TW202140796A - 一種生產2,3-丁二醇的重組微生物以及製造2,3-丁二醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種生產2,3-丁二醇之非天然微生物，其中該微生物包含一或多種遺傳修飾，本揭露另外提供一種使用該等微生物生產2,3-丁二醇之方法。

Description

一種生產2,3-丁二醇的重組微生物以及製造2,3-丁二醇的方法
本發明係揭露關於一種經基因重組的微生物，以提高該微生物2,3-丁二醇的生產能力，另外，本發明亦揭露關於一種利用經基因重組的微生物進行醱酵反應，以生產2,3-丁二醇的方法。
2,3-丁二醇為多元醇的一種，是重要的化工原料和液體燃料，其應用的範圍相當廣泛，包括在化工、能源、食品以及航太等不同的領域，均有諸多不同的用途。舉例而言，在燃料產業中，2,3-丁二醇可以與汽油混合，作為辛烷值提升劑，亦可直接作為一種液體燃料。在化工產業中，2,3-丁二醇具有非常低的凝固點，可作為抗凍劑；而作為多用途的化工原料，2,3-丁二醇可經由簡單的反應轉化為1,3-丁二烯，可作為合成橡膠及合成樹脂的原料，或轉化為甲基乙基酮，除可用作燃料添加劑及溶劑外，亦常作為低沸點溶劑，可廣泛使用於黏結劑、塗料、燃料、潤滑劑和油墨等不同的行業。在食品產業中，2,3-丁二醇亦可轉化為2,3-丁二酮（聯乙醯）或乙醯乙醇（乙偶姻），作為風味劑或天然食用香料使用，二者均廣泛應用在食品工業中。
目前用於生產2,3-丁二醇的方法主要有化學法和生物醱酵法兩大類。化學法以傳統石油化工方法進行裂解提煉，以非再生性的化石原油做為原料，由於裂解提煉過程需高溫高壓，因而導致嚴重污染；相較於此，生物醱酵法以可再生性的生質原料為基礎，並以微生物進行醱酵方式進行生產，其原料及生產方式均對環境友善，較符合現今國際社會對於工業在環保和永續發展上的訴求，鑒於此類環保和可永續發展的技術領域已成為趨勢，也是世界各國目前正積極投入發展的領域。
然而，雖然已知2,3-丁二醇可經由多種細菌進行醱酵生產，其中包括克雷白氏菌屬（Klebsiella）、腸桿菌屬（Enterobacter）、桿菌屬（Bacillus）、鋸桿菌屬（Serratia）等，但歷經各種針對醱酵條件的優化，如溫度、pH值、氧濃度等，和微生物醱酵能力的改良，以微生物醱酵生產2,3-丁二醇仍然有低生產率的問題，因此，以生物醱酵法生產2,3-丁二醇的成本仍居高不下。
此外，上述用於醱酵生產2,3-丁二醇的微生物多具有致病性，在各地衛生管理機關均有依各種微生物的致病能力進行分級下，於使用此等微生物的操作過程中，均需符合相對應的規定。此等有關操作過程中的規定及潛在的致病風險，更進一步增加了以生物醱酵法生產2,3-丁二醇的成本。
有鑒於此，本領域仍需一種安全且產率高的方法進行2,3-丁二醇的醱酵生產，以進一步降低以生物醱酵法生產2,3-丁二醇的成本。
因此，本發明之目的在於提供一種具有2,3-丁二醇生產能力的重組微生物，其中至少三種選自於由尿苷二磷酸葡萄糖磷酸尿甘醯轉移酶基因（galU ）、乙醯乙醇去氫酶基因（acoA ）、磷酸乙醯轉移酶基因（pta ）、葡萄糖磷酸腺苷醯轉移酶基因（glgC ）、乳糖去氫酶基因（ldhA ）和磷酸二酯酶基因（pdeC ）所組成群組的基因被修飾。
於一具體實施例中，本發明揭露之一種重組微生物包括尿苷二磷酸葡萄糖磷酸尿甘醯轉移酶基因、乙醯乙醇去氫酶基因和磷酸乙醯轉移酶基因被修飾。於另一具體實施例中，本發明揭露之一種重組微生物包括尿苷二磷酸葡萄糖磷酸尿甘醯轉移酶基因、乙醯乙醇去氫酶基因、磷酸乙醯轉移酶基因和葡萄糖磷酸腺苷醯轉移酶基因被修飾。於再另一具體實施例中，本發明揭露之一種重組微生物包括尿苷二磷酸葡萄糖磷酸尿甘醯轉移酶基因、乙醯乙醇去氫酶基因、磷酸乙醯轉移酶基因、葡萄糖磷酸腺苷醯轉移酶基因和乳糖去氫酶基因被修飾。於再另一具體實施例中，本發明揭露之重組微生物包括尿苷二磷酸葡萄糖磷酸尿甘醯轉移酶基因、乙醯乙醇去氫酶基因、磷酸乙醯轉移酶基因、葡萄糖磷酸腺苷醯轉移酶基因、乳糖去氫酶基因和磷酸二酯酶基因被修飾。
本發明所提供重組微生物之基因係經修飾，其中所述修飾包括抑制、刪除、或靜默。於一具體實施例中，本發明所提供重組微生物的基因修飾為刪除。
於一具體實施例中，本發明揭露之重組微生物係屬於克雷白氏菌屬(Klebsiella )。於另一具體實施例中，本發明揭露之重組微生物為寄存於財團法人食品工業發展研究所之菌株，寄存編號為BCRC910979之克雷白氏菌(Klebsiella sp )。
本發明揭露之重組微生物相較於未經修飾的微生物具有提高的2,3-丁二醇生產能力。本發明揭露之重組微生物相較於未經修飾的微生物，在相同培養時間內生產較多的2,3-丁二醇。於另一具體實施例中，本發明揭露之重組微生物相較於未經修飾的微生物可持續生產2,3-丁二醇的時間較長，如可持續生產2,3-丁二醇至少50個小時、至少60個小時、至少70個小時、至少80個小時、或至少90個小時。
本發明揭露之重組微生物相較於未經修飾的微生物具有提高的安全性。於另一具體實施例中，本發明揭露之重組微生物與未經修飾的微生物具有實質上同等的生長能力。於再另一具體實施例中，本發明揭露之重組微生物可在酸性環境下生產2,3-丁二醇。
本發明還揭露一種製造2,3-丁二醇的方法，包含：培養如本發明所提供之重組微生物；以及從培養液中分離取得2,3-丁二醇。
以下係藉由特定的具體實施例說明本發明之實施方式，熟習此技藝之人士可由本說明書所揭示之內容瞭解本揭露之其他優點與功效。本發明也可藉由其他不同的具體實施例加以施行或應用，本發明中的各項細節亦可基於不同觀點與應用，在不悖離本揭露之精神下進行各種修飾與變更。
除非文中另有說明，否則說明書及所附申請專利範圍中所使用之單數形式「一」及「該」包括複數個體。
除非文中另有說明，否則說明書及所附申請專利範圍中所使用之術語「或」包括「及/或」之含義。
除非文中另有說明，否則說明書及所附申請專利範圍中所使用之術語「微生物」屬於微觀生物體，包括細菌、古細菌、病毒或真菌等。如於本發明中所述，「微生物」之引述應理解為涵蓋「細菌」。
本發明中所使用的術語「重組」係指以人工方式組合兩個彼此分離之序列片段。一般而言，術語「重組」係指核酸、蛋白質或微生物含有源自於多個不同來源之遺傳物質，或由源自於多個不同來源之遺傳物質編碼，諸如源自於兩種或更多種不同品系或物種的微生物。如本發明中所使用，術語「重組」亦可用於描述微生物包括突變核酸或蛋白質，其包括藉由例如化學合成或藉由以基因工程技術操作所得到包含突變形式之內源性核酸或蛋白質。
本發明中所使用的術語「突變」係指細菌中之核酸或蛋白質相較於其野生型或親本微生物係已經過修飾。在一些實施例中，突變可為編碼酶之基因的缺失、插入或取代。在其他實施例中，突變可為酶中的一或多種胺基酸之缺失、插入或取代。
本發明中所使用的術語「基因修飾」廣泛地指對微生物之基因組或核酸之操作。基因修飾的方法包含例如異源基因的表現、基因或啟動子的插入、缺失、刪除或靜默、更改基因的表現或基因表現的不活化或抑制、酶工程、定向進化、基於知識之設計、隨機突變誘發、基因改組及密碼子最佳化，但不以上述為限。
本發明中還另揭示一個序列表，該序列表內所提之序列係指實施方式之表1與表5所述之引子序列。
本發明之一種生產2,3-丁二醇的重組微生物，其中至少三種選自於由尿苷二磷酸葡萄糖磷酸尿甘醯轉移酶基因（galU ）、乙醯乙醇去氫酶基因（acoA ）、磷酸乙醯轉移酶基因（pta ）、葡萄糖磷酸腺苷醯轉移酶基因（glgC ）、乳糖去氫酶基因（ldhA ）和磷酸二酯酶基因（pdeC ）所組成群組的基因被修飾，且其係在民國109年3月20日申請寄存於財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，微生物寄存編號為BCRC 910979。
實驗方法：
一、菌種培養方法
本發明中構築重組菌株的菌種培養方法除非特別說明，菌種通常於室溫或30o C培養在Luria-Bertani （LB）或Yeast Extract Peptone （YPD）培養基，培養時間約18至24小時。
二、抽取全菌體染色體
本發明中構築重組菌株的步驟首先為抽取全菌體染色體，以作為聚合酶鏈鎖反應增幅含目標基因之DNA片段的模板。全菌體染色體的抽取方法應為適合製備需長期保存之全菌體染色體DNA。例如，可以使用市面上的染色體抽取套組，如Qiagen DNeasy Plant Mini Kit，詳細的抽取步驟於以下說明。
首先，離心收集於LB培養液生長40小時（h）之菌體2 mL，接著將每個樣品復溶於預先加熱至65o C的400 μL AP1緩衝液（內含 4 μL RNaseA，Genomic DNA Kit for Plant Tissues, Yeastern Biotech Co., Ltd.），經震盪處理菌體，並於懸浮後置於65o C水浴槽約5分鐘，偶爾翻轉混勻。隨後加入130 μL的P3緩衝液，翻轉混勻後靜置於冰上5分鐘，再以14,000 rpm離心5分鐘，將上清液吸取至均質離心管柱（QIAshredder spin column），並置於2 mL收集管中，以14000 rpm離心2分鐘，將過濾液移至新離心管，若有沉澱物不要打散，隨後加入AW1緩衝液，以微量離心管小心反覆吸取混勻，再吸取約650 μL的混合液至萃取離心管柱（DNeasy Mini spin column），並置於2 mL的收集管，以8000 rpm離心1分鐘，倒掉過濾液，重覆此步驟直到混合液全部過濾完畢。將下方收集管換新，上方離心管（spin column）加入500 μL的AW2緩衝液，以8000 rpm離心1分鐘，倒掉過濾液，再重覆以AW2緩衝液沖洗一次，並以14000 rpm離心2分鐘，倒掉過濾液，小心移除下方收集管，並儘可能不要使過濾液殘留在上方離心管的管壁，下方則換成新的1.5 mL微量離心管，此時加入100 μL預熱至65o C的AE緩衝液（10 mM Tris-HCl，0.5 mM EDTA，pH 9.0），靜置於室溫約5分鐘後，以14,000 rpm離心1分鐘，即完成全菌體染色體抽取。依照上述方法，將抽取之全基因體DNA以分光光度計分析並定量，其中空白對照組使用AE緩衝液，每個樣品則取4 μL，加入400 μL的AE緩衝液稀釋後，再分別測量260 nm及280 nm的吸光值。
三、聚合酶鏈鎖反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）
本發明所述之聚合酶鏈鎖反應為本領域具有通常知識者所能輕易理解而應用的實驗方法。而本發明中的聚合酶鏈鎖反應所使用之聚合酶為Phusion High Fidelity DNA Polymerase （Thermo Scientific, Vilnius, Lithuania, USA）。反應之步驟設定為：先於95o C反應5分鐘，接下來重複35至40個以下的循環：95o C反應30秒至3分鐘（若以菌落直接作為模版，則延長為10分鐘）、50至62o C （使用梯度設定，或依照實驗需求改變溫度設定值）反應30秒，72o C反應90至120秒（或依增幅片段的長度以15至30秒/kb設定）。上述循環結束後，最後於72o C反應5至10分鐘，再降溫至4o C。
四、聚合酶鏈鎖反應（PCR）產物的電泳分析
本發明所述之聚合酶鏈鎖反應（PCR）產物的電泳分析為本領域具有通常知識者所能輕易理解而應用的實驗方法。而本發明中的電泳分析係取10 μL的PCR產物以1%洋菜瓊脂凝膠（agarose gel）進行電泳分析（135 V），先以溴化乙錠（ethidium bromide, 0.5 μL/mL）染色30分鐘，再以一次水（蒸餾水）退染10分鐘，並以UV光顯像分析及拍照記錄。
五、同源重組（homologous recombination）基因剔除方法
本發明係使用同源重組基因剔除方法構築重組菌株，同源重組基因剔除方法係利用菌體的內源重組酶，將目標基因上下游之序列進行同源重組，再經由反向篩選（counter-selection）過程，選擇經過第二次同源重組後，失去改造用質體序列（含抗生素抗性基因）之重組菌株，由於篩選後的菌株抗生素抗藥性基因隨質體剔除（plasmid loss）後消失，因此篩選後的菌株不具抗藥性。若原始野生株序列經過兩次同源重組後仍留在染色體上，則經過質體剔除後，菌株將回復成為野生株，此稱為回復株（revertant）。
本發明所使用之同源重組基因剔除方法具穩定性，並可重覆篩選突變株。為了反向篩選，此同源重組基因剔除方法必須先隨機突變篩選鏈黴素（streptomycin）抗藥性菌株，以作為突變用母株，此隨機突變篩選過程可能改變部份菌株生理特性。此外，此同源重組基因剔除方法包括將含有目標基因上下游各約1000bp之片段構築至突變用質體，才能進行突變流程，且突變目標菌株也必須能夠成功藉由接合作用接受基因傳遞。
舉例說明：請參閱第1A圖，於同源重組發生前，將位在野生株（wild-type strain）及轉形菌株（transconjugant）染色體上的目標基因與經轉形重組用的DNA片段進行同源重組，再經由反向篩選，在此，突變用位於自殺質體上的上、下游區域分別以A、B表示，接續，請參閱第1B圖，經過兩次同源重組後，突變株（mutant strain）染色體上的目標基因經去除，在此，KmR表示卡那黴素（kanamycin）抗藥性基因。
本發明使用同源重組基因剔除方法構築重組菌株，該方法包括以下步驟：（a）篩選鏈黴素自然突變株、（b）進行接合作用以挑選第一次同源重組菌株、（c）反向篩選取得第二次同源重組菌株以及（d）確認基因突變位置。
篩選鏈黴素自然突變株的方法簡述如下。首先，將野生株之單一菌落接種於2 mL的LB培養液，於37oC 旋轉培養8小時，再離心收集菌體，並以生理食鹽水（0.85%的NaCl）清洗菌體兩次，再將菌體分別均勻塗抹在含有500 μg/mL鏈黴素的LB培養基，並於37o C隔夜靜置培養。
接續，請參閱第2圖，為本發明之鏈黴素自然突變株之菌落圖。挑選可生長於含有500 μg/mL鏈黴素的LB培養基之菌落(第2圖中箭頭所指為能耐受500 μg/mL鏈黴素之菌落)。並挑選單一菌落，然後培養於含有500 μg/mL鏈黴素的LB培養液，再將菌種保存於－80o C ，在此本發明中所使用的鏈黴素為自然突變株S1。
獲得鏈黴素自然突變株後，進行接合作用，並挑選第一次同源重組菌株。接合作用係一種將突變用質體送入鏈黴素自然突變株的方法，包括將給予株（donor）和接收株（recipient）以適當比例混和後進行培養，再挑選具有鏈黴素抗性的菌落，並以PCR確認基因片段是否成功嵌入目標基因位置。接者進行第二次同源重組，挑選單一菌落進行培養後稀釋，並塗抹在含有鏈黴素之LB培養基上，培養後挑選不同單一菌落，分別塗抹在含有卡那黴素或鏈黴素之LB培養基上，隔夜培養後挑選可耐受鏈黴素但失去卡那黴素抗性的菌落，分別進行PCR確認，此時菌落經過第二次同源重組，可能為基因缺失突變株（gene-deletion mutant），或者回復成野生株之回復株（revertant），接著以電泳分析並選擇正確之基因缺損突變株。
六、2,3-丁二醇（2,3-BDO）定量方法
本發明包含對2,3-丁二醇（2,3-BDO）專一地進行定量，包括以薄膜層析法將細菌培養液的成分分開，再以香草醛（vanillin）呈色。詳細的反應條件如下：使用薄層層析（thin layer chromatography，TLC）平板（Pre-activated silica TLC plate，Sigma-Aldrich），將5 μL樣品滴於平板的一端，再利用己烷：醋酸乙酯：冰醋酸 = 70：30：1.5作為移動相，進行色層分析。40分鐘後，當移動相接近平板頂端時，將平板噴上顯示劑（香草醛：硫酸：乙醇 = 0.5 g：1 ml：9 ml；Sigma-Aldrich）。隨後於110°C烘烤5分鐘，即可觀察到顏色出現。經過測試後，只有2,3-BDO呈現藍色，而葡萄糖呈現深褐色，其他如乙醯乙醇與雙乙醯均無顏色產生，因此本定量方法對2,3-BDO具有專一性。
本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。
《實施例1：構築突變用質體》
以上述之聚合酶鏈鎖反應增幅目標基因的上下游約1,000鹼基對（base pair，bp）的DNA片段，聚合酶鏈鎖反應中所使用的引子序列如表1所示。 表1. 聚合酶鏈鎖反應中所使用之引子序列。
引子名稱 引子序列 SEQ ID NO.
acoA_up (F) ATGAATTCTGAAGCGATCTTCATGCCC SEQ ID NO. 1
acoA_up (R) ATTCTAGAAAGGTCACCCAGGCGGG SEQ ID NO. 2
acoA_down (F) ATTCTAGACGCTGCCTACCCGGCTC SEQ ID NO. 3
acoA_down (R) ATGATATCAGCACTTGACGGACGGC SEQ ID NO. 4
glgC_up (F) ATGAATTCACTGTTCGAGGCTATCCGC SEQ ID NO. 5
glgC_up (R) ATGGTACCCGGATCGTTTTTTTCAAGC SEQ ID NO. 6
glgC_down (F) ATGGTACCAAACAGGAGCGCTAATGC SEQ ID NO. 7
glgC_down (R) ATTCTAGAGCCCACTTTGCCTGGATGT SEQ ID NO. 8
ldhA_up (F) ATGATATCTAAGACGCGGGCTCTCCTG SEQ ID NO. 9
ldhA_up (R) ATGGTACCCCGCGATTTTCATAAGACT SEQ ID NO. 10
ldhA_down (F) ATGGTACCCTGATCAGCATTTCGGAGA SEQ ID NO. 11
ldhA_down (R) ATGAATTCTACTTCCCCTCTCGACGCC SEQ ID NO. 12
pdeC_up (F) TATCTAGAGGCTGCAGAAAACGAAAAAGC SEQ ID NO. 13
pdeC_up (R) TAGGATCCACCATTTCCGTTTTTTGC SEQ ID NO. 14
pdeC _down (F) ATGGATCCCTCTACAAGCGCGGCGTAC SEQ ID NO. 15
pdeC _down (R) ATGAATTCCTCGCCTGCAGACAAAAC SEQ ID NO. 16
將以上所得之目標基因上下游片段接合後嵌入自殺性質體pKAS46，以構築帶有不同目標基因片段的突變用質體，如表2所示。此處使用之質體構築的方法為本技術領域中一般習知技術。 表2. 各目標基因上下游片段接合後，所嵌入之自殺性質體。
質體名稱 說明
pKAS46-D1 帶有包含acoA 基因上游998 bp及下游1076 bp序列的pKAS46基因選殖質體
pKAS46-D3 帶有包含glgC 基因上游1028 bp及下游1064 bp序列的pKAS46基因選殖質體
pKAS46-D4 帶有包含ldhA 基因上游1025 bp及下游1020 bp序列的pKAS46基因選殖質體
pKAS46-D5 帶有包含pdeC 基因上游1000 bp及下游500 bp序列的pKAS46基因選殖質體
另外，包含目標基因為galU 的突變用質體則由中山醫學大學賴怡琪副教授所提供，即包含帶有經刪除710 bp的galU 基因且全長為1.8 kb之DNA片段的pKAS46基因選殖質體，命名為pYC094。
包含有目標基因為pta 的突變用質體的構築方式為先利用PCR增幅約1700bp的部分pta 基因片段(使用的PCR引子序列為pta (F)：TCTAGACATCTTCCATCTGCACGACACCC (SEQ ID NO. 29)以及pta (R) GAATTCAGTCGGCGTTGATGTAGTTGGC (SEQ ID NO. 30) )，並以限制酶KpnI將此片段中間切除約300個鹼基對的片段後，再接入自殺性質體pKAS46（命名為pKAS46-D2），如表3所示。 表3. pG-D2及pKAS46-D2比較表。
質體名稱 說明
pG-D2 帶有包含pta 基因上游566 bp及下游1192 bp序列的pGem-T easy質體，並以KpnI限制酶切割後再進行黏合
pKAS46-D2 帶有pG-D2質體中1453 bp片段的pKAS46基因選殖質體
《實施例2：構築重組菌株》
將實施例1中帶有不同目標基因的突變用重組質體，各自以轉形作用（transformation）送入大腸桿菌E. coli S17-1 λpir中，所得到包含突變用重組質體之大腸桿菌菌株，再依照上述之同源重組基因剔除方法構築包含目標基因之重組菌株。
舉例而言，使用上述所得之鏈黴素自然突變株（S1）做為接合作用中之接收株，給予株則為含有pYC094突變用重組質體的E. coli S17-1 λpir （可耐受卡那黴素和胺苄青黴素（ampicillin）），將菌落隔夜培養於含有適當抗生素之LB培養液，離心收集菌體後，分別以生理食鹽水清洗菌體兩次，再將菌體以2：1混合（給予株：接受株），離心之後均勻塗抹在置於LB培養基上的無菌硝化纖維膜（nitrocellulose membrane，NC membrane）上，於37o C隔夜靜置培養，之後將硝化纖維膜以無菌鑷子夾起，放入含有約3 mL的LB培養液試管中震盪，待菌體自硝化纖維膜脫離至LB培養液後，吸取1 mL的再懸浮菌液，經離心後收集菌體，以生理食鹽水清洗菌體兩次，再將菌體以10倍序列稀釋（10倍與100倍稀釋）於生理食鹽水，接著分別將100μ L不同稀釋倍率之菌液塗抹在M9培養基（47 mM Na2 HPO4 ，22 mM KH2 PO4 ，18 mM NH4 Cl，8 mM NaCl，2 mM MgSO4 ，0.15 mM CaCl2 ）、LB培養基（含卡那黴素和胺苄青黴素）及M9培養基（含卡那黴素和胺苄青黴素），於37o C隔夜靜置培養。之後挑選可於M9培養基（含卡那黴素和胺苄青黴素）生長之菌落，並於LB培養基（含卡那黴素和胺苄青黴素）純化，此時菌落為第一次同源重組接合菌株（transconjugant）。隨後以PCR方式確認基因片段是否成功嵌入galU 基因位置。
隨後，進行第二次的同源重組。首先，挑選單一菌落於LB培養液中37oC 隔夜培養，再將隔夜培養的菌液以100倍稀釋於LB培養液（含500 μg/mL的鏈黴素）中，37o C旋轉培養8小時，然後將菌液以生理食鹽水序列稀釋，並均勻塗抹在含有500 μg/mL鏈黴素之LB培養基上，37o C隔夜培養。隨後挑選不同的單一菌落，分別塗抹在含有卡那黴素或鏈黴素之LB培養基上，隔夜培養後挑選可耐受鏈黴素但失去卡那黴素抗性的菌落，分別進行PCR確認。此時所挑選之菌落係經過第二次同源重組，可能為基因突變株，或者為回復成野生株之回復株（revertant），可以電泳分析選擇基因突變株，此基因突變株即為galU 基因缺失之重組菌株。
舉例而言，使用PCR引子對p032:
GCCGAGCTCACTCTTGCATGGATGGCT （SEQ ID NO. 17）及p042：GTCAGCTGAATTTCATCAC （SEQ ID NO. 18）針對galU 基因片段進行PCR，再以1X TAE （Tris-base、乙酸（acetic acid）和乙二胺四乙酸（EDTA））緩衝液製作1%洋菜的膠體，並以90 V進行電泳40分鐘，分析取自第二次同源重組後所挑選菌株的目標基因片段的大小。如第3圖所示，顯示編號2至6的五個菌落為基因缺損突變株（命名為S1U1）；編號 1及7至13的菌落則為回復株。Ｍ為1 kb之DNA階梯，Ｗ為隔夜培養的S1菌株基因體DNA的增幅結果，P為pYC094質體DNA的增幅結果，在此，箭頭所指位置分別為野生株片段及突變株片段經過PCR增幅之結果。藉由使用包含實施例1中所得之不同目標基因突變用質體之菌株做為接合作用中的接受株或給予株，進行如上述之同源重組基因剔除方法中的接合作用及篩選，可構築包含一或多個目標基因修飾的重組菌株，如表4所示。 表4. 不同目標基因突變用質體之菌株及其接合作用中的接受株，進行接合作用及篩選所構築之重組菌株。
給予株 接受株 篩選後之重組菌株名稱 重組菌株所包含之目標基因修飾
經pKAS46-D1轉形之大腸桿菌菌株 S1U1 S1U1D1 galU 、acoA
經pKAS46-D2轉形之大腸桿菌菌株 S1U1D1 S1U1D2 galU 、acoA 、pta
經pKAS46-D3轉形之大腸桿菌菌株 S1U1D2 S1U1D3 galU 、acoA 、pta 、glgC
經pKAS46-D4轉形之大腸桿菌菌株 S1U1D3 S1U1D4 galU 、acoA 、pta 、glgC 、ldhA
經pKAS46-D5轉形之大腸桿菌菌株 S1U1D4 S1U1D5 galU 、acoA 、pta 、glgC 、ldhA 、pdeC
如上所述，挑選出S1U1D1、S1U1D2、S1U1D3、S1U1D4及S1U1D5重組菌株後，以PCR增幅目標基因片段，所使用的PCR引子如表5所示。 表5. 各PCR引子之序列及SEQ ID NO.。
引子名稱 引子序列 SEQ ID NO.
acoA_check (F) CGTGGAAGTCGTCGATAATCAGGTAC SEQ ID NO. 19
acoA_check (R) AACTTAGCCGCCTGGTTGTACAGTGC SEQ ID NO. 20
pta_check (F) TCTAGACATCTTCCATCTGCACGACACCC SEQ ID NO. 21
pta_check (R) GAATTCAGTCGGCGTTGATGTAGTTGGC SEQ ID NO. 22
glgC_check (F) TAATGCTTACTGCCAGGACAATGCCC SEQ ID NO. 23
glgC_check (R) CCATGCATGTTGTAAAACGACCACG SEQ ID NO. 24
ldhA_check (F) AGCCTCGGTCATTTCCTGCTAATGTG SEQ ID NO. 25
ldhA_check (R) AGCGTCAACTGGTTTTCCGTCAGATC SEQ ID NO. 26
pdeC_check (F) CGTAATCGCTTTTGCGAAGCTGAATA SEQ ID NO. 27
pdeC_check (R) GGCTACGTCTCGCAGCAAACCTTCT SEQ ID NO. 28
如上所述，以電泳分析PCR產物片段的大小，結果分別如第4圖至第8圖所示。
請參閱第4圖，為本發明利用RT-PCR表現S1U1基因之另一電泳圖。片段大小約為1094 bp的七個菌落（編號1、6、7、10、13、17、19）為基因缺損突變株；片段大小約為2048 bp的十五個菌落（編號2至5、8至9、11至12、14至16、18、20至22）則為回復株。Ｍ為1 kb之DNA階梯，Ｗ為隔夜培養的S1U1菌株基因體DNA的增幅結果，P為pKAS46-D1質體DNA的增幅結果。
請參閱第5圖，為本發明利用RT-PCR表現S1U1D2基因之電泳圖。片段大小約為1453 bp的二個菌落（編號3及12）為基因缺損突變株；片段大小約為1758 bp的二十個菌落（編號1至2、4至11及13至22）則為回復株。Ｍ為1 kb之DNA階梯，Ｗ為隔夜培養的S1U1菌株基因體DNA的增幅結果，P為pKAS46-D2質體DNA的增幅結果。
請參閱第6圖，為本發明利用RT-PCR表現S1U1D3基因之電泳圖。片段大小約為1083 bp的十六個菌落（編號1、3至5、7至8、10、12至13及15至21）為基因缺損突變株；片段大小約為2337 bp的六個菌落（編號2、6、9、11、14及22）則為回復株。Ｍ為1 kb之DNA階梯，Ｗ為隔夜培養的S1U1菌株基因體DNA的增幅結果，P為pKAS46-D3質體DNA的增幅結果。
請參閱第7圖，為本發明利用RT-PCR表現S1U1D4基因之電泳圖。片段大小約為1083 bp的十六個菌落（編號1、3至5、7至8、10、12至13及15至21）為基因缺損突變株；片段大小約為2337 bp的六個菌落（編號2、6、9、11、14及22）則為回復株。Ｍ為1 kb之DNA階梯，Ｗ為隔夜培養的S1U1菌株基因體DNA的增幅結果，P為pKAS46-D3質體DNA的增幅結果。
請參閱第8圖，為本發明利用RT-PCR表現S1U1D5基因之電泳圖。片段大小約為600 bp的二十一個菌落（編號1至12及14至22）為基因缺損突變株；片段大小約為2551 bp的菌落（編號13）則為回復株。Ｍ為1 kb之DNA階梯，Ｗ為隔夜培養的S1U1菌株基因體DNA的增幅結果，P為pKAS46-D5質體DNA的增幅結果。
觀察重組基因菌株之菌落外觀，如第9圖所示，基因重組菌株S1U1及S1U1-2與其未經基因修飾之母株S1相比，因缺少合成莢膜多醣體的重要基因galU ，菌落明顯變小，而Ur1回復株菌落的生長外觀則與母株S1相近。
《實施例3：比較重組菌株的生長情形》
將野生株S1及實施例2中所得之六株重組菌株（S1U1、S1U1D1、S1U1D2、S1U1D3、S1U1D4及S1U1D5）分別培養於含有5%葡萄糖的M9培養基，並在30°C培養箱内以200 rpm震盪培養，每兩小時測量菌液之OD595 吸光值。生長曲線如第10圖所示，S1U1、S1U1D1、S1U1D2、S1U1D3及S1U1D4重組菌株的生長速度差異不大，僅重組菌株S1U1D5於前30個小時的生長速度較其他菌株稍微遲緩，但於30個小時後的生長速度則均相似。另如第11圖所示，野生株S1和S1U1的生長曲線並無明顯差異，僅S1U1在生長中後期（4小時以上）稍微遲緩，顯示重組菌株之生長速度並未受其所包含之基因修飾而有明顯影響。
《實施例4：比較重組菌株醱酵生產多元醇的產量》
利用不同濃度的2,3-BDO（10 mM、25 mM、50 mM、100 mM、200 mM、300 mM、400 mM、500 mM）進行TLC-香草醛測試，使用Image J軟體將影像轉成灰階（第12圖），再以Excel繪製迴歸曲線（第13圖），並以此迴歸曲線作爲標準曲線，以計算各突變株的2,3-BDO產量。
將各基因重組菌株於含有5%葡萄糖的M9培養液中以30℃培養，在第24、48、72和96小時進行取樣，並利用TLC-香草醛法分析不同基因重組菌株經醱酵生產的2,3-BDO產量，結果如第14A圖及第14B圖所示。將第14A圖及第14B圖中TLC-香草醛分析所得的結果以Image J軟體量化後，列於表6中，再以曲線表示（如第15圖所示）。 表6. S1U1與其他基因重組菌株S1U1D1、S1U1D2、S1U1D3、S1U1D4及S1U1D5於不同時間內所測得2,3-BDO產量。
2,3-BDO產量 (g/L)
時間(小時) S1U1 S1U1D1 S1U1D2 S1U1D3 S1U1D4 S1U1D5
0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0
24 1.97±0.11 2.4±0.29 3.8±0.2 4.04±0.23 4.46±0.49 4.18±0.17
48 3.01±0.2 3.39±0.45 5.96±0.21 5.77±0.38 6.16±0.08 5.94±0.38
72 3.27±0.21 4.03±0.15 7.4±0.32 7.5±0.49 7.39±0.38 7.08±0.35
96 3.27±0.2 4.32±0.27 7.81±0.44 7.86±0.22 7.83±0.39 7.75±0.17
如第15圖及表6所示，S1U1於約第60個小時之後，2,3-BDO的產量趨緩，而S1U1D1的2,3-BDO產量則持續緩慢增加至約第90個小時；相較於S1U1，基因重組菌株S1U1D2、S1U1D3、S1U1D4和S1U1D5的2,3-BDO產量明顯增加，於一開始培養時即明顯產出較多的2,3-BDO，並持續生產至約第96個小時，其中，基因重組菌株S1U1D2、S1U1D3、S1U1D4和S1U1D5在48個小時培養後，可產出5.77至6.16 g/L的2,3-BDO，相較於S1U1的3.01 g/L，增加了91.7%至105%的產量；於72和96小時培養後，甚至可產出7.08至7.86 g/L的2,3-BDO，相較於S1U1的3.27 g/L，增加了117%至140%的產量。
《實施例5：比較重組菌株的醱酵pH值》
將各基因重組菌株於含有5%葡萄糖的M9培養液中以30℃培養，並取樣測量菌液之pH值，結果如第16圖所示。結果顯示，於菌株培養的前6個小時，各菌株間的pH值並無顯著差異，然於菌株培養的第24個小時左右，其間顯示顯著的pH值差異，以S1U1D3及S1U1D2的pH值最高，平均有pH 5以上，而S1U1的pH值最低，低於pH 4，顯示基因重組菌株具有減緩醱酵環境酸化的效果。
如第16圖所示，在菌株培養的第48個小時，所有菌株的pH值均降至3至4之間。綜合以上第15、16圖及表6所示，基因重組菌株S1U1D2、S1U1D3、S1U1D4和S1U1D5於低pH值的酸性醱酵環境中，仍能持續以較高的產量生產2,3-BDO，而不受低pH值的酸性醱酵環境所影響，例如，基因重組菌株S1U1D2、S1U1D3、S1U1D4和S1U1D5在48個小時培養後，雖然醱酵環境pH值均已降至pH 4以下，其產量仍顯著高於S1U1菌株，產出5.77至6.16 g/L的2,3-BDO，並持續具有較高的產量至培養72和96小時後，產出7.08至7.86 g/L的2,3-BDO，為S1U1菌株產量的2倍以上。
惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例而已，當不能以此限定本發明實施之範圍，即大凡依本發明申請專利範圍及發明說明內容所作之簡單等效變化與修飾，皆仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。
無
第1A圖係顯示野生株(wild-type strain)及轉形菌株（transconjugant）的染色體上，目標基因與經轉形重組用的DNA片段進行同源重組之示意圖。
第1B圖係顯示經過兩次同源重組後，染色體上的目標基因經去除之突變株（mutant strain）之示意圖。
第2圖係顯示鏈黴素自然突變株之菌落圖。
第3圖係顯示利用RT-PCR表現S1U1基因之電泳圖。
第4圖係顯示利用RT-PCR表現S1U1D1基因之另一電泳圖。
第5圖係顯示利用RT-PCR表現S1U1D2基因之電泳圖。
第6圖係顯示利用RT-PCR表現S1U1D3基因之電泳圖。
第7圖係顯示利用RT-PCR表現S1U1D4基因之電泳圖。
第8圖係顯示利用RT-PCR表現S1U1D5基因之電泳圖。
第9圖係顯示基因重組菌株S1U1及S1U1-2與野生株（S1）和回復株（Ur1）的菌落外觀示意圖。
第10圖係顯示基因重組菌株S1U1及其他基因重組菌株S1U1D1、S1U1D2、S1U1D3、S1U1D4及S1U1D5的生長曲線圖。
第11圖係顯示野生株S1與基因重組菌株S1U1的生長曲線圖。
第12圖係顯示不同2,3-BDO濃度進行TLC-香草醛測試的呈色反應之示意圖。
第13A圖係顯示TLC-香草醛測試的灰色值曲線圖。
第13B圖係顯示各基因重組菌株的2,3-BDO產量之標準曲線圖。
第14A圖係顯示野生株S1與基因重組菌株S1U1在含有5% 葡萄糖的M9培養液中不同時間的2,3-BDO產量之示意圖。
第14B圖係顯示S1U1與其他基因重組菌株S1U1D1、S1U1D2、S1U1D3、S1U1D4及S1U1D5在含有5% 葡萄糖的M9培養液中不同時間的2,3-BDO產量之示意圖。
第15圖係顯示S1U1與其他基因重組菌株S1U1D1、S1U1D2、S1U1D3、S1U1D4及S1U1D5之2,3-BDO產量（g/L）的曲線圖。
第16圖係顯示S1U1與其他基因重組菌株S1U1D1、S1U1D2、S1U1D3、S1U1D4及S1U1D5在含有5%葡萄糖的M9培養液中醱酵不同時間的pH值曲線圖。
TW中華民國、財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，寄存日期為民國109年3月20日，寄存編號為BCRC910979。

Claims (10)

  1. 一種生產2,3-丁二醇的重組微生物，其中至少三種選自於由尿苷二磷酸葡萄糖磷酸尿甘醯轉移酶基因（galU ）、乙醯乙醇去氫酶基因（acoA ）、磷酸乙醯轉移酶基因（pta ）、葡萄糖磷酸腺苷醯轉移酶基因（glgC ）、乳糖去氫酶基因（ldhA ）和磷酸二酯酶基因（pdeC ）所組成群組的基因被修飾。
  2. 如請求項1所述之生產2,3-丁二醇的重組微生物，其中包括尿苷二磷酸葡萄糖磷酸尿甘醯轉移酶基因、乙醯乙醇去氫酶基因和磷酸乙醯轉移酶基因被修飾。
  3. 如請求項1所述之生產2,3-丁二醇的重組微生物，其中包括尿苷二磷酸葡萄糖磷酸尿甘醯轉移酶基因、乙醯乙醇去氫酶基因、磷酸乙醯轉移酶基因和葡萄糖磷酸腺苷醯轉移酶基因被修飾。
  4. 如請求項1所述之生產2,3-丁二醇的重組微生物，其中包括尿苷二磷酸葡萄糖磷酸尿甘醯轉移酶基因、乙醯乙醇去氫酶基因、磷酸乙醯轉移酶基因、葡萄糖磷酸腺苷醯轉移酶基因和乳糖去氫酶基因被修飾。
  5. 如請求項1所述之生產2,3-丁二醇的重組微生物，其中包括尿苷二磷酸葡萄糖磷酸尿甘醯轉移酶基因、乙醯乙醇去氫酶基因、磷酸乙醯轉移酶基因、葡萄糖磷酸腺苷醯轉移酶基因、乳糖去氫酶基因和磷酸二酯酶基因被修飾。
  6. 如請求項1至5所述之生產2,3-丁二醇的重組微生物，其中所述修飾包括抑制、刪除、或靜默。
  7. 如請求項1至5所述之生產2,3-丁二醇的重組微生物，其中所述修飾為刪除。
  8. 如請求項1至5所述之生產2,3-丁二醇的重組微生物，係屬於克雷白氏菌屬(Klebsiella) 。
  9. 如請求項1至5所述之生產2,3-丁二醇的重組微生物，其在酸性環境具有生產2,3-丁二醇的能力。
  10. 一種製造2,3-丁二醇的方法，包含：培養如請求項1至9中任一項所述之重組微生物、以及從培養液中分離取得2,3-丁二醇。
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