JPS59130187A - バチルス微生物における遺伝子の異型クロ−ニング方法 - Google Patents
バチルス微生物における遺伝子の異型クロ−ニング方法Info
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- JPS59130187A JPS59130187A JP58202929A JP20292983A JPS59130187A JP S59130187 A JPS59130187 A JP S59130187A JP 58202929 A JP58202929 A JP 58202929A JP 20292983 A JP20292983 A JP 20292983A JP S59130187 A JPS59130187 A JP S59130187A
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- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
微生物の酵素は、医薬、農薬および有機薬品の製造のよ
うな種々の分野において、重要性が増大してきている。
うな種々の分野において、重要性が増大してきている。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ属は、維持および珀養を容易に行なう
ことができ、しかも特性が著し〈異質（ｈｅｔｅｒｏｇ
ｅｎｅｏｕｓ）である細菌の群からなる。且１工１」Ｊ
ヱ」 Ｍｌ」ｕａｌ ｏｆ Ｄｔｅｒｍｉｎａ
ｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ −ｙ 中に記載
されているＢａｃｉｌｌｕｓ／４の４８種のすべは、可
溶性の酵素を分泌する。
ことができ、しかも特性が著し〈異質（ｈｅｔｅｒｏｇ
ｅｎｅｏｕｓ）である細菌の群からなる。且１工１」Ｊ
ヱ」 Ｍｌ」ｕａｌ ｏｆ Ｄｔｅｒｍｉｎａ
ｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ −ｙ 中に記載
されているＢａｃｉｌｌｕｓ／４の４８種のすべは、可
溶性の酵素を分泌する。
古典的遺伝子操作の技術、たとえば、紫外線照射および
突然変異選択、は、α−アミラーゼのようなＩｖＰ素の
収用および性質を改良するために使用されてきた。１９
６０年代において、分子生物学者は、細菌、すなわち、
Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉ ｃＯｌｌおよびそれらを感染す
るウィＪレヌを利用し、遺伝子暗号を解読し、突然変異
の分子基準を確立し、デオキシリポ核Ｍ（ＤＮＡ）か１
つの細１にすかも他の細胞へ行くことができる方法を発
見し、そして正確にかつ詳細に、生機生物が特定の遺伝
子の表現または活性を制御できる方法を明らかにした。
突然変異選択、は、α−アミラーゼのようなＩｖＰ素の
収用および性質を改良するために使用されてきた。１９
６０年代において、分子生物学者は、細菌、すなわち、
Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉ ｃＯｌｌおよびそれらを感染す
るウィＪレヌを利用し、遺伝子暗号を解読し、突然変異
の分子基準を確立し、デオキシリポ核Ｍ（ＤＮＡ）か１
つの細１にすかも他の細胞へ行くことができる方法を発
見し、そして正確にかつ詳細に、生機生物が特定の遺伝
子の表現または活性を制御できる方法を明らかにした。
この情報は１９７０年代において利用されて、遺伝ｆ操
作の産業、たとえば、組換えＤＮＡ技術、の基礎が形成
された。
作の産業、たとえば、組換えＤＮＡ技術、の基礎が形成
された。
組換えＤＮＡ技術は、遺伝物質（遺伝子またはＤＮＡ断
片）の１つの微生物から第２の微生物の形質転換および
結合された遺伝物質の引き続く伸長を包含する。
片）の１つの微生物から第２の微生物の形質転換および
結合された遺伝物質の引き続く伸長を包含する。
所望の遺伝的特徴を有する特定の遺伝子、すなわち、Ｄ
ＮＡ配列、は、物理化学的手順により単離され、あるい
は化学的に合成された。次いで、このＤＮＡ配列はプラ
スミドと呼ばれる小さい円形の染色体に共有結合される
。プラスミド分子の設計は、ある群の分子状酵素、すな
わち、制限エンドヌクし・アーセ類、による開裂により
、特定の【気において開くことができ、そしてＤＮＡの
「異質」片を挿入して組換えプラスミドを生産できるよ
うなものである。成功する組換えＤＮＡ技術は、宿主微
生物における遺伝イ活性をｕ（能とする、プラスミド上
の部位においてＤＮＡが挿入されることを必要とする。
ＮＡ配列、は、物理化学的手順により単離され、あるい
は化学的に合成された。次いで、このＤＮＡ配列はプラ
スミドと呼ばれる小さい円形の染色体に共有結合される
。プラスミド分子の設計は、ある群の分子状酵素、すな
わち、制限エンドヌクし・アーセ類、による開裂により
、特定の【気において開くことができ、そしてＤＮＡの
「異質」片を挿入して組換えプラスミドを生産できるよ
うなものである。成功する組換えＤＮＡ技術は、宿主微
生物における遺伝イ活性をｕ（能とする、プラスミド上
の部位においてＤＮＡが挿入されることを必要とする。
ＤＮＡ組換え技術において興味ある１つの領域は、酵素
、たとえば、α−アミラーゼ、プロテアーゼ、アミログ
ルコシダーゼおよびグルコースィンメラーセ、を暗号化
する遺伝子をクローニングすることを包含する。これら
の酵素の構造およびこのような酵素を生産する微生物の
遺伝系は、広範に特徴づけされてきていない。
、たとえば、α−アミラーゼ、プロテアーゼ、アミログ
ルコシダーゼおよびグルコースィンメラーセ、を暗号化
する遺伝子をクローニングすることを包含する。これら
の酵素の構造およびこのような酵素を生産する微生物の
遺伝系は、広範に特徴づけされてきていない。
問題のこのような遺伝子を単離することは不可能であり
、そしてそれらの遺伝子の存在または遺伝子牛産物、す
なわち、問題の酵素、の存在を直接彦根する技術は存在
しないので、「ショットガン（、ｓ ｈｏｔ−ｇｕｎ）
Ｊクローニング、すなわち、問題のイ旬機体の問題のゲ
ノムのクロｍ＝７ヴ１はいばしは必要である。
、そしてそれらの遺伝子の存在または遺伝子牛産物、す
なわち、問題の酵素、の存在を直接彦根する技術は存在
しないので、「ショットガン（、ｓ ｈｏｔ−ｇｕｎ）
Ｊクローニング、すなわち、問題のイ旬機体の問題のゲ
ノムのクロｍ＝７ヴ１はいばしは必要である。
種々の鯉山で、直接のＢａｃｊ Ｉ ｌｕｓ宿七、たと
えは、Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ、・＼の［ショットカンｊ
クローニングは実際的ではない。いくつかのＪ１由は、
次きのとおりである：所望のＢ、ｓｕ ｂ ｔ ｉ ｌ
ｉ ｓクローニングヘクトル（プラスミド）の不ノｌ
、形質転換の非効率、および結合混合１物からの組換え
プラスミド分子の非常に制限された形質転換の能力。し
たがって、クローニングの細心の５１画を好意して選択
して、最小の工程数で所望の遺伝子をクローニングしか
つ同定する可能牛を最大とじなイてはならない。
えは、Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ、・＼の［ショットカンｊ
クローニングは実際的ではない。いくつかのＪ１由は、
次きのとおりである：所望のＢ、ｓｕ ｂ ｔ ｉ ｌ
ｉ ｓクローニングヘクトル（プラスミド）の不ノｌ
、形質転換の非効率、および結合混合１物からの組換え
プラスミド分子の非常に制限された形質転換の能力。し
たがって、クローニングの細心の５１画を好意して選択
して、最小の工程数で所望の遺伝子をクローニングしか
つ同定する可能牛を最大とじなイてはならない。
Ｂａｃｉ １ｌｕｓ株におけるα−アミラーゼを暗号化
しまたは調節する遺伝子は、２つの株が十分に密接に関
係があるとき、すなわち、２つの株の間に広範な相同性
が存在するとき、他のＢａｃｉ１１ｕｓ株に導入するこ
とができることは、知られている。これは相同形質転換
（ｈｏｍｏ Ｉ 。
しまたは調節する遺伝子は、２つの株が十分に密接に関
係があるとき、すなわち、２つの株の間に広範な相同性
が存在するとき、他のＢａｃｉ１１ｕｓ株に導入するこ
とができることは、知られている。これは相同形質転換
（ｈｏｍｏ Ｉ 。
ｇｏｕｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）と呼ばれ
る。たとえは、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、。
る。たとえは、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、。
１ヱ０ ：１１４４−１１５ （１９７４）は、例外的
に高いα−アミラーセ活性を有するＢ、５ｕｂｔｉｌｉ
ｓ ｖａｒ ａｍｙｌｏｓａｃｃａｒｊｔｉｃυＳ
からのＤＮＡを、比較的低いα−アミラーゼを有する遺
伝的に類似する（相同性の）微生物（Ｂ、５ｕｂｔｉｌ
ｉ、ｓ １６８ Ｍａｒｂｕｒｇ）中に導入するこ
とを記載している。生産庄れる形質転換された微生物は
、高いα−アミテーゼ活性を獲得した。
に高いα−アミラーセ活性を有するＢ、５ｕｂｔｉｌｉ
ｓ ｖａｒ ａｍｙｌｏｓａｃｃａｒｊｔｉｃυＳ
からのＤＮＡを、比較的低いα−アミラーゼを有する遺
伝的に類似する（相同性の）微生物（Ｂ、５ｕｂｔｉｌ
ｉ、ｓ １６８ Ｍａｒｂｕｒｇ）中に導入するこ
とを記載している。生産庄れる形質転換された微生物は
、高いα−アミテーゼ活性を獲得した。
１上」ユ、Ｅｎｖｉ ｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉ 。
１．１１： ２７４−２７６ （１９８０）は、α−ア
ミラーゼ生産およびプロテアーセについての関ｉＬＩ＋
遺伝子をある株中へ組込む効果は、相乗的性質のα−ア
ミラーゼ生産を増加させるということを、確立１−だ。
ミラーゼ生産およびプロテアーセについての関ｉＬＩ＋
遺伝子をある株中へ組込む効果は、相乗的性質のα−ア
ミラーゼ生産を増加させるということを、確立１−だ。
全体のアプローチは、段階的形質転換手順により、遺伝
子を受容体のＢ 、 Ｓ ｕ ｂ ｔｉ Ｉ ｉ ｓ
Ｍａｒｂｕｒｇ ６］６０１生物中へ段階的に導入
することを含んだ。著者らは、形賀転換手ｒｒａ″（が
染色体の相同性を必要とするので、染色体の異型を利用
できる、示唆された別のアプローチが、遺伝子類をクロ
ーニングし、そしてそれらを、より精製された形態の修
飾された受容体、すなわち、Ｉ’ｍ胞（ｍｏｔｈｅｒ
ｃｅｌｌ）ノ中に導入するためのべりトルの開発を含
む、ことを示している。
子を受容体のＢ 、 Ｓ ｕ ｂ ｔｉ Ｉ ｉ ｓ
Ｍａｒｂｕｒｇ ６］６０１生物中へ段階的に導入
することを含んだ。著者らは、形賀転換手ｒｒａ″（が
染色体の相同性を必要とするので、染色体の異型を利用
できる、示唆された別のアプローチが、遺伝子類をクロ
ーニングし、そしてそれらを、より精製された形態の修
飾された受容体、すなわち、Ｉ’ｍ胞（ｍｏｔｈｅｒ
ｃｅｌｌ）ノ中に導入するためのべりトルの開発を含
む、ことを示している。
文献は、異型の形質転換において普通の形質転換技術を
使用すること、たとえば、Ｂ、ａｌ１１７１ｏ １ ｊ
ｑｕｊｆａｃｉｅｎｓからの遺伝子をＢ、５ｕｂｔ ｉ
ｌｉｓに導入すること、が困難であることを示してい
る。、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ 。
使用すること、たとえば、Ｂ、ａｌ１１７１ｏ １ ｊ
ｑｕｊｆａｃｉｅｎｓからの遺伝子をＢ、５ｕｂｔ ｉ
ｌｉｓに導入すること、が困難であることを示してい
る。、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ 。
±ユニ： ７０５−７１６ （１９７２）、とくに表２
、中に示されているように、相同のＢ、 ｓｕ ｂｔｉ
ｌｉｓ １６８株からのＤＮＡにょるＢ、５ｕｂｔ
ｉ ｌ １ｓ１６８株（ＢＲ１５１）（７）形質転換は
、異型源、Ｂ、ａｍｙｌｏｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ
ＨがらのＤＮＡよりも、３つの試験した遺伝４座につ
いて１ 、ＱＱｏ倍多い形質転換体を生産した。
、中に示されているように、相同のＢ、 ｓｕ ｂｔｉ
ｌｉｓ １６８株からのＤＮＡにょるＢ、５ｕｂｔ
ｉ ｌ １ｓ１６８株（ＢＲ１５１）（７）形質転換は
、異型源、Ｂ、ａｍｙｌｏｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ
ＨがらのＤＮＡよりも、３つの試験した遺伝４座につ
いて１ 、ＱＱｏ倍多い形質転換体を生産した。
最も近い先行技術は、Ｒａｐｏｐｏｒｔ 、ｅｊ、Ｑｌ
、、川、ｑ±」、兵ｅｎｅｔ 、↓１６ ： ２３９２
４５ （］９７９）８よびＰａ１ｖａ、ｅｔ、ａｌ、、
Ｇｅｎｅ、１上： ４３−５１（１９８１）中に記載さ
れているものであると、リノ、われる。
、、川、ｑ±」、兵ｅｎｅｔ 、↓１６ ： ２３９２
４５ （］９７９）８よびＰａ１ｖａ、ｅｔ、ａｌ、、
Ｇｅｎｅ、１上： ４３−５１（１９８１）中に記載さ
れているものであると、リノ、われる。
Ｒａｐｏｐｏｒｔ、ｅｔ、ａｌ、は、２機能性（ｂｉｆ
ｕｎｃｔｊｎａｌ）プラスミＩ’（ｐＨＶ３３）を使用
し、て、Ｂ、５ｕｂｔ、１ｌｉｓの全ゲ、ツムに相当す
るＤＮＡ断片を川１．ＮてＥ、ｃｏｌｉ含有プラスミド
のコロニー／ヘー／りを構成することを記４としている
。Ｒａｐｏｐｏ ｒｔ 、ｅｔ 、ａｌ、は、Ｂ、ａｍ
ｙｌｏｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎＳからのＤＮＡを、同一
種の第２宿十Ｂ、５ｕｂｔｉｌ＋ｓへ相同クローニング
した。ＲａｐＯＰｏｒｔ 、ｅｊ、ａｌ、は、イ１）ら
れたＤＮＡの大きい断片を機械的剪断しこより形成し、
そして１１ノ１限エンドヌクレアーセを用いる完全消化
ζよ、それ力）所ｑ１の構造造仏子内のＤＮＡの開裂に
より、遣４１； ７古性の損失を起こすことがあるので
、望ましくなｌ／）ことを示した。
ｕｎｃｔｊｎａｌ）プラスミＩ’（ｐＨＶ３３）を使用
し、て、Ｂ、５ｕｂｔ、１ｌｉｓの全ゲ、ツムに相当す
るＤＮＡ断片を川１．ＮてＥ、ｃｏｌｉ含有プラスミド
のコロニー／ヘー／りを構成することを記４としている
。Ｒａｐｏｐｏ ｒｔ 、ｅｔ 、ａｌ、は、Ｂ、ａｍ
ｙｌｏｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎＳからのＤＮＡを、同一
種の第２宿十Ｂ、５ｕｂｔｉｌ＋ｓへ相同クローニング
した。ＲａｐＯＰｏｒｔ 、ｅｊ、ａｌ、は、イ１）ら
れたＤＮＡの大きい断片を機械的剪断しこより形成し、
そして１１ノ１限エンドヌクレアーセを用いる完全消化
ζよ、それ力）所ｑ１の構造造仏子内のＤＮＡの開裂に
より、遣４１； ７古性の損失を起こすことがあるので
、望ましくなｌ／）ことを示した。
Ｒａｐｏｐｏｒｔは、ある種のＢ、５ｕｂｔｉ１ｉｓ宿
主株の栄養要求変異種の相補性により１、Ｖ＋−ａえク
ロンを同定した。この方法は、所望の遺伝１′−または
遺伝子生産物の存在を同定するための直接選択を含んだ
。このアプローチにより、ＲａｐｏｐｏｒｔはＢ、５ｕ
ｂｔｉｌｉｓ突然変異の栄養要求を暗号解読（ｃ ｏ
ｄ ｅ）する、クローニングされた遺伝子についてのみ
探索すること番こ制限された。前述の酵素を暗号解読す
る、クローニングされた遺伝子は、このアプローチ（と
よっては、選択および同定されることはできな力１つだ
。
主株の栄養要求変異種の相補性により１、Ｖ＋−ａえク
ロンを同定した。この方法は、所望の遺伝１′−または
遺伝子生産物の存在を同定するための直接選択を含んだ
。このアプローチにより、ＲａｐｏｐｏｒｔはＢ、５ｕ
ｂｔｉｌｉｓ突然変異の栄養要求を暗号解読（ｃ ｏ
ｄ ｅ）する、クローニングされた遺伝子についてのみ
探索すること番こ制限された。前述の酵素を暗号解読す
る、クローニングされた遺伝子は、このアプローチ（と
よっては、選択および同定されることはできな力１つだ
。
Ｐａ ｌｖａ’、ｅｔ 、ａｌ、は、Ｂ 、 ａｍｙ
１ 。
１ 。
］ １ｑｕｉｆａｃｔｅｎｓからのα−アミラーゼの遺
伝子を、プラスミドのベクトルｐｕ、Ｂｔｔ。
伝子を、プラスミドのベクトルｐｕ、Ｂｔｔ。
にクローニングすることを、記載してしＡる。この研究
は、宿１丁微生物としてＢ、５ｕｂｔ ｉ １４ ｓへ
のクローニングを含んだが、使用されたベクトルは２機
能性ではなかった。
は、宿１丁微生物としてＢ、５ｕｂｔ ｉ １４ ｓへ
のクローニングを含んだが、使用されたベクトルは２機
能性ではなかった。
前述の参考書はいずれも、α−アミラーゼ、プロテアー
ゼ、アミログルコシターゼまたはグルコースイソメラー
ゼを暗号化する異型（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）クロ
ーニングを達成するための、本発明の方法を記載してい
ない。
ゼ、アミログルコシターゼまたはグルコースイソメラー
ゼを暗号化する異型（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）クロ
ーニングを達成するための、本発明の方法を記載してい
ない。
本発明は、あるＢａｃｉｌｌｑｓ微生物からのα−アミ
ラーゼ、プロテアーゼ、アミログルコシターゼまたはグ
ルコースイソメラーゼを暗号化（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）す
る遺伝子を、他の種のＢａｃｉ ］ ｌｕｓ宿主微生物
にクローニングする方法に関する。この方法は、（ａ）
Ｅ、ｃｏｌｉおよびＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓの両者の中で
複製する能力を有する２機能プラスミド、ここで前記プ
ラスミドは少なくとも２つの選択可能な遺伝標識（ｍａ
ｒｋｅｒ）を含有する、をエンドヌクレアーゼで消化し
て、線状プラスミド分子を生産し、（ｂ）前記遺伝子を
含有するＤＮＡ断片を発生させ、そして非機能的遺伝標
識を生産するための＋ｉｉｊ記選釈可能な遺伝標識の１
つの挿入的不活性化（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ １ｎ
ａｃｔｉｖａＬｉｏｎ）が起こるように、前記ＤＮＡ断
片を（６）のｊｉｉ＋記プラスミ１ζ中に組み込み、少
なくとも１種の機能的選択０■能な遺伝標識を残して、
組換え雑種プラスミドおよび副産物として、（ａ）のｒ
ｉｉｉ記２機能プラスミドを含有する混合物を生産し、
（ｃ’）（ｂ）の前記混合物を、（ａ）の前記選択可
能な遺伝標識をもたないＥ、ｃｏｌｉ微生物中に組み込
んで、前記Ｅ、ｃｏｌｉを形質転換さゼ、 （ｄ）（ｂ
）の前記プラスミドを含有するＥ、ｃｏｌｉ形質転換体
を、前記機能的選択可能な遺伝標識により選択し、（ｅ
）前記非機能的の、挿入的に不活性化された遺伝標識の
存在について（ｄ）の前記形質転換体をスクリーニング
することにより、前記組換えプラスミドを含有する形質
転換体を同定し、（ｆ）プラスミドＤＮＡを（ｅ）の前
記Ｅ、ｃｏ ｌ ｉ形質転換体から抽出し、（ｇｃ
（ａ）の前記選択可能な遺伝標識を含有しない前記Ｂａ
ｃｉ ｌ ｌｕｓ宿主微生物を、（ｆ）からの前記プラ
スミドＤＮＡで形質転換し、（ｈ）前記組換えプラスミ
ドを含有する前記Ｂａｃ ｉ ｌ ｌｕｓ宿主形質転換
体を、前記機能的に選択可能な遺伝標識により選択し、
そして（ｉ）それから、前記プラスミド−［−の前記遺
伝子により暗号化された前記酵素を生産することができ
る、Ｂａｃｉ ｌ ｌｕｓ宿主微生物を単離することを
特徴とを含む。
ラーゼ、プロテアーゼ、アミログルコシターゼまたはグ
ルコースイソメラーゼを暗号化（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）す
る遺伝子を、他の種のＢａｃｉ ］ ｌｕｓ宿主微生物
にクローニングする方法に関する。この方法は、（ａ）
Ｅ、ｃｏｌｉおよびＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓの両者の中で
複製する能力を有する２機能プラスミド、ここで前記プ
ラスミドは少なくとも２つの選択可能な遺伝標識（ｍａ
ｒｋｅｒ）を含有する、をエンドヌクレアーゼで消化し
て、線状プラスミド分子を生産し、（ｂ）前記遺伝子を
含有するＤＮＡ断片を発生させ、そして非機能的遺伝標
識を生産するための＋ｉｉｊ記選釈可能な遺伝標識の１
つの挿入的不活性化（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ １ｎ
ａｃｔｉｖａＬｉｏｎ）が起こるように、前記ＤＮＡ断
片を（６）のｊｉｉ＋記プラスミ１ζ中に組み込み、少
なくとも１種の機能的選択０■能な遺伝標識を残して、
組換え雑種プラスミドおよび副産物として、（ａ）のｒ
ｉｉｉ記２機能プラスミドを含有する混合物を生産し、
（ｃ’）（ｂ）の前記混合物を、（ａ）の前記選択可
能な遺伝標識をもたないＥ、ｃｏｌｉ微生物中に組み込
んで、前記Ｅ、ｃｏｌｉを形質転換さゼ、 （ｄ）（ｂ
）の前記プラスミドを含有するＥ、ｃｏｌｉ形質転換体
を、前記機能的選択可能な遺伝標識により選択し、（ｅ
）前記非機能的の、挿入的に不活性化された遺伝標識の
存在について（ｄ）の前記形質転換体をスクリーニング
することにより、前記組換えプラスミドを含有する形質
転換体を同定し、（ｆ）プラスミドＤＮＡを（ｅ）の前
記Ｅ、ｃｏ ｌ ｉ形質転換体から抽出し、（ｇｃ
（ａ）の前記選択可能な遺伝標識を含有しない前記Ｂａ
ｃｉ ｌ ｌｕｓ宿主微生物を、（ｆ）からの前記プラ
スミドＤＮＡで形質転換し、（ｈ）前記組換えプラスミ
ドを含有する前記Ｂａｃ ｉ ｌ ｌｕｓ宿主形質転換
体を、前記機能的に選択可能な遺伝標識により選択し、
そして（ｉ）それから、前記プラスミド−［−の前記遺
伝子により暗号化された前記酵素を生産することができ
る、Ｂａｃｉ ｌ ｌｕｓ宿主微生物を単離することを
特徴とを含む。
本発明の方法は、α−アミラーゼ、プロテアーゼ、アミ
ログルコシダーゼまたはグルコースイソメラーゼを暗号
化する遺伝子を、Ｂａｃｉ ｌ Ｉ ｕＳ宿主微生物に
、クローニングする方法を提供する。中−・または複数
の遺伝子のコーピーを、本発明の方法によりクローニン
グすることができる。
ログルコシダーゼまたはグルコースイソメラーゼを暗号
化する遺伝子を、Ｂａｃｉ ｌ Ｉ ｕＳ宿主微生物に
、クローニングする方法を提供する。中−・または複数
の遺伝子のコーピーを、本発明の方法によりクローニン
グすることができる。
以下の説明において、種々の微生物はＡＴＣＣまたはＢ
ＧＳＣの番号を有するとして表示される。各ＡＴＣＣ表
示された微生物は、アメリカンφタイプ・カルチャー・
コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ
１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔ ｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉ
ｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）から入手、することができ
、そしてＢＧＳＣ表示されている微生物は、へシルス・
ジエネチ・ンク・スト・ンク争センター（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓＧｅｎｅｔｉｃ Ｃｅｎｔｅｒ、０ｈｉｏ ５
ｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｃｏｌｕｍｂｕ
ｓ、０ｈｉｏ）から入手することかできる。
ＧＳＣの番号を有するとして表示される。各ＡＴＣＣ表
示された微生物は、アメリカンφタイプ・カルチャー・
コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ
１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔ ｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉ
ｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）から入手、することができ
、そしてＢＧＳＣ表示されている微生物は、へシルス・
ジエネチ・ンク・スト・ンク争センター（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓＧｅｎｅｔｉｃ Ｃｅｎｔｅｒ、０ｈｉｏ ５
ｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｃｏｌｕｍｂｕ
ｓ、０ｈｉｏ）から入手することかできる。
本発明は、異質ＤＮＡ断片のプラスミド分子中への導入
のっての以下の説明から、より容易に理解されうるであ
ろう。
のっての以下の説明から、より容易に理解されうるであ
ろう。
まず、Ｅ、ｃｏｌｉおよびＢ、５ｕｂｔｉｌｉＳの両者
の中で複製し、次ぎの特性を有する、２機能プラスミド
を選択する。このプラスミドは、アンピシリン抵抗性（
ＡＰＲ）、テトラサイクリン抵抗性（ＴＣＲ）、および
クロラミフェニコール抵抗性（ＣｍＲ）について遺伝子
類を暗号化し、ここでＡｐ”、ＴｃＲ１およびＣｍＲは
、すべて、Ｅ、ｃｏｌｉ中で機能し、そしてＣｍＲのみ
はＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓ中で機能する。これらの遺伝子
類は、選択可能な遺伝標識として機能する。
の中で複製し、次ぎの特性を有する、２機能プラスミド
を選択する。このプラスミドは、アンピシリン抵抗性（
ＡＰＲ）、テトラサイクリン抵抗性（ＴＣＲ）、および
クロラミフェニコール抵抗性（ＣｍＲ）について遺伝子
類を暗号化し、ここでＡｐ”、ＴｃＲ１およびＣｍＲは
、すべて、Ｅ、ｃｏｌｉ中で機能し、そしてＣｍＲのみ
はＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓ中で機能する。これらの遺伝子
類は、選択可能な遺伝標識として機能する。
プラスミド分子は１．ＴＣＲ遺伝遺伝子持別の部位を切
断する制限エンドヌクレアーゼで消化する。このような
消化は、線状プラスミド分子を生ずる。これらの線状分
子は、ここで異質のＤＮＡ断片と混合されており、この
ＤＮＡ断片は同様に同一の制限エンドヌクレアーセの消
化により生産されたものである。異質ＤＮＡ分子および
線状プラスミドＤＮＡ分子は同一の「スティッキーエン
ド」をもち、そしてこれらのエンドはアニーリングして
組み換え雑種分子を形成するであろう。アニーリングし
たエンドは、ここでＤＮＡリガーゼ酵素の作用により［
シール（ｓｅａｌ）Ｊされる。
断する制限エンドヌクレアーゼで消化する。このような
消化は、線状プラスミド分子を生ずる。これらの線状分
子は、ここで異質のＤＮＡ断片と混合されており、この
ＤＮＡ断片は同様に同一の制限エンドヌクレアーセの消
化により生産されたものである。異質ＤＮＡ分子および
線状プラスミドＤＮＡ分子は同一の「スティッキーエン
ド」をもち、そしてこれらのエンドはアニーリングして
組み換え雑種分子を形成するであろう。アニーリングし
たエンドは、ここでＤＮＡリガーゼ酵素の作用により［
シール（ｓｅａｌ）Ｊされる。
結合反応は、組み換え分子の発生が非効率的過程である
ので、プラスミドＤＮＡ分子の混合物を生産する。プラ
スミド分子は、次ぎの型であることができる： （ａ）
表現型ＡｐＲ，ＴｃＲ，ＣｍＲの、異質ＤＮＡ断片と反
応したもとの２ｊａ能プラスミド、および（ｂ）表現、
！ｌ！ｌ、ＡＰ 、Ｔｃ”（゛テトラサイクリン抵抗
性） 、ＣｍＲの、ＴｃＲ部位における異質ＤＮＡ断片
を含有する組み換え雑種プラスミド。こうして、テトラ
サイクリン抵抗性は、異質ＤＮＡ断片の挿入により不活
性化され、そして非機能性の選択可能な遺伝標識となる
。
ので、プラスミドＤＮＡ分子の混合物を生産する。プラ
スミド分子は、次ぎの型であることができる： （ａ）
表現型ＡｐＲ，ＴｃＲ，ＣｍＲの、異質ＤＮＡ断片と反
応したもとの２ｊａ能プラスミド、および（ｂ）表現、
！ｌ！ｌ、ＡＰ 、Ｔｃ”（゛テトラサイクリン抵抗
性） 、ＣｍＲの、ＴｃＲ部位における異質ＤＮＡ断片
を含有する組み換え雑種プラスミド。こうして、テトラ
サイクリン抵抗性は、異質ＤＮＡ断片の挿入により不活
性化され、そして非機能性の選択可能な遺伝標識となる
。
前述のプラスミド分子の混合物は、初めこれらの遺伝標
識、すなわち、Ａｐ’ （アンピシリン感受性）、Ｔ
ｃ’をもたない、Ｅ、ｃｏｌｉ微生物への形質転換によ
り組込まれる。ここで（ａ）または（ｂ）のいずれかの
プラスミド分子を含有するＥ、ｃｏｌｉ細胞は、それら
のＡ２２表現型により、形質転換されていない（形質転
換は非効率的過程である）細胞から選択されることがで
きる。この選択は、アンピシリンを含有する培地りです
べての細胞を生長させることにより実施する。ＡＰＲ細
胞のみは、生長するであるかもとのプラスミド含有する
Ｅ、ｃｏｌｉ細胞［’１ｊｊｊ述の（ａ）］と比較して
、組み換え雑種プラスミドを含有する］Ｅ、ｃｏｌｉ細
胞［前述の（ｂ）］は、１’ｃＳ表現型ついてＡｐＲ形
質転換体をスクリーニングすることによって得られる。
識、すなわち、Ａｐ’ （アンピシリン感受性）、Ｔ
ｃ’をもたない、Ｅ、ｃｏｌｉ微生物への形質転換によ
り組込まれる。ここで（ａ）または（ｂ）のいずれかの
プラスミド分子を含有するＥ、ｃｏｌｉ細胞は、それら
のＡ２２表現型により、形質転換されていない（形質転
換は非効率的過程である）細胞から選択されることがで
きる。この選択は、アンピシリンを含有する培地りです
べての細胞を生長させることにより実施する。ＡＰＲ細
胞のみは、生長するであるかもとのプラスミド含有する
Ｅ、ｃｏｌｉ細胞［’１ｊｊｊ述の（ａ）］と比較して
、組み換え雑種プラスミドを含有する］Ｅ、ｃｏｌｉ細
胞［前述の（ｂ）］は、１’ｃＳ表現型ついてＡｐＲ形
質転換体をスクリーニングすることによって得られる。
このスクリーニングは、テトラサイタリンを含有する培
地上ですべてのＡＰＲ細胞を生長させることによって実
施される。Ｔ ｃ ’ ａ胞はこの培地で生長しないが
、アンピシリンを含有する培地で生長した細胞の複製の
組［複製−平板培養（ｒｅｐｌｉｃａ−ｐｌａｔｉｎｇ
）］から回収することかできる。
地上ですべてのＡＰＲ細胞を生長させることによって実
施される。Ｔ ｃ ’ ａ胞はこの培地で生長しないが
、アンピシリンを含有する培地で生長した細胞の複製の
組［複製−平板培養（ｒｅｐｌｉｃａ−ｐｌａｔｉｎｇ
）］から回収することかできる。
プラスミドＤＮＡは、これらのＡＰＲ，ＴＣＳＥ、ｃｏ
ｌｉ細胞から抽出され、そしてＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓｌ
宿主細胞、これは初め前述の遺伝標識をもたない、中に
形質転換により組み込まれる。プラスミドを含有する、
Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉＳ細胞は、プラスミドを含有しない
ものから、それらのＣｍＲ表現型により選択される。
ｌｉ細胞から抽出され、そしてＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓｌ
宿主細胞、これは初め前述の遺伝標識をもたない、中に
形質転換により組み込まれる。プラスミドを含有する、
Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉＳ細胞は、プラスミドを含有しない
ものから、それらのＣｍＲ表現型により選択される。
この選択は、クロランフェニコールを含有する培地−ヒ
ですべてのＢ、５ｕｂＬｉｌｉｓ細胞を生長させること
によって実施される。ＣｍＲである細胞のみが生長する
だけであろう。これのＣｍＲ細胞のすべては、組み換え
雑種プラスミドを含有する。
ですべてのＢ、５ｕｂＬｉｌｉｓ細胞を生長させること
によって実施される。ＣｍＲである細胞のみが生長する
だけであろう。これのＣｍＲ細胞のすべては、組み換え
雑種プラスミドを含有する。
適邑なプラスミドは、２機能性、すなわち、２つの細菌
種、たとえば、Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓおよびＥ、ｃｏｌ
ｉ微生物の中で複製できる、プラスミドである。このよ
うな２機能プラスミドは、Ｐｒ’ｏｃ、Ｎａｔ １．Ａ
’ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ、７５ （３）： １４３
３−１４３６ （１９７８）に記載されている、ｐＨＶ
３３、ＡＴＣＣ３９２１７オヨＵＰＨＶ １１を包含す
ル。
種、たとえば、Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓおよびＥ、ｃｏｌ
ｉ微生物の中で複製できる、プラスミドである。このよ
うな２機能プラスミドは、Ｐｒ’ｏｃ、Ｎａｔ １．Ａ
’ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ、７５ （３）： １４３
３−１４３６ （１９７８）に記載されている、ｐＨＶ
３３、ＡＴＣＣ３９２１７オヨＵＰＨＶ １１を包含す
ル。
このようなプラスミド類は、少なくとも２つの「選択可
能な」遺伝標識を含有しなくてはならない。選択可能な
遺伝標識を得ることにより、予備的選択技術を用いるこ
とが可能となり、たとえば、形質転換された微生物があ
る種の抗生物質に対して抵抗性であるとき、微生物をこ
のような抗生物質および生存し・うる形質転換体として
選択されうる微生物の存在下−に培養することができる
。
能な」遺伝標識を含有しなくてはならない。選択可能な
遺伝標識を得ることにより、予備的選択技術を用いるこ
とが可能となり、たとえば、形質転換された微生物があ
る種の抗生物質に対して抵抗性であるとき、微生物をこ
のような抗生物質および生存し・うる形質転換体として
選択されうる微生物の存在下−に培養することができる
。
選択可能な遺伝標識は、抗生物質抵抗性に限定されない
が、生長要件物質（ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｑｕｉｒｅｍ
ｅｎｔｓ）を含むことができ、たとえば、微生物はアミ
ノ酸、たとえば、スレオニン、リシン、チロシン、アラ
ニン、ロイシン、またはセリンの存在を必要とする。プ
リン類およびピリミジン類、たとえば、アゾこン、ナミ
ン、グアニン、シトシンおよびウラシル、は、 Ｐ１様
に生長要件物質としておよび選択可能な遺伝標識として
機能することができる。
が、生長要件物質（ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｑｕｉｒｅｍ
ｅｎｔｓ）を含むことができ、たとえば、微生物はアミ
ノ酸、たとえば、スレオニン、リシン、チロシン、アラ
ニン、ロイシン、またはセリンの存在を必要とする。プ
リン類およびピリミジン類、たとえば、アゾこン、ナミ
ン、グアニン、シトシンおよびウラシル、は、 Ｐ１様
に生長要件物質としておよび選択可能な遺伝標識として
機能することができる。
選択可能な遺伝標識の１種またはそれ以上は「挿入的に
不活性化」されることができ、すなわち、プラスミド中
へのＤＮＡ断片の挿入は選択可能な遺伝標識の１つを不
活性化するであろう、ということも１つの要件である。
不活性化」されることができ、すなわち、プラスミド中
へのＤＮＡ断片の挿入は選択可能な遺伝標識の１つを不
活性化するであろう、ということも１つの要件である。
たとえば、遺伝標識の１つが、薬物抵抗性、たとえば、
クロランフェニコール抵抗性（ＣｍＲ）、アンピシリン
抵抗性（Ａ ｐＲ）およびテトラサイクリン抵抗性（Ｔ
ＣＲ）、を与える遺伝子を含むとき、遺伝標識の１つ、
たとえば、遺伝子、は不活性化され、ここで細胞は、遺
伝標識としての役目をするために、薬物、すなわち、Ｃ
ｍＲ，ＡｐＲ，またはＴｃＲに対して感受性とされる。
クロランフェニコール抵抗性（ＣｍＲ）、アンピシリン
抵抗性（Ａ ｐＲ）およびテトラサイクリン抵抗性（Ｔ
ＣＲ）、を与える遺伝子を含むとき、遺伝標識の１つ、
たとえば、遺伝子、は不活性化され、ここで細胞は、遺
伝標識としての役目をするために、薬物、すなわち、Ｃ
ｍＲ，ＡｐＲ，またはＴｃＲに対して感受性とされる。
遺伝標識類は両者共同型、すなわち、２つの抗生物質の
遺伝標識または２つの生長要件物質であることができ、
あるいは抗生物質の遺伝標識および生長要件物質の組み
合わせであることができる。
遺伝標識または２つの生長要件物質であることができ、
あるいは抗生物質の遺伝標識および生長要件物質の組み
合わせであることができる。
たとえば、ロイシンの遺伝子および抗生物質抵抗性の遺
伝子を含有する２機能プラスミドを次ぎのように使用す
ることができる。抗生物質抵抗性の遺伝子中へのＤＮＡ
断片の挿入を使用して抗生物質抵抗性遺伝子を不活性化
して、非機能性遺伝標識を生産し、ロイシンの遺伝子を
機能的選択可能な遺伝標識として残すことができるであ
ろう。
伝子を含有する２機能プラスミドを次ぎのように使用す
ることができる。抗生物質抵抗性の遺伝子中へのＤＮＡ
断片の挿入を使用して抗生物質抵抗性遺伝子を不活性化
して、非機能性遺伝標識を生産し、ロイシンの遺伝子を
機能的選択可能な遺伝標識として残すことができるであ
ろう。
生産された組換えプラスミドは、生長のためのロイシン
を必要とする、適当なＥ、ｃｏｌｉ微生物（後述する）
中へ組み込まれる。組換えプラスミドおよびもとの２機
能プラスミドの両者を含有するＥ、ｃｏｌｉ形質転換体
は、機能的に選択可能な遺伝標識としてロイシン生長要
件物質を利用することにより選択される。この選択は、
ロイシンの不存在Ｆに微生物を生長させ、そして生存す
る微生物を選択することによって、達成される。これら
の微生物から、組換えプラスミドのみを含有するＥ、ｃ
ｏｌｉ形質転換体は、あるプラスミド４を含有するもの
について、非機能性の挿入的に不活性化された抗生物質
抵抗性遺伝標識で、形質転換体をスクリーニングするこ
とによって同定される。復製−・１ｉ板培養の使用によ
り、抗生物質の存在ドに生長できない形質転換体を同定
することによって達成される。次いで、これらの形質転
換体からのプラスミドＤＮＡを抽出し、そして選択可能
な遺伝標識を含有しないＢａｃｉ １１ｕｓ宿主微生物
を形質転換するために使用する。紹換えプラスミドを含
有する所望のＢ、 ５ｕｂｔ ｉ Ｉ ｉ ｓ形質転換
体は、機能的選択ＦｉＪ能な遺伝標識、すなわち、ロイ
シン生長要件物質、を用いることにより選択され、そし
て所望の酵素生産性微生物が単離される。
を必要とする、適当なＥ、ｃｏｌｉ微生物（後述する）
中へ組み込まれる。組換えプラスミドおよびもとの２機
能プラスミドの両者を含有するＥ、ｃｏｌｉ形質転換体
は、機能的に選択可能な遺伝標識としてロイシン生長要
件物質を利用することにより選択される。この選択は、
ロイシンの不存在Ｆに微生物を生長させ、そして生存す
る微生物を選択することによって、達成される。これら
の微生物から、組換えプラスミドのみを含有するＥ、ｃ
ｏｌｉ形質転換体は、あるプラスミド４を含有するもの
について、非機能性の挿入的に不活性化された抗生物質
抵抗性遺伝標識で、形質転換体をスクリーニングするこ
とによって同定される。復製−・１ｉ板培養の使用によ
り、抗生物質の存在ドに生長できない形質転換体を同定
することによって達成される。次いで、これらの形質転
換体からのプラスミドＤＮＡを抽出し、そして選択可能
な遺伝標識を含有しないＢａｃｉ １１ｕｓ宿主微生物
を形質転換するために使用する。紹換えプラスミドを含
有する所望のＢ、 ５ｕｂｔ ｉ Ｉ ｉ ｓ形質転換
体は、機能的選択ＦｉＪ能な遺伝標識、すなわち、ロイ
シン生長要件物質、を用いることにより選択され、そし
て所望の酵素生産性微生物が単離される。
−１−に示したように、適当なりａｃｉｌｌｕｓｌｌ生
物を使用する。これらの微生物の１つの要件は、それら
が２機能プラスミドの選択可能な遺伝標識を有してはな
らない、きいうことである。適当なりａｃｉ Ｉ ｌｕ
ｓ宿主微生物は、Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ １６８（Ａ
ＴＣＣ２７６８９）、Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ （ＢＧＳ
ＣＩ Ａ ２ ８９）、Ｂ、ａｍｙｌｏｌｉｑｕｉ
ｆａｃｉｅｎｓＨ（ＢＧＳＣ１０Ａ２）、およびＢ、Ｉ
ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＡＴＣＣ２７８１１を包
含する。
物を使用する。これらの微生物の１つの要件は、それら
が２機能プラスミドの選択可能な遺伝標識を有してはな
らない、きいうことである。適当なりａｃｉ Ｉ ｌｕ
ｓ宿主微生物は、Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ １６８（Ａ
ＴＣＣ２７６８９）、Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ （ＢＧＳ
ＣＩ Ａ ２ ８９）、Ｂ、ａｍｙｌｏｌｉｑｕｉ
ｆａｃｉｅｎｓＨ（ＢＧＳＣ１０Ａ２）、およびＢ、Ｉ
ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＡＴＣＣ２７８１１を包
含する。
同様に、適当なＥ、ｃｏｌｉ微生物は、２機能プラスミ
ドの選択可能な遺伝標識をもたないものから選択するこ
とができる。たとえば、Ｅ、ｃ。
ドの選択可能な遺伝標識をもたないものから選択するこ
とができる。たとえば、Ｅ、ｃ。
１ｉ Ｋ１２（ＡＴＣＣ１０７９８）およびＥ、ｃｏ
ｌｉ Ｃ６００（ＡＴＣＣ３３５３５）を使用できる
。
ｌｉ Ｃ６００（ＡＴＣＣ３３５３５）を使用できる
。
所望の酵素について暗号化する所望の遺伝子を含有する
、適当なりａｃｉｌｌｕＳ種からの染色体ＤＮＡは、後
述する普通の技術により単離することができる。染色体
ＤＮＡを得ることができる適当な微生物は、次ぎのちの
を包含する：α−アミラーゼ、Ｂ、ｃｅｒｅｕｓ Ａ
ＴＣＣ２１７６８、プロテアーゼ、Ｂ、ａｍｙｌｏｌｉ
ｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ ＡＴＣＣ２３８４２および２
３８４４、Ｂ、ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ ＡＴＣＣ
２１５２２およびＢ、ｌ １ｃｈｅｎｉｆ 。
、適当なりａｃｉｌｌｕＳ種からの染色体ＤＮＡは、後
述する普通の技術により単離することができる。染色体
ＤＮＡを得ることができる適当な微生物は、次ぎのちの
を包含する：α−アミラーゼ、Ｂ、ｃｅｒｅｕｓ Ａ
ＴＣＣ２１７６８、プロテアーゼ、Ｂ、ａｍｙｌｏｌｉ
ｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ ＡＴＣＣ２３８４２および２
３８４４、Ｂ、ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ ＡＴＣＣ
２１５２２およびＢ、ｌ １ｃｈｅｎｉｆ 。
ｒｍｉｓ ＡＴＣＣ２１４２４、アミログルコシダー
セ、Ｂ、５ｕｂｊｉｌｊｓ ＡＴＣＣ３１０６８、お
よびグルコースイソメラーセ、Ｂ。
セ、Ｂ、５ｕｂｊｉｌｊｓ ＡＴＣＣ３１０６８、お
よびグルコースイソメラーセ、Ｂ。
１ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＡＴＣＣ３１６６７、
（米国特許第４，３５５，１０３号中に開示されている
）。
（米国特許第４，３５５，１０３号中に開示されている
）。
ＤＮＡ断片は、適当な制限酵素、たとえば、Ｂａｍ
ＨＩまたはＳａｌ Ｉ、を用いる開裂を包含する普通
の技術により発生させることができる。ＤＮＡ断片は、
少なくとも１つの断片がクローニングすべき全遺伝子を
含有することを保証する大きさであるべきである。後述
する酵素、すなわち、α−アミラーゼ、プロテアーゼ、
アミログルコシターセおよびグルコースイソメラーセ、
について、断片は約２メガダルトン（Ｍｄ）以−ヒの大
きさであるべきである。
ＨＩまたはＳａｌ Ｉ、を用いる開裂を包含する普通
の技術により発生させることができる。ＤＮＡ断片は、
少なくとも１つの断片がクローニングすべき全遺伝子を
含有することを保証する大きさであるべきである。後述
する酵素、すなわち、α−アミラーゼ、プロテアーゼ、
アミログルコシターセおよびグルコースイソメラーセ、
について、断片は約２メガダルトン（Ｍｄ）以−ヒの大
きさであるべきである。
ＤＮＡは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼまたはＥ、ｃｏｌｉ
ＤＮＡリガーゼの使用を含む、普通の結合技術によ
り、２機能プラスミド中へ組み込むことができる。
ＤＮＡリガーゼの使用を含む、普通の結合技術によ
り、２機能プラスミド中へ組み込むことができる。
α−アミラーゼを暗号化する遺伝子を含有する適当なり
、ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ微生物は、１ 文ノＰｅ
ｎ ａ、ｓ ｓ ａｖ肉汁（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ
Ｍｅｄｉｕｍ ＃３、Ｄｉｆｃｏ ＬａｂｏｒＳ
ｔｏｒｆｅｓ、Ｄｅｔｒｏｒｔ 、ＭｆＣｈｇａｎから
入手できる）中で通気しながら１８時間生長させた。細
胞を、遠心分離により収穫し、そして０．１５モルのＮ
ａＣ１，０，１モルのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴ
Ａ）から成るｐＨ８，０の緩衝液の５０ｍ１中に再懸濁
させた。細胞の溶解は、５ｍｇのリソチーム（卵白の結
晶質リソチーム、Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ、Ｅｌｋｈａｒｊ 、Ｉｎｄｉａｎａから商業的に
人手できる）を添加し、次いで３７°Ｃで３０分間保温
する、ことによって実施した・０．１モルのトリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン塩酸ｋｌ（ｔｒｉｓ）、
０．１モル（７） Ｎ ａ Ｃ１，０，５％のドデシル
硫酸すトリウム（ＳＤＳ）から成る、ｐＨ８，０の緩衝
液の１５０ｍ１を加えて、溶解工程を達成した。リゼイ
トを、２００ｍ１の７ｘノール（０，１モルのｔｒｉｓ
、ｐＨ８，０で平衡化したもの）および２０ ｍ ｌの
クロロホルム−イソアミルアルコール、２４：１の比、
で抽出することにより、タンパク質を除去した。［−相
をクロロホルム−イソアミルアルコールで２回以上で抽
出した。上相を０．１モルのＮａＣ１とし、そしてＤＮ
Ａを２体積の冷９５％のエタノールで沈澱させた。この
ＤＮＡを０．１５モルのＮａＣ１および０．０１５モル
のクエン酸ナトリウム、ｐＨ７，０、から成る、０．１
モルの食塩クエン酸塩緩衝液（ＳＳＣ）の１５０ｍ１中
に溶解した。このＤＮＡ溶液を、１０ｍｇのＲＮａｓｅ
で３７℃において２時間処理し、次いで１．５ｍｇのプ
ロテアーゼ（Ｐｒｏｎａｓｅ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、
ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａから商業的に入
手できる）３７°Ｃにおいて３０分間処理した。この溶
液をフェノール（ｌ′ｉ１７述したもの）で２回抽出し
、０．１ｘＳＳＣ中に溶解した。このＤＮＡ溶液を０．
１ｘ ｓｓｃに対して４℃において透析して残留フ□
ノール、ＳＤＳおよびエタノールを除去１７た。
、ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ微生物は、１ 文ノＰｅ
ｎ ａ、ｓ ｓ ａｖ肉汁（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ
Ｍｅｄｉｕｍ ＃３、Ｄｉｆｃｏ ＬａｂｏｒＳ
ｔｏｒｆｅｓ、Ｄｅｔｒｏｒｔ 、ＭｆＣｈｇａｎから
入手できる）中で通気しながら１８時間生長させた。細
胞を、遠心分離により収穫し、そして０．１５モルのＮ
ａＣ１，０，１モルのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴ
Ａ）から成るｐＨ８，０の緩衝液の５０ｍ１中に再懸濁
させた。細胞の溶解は、５ｍｇのリソチーム（卵白の結
晶質リソチーム、Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ、Ｅｌｋｈａｒｊ 、Ｉｎｄｉａｎａから商業的に
人手できる）を添加し、次いで３７°Ｃで３０分間保温
する、ことによって実施した・０．１モルのトリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン塩酸ｋｌ（ｔｒｉｓ）、
０．１モル（７） Ｎ ａ Ｃ１，０，５％のドデシル
硫酸すトリウム（ＳＤＳ）から成る、ｐＨ８，０の緩衝
液の１５０ｍ１を加えて、溶解工程を達成した。リゼイ
トを、２００ｍ１の７ｘノール（０，１モルのｔｒｉｓ
、ｐＨ８，０で平衡化したもの）および２０ ｍ ｌの
クロロホルム−イソアミルアルコール、２４：１の比、
で抽出することにより、タンパク質を除去した。［−相
をクロロホルム−イソアミルアルコールで２回以上で抽
出した。上相を０．１モルのＮａＣ１とし、そしてＤＮ
Ａを２体積の冷９５％のエタノールで沈澱させた。この
ＤＮＡを０．１５モルのＮａＣ１および０．０１５モル
のクエン酸ナトリウム、ｐＨ７，０、から成る、０．１
モルの食塩クエン酸塩緩衝液（ＳＳＣ）の１５０ｍ１中
に溶解した。このＤＮＡ溶液を、１０ｍｇのＲＮａｓｅ
で３７℃において２時間処理し、次いで１．５ｍｇのプ
ロテアーゼ（Ｐｒｏｎａｓｅ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、
ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａから商業的に入
手できる）３７°Ｃにおいて３０分間処理した。この溶
液をフェノール（ｌ′ｉ１７述したもの）で２回抽出し
、０．１ｘＳＳＣ中に溶解した。このＤＮＡ溶液を０．
１ｘ ｓｓｃに対して４℃において透析して残留フ□
ノール、ＳＤＳおよびエタノールを除去１７た。
このＤＮＡをＳａｌ 制限エンドヌクレアーセ（Ｍｉ
ｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、
Ｅｌｋｈａｒｔ、Ｉｎｄｉａｎａから商業的に入手でき
る）で供給会社が推奨する条件下で開裂させた。α−ア
ミラーゼ遺伝子がこの酵素で開裂されないことを確保す
るために、酵素処理の条件を、部分的消化のみが達成さ
れるように、確１ヶした。条件は、限定された期間にわ
たって酵素の低い濃度を用いることを含んだ。これらの
条件は、肖業者により容易に決定さうる。生ずる断片を
スクロースの密度勾配遠心により分離し、そしでＤＮＡ
断片の２メ力ダルドア以上を含有するフラクションをク
ローニングのために選択した。
ｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、
Ｅｌｋｈａｒｔ、Ｉｎｄｉａｎａから商業的に入手でき
る）で供給会社が推奨する条件下で開裂させた。α−ア
ミラーゼ遺伝子がこの酵素で開裂されないことを確保す
るために、酵素処理の条件を、部分的消化のみが達成さ
れるように、確１ヶした。条件は、限定された期間にわ
たって酵素の低い濃度を用いることを含んだ。これらの
条件は、肖業者により容易に決定さうる。生ずる断片を
スクロースの密度勾配遠心により分離し、そしでＤＮＡ
断片の２メ力ダルドア以上を含有するフラクションをク
ローニングのために選択した。
Ｂ、 Ｊ）ＨＶ３３プラスミドのｒ酊Ｅ仕呵佐週ｙプ
ラスミドｐＨＶ３３は、ＡＴＣＣからＥ、ｃｏ ｌ ｉ
ＲＲＩ （ＡＴＣＣ３９２１７）において人手でき
る。プラスミドＤＮＡは、吹きの手１哨１ｏｇｙ、Ｒｏ
ｂｅｒｔ Ｆ、５ｃｈｌｅｉｆ。
ラスミドｐＨＶ３３は、ＡＴＣＣからＥ、ｃｏ ｌ ｉ
ＲＲＩ （ＡＴＣＣ３９２１７）において人手でき
る。プラスミドＤＮＡは、吹きの手１哨１ｏｇｙ、Ｒｏ
ｂｅｒｔ Ｆ、５ｃｈｌｅｉｆ。
（１９８１）、参照］。
ｐＨＶ３３を含有する上のＥ、ｃｏｌｉを、５０ ｐＬ
ｍ７／ ｍ Ｌのアンピシリンを含有するＰｅｎａｓｓ
ｙ肉Ｆの６００ｍ１中で、通気しながら中−指数的生長
相に、はぼ３時間生長させた。同時に、１５０ｍｇのク
ロランフェニコールを培養物に加えて、プラスミドＤＮ
Ａを増幅させる。保温を２３時間続けた。細胞は、遠心
分離により収穫し、０．０１モルのｔ ｒ ｉ ｓ、０
．００１モルのエチレンジアミン四酢酸（Ｅ Ｄ ＴＡ
）から成るｐＨ８，０の緩衝液（ＴＥ 緩衝液）中で
１回洗浄した。洗浄した細胞を２５％のスクロース、０
、０５モルノｔ ｒ ｉ ５−ＨＣｌを含有する緩衝
液、ｐＨａ、ｏ、の５０ｍ１中に懸濁した。溶解は、５
ｍｇのリソチームを添加し、次いで水浴中で１０分間保
温することによって達成した。１ｍｌの０．２５モルの
ＥＤＴＡを加え、そして保温を１０分間さらに続けた。
ｍ７／ ｍ Ｌのアンピシリンを含有するＰｅｎａｓｓ
ｙ肉Ｆの６００ｍ１中で、通気しながら中−指数的生長
相に、はぼ３時間生長させた。同時に、１５０ｍｇのク
ロランフェニコールを培養物に加えて、プラスミドＤＮ
Ａを増幅させる。保温を２３時間続けた。細胞は、遠心
分離により収穫し、０．０１モルのｔ ｒ ｉ ｓ、０
．００１モルのエチレンジアミン四酢酸（Ｅ Ｄ ＴＡ
）から成るｐＨ８，０の緩衝液（ＴＥ 緩衝液）中で
１回洗浄した。洗浄した細胞を２５％のスクロース、０
、０５モルノｔ ｒ ｉ ５−ＨＣｌを含有する緩衝
液、ｐＨａ、ｏ、の５０ｍ１中に懸濁した。溶解は、５
ｍｇのリソチームを添加し、次いで水浴中で１０分間保
温することによって達成した。１ｍｌの０．２５モルの
ＥＤＴＡを加え、そして保温を１０分間さらに続けた。
溶解は、孜ぎの成分から構成された洗浄剤溶液の３．２
ｍｌの添加により完結した＝１．０％のポリエキシエチ
レンラウリルエーテル（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓ、ｃｉｅｎ
ｔ １ｆｉｃ ＣｏｍｐａｎＶ、Ｆｉｒｈａｖｅｎ、
Ｎｅｗ Ｊｅｒｓ−ｅｙから、商品名Ｂｒ１ｊ ３
５で人手できる）、０．４％のナトリウムデオヤシコレ
ート、０．０６モルのＥＤＴＡ、および０゜０モＪｌｚ
（７）Ｔｒ ｉ ５−ＨＣ１，ｐＨ８、０，溶解混合物
を、ガラスの撹拌棒でおだやかにかきまぜた。リセイト
を、遠心分離により細胞の破片および染色体ＤＮＡを除
去することによって、透明化した。透明化されたリゼイ
トを、臭化エチジウムの存在ドに、塩化セシウムの等比
重遠心分離して、共有的に閉じた円形プラスミドＤＮＡ
を他の核酸から分離した。塩化セシウムをリセイトに周
囲温度において加えて、屈折率を１．３９９５にした。
ｍｌの添加により完結した＝１．０％のポリエキシエチ
レンラウリルエーテル（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓ、ｃｉｅｎ
ｔ １ｆｉｃ ＣｏｍｐａｎＶ、Ｆｉｒｈａｖｅｎ、
Ｎｅｗ Ｊｅｒｓ−ｅｙから、商品名Ｂｒ１ｊ ３
５で人手できる）、０．４％のナトリウムデオヤシコレ
ート、０．０６モルのＥＤＴＡ、および０゜０モＪｌｚ
（７）Ｔｒ ｉ ５−ＨＣ１，ｐＨ８、０，溶解混合物
を、ガラスの撹拌棒でおだやかにかきまぜた。リセイト
を、遠心分離により細胞の破片および染色体ＤＮＡを除
去することによって、透明化した。透明化されたリゼイ
トを、臭化エチジウムの存在ドに、塩化セシウムの等比
重遠心分離して、共有的に閉じた円形プラスミドＤＮＡ
を他の核酸から分離した。塩化セシウムをリセイトに周
囲温度において加えて、屈折率を１．３９９５にした。
１３０，０００Ｘｇにおいて４０時間遠心分離した後、
プラスミドＤＮＡのバンドを取り出し、水で飽和した５
ｅｃ−ブタノールで６回抽出して、臭化エチジウムを除
去した。最後の抽出からのＬ相を酢酸マトリラムについ
て０．３モルとし、−２０℃において２体積の冷エタノ
ールで沈澱させた。プラスミドＤＮＡｔ−ＴＥ緩衝液中
に溶解し、そしてＴＥ緩衝液に対して４°Ｃにおいて広
範に透析した。
プラスミドＤＮＡのバンドを取り出し、水で飽和した５
ｅｃ−ブタノールで６回抽出して、臭化エチジウムを除
去した。最後の抽出からのＬ相を酢酸マトリラムについ
て０．３モルとし、−２０℃において２体積の冷エタノ
ールで沈澱させた。プラスミドＤＮＡｔ−ＴＥ緩衝液中
に溶解し、そしてＴＥ緩衝液に対して４°Ｃにおいて広
範に透析した。
次いで、プラスミドＤＮＡを、Ｓａｔ Ｉ制限エンド
ヌクレアーゼ（それについて、それは独特の部位を含有
する）、円形分子が線状形態に転化されるような適当な
条件下で、開裂させた。
ヌクレアーゼ（それについて、それは独特の部位を含有
する）、円形分子が線状形態に転化されるような適当な
条件下で、開裂させた。
Ｃ０級金止運
線状化されたプラスミドＤＮＡおよびＢ、１ｉｃｈｅｎ
ｉｆｏｒｍｉｓ ＤＮＡ断片を、後述する方法で、−
緒に混合して、円形ＤＮＡ分子の集団を生産した、各分
子はｐＨＶ３３ ＤＮＡおよび多少の断片のＢ、１ｉ
ｃｈｅｎｊｆｏｒｒｎｉｓのゲノムを含有した。
ｉｆｏｒｍｉｓ ＤＮＡ断片を、後述する方法で、−
緒に混合して、円形ＤＮＡ分子の集団を生産した、各分
子はｐＨＶ３３ ＤＮＡおよび多少の断片のＢ、１ｉ
ｃｈｅｎｊｆｏｒｒｎｉｓのゲノムを含有した。
適当な緩衝液中の１０．０ｇｇ＋７）Ｂ、ｌ ｉｃ）１
ｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＤＮＡｔｌｉ、Ｍ−（Ｓａｌ
Ｉで処理した）、２．８ルｇのＳａｌ Ｉ処理した
ｐＨＶ３３．０．００２モルのアデノシントリホスフェ
−） （ＡＴＰ）、０．５角ｇのＴ４ ＤＮＡリガー
ゼ（Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ
、から商業的に入手される）から成る反応混合物を、１
４．５°Ｃにおいて１８時間保湿した６反応群合物の合
計の体積は、８０１１．１であった。
ｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＤＮＡｔｌｉ、Ｍ−（Ｓａｌ
Ｉで処理した）、２．８ルｇのＳａｌ Ｉ処理した
ｐＨＶ３３．０．００２モルのアデノシントリホスフェ
−） （ＡＴＰ）、０．５角ｇのＴ４ ＤＮＡリガー
ゼ（Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ
、から商業的に入手される）から成る反応混合物を、１
４．５°Ｃにおいて１８時間保湿した６反応群合物の合
計の体積は、８０１１．１であった。
このような反応混合物は、次ぎの成分を含む：Ｂ、ｌｉ
ｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＤＮＡ断片と１ゾＪ、＋３
．： シなかった、再円形化Ｐ ＨＶ ３３分子、（Ａ
、ｊ？、ＴＣＲ）、およびテトラザイクリン遺伝子で挿
入されたＢ、ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓＤＮＡ断片を
含有する組換えプラス］；、（ＡｐＲ，Ｔｃ５）。
ｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＤＮＡ断片と１ゾＪ、＋３
．： シなかった、再円形化Ｐ ＨＶ ３３分子、（Ａ
、ｊ？、ＴＣＲ）、およびテトラザイクリン遺伝子で挿
入されたＢ、ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓＤＮＡ断片を
含有する組換えプラス］；、（ＡｐＲ，Ｔｃ５）。
６０ＩＬｌの前記結合混合物を、ｌル１の０．３モルの
ＣａＣｌ２および３０ル１のＨ２Ｏと混合した。Ｅ、ｃ
ｏｌｉ ＲＲＩ細胞を、前もってＣａ ＣＩ ２で処
理するごとにより受容性（ｃｏｍｐ ｅ ｔ ｅ ｎ
ｔ ’）とし、−７０℃において貯蔵した。結合溶液を
、２００ｇ１の融解したＥ、ｃ。
ＣａＣｌ２および３０ル１のＨ２Ｏと混合した。Ｅ、ｃ
ｏｌｉ ＲＲＩ細胞を、前もってＣａ ＣＩ ２で処
理するごとにより受容性（ｃｏｍｐ ｅ ｔ ｅ ｎ
ｔ ’）とし、−７０℃において貯蔵した。結合溶液を
、２００ｇ１の融解したＥ、ｃ。
１ｉ細胞に加え、生ずる混合物を４２℃に１分間加熱し
て、形質転換を完結した。Ｅ、ｃｏｌｉのこの形質転換
手順は、１．鼠ユ１ 、 Ｂ ｉｏ ｌ 、 。
て、形質転換を完結した。Ｅ、ｃｏｌｉのこの形質転換
手順は、１．鼠ユ１ 、 Ｂ ｉｏ ｌ 、 。
亘ヱ： １５９−１６３．１８７０中に詳述されている
。
。
次いで、この混合物を２．０ｍｌのＰｅｎａｓｓｙ肉！
１で希釈した。この懸濁液を３７°Ｃで２時Ｉｆｊｌ
！、’Ａ温して、プラスミド暗号化するアンピシリン抵
抗ゼｉ、遺伝子の表現を許した。次いで、細胞を５０ｇ
ｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＴＢＡＢ（Ｔｒｙｐ
ｔｏｓｅ Ｂｌｏｏｄ Ａｇａｒ Ｂａ５ｅ、Ｄ
ｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉ
ｔ、Ｍｉｃｈｉｇａｎから人手できる）−にで１１板培
養し、た。プラスミドＤＮＡに−より形質転換された細
胞のみは、この初期の選択において生長した。
１で希釈した。この懸濁液を３７°Ｃで２時Ｉｆｊｌ
！、’Ａ温して、プラスミド暗号化するアンピシリン抵
抗ゼｉ、遺伝子の表現を許した。次いで、細胞を５０ｇ
ｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＴＢＡＢ（Ｔｒｙｐ
ｔｏｓｅ Ｂｌｏｏｄ Ａｇａｒ Ｂａ５ｅ、Ｄ
ｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉ
ｔ、Ｍｉｃｈｉｇａｎから人手できる）−にで１１板培
養し、た。プラスミドＤＮＡに−より形質転換された細
胞のみは、この初期の選択において生長した。
生ずる形質転換体を、２０ｕｇ／ｍ、１のテ）・ラサイ
クリンを含有するＴＢＡＢのペトリ皿上で、複製−・平
板培養によりスクリーニングした。テトラサイクリンに
感受性である細胞は、テトラサイクリン抵抗性の遺伝子
中に挿入されたＢ、Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ Ｄ
ＮＡを含有するプラスミドを収容し、これによりこの遺
伝子を不活性化する。このようにして、表現型ＡｐＲ，
ＴｃＳを有するプラスミドを収容するクロンのが、同定
され、かつ保護される。
クリンを含有するＴＢＡＢのペトリ皿上で、複製−・平
板培養によりスクリーニングした。テトラサイクリンに
感受性である細胞は、テトラサイクリン抵抗性の遺伝子
中に挿入されたＢ、Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ Ｄ
ＮＡを含有するプラスミドを収容し、これによりこの遺
伝子を不活性化する。このようにして、表現型ＡｐＲ，
ＴｃＳを有するプラスミドを収容するクロンのが、同定
され、かつ保護される。
次ぎの式を使用して、全Ｂ、１ｉｃｈｅｎｉ ｆＯｒ
ｍ Ｉ Ｓゲノムが得られたクロン中に表現される、９
９％の確率を確保するために必要な、クロンの数を計算
した［Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、５３ ：１５９ （１
９７０）参照］ Ｐ＝１− （Ｌ−Ｆ）Ｎ Ｎ＝ Ｉ ｎ （１−Ｐ） ／’Ｉ ｎ （Ｊ、−Ｆ）
９９％の確率について、 仮定＋ ３Ｍｄの断片の部位 ３Ｘ１０’ダｊｉ・７＝Ｂ、ｌ ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍ
ｉｓのゲノムの太き さ、 Ｎ＝４，６００ ここで、 Ｆ＝各断片により表現された合計のゲノムのフラクショ
ン、そして Ｐ＝独特のＤＮＡ配列がＮの形質転換体のコロニーの集
団中に存在する確率。
ｍ Ｉ Ｓゲノムが得られたクロン中に表現される、９
９％の確率を確保するために必要な、クロンの数を計算
した［Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、５３ ：１５９ （１
９７０）参照］ Ｐ＝１− （Ｌ−Ｆ）Ｎ Ｎ＝ Ｉ ｎ （１−Ｐ） ／’Ｉ ｎ （Ｊ、−Ｆ）
９９％の確率について、 仮定＋ ３Ｍｄの断片の部位 ３Ｘ１０’ダｊｉ・７＝Ｂ、ｌ ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍ
ｉｓのゲノムの太き さ、 Ｎ＝４，６００ ここで、 Ｆ＝各断片により表現された合計のゲノムのフラクショ
ン、そして Ｐ＝独特のＤＮＡ配列がＮの形質転換体のコロニーの集
団中に存在する確率。
合２−１５．５９５のコロニーは、ＡｍｐＲ，ＴＣ≦で
あるとして、同定された。この５，５９５のコロニーを
個々に肉汁培地中で生長させ、３００組にプールし、”
そしてプラスミドＤＮＡを各組から屯離した。プラスミ
ドＤＮＡの単離は、洗浄剤の溶解、引き続くエタノ−１
し沈殿により達成した［旦二二、遵匹、 Ａｃ ａｄ
、Σ牲、長す、□ｊヱ：１１５９−１１６６ （１９６
９）参照］。
あるとして、同定された。この５，５９５のコロニーを
個々に肉汁培地中で生長させ、３００組にプールし、”
そしてプラスミドＤＮＡを各組から屯離した。プラスミ
ドＤＮＡの単離は、洗浄剤の溶解、引き続くエタノ−１
し沈殿により達成した［旦二二、遵匹、 Ａｃ ａｄ
、Σ牲、長す、□ｊヱ：１１５９−１１６６ （１９６
９）参照］。
次いで、プラスミドのプールを共与体ＤＮＡとして使用
して、這択可能な遺伝標識、すなわち、Ａｒｎ’ｙ−、
Ｃｍ 細胞、を含有しない、受容宿主Ｂ、５ｕｂｔｉ
ｌｉｓ細胞をＣｍＲに形質転換し、そして後のＥ節にお
いて説明するように、Ｃ■ 形質転換体をα−アミラー
ゼを生産する能力（’Ａｍｙ’）についてスクリーニン
グした。プラスミドＤＮＡによる受容（ｃｏｍｐｅｔｅ
ｎｔ）Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉＳ（７）形質転換は、Ｍｏ１
ｅｃ−ｕｌａｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ 、Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ□ 、 ↓−６１−□□［；ｊｌ 二
２５１−２５８ （１９７９） 弓］に記載されて
いる。
して、這択可能な遺伝標識、すなわち、Ａｒｎ’ｙ−、
Ｃｍ 細胞、を含有しない、受容宿主Ｂ、５ｕｂｔｉ
ｌｉｓ細胞をＣｍＲに形質転換し、そして後のＥ節にお
いて説明するように、Ｃ■ 形質転換体をα−アミラー
ゼを生産する能力（’Ａｍｙ’）についてスクリーニン
グした。プラスミドＤＮＡによる受容（ｃｏｍｐｅｔｅ
ｎｔ）Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉＳ（７）形質転換は、Ｍｏ１
ｅｃ−ｕｌａｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ 、Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ□ 、 ↓−６１−□□［；ｊｌ 二
２５１−２５８ （１９７９） 弓］に記載されて
いる。
別法とＩ７て、本来受容性（ｃｏｍｐｅｔｅｎし〕でな
いＢａｃｉｌｌｕｓの株について、原形＋７１ｊ体の形
質転換手順を使用できる。この手順は、微生物のリソチ
ーム処理、引き統＜ＤＮＡ（７）ポリエチレングリコー
ルを仲介する吸収を含む。［９−免Ｊ−ｚ 、Ｖｏ Ｉ
、Ｉ 、９７−１０５ （１９８２）参照１ 。
いＢａｃｉｌｌｕｓの株について、原形＋７１ｊ体の形
質転換手順を使用できる。この手順は、微生物のリソチ
ーム処理、引き統＜ＤＮＡ（７）ポリエチレングリコー
ルを仲介する吸収を含む。［９−免Ｊ−ｚ 、Ｖｏ Ｉ
、Ｉ 、９７−１０５ （１９８２）参照１ 。
宿１ｇＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓ （ＢＧＳＣ株ｌＡ２８９
）は、初めｃｍＳであり、かつα−アミラーゼをつくる
能力に欠乏していた（Ａｍｙ−）。
）は、初めｃｍＳであり、かつα−アミラーゼをつくる
能力に欠乏していた（Ａｍｙ−）。
Ａ ｍ ｙ−細胞の大きい集団の中から比較的小さい数
のＡ ｍ ｙ＋を検出できる、好ましいアミラーゼの＆
＋−り皿ＩＩｇ検出測定（ａｍｙｌａ’ｓｅ ｐｉ
ａｔｅ ｍｅｎｂｒａｎｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎａ
ｓｓａｙ）を開発した。
のＡ ｍ ｙ＋を検出できる、好ましいアミラーゼの＆
＋−り皿ＩＩｇ検出測定（ａｍｙｌａ’ｓｅ ｐｉ
ａｔｅ ｍｅｎｂｒａｎｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎａ
ｓｓａｙ）を開発した。
ＴＢＡＢ、０．１％のカサミノ酸類（ｃａｓａｍｉｎｏ
ａｃｉｄｓ）（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂ。
ａｃｉｄｓ）（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂ。
ｒａｔ ｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ 、Ｍｉｃｈｉｇ
ａｎ）および５ｊＬｇ／ｍｌのクロランフェニコール、
Ｊ、、０％（ｗ／ｖ）のでんぷんを含む、の負犬培地を
、調製した。連名なでんぷんは。
ａｎ）および５ｊＬｇ／ｍｌのクロランフェニコール、
Ｊ、、０％（ｗ／ｖ）のでんぷんを含む、の負犬培地を
、調製した。連名なでんぷんは。
「ダイアスタチス粉末およびα−アミラーゼ定量に特異
的（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ Ｄｉａｓｔａｔｉ
ｓ Ｐｏｗｄｅｒ ａｎｄ ａ−ａｍｙｌ
ａｓｅ Ｄｅｔ、ｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）コなでん、
ターん（Ａｍｅｒｉｃａｎ ５ｏｃｉｅｔｙ 。
的（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ Ｄｉａｓｔａｔｉ
ｓ Ｐｏｗｄｅｒ ａｎｄ ａ−ａｍｙｌ
ａｓｅ Ｄｅｔ、ｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）コなでん、
ターん（Ａｍｅｒｉｃａｎ ５ｏｃｉｅｔｙ 。
ｆ Ｂｒｅｗｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ、Ｉｎ
ｃ、、Ｓｔ、Ｐａｕｌ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ ５５１
２１）である。培地の１５ｍ１の部分を、１００ ｍ
ｌ容のぺ（・り皿（ｐｌａｔｅ）お中に入れた。ペトリ
皿を、密閉したプラスチングのスリーブの中に４°Ｃに
おいて３週間まで、劣化作用なし。
ｃ、、Ｓｔ、Ｐａｕｌ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ ５５１
２１）である。培地の１５ｍ１の部分を、１００ ｍ
ｌ容のぺ（・り皿（ｐｌａｔｅ）お中に入れた。ペトリ
皿を、密閉したプラスチングのスリーブの中に４°Ｃに
おいて３週間まで、劣化作用なし。
に、１佇蔵することができた。
０．４５ルｍの孔サイ７の半透膜を、次ぎのように使用
した。適当な膜は、ミリポア・コーポレーシー＋ン（Ｍ
ｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔ ｉ ｏｎ、Ｂ
ｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から表示
Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔ ｉ 。
した。適当な膜は、ミリポア・コーポレーシー＋ン（Ｍ
ｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔ ｉ ｏｎ、Ｂ
ｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から表示
Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔ ｉ 。
ｎ Ｍｅｎｂｒａｎｅ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｉｓｃ
Ｓで商業的に入毛することができる。
Ｓで商業的に入毛することができる。
２枚の切断物、長さほぼ５ｍｍ、をＩｉいに哀情にし、
膜をでんぷん寒天］１板培養基ヒへの位置決めのための
配向マークとして役ケたせた。灰分のない濾紙を薄いス
トリップ（はぼ５ｍｍＸ５０ｍｍ）に切り、滅菌の間、
膜の間に配置した。重ねた膜をカラスのぺ（・り皿内の
水中に沈め、１２００Ｃで３０分間オートクレーブ処理
した。
膜をでんぷん寒天］１板培養基ヒへの位置決めのための
配向マークとして役ケたせた。灰分のない濾紙を薄いス
トリップ（はぼ５ｍｍＸ５０ｍｍ）に切り、滅菌の間、
膜の間に配置した。重ねた膜をカラスのぺ（・り皿内の
水中に沈め、１２００Ｃで３０分間オートクレーブ処理
した。
無菌の膜を、でんぷんの１１板の寒天表面−ヒに、無菌
のフィルターピンセットで、無菌的に移した。Ｌ１２板
のターテーブル、にで、無菌のガラス林を使用し、て、
膜と寒天表面との間の緊密な接触を妨げる、しわや％泡
を除去した。フィルターの刻み目の位置を、各板の底部
において標識付けた。でんぷん板はできるだけ新鮮であ
りかつ気泡が存在しないようにして、欣を寒天のすべて
の区域と緊密に接触させることが、測定の効率に対して
重要である。
のフィルターピンセットで、無菌的に移した。Ｌ１２板
のターテーブル、にで、無菌のガラス林を使用し、て、
膜と寒天表面との間の緊密な接触を妨げる、しわや％泡
を除去した。フィルターの刻み目の位置を、各板の底部
において標識付けた。でんぷん板はできるだけ新鮮であ
りかつ気泡が存在しないようにして、欣を寒天のすべて
の区域と緊密に接触させることが、測定の効率に対して
重要である。
Ｂａｃｉ １１ｕｓ宿主微生物のプラスミド形質転換の
後、０．１ｍ、ｌの細胞、はぼｌＸ１０５／ｍ１のコロ
ニー形成栄位を含有する、をフィルター−１−へ直接か
ぶせた。板を３７°Ｃにおいて１８〜２４時間、根の右
側を−Ｌにし、て、保１易した。保温期間後、膜を無菌
的にフィルタービンセンｌ’で除去した。ｊ模を除去し
、無菌のペトリ皿へ移し、廉＼ｈに標識を伺した。この
ようにして、コロニーはそれら自体、ｌ’ｌ’ｌ＋濃度
で致死的である、ヨウ素の）に気に暴亮されなかった。
後、０．１ｍ、ｌの細胞、はぼｌＸ１０５／ｍ１のコロ
ニー形成栄位を含有する、をフィルター−１−へ直接か
ぶせた。板を３７°Ｃにおいて１８〜２４時間、根の右
側を−Ｌにし、て、保１易した。保温期間後、膜を無菌
的にフィルタービンセンｌ’で除去した。ｊ模を除去し
、無菌のペトリ皿へ移し、廉＼ｈに標識を伺した。この
ようにして、コロニーはそれら自体、ｌ’ｌ’ｌ＋濃度
で致死的である、ヨウ素の）に気に暴亮されなかった。
各でん７ミーん一寒天板を・「袋で直接ヨウ素蒸気の１
−に４〜７秒間保持し、炊いで光源の１−に配置して、
ブルーのでんんぷん−ヨウ素のパックグラウンドに対し
て、でんぷんの加水分解の透明ゾーンをｉ’ｆ’Ｒ化し
た。■×１０５のＡｍｙ−コロニーの場における１つの
アミラーゼ生産性コロニーは、この技術により検出する
二とができた。板のヨー素による現像直後に、ゾーンの
位置を板の底に直接マークした。これは、Ａ色は７〜１
５秒後に退色し始めるからで多〕った。ヨウ素蒸気下程
の代わりに、２ｍｌのヨウ素水溶液（２％のヨウ化カリ
ウム、０．２％のヨウ素）を使用して、ゾーンを可視化
することができる。この方法におけるヨウ素の適用は、
蒸気法よりもＲ〈保持される着色を生ずる。
−に４〜７秒間保持し、炊いで光源の１−に配置して、
ブルーのでんんぷん−ヨウ素のパックグラウンドに対し
て、でんぷんの加水分解の透明ゾーンをｉ’ｆ’Ｒ化し
た。■×１０５のＡｍｙ−コロニーの場における１つの
アミラーゼ生産性コロニーは、この技術により検出する
二とができた。板のヨー素による現像直後に、ゾーンの
位置を板の底に直接マークした。これは、Ａ色は７〜１
５秒後に退色し始めるからで多〕った。ヨウ素蒸気下程
の代わりに、２ｍｌのヨウ素水溶液（２％のヨウ化カリ
ウム、０．２％のヨウ素）を使用して、ゾーンを可視化
することができる。この方法におけるヨウ素の適用は、
蒸気法よりもＲ〈保持される着色を生ずる。
アミラーゼ生産性コロニーを回収する目的で、Ａ ｍ
ｙ ” ＡＨＩ Ｉ泡を含有する膜を同定し、そして適
切な整合を達成するためにフィルター中の刻み目を１月
い一乙前記膜をそのもとのでんぷん−ヨウ素寒天枇へ移
してもどした。板を光源のＬ方で保持することにより、
フィルターを通して見て、フィルターにのコロニーと関
係ずけることができた。
ｙ ” ＡＨＩ Ｉ泡を含有する膜を同定し、そして適
切な整合を達成するためにフィルター中の刻み目を１月
い一乙前記膜をそのもとのでんぷん−ヨウ素寒天枇へ移
してもどした。板を光源のＬ方で保持することにより、
フィルターを通して見て、フィルターにのコロニーと関
係ずけることができた。
コロニーを小ようじでかき取ることにより除去し、細胞
を１．０１１１１（７）ＴＢＢ肉汁（Ｔｒｙｐｔｃｓｅ
Ｂｅｅｆ Ｂｒｏｔｈ：１．０％のトリプト−７
，０，３％の牛肉エキス、０．５％のＮａＣ１および０
．１％のカサミノ酸類）中に懸濁させた。系統的希釈を
実施し、そして０１ｍ１の細胞をフィルター上のＴＢＡ
Ｂ＋でんぷん＋クロランフェニコール板の」−に前述の
ように、か７いせた。フィルターの検出を、前述のよう
に、Ａｍｙ”Ｃｍ５Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ細胞の純粋４
゛培養物が得られたことが確立されるまで１反復した。
を１．０１１１１（７）ＴＢＢ肉汁（Ｔｒｙｐｔｃｓｅ
Ｂｅｅｆ Ｂｒｏｔｈ：１．０％のトリプト−７
，０，３％の牛肉エキス、０．５％のＮａＣ１および０
．１％のカサミノ酸類）中に懸濁させた。系統的希釈を
実施し、そして０１ｍ１の細胞をフィルター上のＴＢＡ
Ｂ＋でんぷん＋クロランフェニコール板の」−に前述の
ように、か７いせた。フィルターの検出を、前述のよう
に、Ａｍｙ”Ｃｍ５Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ細胞の純粋４
゛培養物が得られたことが確立されるまで１反復した。
純粋な培養物を、肉汁培地中で生長させ、α−アミラー
ゼ活性について試験した。培養はある生産物を生産し、
この生産物は、クローニングされた遺伝子が誘導される
Ｂ、１ｉｃｈｅｎｉｆｏ ｒｍｉｓ微生物により生産さ
れるα−アミラーゼと、回−の電気泳動移動度を示した
。、これらの試験は、説り１した方法がα−アミラーゼ
造伝ｆのＢａｃｊｌｌＬ１５宿主微生物へのクローニン
グに４１効であることを示した。
ゼ活性について試験した。培養はある生産物を生産し、
この生産物は、クローニングされた遺伝子が誘導される
Ｂ、１ｉｃｈｅｎｉｆｏ ｒｍｉｓ微生物により生産さ
れるα−アミラーゼと、回−の電気泳動移動度を示した
。、これらの試験は、説り１した方法がα−アミラーゼ
造伝ｆのＢａｃｊｌｌＬ１５宿主微生物へのクローニン
グに４１効であることを示した。
Ｂ、１１ｃｈｅｎｉ ｆ＋：＋ｒｍｉｓα−アミラーセ
潰伝−イーのＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓ宿主へのクローニン
グは、２つのＪ１由で９ましかった。第１に、Ｂ、ｌ
ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓは、標準の技術で遺伝子操作
が不ＩＴ丁能である。したがって、α−アミラーゼ生産
の遺伝的基礎は、よく特徴づけられたＢ、ｓｕ’ｏｔｉ
ｌｉｓ宿主においてより容易に研究することできる。第
２に、Ｂ、５ｕｂｔｉ１ｉｓは、しばしば、工業的用途
において、Ｂ。
潰伝−イーのＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓ宿主へのクローニン
グは、２つのＪ１由で９ましかった。第１に、Ｂ、ｌ
ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓは、標準の技術で遺伝子操作
が不ＩＴ丁能である。したがって、α−アミラーゼ生産
の遺伝的基礎は、よく特徴づけられたＢ、ｓｕ’ｏｔｉ
ｌｉｓ宿主においてより容易に研究することできる。第
２に、Ｂ、５ｕｂｔｉ１ｉｓは、しばしば、工業的用途
において、Ｂ。
１ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓよりも望ましい発酵微生物
でありうる。
でありうる。
形質転換されたＢａｃｉｌｌｕｓ宿主微生物の選枳のた
めのいかなる適当な選択子１頭をも、当業治は使用でき
る。
めのいかなる適当な選択子１頭をも、当業治は使用でき
る。
臂語出−人 マイルス・ラボラドリース・インコ第１頁
の続き ０発 明 者 ゲーリー・エイ・ウィルソンアメリカ合
衆国インディアナ用 ４６５１４エルクハート・サスクエ ハナ５４４０１ ０発 明 者 カレン・ウオルウエバーアメリカ合衆国
インディアナ州 ４６５４４ミシヤウオ力・バーカド サークル−ナンバー２８ ３４０ ＠発 明 者 クリフォード・オー・イエールアメリカ
合衆国インディアナ州 ４６５１４エルクハート・キングズ ランドコート２３２１５ 手続補正書（方式） ％式％ 特許庁長自° 若杉オ［Ｊ夫 殿 １、事件の表示 昭、１１］５８年％ｄ”ｌ！Ｍｔ＋Ｍ ２０２９２９→
う。
の続き ０発 明 者 ゲーリー・エイ・ウィルソンアメリカ合
衆国インディアナ用 ４６５１４エルクハート・サスクエ ハナ５４４０１ ０発 明 者 カレン・ウオルウエバーアメリカ合衆国
インディアナ州 ４６５４４ミシヤウオ力・バーカド サークル−ナンバー２８ ３４０ ＠発 明 者 クリフォード・オー・イエールアメリカ
合衆国インディアナ州 ４６５１４エルクハート・キングズ ランドコート２３２１５ 手続補正書（方式） ％式％ 特許庁長自° 若杉オ［Ｊ夫 殿 １、事件の表示 昭、１１］５８年％ｄ”ｌ！Ｍｔ＋Ｍ ２０２９２９→
う。
２、発明の名称
３補正をする者
事件との関係 特許出願人
４代 理 人〒１０７
住 所 東京都港区赤坂１丁目９番１５号明細書
第１頁の発明の名称を下記の通り訂正する。
第１頁の発明の名称を下記の通り訂正する。
「バチルス微生物における遺伝子の異型クローニング方
法」
法」
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 ■ あるＢａｃｉｌｌｕｓｌｉＨ生物からノα−アミラ
ーゼ、プロテアーセ、アミログルコシダーゼおよびグル
コースイソメラーゼから成る群より選ばれた酵素を暗号
化する遺伝子を、偵の種のＢａｃ ｉ ｌ ｌ ｕ Ｓ
宿−１−１生物にクローニングする方法であって、 （’ａ＞ Ｅ、ｃｏｌｉおよびＢ 、 ｓ ｕ ｂ
ｔ ｉ ｌ ｉＳの両者の中で複製する能力を有する２
機能プラスミド、ここで前記プラスミＩ・（ナナなくと
も２つの選択ｎ１能な遺伝標識を含有する。をエンドヌ
クレアーゼで消化して、線状プラスミド分Ｊ′を？１−
産し、 （’） 前記遺伝子を含有するＤＮＡ断ｙ１を発生さ
せ、そして非機能的遺伝標識を生産するだめのｌＩＪ記
選択可能な遺伝標識の１つの挿入的不活性化が起こるよ
うに、前記ＤＮＡ断片を（ａ）の前記プラスミド中に組
み込み、少なくとも［４の機能的選択可能な遺伝標識を
残して、紹換え雑種プラスミドおよび副産物として、
（ａ）の前記２機能プラスミドを含有する混合物を生産
し、 （Ｃ） （ｂ）の前記混合物を、（ａ）の前記選択
可能な遺伝標識をもたないＥ、ｃｏｌｉ微生物中に組み
込んで、前記Ｅ、ｃ。 １１を形質転換させ、 （ｄ） （ｂ）の前記プラスミドを含有するＥ。 ｃ０１ｉ形質転換体を、前記機能的選択■】１能な遺伝
標識により選択し、 （’、 ｅ ） 前記非機能的の挿入的に不活性化さ
れた遺伝標識の存在について（ｄ）の前記形質転換体を
スクリーニングすることによリ、前記組換えプラスミド
を含有する形質転換体を同定し、 ＜ｆ） プラスミドＤＮＡを（ｅ） ｃ７）前記Ｅ、
ｃｒｒｌｒ形質転換体から抽出し、 （ｇ） （ａ）の前記選択可能な遺伝標識を含イ４
しない前記Ｂａｃｉ ｌ ｌｕＳ宿主微生物を、（ｆ）
からの前記プラスミドＤＮＡで形質転換し、 （ｈ） 前記組換えプラスミドを含有するｒｉｉｉ記
Ｂａｃｉｌｌｕｓ宿１−１形質転換体を、前記機能的に
選択可能な遺伝標識により選択し、そして （ｉ） それから、ｆｉｉｉ記プラスミ１：１−の前
記遺伝子により暗は化された前記酵素を生Ｊ１ｆ、する
ことができる、Ｂａｃｉ ｌ ｌｕｓ宿主微生物を弔離
する、 ことを特徴とするＢａｃｉｌｌｕｓ宿主微生物のクロー
ニング方法。 ２、前記選択可能な遺伝標識は、抗生物質耐性または生
長因子を含む、特許請求の範囲第１項記戦の方法。 ３、Ｂａｃｉ ｌ ｌｕｓ宿主微生物は、Ｂ、５ｕｂｔ
ｉ１ｉｓ、Ｂ、ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓおよびＢ、
ａｍｙｌｏｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓから成る群より彦
ばれる、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、プ７スミドは、ｐＨＶ３３ （ＡＴＣＣ３９２１７
）である、特許請求の範囲第１項記載のノブ法。 ５、前記形質転換されたＢａｃｉ ｌ ｌｕｓ宿主微牛
微生、１程（ｈ）において、前記酵素に作用されうる物
質を含有する寒天媒質の表面上に、無菌の半透膜を重ね
、前記形質転換された微生物を１１１１記膜」−で生長
させ、そして前記ｌＷ素を前記寒天中に通過さ也その間
前記形質転換された微生物を前記１１シーヒに保持し、
前記膜を前記寒天表面から除去し、そして前記寒天を、
前記酵素と前記物質との間の検出可能な反応を生成する
物質と接触させる、ことによって、選択する、特許請求
の範囲第１項記載の方法。 ６、あるＢａｃｉｌｉｕｓ微生物からのα−アミラーセ
の遺伝子を他の種のＢａｃ−ｉ１１ｕｓ宿１：微生物に
クローニングする方法であって、（ａ） Ｅ、ｃｏｌ
ｉおよびＢ、 ５ｕｂｔ ｉ Ｉ ｉＳの両者の中で複
製する能力を有する２機能プラスミド、ここで前記プラ
スミド１走少なくとも２つの選択可能な遺伝標識を含イ
１する、をエンドヌクレアーセで消化して、線状プラス
ミド分子を生産 し、 （ｂ） 前記遺伝子を含有するＤＮＡ断片を発生させ
、そし７て非機能的遺伝標識を生産するだめの前記選択
可能な遺伝標識の１つの挿入的不活性化が起こるように
、前記ＤＮＡ断片を（ａ）の前記プラスミド中に組み込
み、少なくとも１種の機能的選ａ＜可能な遺伝標識を残
１−て、組換え雑種プラスミドおよび副産物として、（
ａ）の前記２機能プラスミドを含有する混合物を生産し
、 （Ｃ） （ｂ）の前記混合物を、（ａ）の前記選択
可能な遺伝標識をもたないＥ、ｃｏｌｊ？５生物中に組
み込んで、前記Ｅ、ｃ。 １ｉを形質転換させ、 （ｄ） （ｂ）の前記プラスミドを含有するＥ、ｃ
ｏｌｔ形質転換体を、前記機能的選択ｌ′ｊｆ能な遺伝
標識により選択し、 （ｅ） 前記非機能的の挿入的に不活性化された＠伝
標識の存在について（ｄ）の前記形質転換体をスクリー
ニングすることにより、前記組換えプラスミドを含有す
る形質転換体を同定し、 （ｆ） プラスミドＤＮＡを（ｅ）の前記Ｅ、ｃｏ１
ｉ形質転換体から抽出し、 （ｇ） （ａ）の前記選択可能な遺伝標識を含有し
ない前記Ｂａｃｉ ｌ ｌｕｓ宿主微生物を９ （ｆ）
からの前記プラスミドＤＮＡで形質転換し、 （ｈ） 前記組換えプラスミドを含有する前記Ｂａｃ
ｉ １１ｕｓ宿主形質転換体を、前記機爺的選択可能な
遺伝標識により選択 し、そして （ｉ） それから、α−７ミラーセを生産すること
かできるＢ ａ ＣＩ Ｉ ｒ １．Ｉ Ｓ宿主微生物
を単離する、 ことを特徴とする方法。 ７、宿主微生物は、Ｂ 、 ｓ ＋ｘ ｂ ｔ ｉ ｌ
ｉ ｓ、Ｂ、ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓおよびＢ、
ａｍｙ ｌｏ ｌ １ｑｕｉｆａｃｉｅｎＳから成る群
よりＬ！ばれる、特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８、プラスニドは、ｐＨＶ３３（ＡＴＣＣ３９２１７）
である、特許請求の範囲第６ｑＡ記載の方法。 ９、前記追択可能な遺伝標識は、抗生物質耐性を含む、
特許請求の範囲第６項記載の方法。 １０、前記形質転換されたＢａｃｉ ｌ ｌｕｓ宿北倣
生物は、１程（ｈ）において、でんぷんを含有する寒天
媒質の表面上に、無菌の半透膜を歌ね、前記形質転換さ
れた微生物を前記１１り上で生長させ、そして前記α−
アミラーゼを前記寒天中に通過させ、その間前記形質転
換された微生物を前記膜−りに保持し、前記膜を前記寒
天表面から除去し、そして前記寒天をヨウ素含有試薬と
接触させ、そしてα−アミラーゼとでん７弧ん−ヨウ素
との間の検出可イ指な反応を観察する、ことによって、
選択する、特許請求の範囲第６項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US43854482A | 1982-11-01 | 1982-11-01 | |
| US438544 | 1982-11-01 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59130187A true JPS59130187A (ja) | 1984-07-26 |
| JPS6254473B2 JPS6254473B2 (ja) | 1987-11-16 |
Family
ID=23741032
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58202929A Granted JPS59130187A (ja) | 1982-11-01 | 1983-10-31 | バチルス微生物における遺伝子の異型クロ−ニング方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0108301B2 (ja) |
| JP (1) | JPS59130187A (ja) |
| AT (1) | ATE48156T1 (ja) |
| DE (1) | DE3380878D1 (ja) |
| DK (1) | DK498883A (ja) |
| NO (1) | NO170594C (ja) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5624829A (en) * | 1984-07-03 | 1997-04-29 | Gist-Brocades, B.V. | Transformed industrial bacillus strains and methods for making and using them |
| CA1277931C (en) * | 1984-06-05 | 1990-12-18 | Shimon Ulitzur | Detection and/or identification of microorganisms in a test sample usingbioluminescence or other exogenous genetically-introduced marker |
| DE3527913A1 (de) * | 1985-08-03 | 1987-02-12 | Henkel Kgaa | Alkalische protease, verfahren zur herstellung von hybridvektoren und genetisch transformierte mikroorganismen |
| US5017477A (en) * | 1985-10-25 | 1991-05-21 | Biotechnica International, Inc. | Enhancing DNA sequencies derived from the sacQ gene |
| PT86864B (pt) * | 1987-02-27 | 1992-05-29 | Gist Brocades Nv | Processo para clonagem molecular e expressao de genes que codificam para enzimas proteoliticas |
| ES2135386T3 (es) * | 1987-02-27 | 1999-11-01 | Genencor Int | Transformacion de cepas de bacillus alcalofilas. |
| US6303115B1 (en) * | 1996-06-17 | 2001-10-16 | Microcide Pharmaceuticals, Inc. | Screening methods using microbial strain pools |
| WO2016069432A1 (en) * | 2014-10-30 | 2016-05-06 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Bacillus megaterium recombinant protein expression system |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56113293A (en) * | 1980-01-07 | 1981-09-07 | Univ Rochester | Recomoination bacteriophage for anisogenome structure cloning of batilus microorganism and production thereof |
| JPS56128796A (en) * | 1980-02-15 | 1981-10-08 | Cpc International Inc | Genetically transformed microbe for mass production of amylolytic enzyme and its prescription |
| JPS57139097A (en) * | 1981-01-15 | 1982-08-27 | Cpc International Inc | Method of cloning gene coding heat-resistant alpha-amylase to colibacillus and bacillus subtilis |
| JPS57139092A (en) * | 1981-02-23 | 1982-08-27 | Microbial Chem Res Found | New antibiotic istamycin a1, b1, c1 or a2 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2048894A (en) * | 1979-05-11 | 1980-12-17 | Gist Brocades Nv | Plasmid |
| IL61982A (en) * | 1980-02-15 | 1984-01-31 | Cpc International Inc | Genetically engineered microorganisms for massive production of amyloytic enzymes and process for preparing same using the corresponding recombinant dnas containing amylase coding genes |
| FI64813C (fi) * | 1980-12-31 | 1984-01-10 | Ilkka Antero Palva | Foerfarande foer producering av ett utvalt aeggviteaemne och vid foerfarandet anvaenda rekombinantplasmidvektorer |
-
1983
- 1983-10-19 EP EP83110394A patent/EP0108301B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1983-10-19 NO NO833808A patent/NO170594C/no unknown
- 1983-10-19 DE DE8383110394T patent/DE3380878D1/de not_active Expired
- 1983-10-19 AT AT83110394T patent/ATE48156T1/de not_active IP Right Cessation
- 1983-10-31 DK DK498883A patent/DK498883A/da not_active Application Discontinuation
- 1983-10-31 JP JP58202929A patent/JPS59130187A/ja active Granted
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56113293A (en) * | 1980-01-07 | 1981-09-07 | Univ Rochester | Recomoination bacteriophage for anisogenome structure cloning of batilus microorganism and production thereof |
| JPS56128796A (en) * | 1980-02-15 | 1981-10-08 | Cpc International Inc | Genetically transformed microbe for mass production of amylolytic enzyme and its prescription |
| JPS57139097A (en) * | 1981-01-15 | 1982-08-27 | Cpc International Inc | Method of cloning gene coding heat-resistant alpha-amylase to colibacillus and bacillus subtilis |
| JPS57139092A (en) * | 1981-02-23 | 1982-08-27 | Microbial Chem Res Found | New antibiotic istamycin a1, b1, c1 or a2 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3380878D1 (en) | 1989-12-28 |
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| DK498883A (da) | 1984-05-02 |
| JPS6254473B2 (ja) | 1987-11-16 |
| EP0108301B2 (en) | 1993-09-01 |
| EP0108301B1 (en) | 1989-11-23 |
| NO170594B (no) | 1992-07-27 |
| NO833808L (no) | 1984-05-02 |
| EP0108301A3 (en) | 1986-02-05 |
| DK498883D0 (da) | 1983-10-31 |
| NO170594C (no) | 1992-11-04 |
| ATE48156T1 (de) | 1989-12-15 |
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