배지 잔류물을 제거하면 정화된 배양물이 생성된다. 정화된 배양 용액은 보툴리눔 독소 분자 및 제거될 수 있는 다양한 불순물을 함유하여 보툴리눔 독소 약학적 조성물로 배합하기에 적합한 농축되고 정제된 보툴리눔 독소(예를 들어, BoNT/A1)를 얻는다.

약학적으로-적합한 보툴리눔 독소 조성물을 얻기 위한 기존의 상업적-규모의 공정은 전형적으로 발효 공정으로부터의 잔류 불순물로부터 독소 복합체를 분리하기 위해 다중 침전 단계를 사용한다. 예를 들어, 차가운 알코올 분획화(예를 들어, Cohn의 방법) 또는 침전은 혈장 단백질을 제거하는 데 사용된다. 불행하게도, 보툴리눔 독소를 정제하기 위한 침전 기술은 저해상도, 낮은 수율, 작동 어려움, 제어 및/또는 검증 어려움, 및 확장성의 부족으로 어려움을 겪는다. 부가적으로, 보툴리눔 독소를 건조(예를 들어, 동결건조, 침전 등)하면 그 독성이 상당히 감소한다. 불활성화된 독소가 변성독소를 형성하고 보툴리눔 독소에 대해 환자를 면역화할 수 있기 때문에 이는 임상적 문제이다.

그럼에도 불구하고, 현재 미국에서 승인된 보툴리눔 독소 제품(예를 들어, BOTOX COSMETIC^®, DYSPORT^®, XEOMIN^® 및 JEUVEAU^®)은 안정성 이유로 동결건조 또는 냉동-건조된 형태로 저장된다. 이러한 제형은 환자에게 투여하기 전에 멸균 식염수에서 의사가 재구성해야할 필요가 있다. 이 재구성 단계는 의사 시간의 손실, 희석 오류의 위험 및 오염의 위험과 연관되어 있다. 보툴리눔 독소 제공자는 또한 재구성 단계가 적절하게 수행되도록 의사를 교육해야 한다.

따라서, 발효 배지로부터 보툴리눔 독소를 정제하여 고-순도, 고도로-활성, 약학적으로-적합한 보툴리눔 독소 조성물을, 동물성 생성물이 없거나, 본질적으로 없거나, 또는 실질적으로 없고 환자에 대한 투여 전에 재구성을 요하지 않는 형태로 얻기 위한 제어가능하고 확장가능한 고수율 방법이 요구된다.

일 양태에서, 본 개시내용은 독소를 포함하는 용액으로부터 독소를 정제하는 것을 포함하는, 보툴리눔 독소를 정제하는 방법에 관한 것이며, 여기서 공정은 침전, 원심분리 또는 동결건조를 포함하지 않는다.

일부 실시형태에서, 보툴리눔 독소는 혈청형 A이다. 일부 실시형태에서, 수득된 정제된 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 복합체가 없거나, 본질적으로 없거나, 실질적으로 없다. 일부 실시형태에서, 수득된 정제된 보툴리눔 독소는 인간 알부민을 포함하는 동물 생성물이 없거나, 본질적으로 없거나, 실질적으로 없다.

일부 실시형태에서, 정제는 여과 단계, 바람직하게는 접선 유동 여과 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 여과 단계는 중공사 필터를 사용한다. 일부 실시형태에서, 정제는 제1 크로마토그래피 컬럼을 독소를 포함하는 용액과 접촉시켜 독소-함유 분획물을 생성하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 크로마토그래피 컬럼은 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 포함한다. 일부 실시형태에서, 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼은 Q 세파로스를 포함한다. 일부 실시형태에서, 정제는 독소-함유 분획물을 수집하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 독소-함유 분획물은 제1 정지상에 흡착되지 않는다.

일부 실시형태에서, 정제는 제2 크로마토그래피 컬럼을 독소-함유 분획물과 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 크로마토그래피 컬럼은 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 포함한다. 일부 실시형태에서, 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼은 SP 세파로스를 포함한다. 일부 실시형태에서, 정제는 제2 크로마토그래피 컬럼으로부터 보툴리눔 독소를 용리하여 제1 독소-함유 용리액을 생성하는 것을 추가로 포함한다.

일부 실시형태에서, 정제는 독소-함유 잔류물을 생성하기 위해 제1 독소-함유 용리액을 여과하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 독소-함유 용리액을 여과하는 것은 완충액 교환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 독소-함유 용리액을 여과하는 것은 보툴리눔 독소 분자를 비-독소 단백질로부터 분리하여 유리 독소 분자를 생성한다.

일부 실시형태에서, 정제는 제3 크로마토그래피 컬럼을 독소-함유 잔류물과 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제3 크로마토그래피 컬럼은 제2 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼은 Q 세파로스를 포함한다. 일부 실시형태에서, 정제는 제3 크로마토그래피 컬럼으로부터 보툴리눔 독소를 용리하여 제2 독소-함유 용리액을 생성하는 것을 추가로 포함한다.

일부 실시형태에서, 정제는 제4 크로마토그래피 컬럼을 제2 독소-함유 용리액과 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 독소-함유 용리액은 제4 크로마토그래피 컬럼 상에 직접적으로 주입된다. 일부 실시형태에서, 제3 크로마토그래피 컬럼 및 제4 크로마토그래피 컬럼은 상호연결되어 있다.

일부 실시형태에서, 제4 크로마토그래피 컬럼은 크기 배제 크로마토그래피 컬럼을 포함한다. 일부 실시형태에서, 크기 배제 크로마토그래피 컬럼은 겔 여과 크로마토그래피 컬럼을 포함한다. 일부 실시형태에서, 겔 여과 크로마토그래피 컬럼은 슈퍼덱스 200을 포함한다. 일부 실시형태에서, 정제는 제4 크로마토그래피 컬럼으로부터 보툴리눔 독소를 용리하여 정제된 보툴리눔 독소를 생성하는 것을 추가로 포함한다.

또 다른 양태에서, 독소를 포함하는 용액으로부터 보툴리눔 독소를 정제하는 방법은 (a) 독소를 포함하는 용액을 여과하는 단계; (b) 제1 크로마토그래피 컬럼을 (a)로부터의 독소를 포함하는 여과된 용액과 접촉시키는 단계로서, 여기서 제1 크로마토그래피 컬럼은 이온 교환 크로마토그래피 컬럼인, 단계; (c) 독소-함유 분획물을 수집하는 단계로서, 여기서 독소-함유 분획물은 정지상에 흡착함이 없이 제1 크로마토그래피 컬럼을 통해 유동하는, 단계; (d) 제2 크로마토그래피 컬럼을 독소-함유 분획물과 접촉시키는 단계로서, 여기서 제2 크로마토그래피 컬럼은 이온 교환 크로마토그래피 컬럼인, 단계; (e) 제2 크로마토그래피 컬럼으로부터 보툴리눔 독소를 용리하여 제1 독소-함유 용리액을 생성하는 단계; (f) 제1 독소-함유 용리액을 여과하여 독소-함유 잔류물을 생성하는 단계; (g) 제3 크로마토그래피 컬럼을 여과 (f)로부터의 독소-함유 잔류물과 접촉시키는 단계로서, 여기서 제3 크로마토그래피 컬럼은 이온 교환 컬럼인, 단계; (h) 제3 크로마토그래피 컬럼으로부터 보툴리눔 독소를 용리하여 제2 독소-함유 용리액을 생성하는 단계; (i) 제4 크로마토그래피 컬럼을 제2 독소-함유 용리액과 접촉시키는 단계로서, 여기서 상기 제4 크로마토그래피 컬럼은 크기 배제 크로마토그래피 컬럼인, 단계; 및 (j) 제4 크로마토그래피 컬럼으로부터 보툴리눔 독소를 용리시켜 정제된 보툴리눔 독소를 생성하는 단계를 포함하며, 여기서 공정은 보툴리눔 독소를 침전, 원심분리 또는 동결건조하는 것을 포함하지 않는다.

일부 실시형태에서, 보툴리눔 독소는 보툴리눔 신경독소 혈청형 A를 포함한다. 일부 실시형태에서, 수득된 정제된 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 복합체가 없거나, 본질적으로 없거나, 실질적으로 없다. 일부 실시형태에서, 수득된 정제된 보툴리눔 독소는 인간 알부민을 포함하는 동물 생성물이 없거나, 본질적으로 없거나, 실질적으로 없다.

일부 실시형태에서, 제1 크로마토그래피 컬럼은 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 크로마토그래피 컬럼은 Q 세파로스를 포함한다.

일부 실시형태에서, 제2 크로마토그래피 컬럼은 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 크로마토그래피 컬럼은 SP 세파로스를 포함한다.

일부 실시형태에서, 제1 크로마토그래피 컬럼은 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 포함하고 제2 크로마토그래피 컬럼은 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 크로마토그래피 컬럼은 Q 세파로스를 포함하고 제2 크로마토그래피 컬럼은 SP 세파로스를 포함한다.

일부 실시형태에서, 제3 크로마토그래피 컬럼은 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제3 크로마토그래피 컬럼은 Q 세파로스를 포함한다.

일부 실시형태에서, 제4 크로마토그래피 컬럼은 겔 여과 컬럼을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제4 크로마토그래피 컬럼은 슈퍼덱스 200을 포함한다.

일부 실시형태에서, 제3 크로마토그래피 컬럼은 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 포함하고 제4 크로마토그래피 컬럼은 겔 여과 크로마토그래피 컬럼을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제3 크로마토그래피 컬럼은 Q 세파로스를 포함하고 제4 크로마토그래피 컬럼은 슈퍼덱스 200을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 독소-함유 용리액은 제4 크로마토그래피 컬럼 상에 직접적으로 주입된다. 일부 실시형태에서, 제3 크로마토그래피 컬럼 및 제4 크로마토그래피 컬럼은 상호연결되어 있다.

일부 실시형태에서, 제1 크로마토그래피 컬럼은 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼이고, 제2 크로마토그래피 컬럼은 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼이고, 제3 크로마토그래피 컬럼은 제2 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼이고, 제4 크로마토그래피 컬럼은 겔 여과 크로마토그래피 컬럼이다. 일 실시형태에서, 제1 크로마토그래피 컬럼은 Q 세파로스를 포함하고, 제2 크로마토그래피 컬럼은 SP 세파로스를 포함하고, 제3 크로마토그래피 컬럼은 Q 세파로스를 포함하고, 제4 크로마토그래피 컬럼은 슈퍼덱스 200을 포함한다.

일부 실시형태에서, 제1, 제2, 제3 및 제4 크로마토그래피 컬럼은 단일-사용 크로마토그래피 시스템이다.

일부 실시형태에서, 여과 단계 (f)는 보툴리눔 독소 단백질 분자를 비-독소 단백질로부터 해리시켜 유리 독소 분자를 생성한다. 일부 실시형태에서, 여과 단계 (f)은 완충액 교환을 포함한다.

일부 실시형태에서, 보툴리눔 독소를 포함하는 용액은 동물성 생성물이 없거나, 본질적으로 없거나, 또는 실질적으로 없다. 일부 실시형태에서, 정제는 보툴리눔 독소를 완충 용액과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 완충 용액은 바이오버든을 감소시키기 위해 여과된다.

또 다른 양태에서, 본 개시내용은 독소를 포함하는 용액으로부터 독소를 정제함에 의해 생산된 정제된 보툴리눔 독소에 관한 것이며, 여기서 공정은 침전, 원심분리 또는 동결건조를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 정제된 보툴리눔 독소는 혈청형 A이다. 일부 실시형태에서, 정제된 보툴리눔 독소는 독소 복합체가 없거나, 본질적으로 없거나, 실질적으로 없다. 일부 실시형태에서, 정제된 보툴리눔 독소는 인간 알부민을 포함하는 동물 생성물이 없거나, 본질적으로 없거나, 실질적으로 없다.

또 다른 양태에서, 본 개시내용은 포스페이트를 포함하는 완충 용액에 정제된 보툴리눔 독소를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 완충 용액은 아세테이트를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 완충 용액은 적어도 하나의 클로라이드 이온 공급원을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 클로라이드 이온 공급원은 염화나트륨을 포함한다. 일부 실시형태에서, 완충 용액은 적어도 하나의 계면활성제를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20이다.

본 개시내용에 따른 조성물의 일부 실시형태에서, 보툴리눔 독소는 보툴리눔 신경독소 혈청형 A이다. 일부 실시형태에서, 조성물은 보툴리눔 독소 복합체가 없거나, 본질적으로 없거나, 또는 실질적으로 없다. 일부 실시형태에서, 조성물은 동물성 생성물이 없거나, 본질적으로 없거나, 실질적으로 없다. 일부 실시형태에서, 조성물은 인간 알부민이 없거나, 본질적으로 없거나, 실질적으로 없다. 일부 실시형태에서, 조성물은 약 6.6 내지 6.9의 pH를 갖는다.

다음의 상세한 설명은 예시적이고 설명적이지만, 제한하려는 의도는 아니다.

도 1은 본 개시내용에 따른 발효 배지로부터 보툴리눔 독소 조성물을 정제하는 방법의 일 실시형태를 나타내는 흐름도이다.
도 2는 본 개시내용에 따라 제조된 생성물 독소 용액에 대한 콜로이드 쿠마시 블루 염색을 사용한 SDS-PAGE 결과를 나타낸다.
도 3은 본 개시내용에 따라 제조된 3가지 상이한 생성물 독소 용액에 대한 SDS-PAGE 결과를 나타낸다.
도 4는 본 개시내용에 따라 제조된 생성물 독소 용액에 대한 SEC 분자량 분포 결과를 나타낸다.
도 5는 본 개시내용에 따라 제조된 3가지 생성물 독소 용액에 대해 연속 정제 단계에 대한 평균 공정 수율을 나타낸다.
도 6은 본 개시내용에 따라 제조된 3가지 생성물 독소 용액에 대해 연속 정제 단계에 대한 평균 누적 공정 수율을 나타낸다.
도 7은 본 개시내용에 따라 제조된 3가지 생성물 독소 용액에 대해 연속 정제 단계에 대한 평균 순도 개선 인자를 나타낸다.
도 8은 본 개시내용에 따라 제조된 3가지 생성물 독소 용액에 대해 연속 정제 단계에 대한 평균 누적 순도 개선 인자를 나타낸다.

본 개시내용에 따른 실시형태들은 이하에서 더 완전하게 기술될 것이다. 그러나 개시내용의 양태는 상이한 형태로 구현될 수 있으며 본 명세서에서 설명하는 실시형태에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 오히려, 이들 실시형태는 본 개시내용이 철저하고 완전할 수 있고, 통상인에게 발명의 범주가 충분히 전달될 수 있도록 제공된다. 이러한 본 기술은 물론 다양할 수 있는 특정 방법, 시약, 화합물 조성 또는 생물학적 시스템에 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 본 명세서 설명에서 사용된 용어는 단지 특정한 실시형태를 설명하기 위해 사용된 것으로, 한정하려는 의도가 아니다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학 용어 포함)는 본 개시내용이 속하는 기술 분야에서 통상인에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의된 것과 같은 용어는 본 출원 및 관련 기술의 맥락에서 그 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하고 본 명세서에 명시적으로 그렇게 정의되지 않는 한 이상화되거나 지나치게 형식적인 의미로 해석되어서는 안된다는 것이 추가로 이해될 것이다. 아래에 명시적으로 정의되지는 않았지만 이러한 용어는 그 공통된 의미에 따라 해석되어야 한다.

부가하여, 개시내용의 특징 또는 양태가 마쿠시 그룹의 관점에서 기술되는 경우, 당업자는 개시내용이 마쿠시 그룹의 임의의 개별 부재 또는 부재의 하위 그룹의 관점에서도 이에 의해 기술된다는 것을 인식할 것이다.

당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 임의의 및 모든 목적을 위해, 특히 서면 설명을 제공하는 관점에서, 본 명세서에 개시된 모든 범위는 또한 임의의 및 모든 가능한 하위범위 및 그의 하위범위의 조합을 포괄한다. 임의의 열거된 범위는 동일한 범위를 적어도 동일한 절반, 3분의 1, 4분의 1, 5분의 1, 10분의 1 등으로 나눌 수 있도록 충분히 설명하고 가능하게 하는 것으로 쉽게 인식될 수 있다. 비-제한적인 예로서, 본 명세서에 논의된 각 범위는 하위 1/3, 중간 1/3 및 상위 1/3 등으로 쉽게 분류될 수 있다. 또한 "최대", "적어도", "초과", "미만" 등과 같은 모든 언어는 인용된 수를 포함하고 상기에서 논의한 바와 같이 후속적으로 하위 범위로 나눌 수 있는 범위를 지칭하는 것으로 당업자에 의해 이해될 것이다. 마지막으로, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 범위는 각각의 개별 구성원을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 1-3개 세포를 갖는 그룹은 1, 2 또는 3개 세포를 갖는 그룹을 지칭한다. 유사하게, 1-5개 세포를 갖는 그룹은 1, 2, 3, 4 또는 5개 세포를 갖는 그룹 등을 지칭한다.

문맥이 달리 나타내지 않는 한, 본 명세서에 기재된 기술의 다양한 특징이 임의의 조합으로 사용될 수 있다는 것이 구체적으로 의도된다. 더욱이, 개시내용은 또한 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 특징 또는 특징의 조합이 배제되거나 생략될 수 있음을 고려한다. 설명을 위해, 명세서에 복합체가 성분 A, B 및 C를 포함한다고 명시되어 있는 경우, A, B 또는 C 또는 이의 조합 중 어느 하나가 생략될 수 있고 단독으로 또는 임의의 조합으로 부인될 수 있다는 것이 구체적으로 의도된다.

달리 명시적으로 나타내지 않는 한, 모든 특정 실시형태, 특징 및 용어는 인용된 실시형태, 특징 또는 용어 및 이의 생물학적 균등물 모두를 포함하도록 의도된다.

본 명세서에 언급되거나 인용된 모든 특허, 특허 출원, 가출원 및 간행물은 본 명세서의 명시적 교시와 불일치하지 않는 정도로 모든 도면 및 표를 포함하여 그 전체가 참고로 포함된다.

정의

본 명세서에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 단수만을 지정하도록 명시적으로 언급되지 않는 한, 단수 및 복수 둘 모두를 지정한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "및/또는"은 대안("또는")으로 해석될 때 조합의 결여 뿐만 아니라 연관된 나열된 항목 중 하나 이상의 임의의 및 모든 가능한 조합을 지칭하고 포괄한다.

명시적으로 언급되지 않더라도, 모든 수치 지정은 용어 "약" 또는 "대략"가 앞에 온다. 용어 "약" 또는 "대략"는 이해되는 숫자가 본 명세서에 제시된 정확한 숫자로 제한되지 않고, 발명의 범주를 벗어나지 않으면서 실질적으로 인용된 숫자 주위의 숫자를 지칭하도록 의도됨을 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "약" "또는 "대략"는 당업자에 의해 이해될 것이고 그것이 사용되는 맥락에 따라 어느 정도 변할 것이다. 해당 용어가 사용되는 맥락에서 관련 기술 분야의 숙련자에게 명확하지 않은 용어의 용도가 있는 경우, "약" 또는 "대략"는 특정 용어의 최대 플러스 또는 마이너스 10%, 5%, 1% 또는 0.1%를 의미할 것이다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "없는" 또는 "완전히 없는"은 사용 중인 기기 또는 공정의 검출 범위 내에서 물질을 검출할 수 없거나 그 존재를 확인할 수 없음을 의미한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "본질적으로 없는"은 미량의 물질만이 검출될 수 있음을 의미한다. 본 개시내용에서, "본질적으로 없는"은 물질이 전체 조성물의 중량을 기준으로 0.1% 미만, 바람직하게는 0.01% 미만, 그리고 가장 바람직하게는 0.001% 미만의 수준임을 의미한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "실질적으로 없는"은 물질이 전체 조성물의 중량을 기준으로 5% 미만, 바람직하게는 2% 미만, 그리고 가장 바람직하게는 1% 미만의 수준임을 의미한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "보툴리눔 독소"는 클로스트리듐 보툴리눔에 의해 생산된 신경독소 뿐만 아니라 비-클로스트리듐 종에 의해 재조합적으로 만들어진 보툴리눔 독소(또는 이의 경쇄 또는 중쇄)를 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 문구 "보툴리눔 독소"는 보툴리눔 독소 혈청형 A, B, C, D, E, F 및 G를 포괄한다. "보툴리눔 독소"는 또한 "변형된 보툴리눔 독소"를 포괄한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "보툴리눔 독소 복합체" 또는 "독소 복합체"는 하나 이상의 연관된 비-독소 단백질과 함께, 보툴리눔 독소 단백질 분자(모든 혈청형에 대해 ~150kDa)를 포함하는 클로스트리듐 박테리아에 의해 방출되는 복합체를 포괄한다. 복합체(예를 들어, 대략 300kDa, 500kDa 또는 900kDa의 분자량)는 비-독소 혈구응집소 단백질("NTH 단백질") 및 비-독소 비-혈구응집소 단백질("NTNH 단백질")을 함유하는 것으로 여겨진다. 따라서, 보툴리눔 독소 복합체는 보툴리눔 독소 분자(신경독성 성분) 및 하나 이상의 NTH 및/또는 NTNH 단백질을 포함할 수 있다. 이들 두 유형의 비-독소 단백질은 독소 분자를 변성으로부터 안정화시키고 독소가 섭취될 때 소화산으로부터 보호할 수 있다. 부가적으로, 더 큰(300kDa 이상) 보툴리눔 독소 복합체는 보툴리눔 독소 단백질과 비교할 때 근육 주사 부위에서 더 천천히 확산될 수 있다.

독소 복합체의 예로서, 보툴리눔 독소 유형 A 복합체는 클로스트리듐 박테리아에 의해 900kDa, 500kDa 및 300kDa 형태로 생산될 수 있다. 보툴리눔 독소 유형 B 및 C1은 500kDa 복합체로 생산된다. 보툴리눔 독소 유형 D은 300kDa 및 500kDa 복합체로 생산된다. 마지막으로, 보툴리눔 독소 유형 E 및 F는 대략 300kDa 복합체로 생산된다.

보툴리눔 신경독소 유형 A1에 관하여, 약 7보다 큰 pH에서, 비-독소 단백질은 보툴리눔 독소 단백질 분자(~150kDa)로부터 해리되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 독소 복합체는 약 7-8의 pH에서 적절한 완충액에서 컬럼 크로마토그래피와 같은 분리 공정에 복합체를 적용함에 의해 보툴리눔 독소 단백질 및 헤마글루티닌 단백질로 해리될 수 있다. 그러나, 보툴리눔 독소 단백질은 NTH 및/또는 NTNH 헤마글루티닌 단백질(들)의 제거 시 불안정한 것으로 알려져 있으며, 독소는 pH 및 온도 상승 또는 표면 스트레칭 또는 건조(예를 들어, 동결건조 또는 침전 동안)의 결과로 그 독성을 상실한다. 더욱이, 독소는 안정화제가 존재하지 않는 한 희석(예를 들어, 배양, 발효 및 정제 동안 희석) 시 그 특정 활성을 상실한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "변형된 보툴리눔 독소"는 천연 보툴리눔 독소와 비교하여 그의 아미노산 중 적어도 하나가 결실, 변형 또는 대체된 보툴리눔 독소를 의미한다. 추가로, 변형된 보툴리눔 독소는 재조합적으로 생성된 신경독소, 또는 재조합적으로 만들어진 신경독소의 유도체 또는 단편일 수 있다. 변형된 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 수용체에 결합하는 능력 또는 뉴런으로부터 신경전달물질 방출을 억제하는 능력과 같은 천연 보툴리눔 독소의 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유한다. 변형된 보툴리눔 독소의 일 예는 하나의 보툴리눔 독소 혈청형(예컨대 혈청형 A)으로부터 경쇄 및 다른 보툴리눔 독소 혈청형(예컨대 혈청형 B)으로부터 중쇄를 갖는 보툴리눔 독소이다. 따라서, 변형된 보툴리눔 독소는 혈청형 A, B, C, D, E, F 또는 G 중 임의의 것으로부터 선택된 2개의 상이한 혈청형으로부터의 경쇄 및 중쇄를 포함할 수 있다. 변형된 보툴리눔 독소의 또 다른 예는 신경전달물질에 커플링된 보툴리눔 독소이다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "정제된 보툴리눔 독소", "순수 독소", "유리 보툴리눔 독소", "유리 독소" 또는 "보툴리눔 독소 단백질"은 보툴리눔 독소 복합체를 형성하는 NTH 및/또는 NTNH 단백질을 비롯한 다른 단백질로부터 단리되거나 실질적으로 단리된 보툴리눔 독소로 정의된다. 정제된 보툴리눔 독소는 95% 초과 순수할 수 있으며, 바람직하게는 99% 초과 순수하다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "배지" 또는 "발효 배지"는 생산 배지의 접종에 사용되는 종자 배양물을 생산하기 위한 성장용, 또는 박테리아가 자라서 그 독소를 생성하는 생산 배지 중 어느 하나인, 박테리아를 배양하기 위한 임의의 배지를 의미한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "동물성 생성물이 없는"("APF"), "본질적으로 동물성 생성물이 없는" 또는 "실질적으로 동물성 생성물이 없는"은 각각 "동물성 단백질 없는", "본질적으로 동물성 단백질 없는" 또는 "실질적으로 동물성 단백질 없는"을 포괄하고, 혈액 유래, 혈액-풀링된 및 기타 동물 유래된 생성물 또는 화합물의 부재, 본질적 부재 또는 실질적인 부재를 의미한다. 이 맥락에서 "없는", "본질적으로 없는" 및 "실질적으로 없는"은 상기에 제공된 정의에 상응한다. "동물"은 포유동물(예를 들어, 인간), 새, 파충류, 물고기, 곤충, 거미 또는 기타 동물 종을 의미한다. "동물"은 박테리아와 같은 미생물을 제외한다. 따라서, 본 발명의 범주 내의 APF 배지 또는 공정 또는 실질적으로 APF 배지 또는 공정은 보툴리눔 독소 또는 클로스트리듐 보툴리눔 박테리아를 포함할 수 있다. 예를 들어, APF 공정 또는 실질적으로 APF 공정은 면역글로불린, 인간 알부민, 육류 소화, 육류 부산물, 및 우유 또는 유제품 또는 다이제스트와 같은 동물 유래 단백질이 없거나 실질적으로 없는 공정을 의미한다. 따라서, APF 공정의 예는 육류 및 유제품 또는 육류 또는 유제품 부산물을 배제하는 공정(예컨대 박테리아 배양 또는 박테리아 발효 공정)이다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "바이오버든(bioburden)"은 살균되지 않은 표면 상, 장치 내부 또는 용액 내에 살아있는 박테리아를 의미한다. 예를 들어, 본 기술의 실시형태는 완충 용액에 살아있거나 용액과 접촉하는 표면(예를 들어, 유리제품 표면)으로부터 용액 안으로 이동한 박테리아인, "바이오버든"을 줄이기 위해 완충 용액을 여과하는 것을 포함한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "접선 유동 여과" 및 "TFF"는 생물학적 물질(예를 들어, 단백질)을 정화, 농축 및 정제하는 데 유용한 여과의 방식을 지칭한다. TFF에서 거대분자 또는 생물학적 물질을 함유하는 용액 또는 현탁액은 막의 표면을 따라 접선으로 펌핑될 수 있다. 적용된 압력은 막의 기공을 통해 용액의 일부를 강제할 수 있다. 이 용액은 본 명세서에서 "투과물"(또는 "여과물")로 지칭된다. 막 기공을 통과하기에는 너무 큰 거대분자, 생물학적 물질 및 미립자는 상류측에 잔류할 수 있다. 이 용액은 본 명세서에서 "잔류물"로 지칭된다. 일반 여과 방법과 달리 잔류 물질은 막의 표면에 축적되지 않는다. 대신, 유체의 접선 흐름에 의해 막의 면을 따라 휩쓸릴 수 있다. 예를 들어, L. Schwartz and K. Seeley, Introduction to Tangential Flow Filtration for Laboratory and Process Development Applications, Pall Life Sciences (2002), https://laboratory.pall.com/content/dam/pall/laboratory/literature-library/non-gated/id-34212.pdf 참고.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "투과물"은 필터 또는 막의 기공을 통과함에 의해 필터 또는 막(예를 들어, 정용여과막, 접선 유동 여과막, 한외여과막, 정밀여과막, 또는 중공사 필터)을 가로지르는 용액, 현탁액 또는 이의 성분 뿐만 아니라 이미 필터 또는 막을 가로지르거나 통과한 용액을 지칭한다. 일반적으로 필터 또는 막 기공 크기보다 작은 용매 분자 및 용질 분자는 필터 또는 막을 가로지를 것인 반면 기공 크기보다 큰 분자는 필터 또는 막을 가로지르지 않을 것이다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "독소-함유 투과물"은 필터의 기공 크기가 보툴리눔 독소 분자보다 커서 보툴리눔 독소 분자가 필터를 가로지를 때와 같은, 보툴리눔 독소 분자를 함유하는 투과물을 지칭한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "잔류물"은 필터 또는 막을 가로지르지 않는 용액, 현탁액, 또는 이의 성분을 지칭한다. 예를 들어, 접선 흐름 여과의 경우, 잔류물은 필터 또는 막을 따라 접선으로 흐르지만 가로지르지 않는 용액 또는 현탁액의 구성성분 또는 부분이다. 일반적으로, 필터 또는 막 기공 크기보다 큰 분자는 필터 또는 막을 가로지르지 않는다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "독소-함유 잔류물"은 필터의 기공 크기가 보툴리눔 독소 분자보다 작아서 보툴리눔 독소 분자가 필터를 가로지를 수 없는 때우와 같은, 보툴리눔 독소 분자를 함유하는 잔류물을 지칭한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "막횡단 압력" 또는 "TMP"는 유체 및 여과가능한 용질이 필터 또는 막을 통과하거나 가로질러 흐르게 하기 위해 여과막의 길이를 따라 적용되는 압력차 구배를 지칭한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "정용여과"는 잔류물을 용매로 희석하고 재-여과하여 가용성 투과물 성분의 농도를 감소시키는 특수화된 부류의 여과를 지칭한다. 정용여과로 인해 단백질(예를 들어, BoNT/A)을 포함한 잔류 성분의 농도가 증가하거나 증가하지 않을 수 있다. 예를 들어, 연속 정용여과에서 용매는 투과액이 생성되는 것과 동일한 속도로 잔류물에 연속적으로 추가된다. 이 경우 잔류물 부피와 잔류 성분 농도는 공정 동안에 변하지 않는다. 다른 한편으로, 불연속 또는 순차적 희석 정용여과에서, 여과 단계 이후에 잔류물 측에 용매를 첨가하고; 잔류물 측에 추가된 용매의 부피가 생성된 투과물의 부피보다 적으면 잔류 성분은 원래 용액에서보다 더 높은 농도를 가질 것이다. 정용여과는 거대분자(예를 들어, BoNT/A와 같은 단백질)의 용액 또는 현탁액의 pH, 이온 강도, 염 조성 또는 기타 특성을 변경하는 데 사용할 수 있다. 예를 들어, L. Schwartz, Diafiltration: A Fast, Efficient, Method for Desalting, or Buffer Exchange of Biological Samples, Pall Life Sciences (2003), https://laboratory.pall.com/content/dam/pall/laboratory/literature-library/non-gated/02.0629_Buffer_Exchange_STR.pdf (last visited Dec. 9, 2019) 참고.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "정용여과 부피" 또는 "DV"는 정용여과의 과정 동안 교환된 총 부피를 지칭한다. 단일 DV는 정용여과의 시작 시 잔류물의 부피와 같다. 예를 들어, 원래 용액 부피가 1리터인 경우, 정용여과 공정은 대략 1리터와 동등한 투과물 부피를 생성하고 잔류물은 1L의 부피로 유지되거나 1L의 부피로 복원되며(예를 들어, 완충 용액 사용), 그 다음 원래 용액 또는 현탁액이 하나의 DV로 여과되거나 세정되었다. 연속 정용여과는 다중 DV의 교환을 허용한다. 예를 들어, 원래의 잔류물 부피가 1리터이고 정용여과 공정에서 대략 5리터와 동등한 투과물 부피가 생성되는 경우, 원래 용액 또는 현탁액은 5개의 DV로 여과되거나 세정되었다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "미세여과"는 전형적으로 대략 0.1μm 내지 대략 10μm 이상의 범위인 막 기공 크기를 사용하는 여과의 부류를 지칭한다. 예를 들어, Munir Cheryan, Ultrafiltration and Microfiltration Handbook (2d ed. 1998) 참고.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "한외여과"는 전형적으로 대략 0.1μm 내지 대략 0.01μm 이하의 범위인 막 기공 크기를 사용하는 여과의 부류를 지칭한다. 대안적으로, 공칭 막 기공 크기는 분자량의 관점에서, 예를 들어 약 30kDa 이하 내지 약 750kDa 이하, 바람직하게는 50kDa 이하 또는 30kDa 이하로 표현될 수 있다. 이는 용액 또는 현탁액이 거대분자를 유지하면서 용매 및 작은 용질 분자가 통과하도록 하는 반투막에 적용되는 임의의 그러한 기술을 지칭할 수 있다. 한외여과를 사용하여 용액 또는 현탁액에서 거대분자(예를 들어, BoNT/A와 같은 단백질)를 농축할 수 있다. 예를 들어, Munir Cheryan, Ultrafiltration and Microfiltration Handbook (2d ed. 1998) 참고.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "크로마토그래피" 또는 "크로마토그래피 분리"는 분리되는 성분(예를 들어, 단백질)이 고정상과 이동상인: 2가지 상 사이에 분포되는 물리적 분리 방법을 지칭한다. 분리되는 분자는 고정상(예를 들어, 다공성 겔, 하전된 중합체 비드 등)을 통해 이동하는 이동상에 용해된다. 샘플에서 다른 분자가 정지상에 대해 상이한 친화도를 나타내어 유사한 분자의 분리를 초래하기 때문에 분리가 가능하다. 고정상에 대한 친화도가 높은 분자는 친화도가 약한 분자보다 고정상을 통해 더 천천히 이동하는 경향이 있을 것이다. 단백질(예를 들어, 보툴리눔 독소)에 적용될 때 크로마토그래피 분리는 많은 상이한 특성을 기반으로 단백질을 분리할 수 있다. 예를 들어, 겔 여과 크로마토그래피에서는 다른-크기의 단백질이, 더 작은 단백질은 갇히게 되어 그 이동이 느려지는, 다공성 고정상을 통과하기 때문에 이동상에서 단백질이 크기에 기반하여 분리된다. 이온-교환 크로마토그래피에서 단백질은 그 전하 및 결과적으로 고정상과의 쿨롱 상호작용을 기반으로 분리된다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "크로마토그래피 컬럼" 또는 간단히 "컬럼"은 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어, 고정상 또는 고체상)를 함유하고 이동상, 예를 들어 유체 샘플 또는 완충액이 컬럼을 통과하여 컬럼에 유지된 고정상을 통과할 수 있도록 구성된 구성요소를 지칭한다. 이러한 컬럼의 비-제한적인 예는 G.E. Healthcare로부터 상업적으로 이용가능한 것들이다. Chromatography Products: Chromatography columns, systems, resins, and buffer management solutions, G.E. Healthcare, https://www.gelifesciences.com/en/us/shop/chromatography (last visited Dec. 9, 2019) 참고.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "분획물"은 컬럼을 나갈 때 수집되는 이동상의 일부를 지칭한다. "분획물"에서의 성분은 수집되는 동안의 시간에 기반하여 다를 것이다. 초기에 수집된 더 빠르게 이동하는 "분획물"은 고정상을 통해 더 빠르게 이동하는 상대적으로 높은 농도의 분자를 함유할 것이고; 나중에 수집된 더 느리게 이동하는 "분획물"은 고정상을 통해 더 천천히 이동하는 상대적으로 높은 농도의 분자를 함유할 것이다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "독소-함유 분획물"은 보툴리눔 독소 분자(예를 들어, BoNT/A 분자)가 이동상에서 컬럼을 빠져나가는 기간 동안 크로마토그래피 컬럼으로부터 수집된 분획을 의미한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "이온 교환 크로마토그래피" 또는 "IEX"는 극성 및 그 전하의 크기(예를 들어, +2, +1, 중성, -1, - 2 등)에 기반하여 분자를 분리하는 크로마토그래피 분리 기술을 지칭한다. IEX는 고정상과의 그 쿨롱 상호작용의 정도에 기반하여 고정상에 분석물 분자(예를 들어, 단백질)를 유지한다. 고정상 표면은 반대 전하의 분석물(예를 들어, 보툴리눔 독소) 이온과 상호작용하는 이온성 작용기를 표시한다. 전기중성을 달성하기 위해, 이들 고정 전하는 이동상에서 교환가능한 반대이온과 상호작용한다. 분석물 분자는 결합을 위해 이들 교환가능한 반대이온과 경쟁한다. 분석물 분자는 그 전하에 기반하여 유지되거나 "용리"된다. 처음에는 고정상에 결합하지 않거나 약하게 결합하는 분자가 먼저 씻겨 나온다. 일반적으로 예를 들어, Ion Exchange Chromatography: Principles and Methods, G.E. Healthcare (2016), https://cdn.gelifesciences.com/dmm3bwsv3/AssetStream.aspx?mediaformatid=10061&destinationid=10016&assetid=13101 (last visited Dec. 9, 2019) 참고.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "음이온 교환 크로마토그래피" 또는 "AIEX"는 음이온성 분석물 분자(예를 들어, 단백질)가 양이온성 정지상에 유지되는 이온 교환 크로마토그래피의 유형을 의미한다. 일반적으로, 예를 들어, Ion Exchange Chromatography: Principles and Methods, G.E. HEALTHCARE(2016), https://cdn.gelifesciences.com/dmm3bwsv3/AssetStream.aspx?mediaformatid=10061&destinationid=10016&assetid=13101(2019년 12월 9일 마지막 방문) 참고.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "양이온 교환 크로마토그래피" 또는 "CIEX"는 양이온성 분석물 분자(예를 들어, 단백질)가 음이온성 정지상에 유지되는 이온 교환 크로마토그래피의 유형을 의미한다. 일반적으로, 예를 들어 Ion Exchange Chromatography: Principles and Methods, G.E. HEALTHCARE(2016), https://cdn.gelifesciences.com/dmm3bwsv3/AssetStream.aspx?mediaformatid=10061&destinationid=10016&assetid=13101(2019년 12월 9일 마지막 방문) 참고.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "용리"는 크로마토그래피 컬럼 내의 용액 조건을 변경함에 의해 정지상에 결합된 분자를 탈착시키는 것을 지칭한다. 교환가능한 반대이온 농도를 높이거나 pH를 변경하여 분석물 결합 친화도에 영향을 줄 수 있다. 고정상에 대한 친화력을 잃고 이동상으로 들어가는 분자는 컬럼으로부터 "용리"된다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "용리제" 또는 "세정 용액"은 분석물(예를 들어, 보툴리눔 독소 분자)의 고정상에 대한 흡착을 변형 및/또는 고정상으로부터 결합되지 않은 물질을 제거하기 위해 사용되는 제제, 전형적으로 용액을 지칭한다. 용리제의 용리 특성은 다른 요인 중에서 예를 들어 pH, 이온 강도 및 세제 강도에 의존할 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "용리액"은 고정상을 통해 이동하고 크로마토그래피 분리에서 컬럼을 빠져 나오는 결합되지 않은 물질("용리된" 또는 탈착된 분석물 분자, 예를 들어, 보툴리눔 독소 분자 포함)을 함유하는 용액(예를 들어, 세정 용액 또는 완충 용액)을 지칭한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "독소-함유 용리액"은 크로마토그래피 분리 컬럼에서 컬럼을 빠져나가는 용리된 보툴리눔 독소 분자를 함유하는 이동상을 지칭한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "겔 여과 크로마토그래피" 또는 "겔 여과"는 샘플에서의 분자(예를 들어, 단백질, 단백질 복합체, 다당류, 핵산, 소분자 등)를, 그 각각이 특정 크기 범위를 갖는 분획으로 분획화하는데 사용될 수 있는 크기 배제 크로마토그래피의 유형을 의미한다. 대안적으로, "겔 여과"는 샘플에서 특정 컷오프 크기보다 큰 모든 분자를 제거할 수 있다. 겔 여과 크로마토그래피 컬럼에서, 정지상은 다공성 매트릭스(예를 들어, 비드)를 포함하고 이동상은 매트릭스 주위를 흐르는 용액(예를 들어, 완충 용액)이다. 매트릭스는 "분획화 범위"로 알려진 정의된 기공 크기 범위를 가질 수 있다. 너무 커서 기공에 들어갈 수 없는 분자와 복합체는 이동상에 남아 완충 용액과 함께 컬럼을 통해 이동한다. 기공 안으로 이동할 수 있는 더 작은 분자와 복합체는 고정상으로 들어가 더 긴 경로(즉, 비드 주위가 아닌 기공을 통함)로 겔 여과 컬럼을 통해 이동한다. 정지상에 들어갈 수 있는 분자는 크기에 의해 분획화된다. 더 작은 분자는 기공을 통해 이동하고 쉽게 기공에 들어갈 수 없는 더 큰 분자보다 더 느려질 것이다. 따라서 더 큰 분자가 더 빨리 용리된다. 따라서, 분획화 범위를 넘는 샘플 성분은 분획화 범위 내의 성분 이전에 용리될 것이다. 일반적으로, 예를 들어, Size Exclusion Chromatography: Principles and Methods, G.E. Healthcare (2018), https://cdn.gelifesciences.com/dmm3bwsv3/AssetStream.aspx?mediaformatid=10061&destinationid=10016&assetid=11639 (2019년 12월 9일 마지막 방문) 참고.

크로마토그래피 시스템의 구성요소와 관련하여 본 명세서에 사용된 바와 같이, "단일-사용"은 각 사용 후에 교체되거나 폐기되도록 구성되고 시스템에서 재-사용되도록 의도되지 않은 구성요소를 지칭한다.

발효 배지

이제 도 1을 참고하면, 보툴리눔 독소를 정제하는 방법(100)은 보툴리눔 독소(예를 들어, BoNT/A)를 포함하는 용액(예를 들어, 발효 배지)을 얻는 단계(104)를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 용액은 발효 배지, 바람직하게는 전체 C. 보툴리눔 세포, 용해된 박테리아, 배양 배지 영양소(예를 들어, 식물성 펩톤), 및 발효 부산물을 포함하는 발효 배지로부터의 상등액일 수 있다. 일부 실시형태에서, 발효 배지는 동시-계류 중인 미국 가특허 출원 번호 62/951,549에 기술된 발효 배지와 같은 동물 생성물(즉, "APF" 발효 배지)이 실질적으로 없거나, 본질적으로 없거나, 또는 없을 수 있다.

보툴리눔 독소는 단백질 정제의 분야에서 통상의 기술자에게 공지된 단백질 정제 방법을 사용하여 발효 배지로부터 단리 및 정제될 수 있다. 일반적으로, 예를 들어, Munir Cheryan, Ultrafiltration and Microfiltration Handbook (2d ed. 1998); Ozutsumi et al., 49 Appl. Envtl. Microbiol. 939 (1985); GE Healthcare, Strategies for Protein Purification Handbook (2010) 참고.

본 명세서에 기재된 바와 같은 본 개시내용의 정제 방법은 150kDa 보툴리눔 독소 단백질 분자보다 더 안정한 보툴리눔 독소 복합체(예를 들어, 900kDa 복합체)를 정제한 다음, 비-독소 단백질(즉, NTH 및/또는 NTNH 단백질)로부터 독소 단백질 분자를 분리하고 추가로 정제하여 임의의 침전, 원심분리 또는 동결건조 단계 없이 정제된 보툴리눔 독소(~150kDa) 생성물을 얻는 것을 포함할 수 있다. 생성물 독소 용액에는 독소 복합체 및/또는 동물 생성물이 없거나, 본질적으로 없거나, 실질적으로 없을 수 있다. 더욱이, 침전, 동결건조 또는 원심분리 단계가 필요하지 않기 때문에, 환자에게 투여하기 이전에 최종 사용자가 재구성해야 하는 분말과 반대로 보툴리눔 독소를 용액에서 회수할 수 있다.

여과

여과 1

여전히 도 1을 참고하면, 방법은 제1 여과("여과 1")(106)를 포함할 수 있으며, 이는 배지 또는 배양 용액을 여과하여 전체 또는 용해된 박테리아, 포자(예를 들어, C. 보툴리눔 포자), 및 잔해를 제거하여 독소-함유 투과물(107)을 제공하는 것을 포함한다. 독소-함유 투과물(107)은 보툴리눔 독소 및 다양한 불순물을 포함하고 농축된 보툴리눔 독소(예를 들어, BoNT/A)를 얻기 위해 가공될 수 있다.

특정 실시형태에서, 제1 여과(106)는 임의의 적합한 여과 기술(예를 들어, 정용여과, 접선 유동 미세여과, 접선 유동 한외여과, 중공사 여과, 등)을 사용하여 발효 배지로부터 전체 또는 용해된 C. 보툴리눔 세포(또는 이의 성분)를 제거하는 것을 포함한다. 단백질과 같은 생체분자를 정제하기 위한 여과 기술은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, L. Schwartz and K. Seeley, Introduction to Tangential Flow Filtration for Laboratory and Process Development Applications, Pall Life Sciences (2002), https://laboratory.pall.com/content/dam/pall/laboratory/literature-library/non-gated/id-34212.pdf (2019년 12월 9일 마지막 방문); Munir Cheryan, Ultrafiltration and Microfiltration Handbook (2d ed. 1998) 참고. 일 실시형태에서, 제1 여과(106)는 접선 유동 미세여과를 포함한다.

일부 실시형태에서, 제1 여과 단계(106)는 필터(예를 들어, 중공사 필터, 접선 흐름 여과 막, 등)를 사용할 수 있으며, 여기서 적어도 용매 및 보툴리눔 독소 분자 또는 독소 복합체는 필터를 통과하여 독소-함유 투과물(107)을 생성하는 반면, 전체 또는 용해된 세포는, 존재하는 경우, 필터를 통과하지 않고 잔류물에 유지된다. 일부 실시형태에서, 필터는 직경이 대략 0.1μm 내지 10μm(예를 들어, 대략 0.2μm)인 기공을 포함한다. 일 실시형태에서, 필터는 중공사 필터이다.

일부 실시형태에서, 제1 여과 단계(106)는 독소-함유 투과물(107)을 농축하는 것 및 임의의 적합한 방법(예를 들어, 정용여과)에 의해 잔류물 및/또는 독소-함유 투과물(107)로부터 추가의 보툴리눔 독소 분자를 회수하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

여과 2

여전히 도 1을 참고하면, 방법은 독소-함유 투과물(107)로부터 발효 배지 잔류물(예를 들어, 작은 펩티드, 탄수화물, 등)을 제거하기 위한 제2 여과("여과 2")(108)를 추가로 포함할 수 있다. 이 단계는 임의의 적합한 여과 기술(예를 들어, 정용여과, 접선 흐름 미세여과, 접선 흐름 한외여과, 중공사 여과, 등)을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 발효 배지 잔류물을 제거하기 위한 제2 여과(108)는 보툴리눔 독소 분자 및/또는 독소 복합체를 유지하면서 발효 배지 잔류물이 필터를 통과하도록 허용하는 기공 크기를 갖는 접선 유동 필터(예를 들어, 중공사 필터)를 사용한 한외여과를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 필터는 150kDa 이하, 100kDa 이하, 또는 50kDa 이하의 기공 크기를 가질 수 있다. 이 경우, 보툴리눔 독소 분자 또는 보툴리눔 독소 복합체는 제2 여과(108)로부터의 잔류물에 남아 보툴리눔 독소 분자 또는 보툴리눔 독소 복합체를 함유하지만, 전체 또는 용해된 C. 보툴리눔 세포(또는 이의 성분), 뿐만 아니라 발효 배지 잔류물(예를 들어, 작은 펩티드, 탄수화물 등)이 없거나, 본질적으로 없거나, 실질적으로 없는 정화된 배양물(110)을 생성한다.

일부 실시형태에서, 정화된 배양물(110)은 정제 공정 동안 임의의 시간에 용액으로부터 보툴리눔 독소 분자 또는 독소 복합체를 침전시키지 않고 후속 공정 단계에서 수집되고 추가로 정제될 수 있다. 유리하게는, 이것은 전반적인 공정 수율을 향상시키고, 독소 활성을 보존하고, 최종 사용자에 의해 동결건조된 약품을 재구성할 필요성을 제거한다.

컬럼 크로마토그래피

제1 크로마토그래피 분리

여전히 도 1을 참고하면, 방법(100)의 일부 실시형태는 제1 크로마토그래피 분리(112)를 사용하여 정화된 배양물(110)을 정제하여 제1 독소-함유 분획물(114)을 생성하는 것을 추가로 포함한다. 이 단계의 목적은 보툴리눔 독소 복합체를 정화된 배양물(110)에 존재하는 핵산(예를 들어, DNA 및 RNA)으로부터 분리하는 것이다. 제1 크로마토그래피 분리(112)는 임의의 적합한 크로마토그래피 분리 기술(예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피 - 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피 포함, 겔 여과 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 등)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 크로마토그래피 분리는 음이온 교환 크로마토그래피(AIEX)를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 제1 크로마토그래피 분리는 Q 세파로스에 대한 AIEX를 포함한다.

제1 크로마토그래피 분리(112)는 보툴리눔 독소 또는 독소 복합체를 포함하는 정화된 배양물(110)과 제1 크로마토그래피 컬럼을 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 이동상(정화된 배양물(110) 포함)은 보툴리눔 독소를 다른 잔류 불순물(예를 들어, 핵산)로부터 분리하기 위해 제1 고정상을 통해 흐를 수 있다. 제1 고정상은 임의의 적합한 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어, Q 세파로스 FF(GE Healthcare)와 같은 아가로스 비드-기반 매질)를 포함할 수 있다.

특정 실시형태에서, 정화된 배양물(110)은 (예를 들어, 완충 용액에서의 희석에 의해 또는 완충액 교환에 의해) 컬럼 크로마토그래피를 위해 컨디셔닝될 수 있다. 특정 실시형태에서, 정화된 배양물(110)은 약 7.5 이하의 pH, 바람직하게는 약 7 이하의 pH, 보다 바람직하게는 약 6.1의 pH에서 인산염 완충액에서 컨디셔닝될 수 있다. 일부 실시형태에서, 정화된 배양물(110)은 약 7.5, 약 7.4, 약 7.3, 약 7.2, 약 7.1, 약 7.0, 약 6.9, 약 6.8, 약 6.7, 약 6.6, 약 6.5, 약 6.4, 약 6.3, 약 6.2, 약 6.1, 약 6.0, 약 5.9, 약 5.8, 약 5.7, 약 5.6, 또는 약 5.5의 pH에서 인산염 완충액에서 컨디셔닝될 수 있다.

특정 실시형태에서, 제1 크로마토그래피 분리(112)는 적합한 완충 용액(예를 들어, pH 6.1의 인산염 완충액)을 사용하여 고정상을 통해 보툴리눔 독소 또는 독소 복합체를 세정하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 이 단계의 목적은 컬럼을 통해 보툴리눔 독소 복합체를 가능한 한 많이 세정하면서 다른 단백질에서 보툴리눔 독소 복합체를 분리하고 핵산(RNA 및 DNA)을 제거하는 것이다. 일부 실시형태에서, 이 완충 용액의 염 농도는 컬럼을 통해 흐르는 보툴리눔 독소 또는 독소 복합체의 양을 최대화하면서 컬럼을 통해 흐르는 다른 단백질의 양을 최소화하도록 선택된다.

일부 실시형태에서, 완충 용액은 약 15mM 이상, 약 20mM 이상, 약 30mM 이상, 약 40mM 이상, 약 50mM 이상, 약 60mM 이상, 약 70mM 이상, 약 80mM 이상, 약 90mM 이상, 약 100mM 이상, 약 150mM 이상, 약 200mM 이상, 약 250mM 이상, 약 300mM 이상, 약 350mM 이상, 약 400mM 이상, 약 450mM 이상, 또는 약 500mM 이상 (및 그 사이 범위)의 농도로 염화나트륨(NaCl)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 완충 용액은 약 15mM, 약 20mM, 약 30mM, 약 40mM, 약 50mM, 약 60mM, 약 70mM, 약 80mM, 약 90mM, 약 100mM, 약 150mM, 약 200mM, 약 250mM, 약 300mM, 약 350mM, 약 400mM, 약 450mM, 또는 약 500mM의 농도로 NaCl을 포함한다. 일 실시형태에서, 완충 용액은 약 150mM의 농도로 NaCl을 포함한다.

특정 실시형태에서, 제1 크로마토그래피 컬럼은 관류 방식으로 작동할 수 있으며, 여기서 보툴리눔 독소 및/또는 독소 복합체는 고정상에 흡착되지 않고 컬럼을 통과할 수 있다. 이 구성에서는 컬럼으로부터 보툴리눔 독소 또는 독소 복합체를 용리할 필요가 없다. 대신, 보툴리눔 독소 또는 독소 복합체는 독소-함유 분획물(114)에서 컬럼을 빠져나갈 수 있으며, 이는 후속 공정 단계에서 수집되고 추가로 정제될 수 있다. 일부 실시형태에서, 독소-함유 분획물(114)의 수집은 280nm("A₂₈₀")에서 관류 흡광도 검출에 의해 모니터링되며, 여기서 독소-함유 분획물(114)은 A₂₈₀ 피크의 출현 동안 수집된다.

2차 크로마토그래피 분리

방법(100)의 일부 실시형태는 제2 크로마토그래피 분리 단계(116)를 추가로 포함하며 여기서 독소-함유 분획물(114)은 정제되어 벌크 불순물(예를 들어, 다른 단백질)을 제거하고 제1 독소-함유 용리액(118)을 생성할 수 있다. 제2 크로마토그래피 분리(116)는 임의의 적합한 크로마토그래피 분리 기술(예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피 - 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피 포함, 겔 여과 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 등)을 포함할 수 있다 특정 실시형태에서 제2 크로마토그래피 분리(116)는 양이온 교환 크로마토그래피(CIEX)를 포함한다.

제2 크로마토그래피 분리(116)는 보툴리눔 독소 또는 독소 복합체를 제2 크로마토그래피 컬럼과 접촉시키는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 독소-함유 분획물(114)을 포함하는 이동상은 제2 정지상을 통해 이동한다. 제2 정지상은 임의의 적합한 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어, SP 세파로스 FF(GE Healthcare)와 같은 아가로스 비드-기반 매질)를 포함할 수 있다. 실시형태에서, 보툴리눔 독소 분자 또는 독소 복합체는 제2 정지상에 결합할 수 있다. 실시형태에서, 보툴리눔 독소 또는 독소 복합체는 제2 고정상에 결합할 수 있고, 컬럼을 통해 세정되는 용액의 A₂₈₀이 모니터링된다. 실시형태에서, 컬럼은 보툴리눔 독소 및 독소 복합체가 제2 고정상에 결합된 상태로 남아 있을 수 있지만 모든 독소-함유 용리액(118)이 컬럼을 통과했음을 나타내는, A₂₈₀이 기준선 값으로 돌아올 때까지 적합한 완충 용액(예를 들어, 50mM 아세트산나트륨, 0.2% 폴리소르베이트 20, pH 4.5)으로 세정된다.

일부 실시형태에서, 제2 크로마토그래피 분리(116)는 제2 크로마토그래피 컬럼을 세정 완충액으로 세정하여 임의의 약하게 결합된 단백질을 제거하는 것을 추가로 포함할 수 있는 반면, 보툴리눔 독소 및 독소 복합체는 제2 고정상에 강하게 결합된 상태로 유지된다. 이 세정 단계는 임의의 적합한 완충 용액(예를 들어, 50mM 아세트산나트륨, 0.2% 폴리소르베이트 20, pH 4.5, 210mM NaCl)을 사용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이 세정 완충액은 250mM 이하, 240mM 이하, 230mM 이하, 220mM 이하, 210mM 이하, 200mM 이하, 190mM 이하, 180mM 이하, 170mM 이하, 160mM 이하, 150mM 이하, 140mM 이하, 130mM 이하, 120mM 이하, 110mM 이하, 또는 100mM 이하 또는 그 이하의 농도로 NaCl을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이 세정 완충액은 약 100mM, 약 110mM, 약 120mM, 약 130mM, 약 140mM, 약 150mM, 약 160mM, 약 170mM, 약 180mM, 약 190mM, 약 200mM, 약 210mM, 약 220mM, 약 230mM, 약 240mM, 또는 약 250mM의 농도로 NaCl을 함유한다.

일부 실시형태에서, 제2 크로마토그래피 분리(116)는 독소-함유 분획물(114)을 제2 크로마토그래피 컬럼과 접촉시키기 전에 (예를 들어, 희석 또는 완충액 교환에 의해) 컬럼 크로마토그래피를 위해 독소-함유 분획물(114)을 컨디셔닝하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 독소-함유 분획물(114)은 약 3 내지 약 7, 약 3.5 내지 약 6, 또는 약 4 내지 약 5의 pH에서, 바람직하게는 약 4.5의 pH에서 아세트산-아세테이트 완충액에서의 희석에 의해 컨디셔닝될 수 있다. 일부 실시형태에서, 독소-함유 분획물은 약 3.5, 약 3.6, 약 3.7, 약 3.8, 약 3.9, 약 4.0, 약 4.1, 약 4.2, 약 4.3, 약 4.4, 약 4.5, 약 4.6, 약 4.7, 약 4.8, 약 4.9, 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 약 5.4, 또는 약 5.5의 pH를 갖는 완충액에서 컨디셔닝된다.

일부 실시형태에서, 제2 크로마토그래피 분리(116)는 컬럼으로부터 보툴리눔 독소 또는 독소 복합체를 용리하여 제1 독소-함유 용리액(118)을 생성하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 용리는 (예를 들어, pH 또는 이온 강도를 변경함에 의해) 고정상으로부터 독소 (또는 독소 복합체) 해리를 촉진하는 하나 이상의 완충 용액으로 컬럼을 세정하는 것을 포함할 수 있다. 이 용리 완충액은 제2 정지상(예를 들어, 50mM 아세트산나트륨, 0.2% 폴리소르베이트 20, pH 4.5)으로부터 독소 또는 독소 복합체 해리를 촉진하기 위한 임의의 적합한 완충 용액일 수 있다. 예를 들어, 이러한 완충 용액은 약 3 내지 약 7, 약 4 내지 약 6, 또는 약 4 내지 약 5, 또는 약 4.5의 pH를 갖는 아세트산-아세테이트 완충액을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 독소-함유 분획물은 약 3.5, 약 3.6, 약 3.7, 약 3.8, 약 3.9, 약 4.0, 약 4.1, 약 4.2, 약 4.3, 약 4.3, 약 4.4, 약 4.5, 약 4.6, 약 4.7, 약 4.8, 약 4.9, 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 약 5.4, 또는 약 5.5의 pH를 갖는 완충액을 사용하여 제2 크로마토그래피 컬럼으로부터 용리된다.

일부 실시형태에서, 이 용리 완충액은 제2 정지상으로부터 보툴리눔 독소 또는 독소 복합체의 해리를 촉진하기에 충분한 농도의 염을 포함할 수 있다. 실시형태에서, 이 용리 완충액은 230mM 이상, 240mM 이상, 250mM 이상, 260mM 이상, 270mM 이상, 280mM 이상, 290mM 이상, 300mM 이상, 350mM 이상, 또는 400mM 이상의 농도로 NaCl을 함유한다. 일부 실시형태에서, 이 용리 완충액은 약 230mM, 약 240mM, 약 250mM, 약 260mM, 약 270mM, 약 280mM, 약 290mM, 약 300mM, 약 310mM, 약 310mM, 약 320mM, 약 330mM, 약 340mM, 약 350mM, 약 360mM, 약 370mM, 약 380mM, 약 390mM, 또는 약 400mM, 또는 그 사이의 임의의 값의 농도로 NaCl을 포함한다.

실시형태에서, 보툴리눔 독소 분자 또는 독소 복합체는 컬럼으로부터 용리되어 제1 독소-함유 용리액(118)을 생성하며, 이는 후속 가공 단계에서 수집되고 추가로 정제될 수 있다. 일부 실시형태에서, A₂₈₀은 컬럼으로부터 용리되는 보툴리눔 독소 분자 또는 독소 복합체의 존재를 검출하기 위해 제2 크로마토그래피 컬럼으로부터의 용리 동안 측정되고, A₂₈₀ 피크는 제1 독소-함유 용리액(118)을 생성하는 단일 분획으로서 수집된다.

여과 3

방법의 일부 실시형태는 제2 크로마토그래피 분리(116) 후 및 제3 크로마토그래피 분리(124) 전에 수행되는 제3 여과 단계(120)를 추가로 포함한다. 실시형태에서, 제3 여과(120)는 보툴리눔 독소 복합체로부터 NTH 및/또는 NTNH 단백질을 해리시킨다. 실시형태에서, 제3 여과(120)는 완충제 교환을 포함하며, 이는 제1 독소-함유 용리액(118)의 pH를 증가시킬 수 있다(예를 들어, 약 4.5에서 약 8.0으로). 실시형태에서, 완충액 교환은 독소-함유 용리액(118)에서 염 농도를 감소시킬 수 있다(예를 들어, 약 270mM에서 약 50mM로). 실시형태에서, 제3 여과(120)는 독소-함유 용리액(118)을 (예를 들어, 약 300mL에서 약 50-60mL로 그 부피를 감소시킴으로써) 농축할 수 있다.

제3 여과(120)는 임의의 적합한 여과 기술(예를 들어, 정용여과, 접선 유동 미세여과, 접선 유동 한외여과, 중공사 여과, 등)을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 제3 여과(120)는 해리된 보툴리눔 독소 분자(150kDa) 및 NTH 및/또는 NTNH 단백질을 보유하기에 적합한 기공 크기를 갖는 접선 유동 필터(예를 들어, 중공사 필터)를 사용하는 한외여과를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 필터는 약 150kDa 이하, 약 140kDa 이하, 약 130kDa 이하, 약 120kDa 이하, 약 110kDa 이하, 약 100kDa 이하, 약 90kDa 이하, 약 80kDa 이하, 약 70kDa 이하, 약 60kDa 이하, 약 50kDa 이하, 약 40kDa 이하, 약 30kDa 이하kDa, 또는 약 20kDa 이하 (또는 그 사이의 범위)의 기공 크기를 가질 수 있다. 예를 들어, 접선 유동 필터는 약 20kDa, 약 25kDa, 약 30kDa, 약 35kDa, 약 40kDa, 약 45kDa, 약 50kDa, 약 55kDa, 약 60kDa, 약 65kDa, 약 70kDa, 약 75kDa, 약 80kDa, 약 85kDa, 약 90kDa, 약 95kDa, 약 100kDa, 약 110kDa, 약 120kDa, 약 130kDa, 약 140kDa, 또는 약 150kDa 또는 그 사이의 값의 기공 크기를 가질 수 있다. 일 실시형태에서, 필터는 약 30kDa의 기공 크기를 갖는다.

일부 실시형태에서, 독소-함유 용리액(118)은 한외여과에 의해 농축될 수 있고, 그 다음 완충 용액에 대한 정용여과를 사용하여 세정되어 보툴리눔 독소 복합체로부터 NTH 및/또는 NTNH 단백질을 해리할 수 있다. 특정 실시형태에서, 보툴리눔 독소 단백질 분자 및 NTH 및/또는 NTNH 단백질은 잔류물(121)(즉, 독소-함유 잔류물)에 남을 수 있는 반면, 다른 여과 및 크로마토그래피 매질 잔류물은 투과물로 분리된다.

제3 여과(120)에 사용되는 완충 용액은 보툴리눔 독소 분자로부터 독소 복합체 내 NTH 및/또는 NTNH 단백질을 해리시키기 위한 임의의 적합한 완충 용액(예를 들어, Tris-HCl 완충액)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 제3 여과(120)에 사용되는 완충 용액은 제3 크로마토그래피 컬럼을 컨디셔닝하는 데 사용되는 동일한 완충액(예를 들어, 하기에 논의되는 바와 같이 pH가 7 초과인 트리스-HCl 완충액)일 수 있다.

일부 실시형태에서, 제3 여과(120)에 사용되는 완충 용액은 보툴리눔 독소 단백질 분자로부터 NTH 및/또는 NTNH 단백질을 해리하기에 적합한 pH를 갖는다. 일부 실시형태에서, 완충 용액의 pH는 적어도 약 7, 바람직하게는 약 7 내지 약 10, 바람직하게는 약 7 내지 약 9, 바람직하게는 약 7.5 내지 약 8.5, 바람직하게는 약 8.0이다. 일부 실시형태에서, 제3 여과(120)를 위한 완충 용액의 pH는 약 7.5, 약 7.6, 약 7.7, 약 7.8, 약 7.9, 약 8.0, 약 8.1, 약 8.2, 약 8.3, 약 8.4, 약 8.5, 약 8.6, 약 8.7, 약 8.8, 약 8.9, 약 9.0, 약 9.5, 또는 약 10.0일 수 있다. 일 실시형태에서, 제3 여과(120)를 위한 완충 용액의 pH는 약 8.0이다.

일부 실시형태에서, 제3 여과(120)로부터의 독소-함유 잔류물(121)은 정제 공정의 임의의 지점에서 용액으로부터 보툴리눔 독소 분자 또는 독소 복합체를 침전시키지 않고 후속 가공 단계에서 수집되고 추가로 정제될 수 있다. 유리하게는, 이는 전반적인 공정 수율을 향상시키고 정제 공정 동안 또는 최종 사용자에 의해 동결건조된 약품 생성물을 임의의 시점에서 재구성할 필요성을 제거한다.

제3 크로마토그래피 분리

방법(100)의 일부 실시형태는 보툴리눔 독소 단백질 분자를 유지하면서 선행하는 제3 여과(120) 동안 독소 복합체로부터 해리된 NTH 및/또는 NTNH 단백질을 분리 및 제거하기 위한 제3 크로마토그래피 분리(124)를 추가로 포함한다. 생성된 제2 독소-함유 용리액(126)은 유리 보툴리눔 독소 단백질 분자(~150kDa)를 포함할 수 있고 독소 복합체가 없거나, 본질적으로 없거나, 실질적으로 없을 수 있다. 제3 크로마토그래피 분리(124)는 임의의 적합한 크로마토그래피 분리 기술(예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피 - 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피를 포함함, 겔 여과 크로마토그래피, 고압 액체 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 등)을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 제3 크로마토그래피 분리(124)는 음이온 교환 크로마토그래피(AIEX)를 포함할 수 있다.

제3 크로마토그래피 분리(124)는 제3 여과(120)로부터의 독소-함유 잔류물(121) 내 보툴리눔 독소 또는 독소 복합체를 제3 크로마토그래피 컬럼과 접촉시키는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 독소-함유 잔류물(121) (및 그 안의 유리 보툴리눔 독소 단백질 분자)을 포함하는 이동상은 제3 정지상을 통해 이동한다. 제3 고정상은 임의의 적합한 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어, Q 세파로스 FF(GE Healthcare)와 같은 아가로스 비드-기반 매질)를 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 제3 크로마토그래피 분리(124)는 컬럼 크로마토그래피(예를 들어, 희석, 완충액 교환, 여과 또는 이의 조합에 의함)를 위해 제3 여과(120)로부터 독소-함유 잔류물(121)을 컨디셔닝하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 독소-함유 잔류물(121)은 7 초과, 바람직하게는 7 내지 10, 바람직하게는 약 7 내지 약 9, 바람직하게는 약 7.5 내지 약 8.5의 pH에서, 또는 바람직하게는 약 8.0의 pH에서 tris-HCl 완충액과 같은 완충 용액에서 희석될 수 있다. 일부 실시형태에서, 완충 용액의 pH는 약 7.5, 약 7.6, 약 7.7, 약 7.8, 약 7.9, 약 8.0, 약 8.1, 약 8.2, 약 8.3, 약 8.4, 약 8.5, 약 8.6, 약 8.7, 약 8.8, 약 8.9, 약 9.0, 약 9.5, 또는 약 10.0이다.

일부 실시형태에서, 독소-함유 잔류물(121) 내 보툴리눔 독소 단백질 분자, 독소 복합체, 및 NTH 및/또는 NTNH 단백질은 제3 정지상에 흡착될 수 있다. 일부 실시형태에서, 독소-함유 잔류물(121)은 제3 크로마토그래피 컬럼 상에 장입되고, 제3 고정상에 결합되지 않은 채로 남아 있는 비-독소 불순물을 제거하기 위해 세정 완충 용액으로 세정된다. 세정 완충액은 임의의 적합한 완충 용액(예를 들어, 20mM 트리스/HCl, 50mM NaCl, 0.2% 폴리소르베이트 20, pH 8.0)일 수 있고, A₂₈₀이, 모든 비-결합된 물질이 제3 크로마토그래피 컬럼을 통해 유동하였음을 나타내는 기준선 값에 도달할 때까지 컬럼을 통과하는 용액의 A₂₈₀을 모니터링할 수 있다.

제3 크로마토그래피 분리(124)는 제3 고정상에 결합된 보툴리눔 독소 단백질을 용리하여 제2 독소-함유 용리액(126)을 생성하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 용리는 보툴리눔 독소 단백질 분자를 적절한 단백질-호환성 완충 용액을 사용하여 (예를 들어, pH, 이온 강도 등을 변경함에 의해) 고정상으로부터 탈착시키기 위해 하나 이상의 완충 용액으로 컬럼을 세정하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 보툴리눔 독소 분자는 7 초과, 바람직하게는 7 내지 10, 바람직하게는 약 7 내지 약 9, 바람직하게는 약 7.5 내지 약 8.5의 pH에서, 또는 바람직하게는 약 8.0의 pH에서 트리스-HCl 완충 용액을 사용하여 제3 고정상으로부터 용리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 완충 용액의 pH는 약 7.5, 약 7.6, 약 7.7, 약 7.8, 약 7.9, 약 8.0, 약 8.1, 약 8.2, 약 8.3, 약 8.4, 또는 약 8.5이다.

일부 실시형태에서, 제3 크로마토그래피 컬럼으로부터 보툴리눔 독소 분자를 용리하기 위해 사용된 완충 용액은 염(예를 들어, NaCl)을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제3 크로마토그래피 컬럼으로부터 보툴리눔 독소 분자를 용리하기 위해 사용된 완충 용액은 제3 정지상으로부터 보툴리눔 독소 분자의 탈착을 촉진하기에 적합한 농도로 NaCl을 함유한다. 실시형태에서, 이 용리 완충액은 NaCl을 약 25mM 내지 약 250mM, 바람직하게는 약 50mM 내지 약 200mM, 바람직하게는 약 100mM 내지 약 150mM, 바람직하게는 약 120mM의 농도로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제3 크로마토그래피 컬럼으로부터 보툴리눔 독소 분자를 용리하기 위해 사용된 용리 완충액은 NaCl을 약 50mM, 약 60mM, 약 70mM, 약 80mM, 약 90mM, 약 100mM, 약 110mM, 약 115mM, 약 120mM, 약 125mM, 약 130mM, 약 135mM, 약 140mM, 약 145mM, 약 150mM, 약 155mM, 약 160mM, 약 165mM, 약 170mM , 약 175mM, 약 180mM, 약 185mM, 약 190mM, 약 195mM, 약 200mM, 약 210mM, 약 220mM, 약 230mM, 약 240mM, 또는 약 250mM의 농도로 함유한다. 일 실시형태에서, 제3 크로마토그래피 컬럼으로부터 보툴리눔 독소 분자를 용리하기 위해 사용된 완충 용액은 약 120mM 또는 약 150mM에서의 NaCl을 함유한다.

일부 실시형태에서, 제3 크로마토그래피 컬럼으로부터 보툴리눔 독소 분자를 용리하기 위해 사용된 완충 용액은 계면활성제(예를 들어, 폴리소르베이트 20)를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제3 크로마토그래피 컬럼으로부터 보툴리눔 독소 분자를 용리하기 위해 사용된 완충 용액은 약 0.05 부피% 내지 약 1.0 부피%, 바람직하게는 약 0.10 부피% 내지 약 0.5 부피%, 바람직하게는 약 0.15 부피% 내지 약 0.25 부피%, 바람직하게는 약 0.20 부피%의 농도에서 계면활성제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제3 크로마토그래피 컬럼으로부터 보툴리눔 독소 분자를 용리하는데 사용된 완충 용액은 약 0.05 부피%, 약 0.10 부피%, 약 0.15 부피%, 약 0.20 부피%, 약 0.25 부피%, 약 0.30 부피%, 약 0.35 부피%, 약 0.40 부피%, 약 0.45 부피%, 약 0.50 부피%, 약 0.55 부피%, 약 0.60 부피%, 약 0.65 부피%, 약 0.70 부피%, 약 0.75 부피%, 약 0.80 부피%, 약 0.85 부피%, 약 0.90 부피% %, 약 0.95 부피%, 또는 약 1.0 부피%의 농도에서 계면활성제를 함유한다. 일 실시형태에서, 제3 크로마토그래피 컬럼으로부터 보툴리눔 독소 분자를 용리하기 위해 사용된 완충 용액은 약 0.20 부피%의 농도에서 폴리소르베이트 20을 함유한다.

특정 실시형태에서, 제2 독소-함유 분획물(126)은 이것이 컬럼으로부터 용리될 때 수집되고 보툴리눔 독소 단백질을 침전 또는 동결건조시키지 않고 후속 공정 단계에서 추가로 정제된다. 일 실시형태에서, 제2 독소-함유 분획물(126)은 최종 연마(즉, 표적 단백질의 응집체를 포함하는 고분자량 오염물 및 표적 단백질과 이전 정제 단계에서 제거되지 않을 수 있는 기타 불순물의 분획을 포함하는 저분자량 오염물 제거)를 위해 제4 크로마토그래피 컬럼 상으로 직접적으로 주입된다.

제4 크로마토그래피 분리

방법(100)의 일부 실시형태는 제3 독소-함유 용리액(130)을 생성하기 위해 제4 크로마토그래피 분리(128)를 사용하여 제2 독소-함유 분획물(126)으로부터 응집체 및/또는 단백질 불순물을 제거하기 위한 최종 연마 단계를 추가로 포함한다. 제4 크로마토그래피 분리(128)는 임의의 적절한 크로마토그래피 분리 기술(예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피 - 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피 포함, 겔 여과 크로마토그래피, 고압 액체 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 등)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 제4 크로마토그래피 분리(128)는 겔 여과 크로마토그래피를 포함할 수 있다.

제4 크로마토그래피 분리(128)는 응집된 보툴리눔 독소 및 기타 단백질 불순물로부터 순수한 보툴리눔 독소 단백질 분자를 분리할 수 있는 임의의 적절한 단백질-적합성 크로마토그래피 매트릭스를 사용할 수 있다. 예를 들어, 제4 크로마토그래피 분리(128)는 슈퍼덱스 200 크로마토그래피 매질(GE Healthcare)을 사용할 수 있다.

제4 크로마토그래피 분리(128)는 (예를 들어, 희석, 완충액 교환, 여과, 또는 이의 조합에 의한) 컬럼 크로마토그래피를 위해 제2 독소-함유 용리액(126)을 컨디셔닝하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 특정 실시형태에서, 제3 크로마토그래피 분리(124)로부터의 제2 독소-함유 용리액(126)은 추가 컨디셔닝 없이 제4 크로마토그래피 컬럼 상에 직접적으로 주입될 수 있다. 이 구성에서, 제3 및 제4 크로마토그래피 컬럼은 제2 독소-함유 용리액(126)의 직접 장입을 허용하도록 상호연결될 수 있다.

제4 크로마토그래피 분리(128)는 제3 독소-함유 용리액(130)을 제공하기 위해 세정 용액 또는 완충제를 사용하여 고정상을 통해 보툴리눔 독소 분자를 세정하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 완충 용액은 임의의 적절한 단백질-적합성 완충액일 수 있다. 특정 실시형태에서, 완충 용액은 약 7 미만, 바람직하게는 약 5 내지 약 7, 바람직하게는 약 6 내지 약 7, 바람직하게는 약 6.6 내지 약 6.9의 pH에서 아세트산-아세테이트 완충 용액일 수 있다. 일부 실시형태에서, 이 완충 용액의 pH는 약 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9, 또는 약 7.0일 수 있다.

일부 실시형태에서, 제4 크로마토그래피 컬럼에서 고정상을 통해 보툴리눔 독소 분자를 세정하는데 사용되는 완충 용액은 염(예를 들어, NaCl)을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 이 세정 완충액은 NaCl을 약 100mM 내지 약 1M, 바람직하게는 약 200mM 내지 약 600mM, 보다 바람직하게는 약 300mM 내지 약 500mM, 가장 바람직하게는 약 400mM의 농도로 함유한다. 일부 실시형태에서, 이 완충 용액은 NaCl을 약 100mM, 약 150mM, 약 200mM, 약 250mM, 약 300mM, 약 310mM, 약 320mM, 약 330mM, 약 340mM, 약 350mM, 약 360mM, 약 370mM, 약 380mM, 약 390mM, 약 400mM, 약 410mM, 약 420mM, 약 430mM, 약 440mM, 약 450mM, 약 500mM, 약 550mM, 약 600mM, 약 650mM, 약 700mM, 약 750mM, 약 800mM, 약 850mM, 약 900mM, 약 950mM, 또는 약 1M의 농도로 함유한다. 일 실시형태에서, 제4 크로마토그래피 컬럼에서 고정상을 통해 보툴리눔 독소를 세정하는데 사용되는 완충 용액은 약 350mM NaCl 또는 약 370mM NaCl을 포함한다.

일부 실시형태에서, 제4 크로마토그래피 컬럼의 정지상을 통해 보툴리눔 독소 분자를 세정하는데 사용되는 완충 용액은 계면활성제(예를 들어, 폴리소르베이트 20)를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 이 완충 용액은 계면활성제를 약 0.05 부피% 내지 약 1.0 부피%, 바람직하게는 약 0.10 부피% 내지 약 0.5 부피%, 바람직하게는 약 0.15 부피% 내지 약 0.25 부피%, 바람직하게는 약 0.20 부피%의 농도로 함유한다. 일부 실시형태에서, 이 완충 용액은 계면활성제를 약 0.05 부피%, 약 0.10 부피%, 약 0.15 부피%, 약 0.20 부피%, 약 0.25 부피%, 약 0.30 부피%, 약 0.35 부피%, 약 0.40 부피%, 약 0.45 부피%, 약 0.50 부피%, 약 0.55 부피%, 약 0.60 부피%, 약 0.65 부피%, 약 0.70 부피%, 약 0.75 부피%, 약 0.80 부피%, 약 0.85 부피%, 약 0.90 부피%, 약 0.95 부피%, 또는 약 1.0 부피%의 농도로 함유한다. 일 실시형태에서, 제4 크로마토그래피 컬럼의 정지상을 통해 보툴리눔 독소 분자를 세정하는데 사용되는 완충 용액은 약 0.20 부피%의 농도로 폴리소르베이트 20을 함유한다.

일부 실시형태에서, 컬럼을 통과하는 용액 내 유리 보툴리눔 독소 분자의 존재는 A₂₈₀에 의해 모니터링된다. 일 실시형태에서, A₂₈₀ 피크(유리 보툴리눔 독소 분자의 존재를 나타냄)는 단일 분획으로 수집되어 제3 독소-함유 용리액(130)을 생성한다.

일부 실시형태에서, 제3 독소-함유 용리액(130)은 제4 크로마토그래피 컬럼으로부터 용리될 때 수집될 수 있고 보툴리눔 독소 단백질을 침전 또는 동결건조하지 않고 후속 공정 단계에서 희석되거나 추가로 정제된다. 일부 실시형태에서, 제3 독소-함유 용리액(130)은 정제-후 가공까지 대략 2-8℃에서 저장될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제3 독소-함유 용리액(130)은 희석, 여과 및 분배되어 생성물 독소 용액(134)을 제공할 수 있다.

희석, 여과 및 분배

일부 실시형태에서, 방법(100)은 생성물 독소 용액(134)을 제공하기 위해 제3 독소-함유 용리액(130)을 희석, 여과 및 분배하는 것(132)을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제3 독소-함유 용리액(130)은 임의의 적절한 완충 용액을 사용하여 최종 농도로 희석될 수 있다. 일부 실시형태에서, 희석제 완충 용액은 제4 크로마토그래피 분리(128)에 사용된 세정 완충액과 조성이 대략 동일할 수 있다. 예를 들어, 희석제 완충 용액은 약 7 미만, 바람직하게는 약 5 내지 약 7, 바람직하게는 약 6 내지 약 7, 바람직하게는 약 6.6 내지 약 6.9의 pH에서 아세트산-아세테이트 완충액을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이 완충 용액의 pH는 약 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9, 또는 약 7.0이다.

방법(100)은 바이오버든을 감소시키고 생성물 독소 용액(134)을 제공하기 위해 제3 독소-함유 용리액(130)(또는 그의 희석된 형태)을 여과하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 제3 독소-함유 용리액(130)을 여과하는 것은 임의의 적절한 여과 기술(예를 들어, 정용여과, 접선 유동 미세여과, 접선 유동 한외여과, 중공사 여과, 등)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 필터는 0.1μm 내지 10μm(예를 들어, 대략 0.2μm)의 기공 크기를 가질 수 있다.

생성물 독소 용액(134)은 용기(예를 들어, 극저온 바이알)에 분배될 수 있으며, 용기는 그 안의 보툴리눔 독소 단백질의 효능을 보존하는 조건 하에 운송 및 저장될 수 있다. 예를 들어, 생성물 독소 용액(134)은 사전-냉각된 저장 용기 내(예를 들어, 사전-냉각된 알루미늄 블록에 함유된 바이알 내)로 분배, 운송 및/또는 저장될 수 있다.

일부 실시형태에서, 생성물 독소 용액 (134)을 분배하는 것은 생성물 독소 용액을 멸균 용기(예를 들어, 멸균 단일-사용 백)로부터 일차 저장 용기(예를 들어, 극저온 바이알)로 펌핑하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 일차 저장 용기는 예를 들어 사전-냉각된 알루미늄 블록에 일차 저장 용기를 저장, 운송 및 동결함에 의해 사전-냉각되고 적절한 온도(예를 들어, 0℃ 이하)에서 유지될 수 있다. 이것은 보툴리눔 독소 분자가 안정하고 그 신경독성을 보유하는 온도에서 생성물 독소 용액(134)을 유지한다. 그것은 또한 생성물 독소 용액(134)을 동결건조할 필요를 제거할 수 있다. 생성물 독소 용액(134)은 추가로 대략 0℃ 이하, 바람직하게는 대략 -70℃ 이하의 온도에서 저장될 수 있다.

공정 수율

전체 공정 수율 및 각 단계에 대한 수율을 계산하여 정제 공정을 평가할 수 있다. 수율은 각 분획에서 수득된 독소 농도로부터 계산할 수 있다. 각 공정 단계에 대한 수율(즉, "공정 단계 수율")은 다음 공식에 따라 계산할 수 있다:

, (식 1)

여기서 C는 독소 농도, V는 부피, 아래첨자 분획은 현재 가공 단계로부터의 독소 농도 또는 부피를 나타내고, 아래첨자 이전 분획은 이전 가공 단계로부터의 독소 농도 또는 부피를 나타낸다. 예를 들어, 공정 단계에서 1000mL의 부피에서 1.0μg/mL의 독소가 생성되고 이전 공정 단계에서 4000mL의 부피에서 0.5μg/mL의 독소가 생성되는 경우, 공정 단계 수율은 50%가 된다. ([1.0μg/mL × 1000mL] / [0.5μg/mL × 4000mL]) × 100 = 50%.)

총 수율은 다음 공식을 사용하여 계산할 수 있다:

, (식 2)

여기서 C는 농도, V는 부피, 아래첨자 DS는 약물 물질(즉, 생성물 독소 용액)을 나타내고, 아래첨자 KS는 0.2-μm 필터를 통해 여과함에 의해 제거된 세포와 함께 수확 시 배양물을 나타낸다. 예를 들어, DS에 100mL의 부피에 50μg/mL의 독소가 함유되어 있고 수확 시 배양물에 5000mL의 부피에 5μg/mL의 독소가 함유되어 있는 경우, 총 수율은 20%가 된다. ([50μg/mL × 100mL] / [5μg/mL × 5000mL]) × 100 = 20%.)

일부 실시형태에서, 총 수율은 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 또는 그 사이의 임의의 범위 또는 값이다. 일부 실시형태에서, 총 수율은 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 약 35%, 약 36%, 약 37%, 약 38%, 약 39%, 또는 약 40%, 또는 그 사이의 임의의 값이다.

일 실시형태에서, 약물 물질의 순도는 SDS-PAGE 및/또는 HPLC-SEC로부터 결정될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 방법으로부터 수득된 약물 물질은 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% (및 그 사이의 범위)의 순도를 갖는다. 일 실시형태에서, 약물 물질은 약 96.0%, 약 96.5%, 약 97.0%, 약 97.5%, 약 98.0%, 약 98.5%, 약 99.0%, 약 99.5%, 또는 약 100.0%, 또는 그 사이의 임의의 값의 순도를 가질 수 있다.

실시예

실시예 1: 보툴리눔 독소를 정제하기 위한 4-컬럼 크로마토그래피 방법

예로써, 방법의 일 실시형태는 하기 설명에 따라 수행될 수 있으며, 여기서 보툴리눔 독소 A1(~150kDa)은 C. 보툴리눔 세포를 포함하는 동물 생성물 및 보툴리눔 독소 A1 단백질 분자와 독소 복합체가 실질적으로 없거나, 본질적으로 없거나, 또는 없는 발효 배지로부터 회수된다. 하나의 그러한 APF 발효 배지가 동시-계류 중인 미국 가특허 출원 번호 62/951,549에 기술되어 있다. 그기에서의 보툴리눔 독소는 임의의 침전 또는 동결건조 단계의 사용 없이, 독소 복합체가 없거나, 본질적으로 없거나, 또는 실질적으로 없는 보툴리눔 독소 단백질 분자를 포함하는 생성물 독소 용액을 생성하기 위해 하기에 보다 상세하게 기술된 공정 단계에 따라 여과되고 정제된다.

완충액 준비

표 1에 도시된 바와 같이, 다수의 상이한 완충 용액이 이 방법의 실시형태에서 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 완충액은 0.2-μm 필터를 통해 (바이오버든을 줄이기 위해) 멸균된 단일-사용 백으로 통과된다. 사용된 필터는 분리되고 완충액을 함유하는 백은 사용할 때까지 실온에서 보관된다.

[표 1]. BoNT/A1 정제 공정에 사용된 완충 용액

표 1에서, 완충액 1 및 2는 제1 크로마토그래피 컬럼을 평형화하기 위해 사용되었고; 완충액 3은 컬럼 크로마토그래피를 위해 정화된 배양물을 컨디셔닝하기 위해 사용되었고; 완충액 4는 보툴리눔 독소 복합체를 관류 방식에서 제1 컬럼을 통해 세정하기 위해 사용되었고; 완충액 5 및 6은 제2 크로마토그래피 컬럼을 평형화하기 위해 사용되었고; 완충액 7은 제2 크로마토그래피 분리를 위해 제1 크로마토그래피 분리로부터 독소-함유 분획물을 컨디셔닝하기 위해 사용되었고; 완충액 8은 제2 크로마토그래피 컬럼을 통해 벌크 불순물(예를 들어, 단백질)을 세정하기 위해 사용되었고; 완충액 9는 제2 크로마토그래피 컬럼으로부터 결합된 보툴리눔 독소 복합체를 용리하기 위해 사용되었고; 완충액 10은 보툴리눔 독소 단백질 분자로부터 NTH 및/또는 NTNH 단백질을 분리(즉, 제3 크로마토그래피 분리를 위해 제2 크로마토그래피 분리로부터 제1 독소-함유 용리액을 컨디셔닝)하기 위해 사용되었고; 완충액 11 및 12는 제3 크로마토그래피 컬럼을 평형화하기 위해 사용되었고; 완충액 13은 제3 크로마토그래피 컬럼에서 불순물을 세정하기 위해 사용되었고; 완충액 14는 결합된 보툴리눔 독소 단백질 분자를 제3 크로마토그래피 컬럼에서 용리시키기하기 위해 사용되었고; 완충액 15는 제4 크로마토그래피 컬럼을 평형화하기 위해 사용되었고; 완충액 16은 제4 크로마토그래피 컬럼을 통해 보툴리눔 독소 분자를 세정하기 위해 사용되었고; 그리고 완충액 17은 생성물 독소 용액을 제공하기 위해 그것을 일차 저장 용기에 분배하기 전에 제4 크로마토그래피 분리로부터 독소-함유 용리액을 그 최종 농도로 희석하기 위해 사용되었다.

여과

C. 보툴리눔 발효 배지는 동시-계류 중인 미국 가특허 출원 번호 62/951,549에 기재된 APF 생산 공정으로부터 수득되었다. 수확 직후, 배양물(대략 5L)을 여과 직전에 pH 조정을 위해 대략 280mL의 완충 용액(1M 아세트산나트륨, 4M NaCl, pH 5.5)을 사용하여 희석하였다. 희석된 용액을 접선 유동 여과에 의해 0.2-μm 중공사 필터를 사용하는 정밀여과("여과 1")에 의해 여과하여 포자뿐만 아니라 전체 및 용해된 C. 보툴리눔 세포를 분리하여 정화된 배양물을 제공했다. C. 보툴리눔의 부재에 대한 공정-내 제어를 위해 정화된 배양물을 샘플링했다. 그 다음 정화된 배양물을 50kDa 중공사 필터를 사용하여 접선 유동 한외여과("여과 2")에 의해 발효 배지 잔류물(예를 들어, 단백질, 탄수화물, 등)을 제거함에 의해 정제했다. 그 다음 정화된 배양물을 인산나트륨 완충액(pH 대략 6.1)에서 완충액 교환하여 컬럼 크로마토그래피를 위해 정화된 배양물을 컨디셔닝했다. 이것과 기타 적합한 단백질 여과 공정은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Munir Cheryan, Ultrafiltration and Microfiltration Handbook (2d ed. 1998) 참고.

정제

임의의 침전, 동결건조 단계 또는 원심분리 단계를 사용함이 없이 BoNT/A1 단백질 분자(~150kDa)를 정제하기 위한 4-컬럼 크로마토그래피 공정이 개발되었다. 이 공정은 보툴리눔 독소 복합체 및/또는 동물 생성물이 없거나, 본질적으로 없거나, 실질적으로 없는 생성물 독소 용액을 제공한다. 이것은 수율을 증진시키고 보툴리눔 독소 약물 조성물의 효능을 감소시키는 것으로 알려진 재구성 절차와 연관된 최종 사용자 오류를 제거한다.

공정은 프로테아제 및 기타 벌크 오염 단백질이 제거되는 동안 독소를 보호하기 위한 초기 단계를 통해 보툴리눔 독소 복합체의 이점을 이용한다. 음이온 교환 크로마토그래피인 제1 크로마토그래피 단계는, 그렇지 않으면 다운스트림 크로마토그래피 단계를 방해하는, 수확 시 배양 배지에서 대부분의 핵산을 제거한다. 이것은 정제 과정 동안 보툴리눔 독소 분자의 변성을 억제한다. 그런 다음 공정은 보툴리눔 독소 단백질 분자를 그의 연관된 NTH 및/또는 NTNH 단백질로부터 분리하여 순수한 보툴리눔 독소 분자(~150kDa)를 포함하고 보툴리눔 독소 복합체가 없거나, 본질적으로 없거나, 실질적으로 없는 생성물 독소 용액을 제공한다.

부가적으로, 이 공정에 사용된 모든 크로마토그래피 단계는 1회 정제 절차 후에 폐기가능한 단일-사용 크로마토그래피 컬럼 상에서 수행되도록 설계되었다. 이는 다중-사용 크로마토그래피 시스템에서 직면하는 비용과 시간이 많이 소요되는 컬럼 재생 단계를 제거한다. 전체 공정은 단일-사용 백, 튜빙, 필터 및 크로마토그래피 컬럼을 이용하는 폐쇄 시스템을 사용하여 수행된다. 더욱이, 공정 유체가 바람직하게는 백, 튜빙, 필터 또는 컬럼 내에서 유지되기 때문에 개방 처리 단계를 피하여, 생성물 독소 용액을 오염으로부터 보호하고 작업자가 독소에 노출되는 것을 방지한다.

표 2는 본 개시내용에 따른 BoNT/A1에 대한 4-컬럼 크로마토그래피 정제 방법을 요약한다. 공정은 다음 단계를 포함한다:

(1) 정화된 배양액을 인산나트륨 완충액(pH 6.1)을 사용하여 관류 방식에서 Q 세파로스 FF 컬럼(직경 80mm 및 높이 500mm를 갖는 컬럼에 2.5L 충진)에 직접적으로 주입하여 핵산으로부터 보툴리눔 독소 복합체를 분리했다. 이 단계에서, 보툴리눔 독소 복합체는 정지상에 결합하지 않고 대신 독소-함유 분획물의 컬럼을 통해 유동했다.

(2) Q 세파로스 FF 컬럼(직경 50mm 및 높이 50mm를 갖는 컬럼에 충진된 100mL)으로부터 독소-함유 분획물을 아세트산나트륨 완충액(pH 4.5)에서 컨디셔닝하고 아세트산나트륨 완충액(pH 4.5)을 사용한 SP 세파로스 FF 컬럼에 통과시켰다. 이 단계에서, 보툴리눔 독소 복합체가 고정상에 흡착한 반면 벌크 불순물(예를 들어, 다른 단백질)은 컬럼을 통해 세정되었다. 컬럼에 결합된 독소 복합체는 NaCl을 함유하는 아세트산나트륨 완충액(pH 4.5)을 사용하여 용리되었고 제1 독소-함유 용리액에 수집되었다.

(3) 제1 독소-함유 용리액을 여과하여 발효 배지 잔류물을 제거하고 30kDa 필터를 사용하여 완충액 교환(tris-HCl 완충액, pH 8.0)을 위해 접선 유동 한외여과("여과 3")에 의해 적절한 완충 용액에서 컨디셔닝하여 독소 복합체에서의 NTH 및/또는 NTNH 단백질로부터 보툴리눔 독소 분자를 해리하였다. 그 다음 잔류물을 Q 세파로스 FF 컬럼(직경 5mm, 높이 100mm를 갖는 컬럼에 충진된 2mL)에 통과시켜 NTH 및/또는 NTNH 단백질로부터 유리 보툴리눔 독소 단백질을 분리했다. 이 단계에서, 보툴리눔 독소 분자는 고정상에 흡착된 반면 NTH 및/또는 NTNH 단백질 (및 기타 벌크 불순물)은 컬럼을 통해 어느 정도 세정되었다 (그러나 주로 보툴리눔 독소 분자보다 고정상에 훨씬 더 강하게 흡착되었다). 보툴리눔 독소 단백질은 NaCl을 함유하는 tris-HCl 완충액(pH 8.0)을 사용하여 용리되었고 제2 독소-함유 용리액에 수집되었다.

(4) 제2 독소-함유 용리액은 최종 연마(즉, 응집체의 제거)를 위해 슈퍼덱스 200 겔 여과 컬럼(직경 25mm, 높이 600mm를 갖는 컬럼에 충진된 320mL)에 직접적으로 주입하였다. 이 단계에서, 컬럼은 50mM Na 아세테이트, 370mM NaCl, 0.2% 폴리소르베이트 20, 13mM Na₂HPO₄ 및 17mM NaOH(pH 6.6-6.9)를 함유하는 완충액으로 세정하고 정제된 보툴리눔 독소 단백질을 제3 독소-함유 용리액에 수집하였다.

[표 2]. BoNT/A1 정제 공정에서 컬럼 크로마토그래피 단계의 요약

상기 논의된 각각의 컬럼 크로마토그래피 단계는 크로마토그래피 분리를 수행하기 이전에 제자리-세정 절차 및 기타 컬럼 준비 단계를 포함할 수 있다. 컬럼 준비 및 작업 절차는 당업계에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 예를 들어, Ozutsumi et al., 49 Appl. Envtl. Microbiol. 939 (1985); GE Healthcare, Strategies for Protein Purification Handbook (2010); Schmidt et al., 156 Anal. Biochem. 213 (1986); Simpson et al., 165 Methods Enzymol. 76 (1988); Zhou et al., 34 Biochem. 15175 (1995); Kannan et al., 15 Mov. Disord. 20 (2000); Wang Y-c, Dermatol. Las Facial Cosmet. Surg. 58 (2002); Johnson et al., 32 Protein Expr. & Purif. 1 (2003); US 2003/0008367 A1 참고.

희석/여과/분배

정제된 보툴리눔 독소 단백질을 적절한 완충 용액(예를 들어, 50mM 아세트산나트륨, 0.2% 폴리소르베이트 20, 370mM NaCl, 13mM 인산나트륨, 17mM NaOH)에서 그 최종 농도로 희석하고 약 30분 동안 플랫폼 로커 상에서 부드럽게 혼합하였다. 희석된 생성물을 0.2μm 필터를 사용하여 멸균-단일 사용 백 안으로 여과하고 분배 펌프와 바늘을 사용하여 1.8-mL 극저온 바이알 안으로 0.4mL 분취량으로 분배했다. 그런 다음 샘플은 < -70℃에서 보관된 사전-냉각된 알루미늄 블록을 사용하여 신속하게 동결되었다. 방법에 따라 보관을 위해 제조된 최종 용액은 이하 본 명세서에서 "약물 물질"(또는 "DS")로 지칭된다.

3개의 상이한 약물 물질 로트를 상기 개괄된 단계에 따라 제조하였다: #16852, #17043, 및 #19139. 그 다음 DS 로트를 다음의 실시예에서 논의된 바와 같이 외관, 효능, 비활성 및 총 단백질 농도에 대해 시험하였다.

실시예 2: 외관 시험

용액에서의 유백색이 단백질의 응집 또는 침전을 나타낼 수 있기 때문에, 투명도 및 색상을 시험하여 약물 물질이 투명하고 색상이 없는지 확인한다. 방법은 "액체의 투명도 및 유백색 정도"의 표제인, Ph. Eur. 2.2.1, 및 "액체의 착색 정도"의 표제인, Ph. Eur. 2.2.2를 기반으로 하지만, 약전 방법에 지정된 용기 및 부피 대신 약물 물질에 대한 바이알 및 부피를 사용하는 변형을 갖는 시각적 방법이다. 물은 참조 용액으로 사용된다.

이 방법에 의해, 실시예 1에 따라 제조된 약물 물질 로트는 모두 투명하고 무색의 용액이었으며, 이는 보툴리눔 독소 단백질 분자의 검출가능한 응집 또는 침전이 없음을 나타낸다.

실시예 3: 효능(potency)

실시예 1에서 수득된 정제된 약물 물질의 효능은 마우스 LD₅₀ 검정을 사용하여 결정되었다. 이것은 시험된 샘플 내에서 효능을 정량적으로 측정하는 절대 검정이다. 젤라틴-포스페이트 완충액을 희석제로 사용하고 목표 LD₅₀ 값을 중심으로 11개의 용량 그룹을 설정한다. 용량당 3.0 - 0.4 단위 사이의 효능을 갖는 용량 그룹은 대략 0.0899 로그 간격으로 균등하게 이격된다. 주사 72시간 후 사망률이 기록되고 Spearman-Karber 방법을 사용하여 LD₅₀이 계산된다. Spearman-Karber 계산은 사망에 대한 로그 희석 곡선의 중간-점(LD₅₀)을 결정하는 수학적 수단으로 사용된다. 정제된 약물 물질의 효능은 LD₅₀ 단위/mL로 표시된다. 예를 들어, M.A. Ramakrishnan, Determination of 50% Endpoint Titer Using a Simple Formula, 5 WORLD J. VIROL. 85-86 (2016) 참고; 또한 G. Karber, 162 PATHOL. U PHARMAKOL. 480-83 (131); C. Spearman, The Method of "Right and Wrong Cases"(Constant Stimuli) Without Gauss's Formula, 2 Br. J. Psychol. 227-42 (1908) 참고.

정제된 약물 물질 로트 #16852, #17043 및 #19139는 각각 11 x 10⁶ LD₅₀ 단위/mL, 23 x 10⁶ LD₅₀ 단위/mL 및 19 x 10⁶ LD₅₀ 단위/mL의 효능 값을 보여주었다. 이들 효능 값은 생산된 DS의 부피와 조합하여, 공정 수율이 DS 로트로부터 생산되는 많은 수의 약물 생성물 용량에 충분하다는 것을 확인시켜주며, 이는 상업적인 DS 생산에 바람직하다.

실시예 4: 총 단백질 농도

실시예 1에 따라 제조된 약물 물질에 대한 총 단백질 농도는 실시예 1에 따라 제조된 전형적인 약물 물질 로트에서 단백질 농도를 결정할 수 있을 만큼 충분히 높은 민감도를 가지므로 비신코닌산(BCA) 방법에 따라 결정되었다. Ph. Eur. 2.5.33 방법 4 참고; 또한 USP <507> 방법 II 참고.

마이크로 BCA 단백질 검정 키트를 사용하여 총 단백질 농도를 측정하고, 소 혈청 알부민을 이용한 표준 곡선을 사용하여 측정된 흡광도로부터 단백질의 농도를 계산한다. 결과는 중복 샘플 측정의 평균값으로 보고된다.

정제된 약물 물질 로트 #16852, #17043 및 #19139의 경우, 총 단백질 농도는 각각 59.4μg/mL, 107.0μg/mL 및 91.4μg/mL인 것으로 결정되었다. DS 로트에 대해 수득된 이들 단백질 농도 값은 방출 및 특성화를 위한 분석 방법이 정밀하고 정확함을 보장할 만큼 충분히 높다.

실시예 5: 비활성(specific activity)

실시예 1에 따라 생산된 약물 물질의 경우, 비활성은 LD₅₀ 검정(실시예 3)에 의해 얻은, 단위/mL 단위로 약물 물질에 대한 효능 값 및 mg/mL 단위로 약물 물질에 대한 총 단백질 농도(실시예 4)로부터 계산된다. 비활성은 다음 공식에 따라 계산된다:

(식 3)

정제된 약물 물질 로트 #16852, #17043 및 #19139의 경우, 비활성은 각각 1.9 x 10⁸ U/mg, 2.2 x 10⁸ U/mg 및 2.1 x 10⁸ U/mg인 것으로 결정되었다. 이것은 DS에 대한 높은 정도의 순도를 확인하며, 이는 공정이 고도로 정제되고 완전히 활성인 복합체-유리 보툴리눔 독소의 상업적 생산에 적합함을 나타낸다.

실시예 6: 단백질-관련된 불순물

실시예 1에 따라 제조된 약물 물질의 단백질-관련된 불순물의 측정에 사용된 방법은 "나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) - 균일한 백분율 겔"의 표제인, Ph. Eur. 2.2.31에 기술된 원리에 기반한다. 이 방법에서는 콜로이드 쿠마시 블루 염색과 조합하여 SDS-PAGE가 사용된다. 샘플을 희석하여 표준 곡선이 준비된다; 비-환원된 샘플 및 환원된 샘플 둘 모두 분석된다. 불순물 밴드의 밴드 강도를 표준 곡선과 관련함에 의해 농도계측을 사용하여 불순물이 정량화된다. 불순물 결과는 겔 상에 장입된 총 단백질 양의 백분율로 표시된다.

도 2는 SDS-PAGE 및 콜로이드 쿠마시 블루 염색을 사용하여 수득된, 실시예 1에 따라 제조된 DS 로트 #17043의 순도의 분석으로부터의 결과를 나타낸다. 왼쪽으로부터 오른쪽으로 레인은 다음과 같다: 1-5: 로트 #17043으로부터 표준 곡선의 비-환원된 샘플(1.2 - 4.0μg/mL); 6-7: 비-환원된 로트 #17043 복제 1 및 2(140μg/mL); 8: 분자량 마커; 및 9-10: 환원된 로트 #17043 복제 1 및 2(140μg/mL). 실시예 1에 따라 제조된 3개 약물 물질 로트 모두에 대해, 단백질-관련된 불순물은 <6.0%였고, 특히 로트 #16852는 검출가능한 불순물을 나타내지 않았다.

실시예 7: 잔류 핵산

실시예 1에 따라 제조된 약물 물질에서 RNA 및/또는 DNA를 검출하기 위하여 잔류 핵산에 대한 한계 시험을 수행하였다. 방법은 상업적으로 이용가능한 RiboGreen RNA 정량 키트를 사용한다. RiboGreen은 핵산에 결합하여 샘플에서 핵산의 양에 비례하는 형광 신호를 생성한다. DNA는 RiboGreen에 결합할 때 RNA보다 더 높은 신호를 생성하므로 RNA를 함유하는 표준을 사용하면 DNA 함유 샘플의 핵산 함량이 과대평가되어 보고된 핵산 값이 샘플에서 핵산의 최대 양이 된다.

정제된 약물 물질 로트 #16852, #17043, 및 #19139를 0.15μg/mL RNA에서 가장 낮은 표준 샘플을 갖는 참조 표준 곡선과 비교하였다. 3개 로트 모두는 ≤0.15μg/mL의 잔류 핵산에 상응하는, 표준보다 낮은 샘플 형광을 나타냈다(데이터는 표시되지 않음).

실시예 8: 단백질 프로파일

단백질 프로파일의 측정에 사용된 방법은 "나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) - 균일한 백분율 겔"의 표제인, Ph. Eur. 2.2.31에 기술된 원리에 기반한다. 정제된 약물 물질 로트 #16852, #17043 및 #19139를 4-12% Bis-Tris 겔에서 분석하여 구성 단백질을 분리하고 은 염색(SilverQuest 염색 키트)을 사용하여 염색하였다. 도 3은 분자량 마커(1 및 10)와 비교하여 환원된(레인 6-9) 및 비환원된(레인 2-5) 약물 물질 샘플에 대한 SDS-PAGE 결과를 나타낸다. 레인 3과 7은 로트 #16852에 해당하고; 레인 4와 8은 로트 #17043에 해당하고; 그리고 레인 5와 9는 로트 #19139에 해당한다. (레인 2와 6은 약간 다른 공정 매개변수(예를 들어, 제1 크로마토그래피 분리에서 완충액에 대해 약간 더 높은 pH)를 사용하여 4-컬럼 크로마토그래피 공정에 따라 제조된 약물 물질 로트(#1014997)에 대한 결과를 나타낸다).

정제된 약물 물질 로트 #1014997, #16852, #17043, 및 #19139는 대략 150kDa(각각 레인 2, 3, 4 및 5)의 강한 밴드를 갖는 필적하는 단백질 프로파일을 나타내며, 이는 일차 단백질 성분이 유리 BoNT/A임을 나타낸다. 레인 6, 7, 8 및 9에서의 환원된 샘플은 각각 BoNT/A의 중쇄 및 경쇄에 상응하는 대략 100kDa 및 150kDa에서 2가지 주요 단백질 성분을 나타낸다.

실시예 9: 약물 물질의 분자량 분포

크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 약물 물질 성분의 분자량 크기 분포를 모니터링하였다. 방법은 생성물 독소와 공정- 또는 생성물-관련될 수 있는 임의의 고-분자량 및 저-분자량 종(각각 HMW 및 LMW)을 포함하는 샘플 내 주요 성분을 분석한다. UPLC® SEC 컬럼이 분리를 위해 사용된다. 이동상은 0.4M L-아르기닌이 보충된 완충액 17(상기 표 1)이고, pH는 6.6-6.9이다. L-아르기닌은 분리된 단백질과 컬럼 매트릭스, 필터 및 크로마토그래피 시스템의 기타 습윤 부분 사이의 2차 상호작용을 최소화하기 위해 버퍼 17에 첨가된다. 0.25mL/분의 유속을 사용하여 임의의 전처리 또는 희석 없이 (약물 물질의 한 바이알로부터) 중복 샘플이 분석된다. 검출은 280nm에서 이루어진다. 결과적인 크로마토그램을 통합하고 주요 성분에 대해 수득된 평균 면적 백분율(면적 %)을 각 약물 물질 로트에 대해 보고한다.

도 4는 실시예 1에 따라 제조된 DS 로트 #17043에 대한 분자량 분포를 나타낸다. 주요 피크는 유리 생성물 독소 분자에 상응한다. 정제된 약물 물질 로트 #16852, #17043, 및 #19139 모두는 주요 성분(BoNT/A)의 적어도 96%를 나타냈다. 이 데이터는 본 개시내용에 따라 제조된 생성물 독소 용액에서 보툴리눔 독소의 높은 수준의 순도를 확인시켜준다.

실시예 10: 공정 단계 수율

BoNT/A의 공정 단계 수율은 정제 공정에서 각 단계의 견고성의 지표로 결정된다. 공정 단계 수율을 계산하기 위해, 각 분획의 무게를 측정하여 부피를 결정한다. 각 분획에서 BoNT/A의 농도를 결정하기 위해 BoNT/A-특이적 ELISA가 사용된다.

ELISA 프로토콜은 USP <1103>, "면역학적 시험 방법 - 효소-연결된 면역흡착 검정"에 기술된 원리와 일반적인 방법을 기반으로 하는 간접 샌드위치 ELISA이다. ELISA 방법은 2가지 다른 유형의 BoNT/A-특이적 다클론 항체를 사용한 BoNT/A의 면역학적 결합 및 검출을 기반으로 한다.

상업적 BoNT/A 독소를 기반으로 하는 일련의 단백질 표준 희석액은 PBS-Tween 용액(0.05% Tween-20)에서 BoNT/A를 3-28ng/mL의 농도 범위로 희석함에 의해 제조된다. PBS-Tween에서 단백질 표준 희석액의 범위로 희석된 샘플을 다클론 항-BoNT/A 항체로 코팅된 마이크로플레이트 웰에 삼중으로 첨가한다. 인큐베이션은 항체 인식 및 웰에 BoNT/A 항원의 결합을 초래한다. 각 인큐베이션 후에 PBS-Tween 용액을 사용하는 자동화된 세정 단계가 수행된다.

일차 검출은 다른 유형의 다클론 항-BoNT/A 항체를 결합하여 수행되어, 샌드위치 복합체의 형성을 초래한다. 그런 다음 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)에 접합된 이차 항체가 추가된다. 일차 항체에 대한 그 결합은 샌드위치 복합체 내에서 BoNT/A의 검출을 허용한다. 그런 다음 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 기질을 샘플 웰에 추가한다. HRP는 TMB 기질을 전환하여 청색 반응 생성물을 생성한다. 정지 용액이 추가되어 TMB 전환을 중지하고 황색으로 잔여 TMB의 색상 전환을 개시한다. 각 마이크로플레이트 웰의 흡광도는 플레이트 판독기로 450nm에서 검출되며, 측정된 흡광도는 웰에서 BoNT/A의 양에 직접적으로 비례한다. 샘플 흡광도 값은 BoNT/A 표준 희석액으로부터 흡광도 값을 기반으로 하는 표준 곡선에 대해 비교함에 의해 계산된다. 결과는 μg/mL 단위인 평균 값으로 보고된다. 공정 단계 수율은 그 다음 상기 식 1에 따라 계산된다.

도 5는 로트 #16852, #17043 및 #19139에 대한 정제 공정에서 각 단계에서 공정 단계 수율에 대한 평균 값을 나타낸다. "DS"로 표지된 막대는 그 단계가 서로연결되어 있고 이들 사이에 샘플링이 수행되지 않기 때문에 최종 두 크로마토그래피 단계에 대한 조합된 수율을 나타낸다. 데이터는 공정 단계에 대한 수율이 대략 100%에서 50% 사이에서 다양함을 나타낸다.

실시예 11: 누적 공정 단계 수율

각 개별 공정 단계에 대한 누적 공정 단계 수율은 다음 공식에 의해 계산된다:

(식 4)

여기서 C는 독소 농도이고, V는 부피이고, 아래첨자 분획은 현재 공정 단계로부터 독소 농도 또는 부피를 나타내고 아래첨자 KS는 0.2-μm 필터를 통해 여과하여 제거된 세포를 갖는, 수확 시 배양물을 나타낸다. 수확 시 배양물에 대한 누적 공정 단계 수율(KS)은 100%로 설정된다.

도 6은 정제된 약물 물질 로트 #16852, #17043 및 #19139에 대한 정제 공정에서 각 단계에 대한 평균 누적 공정 단계 수율을 나타낸다. "DS"로 표지된 막대는 그 단계가 서로연결되어 있고 이들 사이에 샘플링이 수행되지 않기 때문에 최종 두 크로마토그래피 단계에 대한 조합된 수율을 나타낸다.

실시예 12: 총 수율

수확 시 배양물("KS")과 비교하여 생성물 독소 용액(또는 "DS")에서 BoNT/A의 총 수율은 전반적인 정제 공정의 견고성의 지표로 결정된다. 공정 단계 수율을 계산하기 위해, KS 및 DS 분획의 무게를 계량하여 부피를 결정한다. KS 및 DS에서 BoNT/A의 농도는 BoNT/A-특이적 ELISA를 사용하여 결정된다. 총 수율은 상기 식 2에 따라 계산된다.

정제된 약물 물질 로트 #16852, #17043 및 #19139의 경우, 총 수율은 13%와 29% 사이인 것으로 결정되었다(데이터는 표시되지 않음).

실시예 13: (단계에 걸친) 순도 개선 인자

각 개별 공정 단계에 걸친 BoNT/A의 순도 개선 인자는 원치 않는 단백질 성분(공정- 및 생성물-관련됨)을 제거하기 위한 각 단계 (및 전체로서 정제 공정)의 효율성의 지표로 결정된다. 단계에 걸친 순도 개선 인자를 계산하기 위해, 각 분획은 BoNT/A-특이적 ELISA를 사용하여 독소 농도에 대해 분석하고 마이크로 BCA 방법에 의해 총 단백질 농도(실시예 4)에 대해 분석한다. 단계에 걸친 순도 개선은 다음 공식에 따라 계산된다:

(식 5)

여기서 ToxC는 독소 농도이고, TotPC는 총 단백질 농도이고, 아래첨자 분획은 현재 가공 단계로부터 독소 농도 또는 총 단백질 농도를 나타내고 아래첨자 이전 분획은 이전 가공 단계로부터 독소 농도 또는 총 단백질 농도를 나타낸다.

도 7은 정제된 약물 물질 로트 #16852, #17043 및 #19139에 대해 단계에 걸친 순도 개선 인자의 평균 값을 나타낸다. "DS"로 표지된 막대는 그 단계가 서로연결되어 있고 이들 사이에 샘플링이 수행되지 않기 때문에 최종 두 크로마토그래피 단계에 대한 조합된 수율을 나타낸다. 데이터로부터, 제2 크로마토그래피 컬럼이 독소의 정제에 가장 크게 기여하는 단계임이 분명하다. 그러나, (전체 또는 용해된 세포 및 세포 성분을 제거하는 여과 1과 별도로) 모든 단계는 총 단백질 농도에 비해 독소의 전반적인 정제에 기여한다.

실시예 14: (단계에 걸친) 누적 순도 개선 인자

누적 순도 개선 인자는 다음과 같이 각 개별 공정 단계에 대해 계산된다:

(식 6)

여기서 ToxC는 독소 농도이고, TotPC는 총 단백질 농도이고, 아래첨자 분획은 현재 가공 단계로부터 독소 농도 또는 총 단백질 농도를 나타내고, 아래첨자 KS는 0.2-μm 필터를 통한 필터링에 의해 제거된 세포를 갖는, 수확 시 배양물로부터 독소 농도 또는 총 단백질 농도를 나타낸다. 정제 공정의 제1 공정 단계(수확시 발효)를 순도 개선 인자 1로 설정하였다.

도 8은 정제된 약물 물질 로트 #16852, #17043 및 #19139에 대한 단계에 걸친 평균 누적 순도 개선 인자를 나타낸다. "DS"로 표지된 막대는 그 단계가 서로연결되어 있고 이들 사이에 샘플링이 수행되지 않기 때문에 최종 두 크로마토그래피 단계에 대한 조합된 수율을 나타낸다.

Claims

독소를 포함하는 용액으로부터 독소를 정제하는 것을 포함하는 보툴리눔 독소를 정제하는 방법으로서, 공정은 침전, 원심분리 또는 동결건조를 포함하지 않는, 방법.
제1항에 있어서, 보툴리눔 독소는 혈청형 A인, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 수득된 정제된 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 복합체가 없거나, 본질적으로 없거나, 실질적으로 없는, 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 수득된 정제된 보툴리눔 독소는 동물성 생성물이 없거나, 본질적으로 없거나, 실질적으로 없는, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 수득된 정제된 보툴리눔 독소는 인간 알부민이 없거나, 본질적으로 없거나, 실질적으로 없는, 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 정제는 여과 단계, 바람직하게는 접선 유동 여과 단계를 포함하는, 방법.
제6항에 있어서, 여과 단계는 중공사 필터를 사용하는, 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 정제는 제1 크로마토그래피 컬럼을 독소를 포함하는 용액과 접촉시켜 독소-함유 분획물을 생성하는 것을 포함하는, 방법.
제8항에 있어서, 제1 크로마토그래피 컬럼은 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 포함하는, 방법.
제9항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼은 Q 세파로스를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 정제는 독소-함유 분획물을 수집하는 것을 추가로 포함하고, 여기서 독소-함유 분획물은 제1 고정상에 흡착하지 않는, 방법.
제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 정제는 제2 크로마토그래피 컬럼을 독소-함유 분획물과 접촉시키는 것을 추가로 포함하는, 방법.
제12항에 있어서, 제2 크로마토그래피 컬럼은 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 포함하는, 방법.
제13항에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼은 SP 세파로스를 포함하는, 방법.
제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 크로마토그래피 컬럼으로부터 보툴리눔 독소를 용리하여 제1 독소-함유 용리액을 생성하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 독소-함유 용리액을 여과하여 독소-함유 잔류물을 생성하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
제16항에 있어서, 독소-함유 용리액을 여과하는 것은 완충액 교환을 포함하는, 방법.
제16항 또는 제17항에 있어서, 제1 독소-함유 용리액을 여과하는 것은 보툴리눔 독소 분자를 비-독소 단백질로부터 분리하여 독소-함유 잔류물에서 유리 독소 분자를 생성하는, 방법.
제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 크로마토그래피 컬럼을 독소-함유 잔류물과 접촉시키는 것을 추가로 포함하는, 방법.
제19항에 있어서, 제3 크로마토그래피 컬럼은 제2 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 포함하는, 방법.
제20항에 있어서, 제2 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼은 Q 세파로스를 포함하는, 방법.
제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 크로마토그래피 컬럼으로부터 보툴리눔 독소를 용리하여 제2 독소-함유 용리액을 생성하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 제4 크로마토그래피 컬럼을 제2 독소-함유 용리액과 접촉시키는 것을 추가로 포함하는, 방법.
제23항에 있어서, 제4 크로마토그래피 컬럼은 크기 배제 크로마토그래피 컬럼을 포함하는, 방법.
제24항에 있어서, 크기 배제 크로마토그래피 컬럼은 겔 여과 크로마토그래피 컬럼을 포함하는, 방법.
제25항에 있어서, 겔 여과 크로마토그래피 컬럼은 슈퍼덱스 200을 포함하는, 방법.
제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 제4 크로마토그래피 컬럼으로부터 보툴리눔 독소를 용리하여 정제된 보툴리눔 독소를 생성하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
독소를 포함하는 용액으로부터 보툴리눔 독소를 정제하는 방법으로서, 상기 방법은
(a) 독소를 포함하는 용액을 여과하는 단계;
(b) 제1 크로마토그래피 컬럼을 (a)로부터의 독소를 포함하는 여과된 용액과 접촉시키는 단계로서, 여기서 제1 크로마토그래피 컬럼은 이온 교환 크로마토그래피 컬럼인, 단계;
(c) 독소-함유 분획물을 수집하는 단계로서, 여기서 독소-함유 분획물은 정지상에 흡착함이 없이 제1 크로마토그래피 컬럼을 통해 유동하는, 단계;
(d) 제2 크로마토그래피 컬럼을 독소-함유 분획물과 접촉시키는 단계로서, 여기서 제2 크로마토그래피 컬럼은 이온 교환 크로마토그래피 컬럼인, 단계;
(e) 제2 크로마토그래피 컬럼으로부터 보툴리눔 독소를 용리하여 제1 독소-함유 용리액을 생성하는 단계;
(f) 제1 독소-함유 용리액을 여과하여 독소-함유 잔류물을 생성하는 단계;
(g) 제3 크로마토그래피 컬럼을 여과 (f)로부터의 독소-함유 잔류물과 접촉시키는 단계로서, 여기서 제3 크로마토그래피 컬럼은 이온 교환 컬럼인, 단계;
(h) 제3 크로마토그래피 컬럼으로부터 보툴리눔 독소를 용리하여 제2 독소-함유 용리액을 생성하는 단계;
(i) 제4 크로마토그래피 컬럼을 제2 독소-함유 용리액과 접촉시키는 단계로서, 여기서 상기 제4 크로마토그래피 컬럼은 크기 배제 크로마토그래피 컬럼인, 단계;
(j) 제4 크로마토그래피 컬럼으로부터 보툴리눔 독소를 용리시켜 정제된 보툴리눔 독소를 생성하는 단계를 포함하며,
여기서 공정은 보툴리눔 독소를 침전, 원심분리 또는 동결건조하는 것을 포함하지 않는, 방법.
제28항에 있어서, 보툴리눔 독소는 보툴리눔 신경독소 혈청형 A를 포함하는, 방법.
제28항 또는 제29항에 있어서, 수득된 정제된 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 복합체가 없거나, 본질적으로 없거나, 또는 실질적으로 없는, 방법.
제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 수득된 정제된 보툴리눔 독소는 동물성 생성물이 없거나, 본질적으로 없거나, 또는 실질적으로 없는, 방법.
제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 보툴리눔 독소는 인간 알부민이 없거나, 본질적으로 없거나, 또는 실질적으로 없는, 방법.
제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 크로마토그래피 컬럼은 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 포함하는, 방법.
제28항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 크로마토그래피 컬럼은 Q 세파로스를 포함하는, 방법.
제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 크로마토그래피 컬럼은 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 포함하는, 방법.
제28항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 크로마토그래피 컬럼은 SP 세파로스를 포함하는, 방법.
제28항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 크로마토그래피 컬럼은 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 포함하고 제2 크로마토그래피 컬럼은 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 포함하는, 방법.
제28항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 크로마토그래피 컬럼은 Q 세파로스를 포함하고 제2 크로마토그래피 컬럼은 SP 세파로스를 포함하는, 방법.
제28항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 크로마토그래피 컬럼은 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 포함하는, 방법.
제28항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 크로마토그래피 컬럼은 Q 세파로스를 포함하는, 방법.
제28항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 제4 크로마토그래피 컬럼은 겔 여과 컬럼을 포함하는, 방법.
제28항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 제4 크로마토그래피 컬럼은 슈퍼덱스 200을 포함하는, 방법.
제28항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 크로마토그래피 컬럼은 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 포함하고 제4 크로마토그래피 컬럼은 겔 여과 크로마토그래피 컬럼을 포함하는, 방법.
제28항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 크로마토그래피 컬럼은 Q 세파로스를 포함하고 제4 크로마토그래피 컬럼은 슈퍼덱스 200을 포함하는, 방법.
제28항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 독소-함유 용리액은 제4 크로마토그래피 컬럼 상에 직접적으로 주입되는, 방법.
제28항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 크로마토그래피 컬럼 및 제4 크로마토그래피 컬럼은 상호연결되어 있는, 방법.
제28항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 크로마토그래피 컬럼은 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼이고, 제2 크로마토그래피 컬럼은 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼이고, 제3 크로마토그래피 컬럼은 제2 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼이고, 제4 크로마토그래피 컬럼은 겔 여과 크로마토그래피 컬럼인, 방법.
제28항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 크로마토그래피 컬럼은 Q 세파로스를 포함하고, 제2 크로마토그래피 컬럼은 SP 세파로스를 포함하고, 제3 크로마토그래피 컬럼은 Q 세파로스를 포함하고, 제4 크로마토그래피 컬럼은 슈퍼덱스 200을 포함하는, 방법.
제28항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 제1, 제2, 제3 및 제4 크로마토그래피 컬럼은 단일-사용 크로마토그래피 시스템인, 방법.
제28항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 여과 단계 (f)는 보툴리눔 독소 단백질 분자를 비-독소 단백질로부터 해리시켜 유리 독소 분자를 생성하는, 방법.
제28항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 여과 단계 (f)는 완충액 교환을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 보툴리눔 독소를 포함하는 용액은 동물성 생성물이 없거나, 본질적으로 동물성 생성물이 없거나, 또는 실질적으로 동물성 생성물이 없는 발효 배지인, 방법.
제28항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 보툴리눔 독소를 포함하는 용액은 동물성 생성물이 없거나, 본질적으로 동물성 생성물이 없거나, 또는 실질적으로 동물성 생성물이 없는 발효 배지인, 방법.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 보툴리눔 독소를 완충 용액과 접촉시키는 것을 추가로 포함하고, 여기서 완충 용액은 바이오버든(bioburden)을 감소시키기 위해 여과되는, 방법.
제28항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 보툴리눔 독소를 완충 용액과 접촉시키는 것을 추가로 포함하고, 여기서 상기 완충 용액은 바이오버든을 감소시키기 위해 여과되는, 방법.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생산된 정제된 보툴리눔 독소.
제56항에 있어서, 보툴리눔 독소는 혈청형 A인, 정제된 보툴리눔 독소.
제56항 또는 제57항에 있어서, 정제된 보툴리눔 독소는 독소 복합체가 없거나, 본질적으로 없거나, 실질적으로 없는, 정제된 보툴리눔 독소.
제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 보툴리눔 독소는 동물성 생성물이 없거나, 본질적으로 없거나, 또는 실질적으로 없는, 정제된 보툴리눔 독소.
제56항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 보툴리눔 독소는 인간 알부민이 없거나, 본질적으로 없거나, 또는 실질적으로 없는, 정제된 보툴리눔 독소.
제28항 내지 제51항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생산된 정제된 보툴리눔 독소.
제61항에 있어서, 독소는 혈청형 A인, 정제된 보툴리눔 독소.
제61항 또는 제62항에 있어서, 정제된 보툴리눔 독소는 독소 복합체가 없거나, 본질적으로 없거나, 또는 실질적으로 없는, 정제된 보툴리눔 독소.
제61항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 보툴리눔 독소는 동물성 생성물이 없거나, 본질적으로 없거나, 또는 실질적으로 없는, 정제된 보툴리눔 독소.
제61항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 보툴리눔 독소는 인간 알부민이 없거나, 본질적으로 없거나, 또는 실질적으로 없는, 정제된 보툴리눔 독소.
완충액 내에 정제된 보툴리눔 독소를 포함하는 조성물로서, 완충액은 포스페이트를 포함하는, 조성물.
제66항에 있어서, 완충액은 아세테이트를 추가로 포함하는, 조성물.
제66항 또는 제67항에 있어서, 완충액은 적어도 하나의 염화물 이온 공급원을 추가로 포함하는, 조성물.
제68항에 있어서, 적어도 하나의 염화물 이온 공급원은 염화나트륨인, 조성물.
제66항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 완충액은 적어도 하나의 계면활성제를 추가로 포함하는, 조성물.
제70항에 있어서, 적어도 하나의 계면활성제는 폴리소르베이트 20을 포함하는, 조성물.
제66항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 보툴리눔 독소는 보툴리눔 신경독소 혈청형 A인, 조성물.
제66항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 보툴리눔 독소 복합체가 없거나, 본질적으로 없거나, 또는 실질적으로 없는, 조성물.
제66항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 동물성 생성물이 없거나, 본질적으로 없거나, 또는 실질적으로 없는, 조성물.
제66항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 인간 알부민이 없거나, 본질적으로 없거나, 또는 실질적으로 없는, 조성물.
제66항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 약 6.6 내지 6.9의 pH를 갖는, 조성물.