JP2018082704A - Ｃ５糖を含む基質においてバイオマスを産生するための酵母菌株 - Google Patents

Ｃ５糖を含む基質においてバイオマスを産生するための酵母菌株 Download PDF

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Abstract

【課題】１つ以上のＣ５糖を含む基質で増殖できる新規サッカロミセス・セレビシエ酵母菌株の提供。【解決手段】１つ以上のＣ５糖を含む基質の好気性条件下で増殖できるサッカロミセス属の酵母菌株であって、キシロースでの増殖試験の要件を満たすか、又は、ＣＰ培地での増殖試験の要件を満たす様に増殖の最大速度を有し、酵母菌株のゲノムで、ペントース経路の各遺伝子が調節解除され、アルドースレダクターゼ遺伝子（ＧＲＥ３）のコピーは欠失され、キシルロキナーゼ遺伝子（ＸＫＳ１）は過剰発現され、ピキア・スティピティスのキシロースデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＸＤＨ）の１つ以上のコピーが導入され、ピキア・スティピティスのキシロースレダクターゼ遺伝子（ＸＲ）の１つ以上のコピーが導入されている、酵母菌株。キシロースイソメラーゼをコードするピキア・スティピティス遺伝子の１つ以上のコピーが導入された、酵母菌体。【選択図】なし

Description

本発明は、バイオマス産生、特に酵母産生の分野に関する。本発明は特に、少なくとも１つのＣ５糖を含む基質での酵母の産生、より特には、リグノセルロース物質の加水分解から生じる基質での酵母の産生に関する。本発明はまた、製パン、バイオマス産生、フレーバー産生、二次代謝産物の産生、タンパク質産生、ＲＮＡ産生、エタノール産生、醸造または酵母エキスの産生などの酵母工業界についての用途において産生される酵母の使用にも関する。
好気的呼吸のプロセスによる酵母の増殖に関して、酵母は以下を必要とする：
− 炭素およびエネルギー源として炭素化合物、
− アンモニアの形態の還元窒素化合物；しかしながら、いくつかの酵母は、タンパク質および核酸の合成のために酸化化合物（硝酸塩など）または有機化合物を使用できる、
− 種々の無機成分およびビタミンおよび増殖因子（これらは酵母によって変わる）。
酵母が、例えば、炭素基質としてグルコースまたはフルクトースシロップ、ならびに窒素およびリン酸塩源としてアンモニウム塩およびリン塩に基づいて規定された組成を有する培地で産生される場合、培養培地はビタミンおよび微量元素の無機塩の添加によって補充されなければならず、これにより産生物を複雑および高価にする。
ビートおよび甘蔗糖の精製糖蜜は、糖（グルコースおよびフルクトース）、有機化合物および無機化合物からなる。このことが、これらの糖蜜が、経済的観点および技術的観点から選択される基質である理由であり、さらに今まで、それらは酵母の工業生産のために使用される主な原材料である。
しかしながら、特に、バイオエタノールの産生のためのそれらの大量の使用に関して、甘蔗糖またはビートの糖蜜の減少した入手可能性が、この種の産生を危うくしている。したがって、糖蜜から提供されるスクロースのための基質として新たな炭素基質を見つけることが必要とされる。
現在、バイオエタノール、特に第二世代のバイオエタノールの工業生産により、他の源の発酵基質の利用可能性が現れた。実際に、第二世代のバイオエタノールの工業は、植物由来のリグノセルロース物質を使用する。多数の植物を表すこれらの物質は、セルロース、ヘミセルロースおよびリグニンからなる。加水分解後、リグノセルロース物質は、Ｃ６糖（６個の炭素原子）およびＣ５糖（５個の炭素原子）の混合物になる。
全ての酵母はＣ６糖を代謝でき；一方で、Ｃ５糖は一般に発酵にあまり適さないか、またはサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、特にサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＳＣ）の酵母によって発酵できない。
第二世代のバイオエタノールの産生に関する最近の文献は、Ｃ５糖を発酵できるように改変されているＳｃ酵母を記載している。それらの文献の中で、例えば、本出願人名で特許文献１および特許文献２を挙げることができる。
特許文献１は、キシロースレダクターゼ（ＸＲ）をコードする遺伝子およびキシロースデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）をコードする遺伝子を菌株のゲノム内に導入することを含む、遺伝子組換えについての方法によって得られる酵母菌株を記載している。
特許文献２は、キシロースイソメラーゼをコードする外来遺伝子のコピー（前記遺伝子は、好ましくは、クロストリジウム・フィトフェルメンタス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）に由来する）およびキシリトールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の少なくとも１つのコピー（前記遺伝子はピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）に由来する）を菌株のゲノム内に導入することを含む方法によって得られる酵母菌株を記載している。
これらの文献に記載されている菌株はＣ５糖を含む基質で増殖できるが、本発明者らは、Ｃ５糖を含むまたはＣ５糖からなる基質での増殖の速度は低いままであり、いずれの場合も、酵母の工業生産に不適合であることを観察している。
さらに、本発明者らは、例えば、製パンのための発酵における酵母または酵母エキスの産生を意図する酵母などとしてのそれらの最後の工業的用途の間、このように得られた酵母は、改変していない元の菌株から得られた酵母の効率と比較して減少した効率を示すことを観察した。
国際公開第２０１１／１２８５５２号 国際公開第２０１２／７２７９３号
したがって、完全または部分的に炭素基質としてＣ６糖を置き換えることができ、酵母産生収率が、経済的および工業的利用に適合する酵母を産生するための新規の菌株に対する実際の要求が存在する。さらに、このような酵母を培養することは、大きな関心があり、完全に要求を満たす、それらの最終的な工業用途において効果を有する酵母を導かなければならない。
本発明の主題は、酵母の工業生産に適合する増殖速度および増殖率で少なくとも１つのＣ５糖を含む基質で増殖できる新規Ｓｃ酵母菌株に関する。
また、本発明は、培養した場合、適用効率、すなわち、それらの最終的な工業用途における要件を満たす効率、すなわち参照適用効率の少なくとも８０％、好ましくは９５％、さらにより好ましくは１０５％に等しい効率を有する酵母を得ることができる、新規菌株に関する。
本発明の別の主題は、遺伝子組換えまたはハイブリダイゼーションによって本発明に係る酵母菌株を得る方法である。
本発明の別の主題は、製パン、バイオマス産生、フレーバー産生、二次代謝産物の産生、タンパク質産生、ＲＮＡ産生、エタノール産生、醸造、ワイン生産または酵母エキスの産生から選択される工業的用途における本発明の方法によって得られる酵母および／または新規酵母の使用である。
実施例１のＰＣＲ分析の結果である。ゲルの左部分に示した値は、サイズマーカーのＤＮＡ断片のサイズに対応し、塩基対で表される（レーン１）。レーン２から５はそれぞれ、Ｘ１０Ｓ１、Ｘ１０Ｓ２、Ｍａｔ ａ対照およびＭａｔ α対照に対応する。 ＣＰ培地中で３０℃および１５０ｒｐｍにて培養時間（時間で表す）の関数としてＬｏｇ１０（ＯＤラムダ−６００ｎｍ）で表される培地の濁度の変化を表すグラフである。 ＹＦＸ培地中で３０℃および１５０ｒｐｍにて時間で表される培養時間の関数として６００ｎｍの波長にてＯＤで表される培地の濁度を表すグラフである。 分で表される時間に対して通常の生地上でｍＬ／分で表される気体放出を表すグラフである。
本発明は、少なくとも１つのＣ５糖を含む基質において好気条件下で増殖できる酵母菌株に関し、キシロースでの増殖試験の要件を満たすことまたはＣＰ培地での増殖試験の要件を満たすように増殖の最大速度を有することを特徴とする。
キシロースでの増殖試験：
この試験は、６００ｎｍの波長にて分光光度法によって、１５０ｒｐｍでの一定の撹拌下で、３０℃にて試験される１０８個の菌株細胞を接種した５０ｍＬのＹＦＸ培養培地を含有する溶液の濁度の変化を経時的にモニタリングすることからなる。この試験は、２４時間での吸光度（ＯＤ）が２より大きく、４８時間にて少なくとも３、好ましくは少なくとも１０である場合に要件を満たす。
ＹＦＸ培地は以下に定義される通りである：
ＣＰ培地での増殖試験
この試験は、６００ｎｍの波長にて分光光度法によって、１０ｇ／ｋｇのＥＸＬ型Ｊ１００（Ｂｉｏｓｐｒｉｎｇｅｒ）および１０ｇ／ｋｇのバクトペプトンならびに１００ｇ／ｋｇのスクロースを含有する、５０ｍＬのＣＰ培養培地を含有する溶液の濁度の変化を経時的にモニタリングすることからなり、前記培地に、１５０ｒｐｍでの一定の撹拌下で３０℃にて試験される１０８個の細胞が接種される。この試験は、ＯＤの変化が３．５から７．５時間で指数関数的になる場合に要件を満たす。このときのＯＤの変化を表す式は、ＯＤｔｆ＝ＯＤｔｉｅｎ（ｔｆ−ｔｉ）の形式を有し、式中、ｎは０．３５から０．９、好ましくは０．４５から０．８０、優先的には０．６５から０．７５である。
有益な実施形態によれば、本発明に係る菌株は、キシロースでの増殖試験およびＣＰ培地での増殖試験の両方の要件を満たす。
本発明によれば、酵母菌株は、サッカロミセス属、好ましくはサッカロミセス・セレビシエから選択される。
本発明によれば、Ｃ５糖は５個の炭素原子またはペントースを含む単糖を指す。Ｃ５糖は、アラビノース、キシロースおよびそれらの混合物を含む群から選択される。好ましくは、Ｃ５糖はキシロースである。
本発明によれば、少なくとも１つのＣ５糖を含む基質はまた、少なくとも１つのＣ６糖、すなわち６個の炭素原子またはヘキソースを含む単糖を含む。Ｃ６糖は、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノースを含む群から選択されるか、またはスクロース、マルトース、トレハロース、イソマルトースもしくはそれらの混合物などの二糖の分解に由来する。
好ましくは、本発明の基質は、０．１から２のＣ５／Ｃ６比で少なくとも１つのＣ５糖および少なくとも１つのＣ６糖を含む。
本発明に係る菌株の増殖によって得られる酵母は、製パン、バイオマス産生、フレーバー産生、二次代謝産物の産生、タンパク質産生、エタノール産生、醸造、ワイン生産または酵母エキスの産生などの工業用途にとって有益な性能を有する。つまり、本発明に係る菌株を培養することによって得られる酵母は、それらが意図される最終的な工業用途に効果的である。この効果は本特許出願において「適用効率」と称される。
考慮される全ての工業用途に関して、本発明の菌株を培養することによって得られる酵母は、乾燥の間、損傷しない必要がある。すなわち、２０％未満の酵母が乾燥後に不活性になる。
特定の実施形態によれば、本発明に係る菌株は、乾燥試験後に要件を満たすようなものである。
培養後に得られるバイオマスは、乾燥抽出物（「酵母クリーム」）の１８〜２２％に濃縮された酵母懸濁液を得るために、任意に洗浄工程を使用する遠心分離によって培地から分離される。
この懸濁液は、乾燥抽出物の２８〜３４％にてペースト状の塊（「圧縮酵母」）を得るために、濾過によって脱水の工程に供される。
次いでこの組成物は、０．２〜２ｍｍの直径を有する薄いソーセージ状の部分（バーミセリ状の部分）を得るために、ソーセージ状の部分（押出物）を形成するプロセスに供され、それは流動空気床を用いてドライヤの温風の流れによって乾燥される。
乾燥条件（温度スケジュール）は、産生物の温度が常に５０℃未満であるように厳密に制御される。細かいバーミセリ状の部分の形態である最終乾燥酵母は少なくとも９５％の乾燥抽出物含有量を有する。
乾燥酵母の細胞の生存率を向上させるために、０．２〜２％／乾燥重量の酵母にて乳化剤などの保護効果を有する添加物を酵母（懸濁または圧縮酵母）に加えることができ、それらの中でモノステアリン酸ソルビタン（ＭＳＳ）が慣例に使用されている標準添加物である。
乾燥後の生存酵母の数が、乾燥前の生存酵母の数の少なくとも８０％に等しい場合、菌株はこの試験の要件を満たす。
別の実施形態によれば、本発明に係る菌株は、参照適用効率の少なくとも８０％に等しい、好ましくは少なくとも９５％に等しい、さらにより好ましくは少なくとも１０５％に等しい適用効率ＡＥを有する。本発明の意味において、菌株の適用効率という用語は、前記酵母の最終的な工業用途における要件を満たして培養した場合に得られる酵母の効率を指す。すなわち、適用効率ＡＥは、この用途のために参照菌株を培養することによって得られる酵母の適用効率の少なくとも９０％に等しい。所与の使用についての参照菌株は、この用途のために従来から使用されている菌株である。したがって、製パン工業のために培養した菌株についての適用効率は発酵出力であり、参照適用効率は、Ｎｏ．Ｉ−２９７０としてＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅｓ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ［Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ］（ＣＮＣＭ，Ｐａｓｔｅｕｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，２８ ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ，７５７２４ Ｐａｒｉｓ ｃｅｄｅｘ １５）に２００３年２月１２日に寄託された菌株のものであり、１２０ｍｌのＣＯ２が２０ｇの粉末から２時間で放出される。決定方法はＢｕｒｒｏｗｓおよびＨａｒｒｉｓ発酵計によって実施されるいわゆるリソグラフ法である（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｒｅｗｉｎｇ，Ｖｏｌ．ＬＸＶ，Ｎｏ．１，１９５９年，１月−２月）。
バイオマス産生は、本明細書において、培養培地と共に漸進的に供給されるが、そこから培地の容積は引かれない、発酵槽（またはリアクタ）における培養を指す、「半連続様式における培養」または「半連続培養」または「半連続様式」とも称される、いわゆる「好気性フェドバッチ法」を使用して実施される。このような方法において、培養容積は発酵槽において可変であり（および一般的に増加し）、供給速度は一定であっても、可変であってもよい。
「フェドバッチ」法は一般に、Ｖａｎ Ｎｏｓｔｒａｎｄ Ｒｅｉｎｈｏｌｄ、ＩＳＢＮ ０−４４２−３１８９２−８によって公開されている、参照文献「Ｙｅａｓｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、第６章、第２版、１９９１、Ｇ．ＲｅｅｄおよびＴ．Ｗ．Ｎａｇｏｄａｗｉｔｈａｎａに記載されている条件下で実施される。
バイオマス産生のために培養した菌株について、適用効率は産生収率であり、参照適用効率は、Ｎｏ．９９５としてＮＣＹＣ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｙｅａｓｔ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｎｏｒｗｉｃｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，Ｃｏｌｎｅｙ，Ｎｏｒｗｉｃｈ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ，ＮＲ４ ７ＵＡ）に１９８１年２月２６日に寄託された菌株のものであり、それは、使用されるＣ６糖に対して８０％収率であるか、または注いだ糖液１ｇ当たり８０ｇの酵母である。この試験は、産生される乾燥物質の量を測定することによって実施される。
アルコールの産生のために培養された菌株について、適用効率はエタノール産生収率であり、参照適用効率は、Ｎｏ．Ｉ−４０７１としてＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅｓ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ，Ｐａｓｔｅｕｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，２８ ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ，７５７２４ Ｐａｒｉｓ ｃｅｄｅｘ １５）に２００８年９月４日に寄託した菌株のものであり、使用されるＣ６糖１ｇ当たり０．４０ｇのエタノールが産生される。エタノールおよびＣ６糖の量はＨＰＬＣまたは酵素アッセイによって測定される。
酵母エキスの産生のために培養した菌株について、適用効率は、得られた酵母エキスの窒素含有量の決定であり、参照効率は、参照Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ０２０３／０−ＭＧ−ＬとしてＢｉｏ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ社によって市販されている酵母エキスのものであり、乾燥物質に対して１０％の窒素である。窒素アッセイは燃焼法を使用して行われる。
特定の実施形態によれば、菌株は、参照適用効率の少なくとも８０％に等しい、好ましくは少なくとも９５％に等しい、さらにより好ましくは少なくとも１０５％に等しい、適用効率ＡＥを有し、適用効率は、発酵出力、バイオマスの収率、フレーバー、二次代謝産物、タンパク質、エタノールの産生を含む群から選択される。
有益には、本発明に係る菌株は乾燥試験の要件を満たし、参照適用効率の少なくとも８０％に等しい適用効率ＡＥを有する。
本発明はまた、以下の新規菌株に関する：
− Ｎｏ．Ｉ−４６７０としてＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅｓ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ，Ｐａｓｔｅｕｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，２８ ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ，７５７２４ Ｐａｒｉｓ ｃｅｄｅｘ １５）に２０１２年８月２３日に寄託された酵母菌株
− Ｎｏ．Ｉ−４６７１としてＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅｓ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ，Ｐａｓｔｅｕｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，２８ ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ，７５７２４ Ｐａｒｉｓ ｃｅｄｅｘ １５）に２０１２年８月２３日に寄託された酵母菌株。
これらの菌株は製パン酵母菌株であり、それらの各々は、キシロースでの増殖試験およびＣＰ培地での増殖試験の要件を満たし、それらの各々は、それぞれ２０ｇの粉末から２時間で放出される少なくとも１００ｍＬのＣＯ２の発酵出力を有する。これらの菌株はまた、乾燥試験の要件を満たす。
本発明の別の主題は上記で定義されている酵母菌株を得る方法である。
第１の実施形態によれば、その方法はＣ５糖を代謝できるように参照適用効率を有する菌株Ｂの遺伝子組換えの工程を含む。
第２の実施形態によれば、その方法は、参照適用効率を有する菌株Ｂと、Ｃ５糖を代謝できる菌株Ａとの交配を含む。
本発明に係る方法の実施形態に関わらず、前記方法は、キシロースでの増殖試験、ＣＰ培地での増殖試験および乾燥試験から選択される試験の少なくとも１つの要件を満たすか、または菌株Ｂの参照適用効率の少なくとも８０％に等しい、好ましくは少なくとも９５％に等しい、さらにより好ましくは少なくとも１０５％に等しい適用効率ＡＥを有する菌株を選択できる少なくとも１つのスクリーニング工程を含んでもよい。
スクリーニング工程は本発明の方法の最後の工程として実施され得る。
本発明によれば、Ｃ５糖を代謝する能力は嫌気性条件下でＣ５糖を含む培地からエタノールを産生する能力に反映される。Ｃ５糖を代謝できる菌株は、一般に、遺伝子組換えされた菌株であり、ペントース経路の各遺伝子は調節解除されており、アルドースレダクターゼをコードするＧＲＥ３遺伝子のコピーは欠失され、キシルロキナーゼをコードする天然ＸＫＳ１遺伝子は過剰発現され、指向進化を受ける。
本発明の一つの形態によれば、Ｃ５糖を代謝できる菌株は、酵素キシロースレダクターゼをコードするピキア・スティピティスＸＲ遺伝子の少なくとも１つのコピー、および酵素キシロースデヒドロゲナーゼをコードするピキア・スティピティスＸＤＨ遺伝子の少なくとも１つのコピーを含む菌株である。
本発明の別の形態によれば、Ｃ５糖を代謝できる酵母は、キシロースイソメラーゼをコードする外来遺伝子の少なくとも１つのコピーおよび好ましくは、ピキア・スティピティスに由来するキシリトールデヒドロゲナーゼをコードする外来遺伝子の少なくとも１つのコピーを含む酵母菌株である。
キシロースイソメラーゼは、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、ホヤ（Ｃｉｏｎａ）、ニセツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ）、セルビブリオ（Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ）、キチノファガ（Ｃｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａ）、サッカロポリスポラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ）またはサリニバクター（Ｓａｌｉｎｉｂａｃｔｅｒ）に由来する遺伝子であり、好ましくは、クロストリジウム・フィトフェルメンタスに由来するか、またはピロミセス種由来の遺伝子である。
さらに、Ｃ５糖を代謝できる菌株は以下の改変を含む：
− アルドースレダクターゼをコードする遺伝子、好ましくはＧＲＥ３遺伝子の少なくとも１つのコピー、好ましくは少なくとも２つのコピーが欠失される、
− キシルロキナーゼをコードする外来遺伝子、好ましくはＸＫＳ１遺伝子が、嫌気状態によって、または任意の炭素源により誘導される異化抑制によって抑制されない遺伝子のプロモーターの制御下に置かれ、アルコール発酵の間に強力に発現される、
− 好ましくは、ＲＰＥ１、ＲＫＩ１、ＴＫＬ１およびＴＡＬ１遺伝子から選択される、ペントースリン酸経路の非酸化部分の少なくとも１つの外来遺伝子、ならびに特に好ましくはこれらの遺伝子の全ては、嫌気状態によって、または任意の炭素源により誘導される異化抑制によって抑制されない遺伝子のプロモーターの制御下に置かれ、アルコール発酵の間に強力に発現される。
遺伝子組換えの方法は、国際公開第２０１１／１２８５５２号または国際公開第２０１２／７２７９３号に記載されているもののうちの１つであってもよい。
第１の実施形態によれば、遺伝子組換えの方法は、キシロースレダクターゼをコードするピキア・スティピティス遺伝子の少なくとも１つのコピーおよびキシロースデヒドロゲナーゼをコードするピキア・スティピティス遺伝子の少なくとも１つのコピーを菌株Ａのゲノム内へ組み込むことを含む。
遺伝子組換えの方法は、さらに、好ましくはクロストリジウム属、好ましくはクロストリジウム・フィトフェルメンタスの細菌に由来するキシロースイソメラーゼをコードする外来遺伝子の少なくとも１つのコピー、およびピキア・スティピティスに由来するキシリトールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の少なくとも１つのコピーを以前に得られた菌株のゲノム内に組み込むことを含んでもよい。
本発明に係るハイブリダイゼーション法の実施形態によれば、前記方法は以下の工程を含む：
− Ｃ５糖を代謝できる菌株（Ａ）の選択；
− 工業用途に適合した性能を有する菌株（Ｂ）の選択；
− 菌株（Ａ）の分離個体と菌株（Ｂ）の分離個体とのハイブリダーゼーション。
一つの変形例によれば、本発明に係る前記ハイブリダーゼーション法は、以下のさらなる工程を含む：
− Ｃ５糖を代謝できる菌株（Ａ）の選択；
− 分離個体Ｘを得るために前記菌株（Ａ）の胞子形成；
− 工業用途に適合した性能を有する菌株（Ｂ）の選択；
− 分離個体Ｙを得るために前記菌株（Ｂ）の胞子形成；
− ＸおよびＹのハイブリダイゼーション。
菌株Ａは遺伝子組換え菌株から選択され、ペントース経路の各遺伝子は調節解除され、アルドースレダクターゼをコードする遺伝子のコピーは欠失され、指向進化を受ける。
本発明の一つの形態によれば、Ｃ５糖を代謝する菌株Ａは、酵素キシロースレダクターゼをコードするピキア・スティピティスＸＲ遺伝子の少なくとも１つのコピーおよび酵素キシリトールデヒドロゲナーゼをコードするピキア・スティピティスＸＤＨ遺伝子の少なくとも１つのコピーを含む菌株である。
本発明の別の形態によれば、Ｃ５糖を代謝できる菌株Ａは、キシロースイソメラーゼをコードする外来遺伝子の少なくとも１つのコピー、および好ましくはピキア・スティピティスに由来するキシリトールデヒドロゲナーゼをコードする外来遺伝子の少なくとも１つのコピーを含む酵母菌株である。
キシロースイソメラーゼは、クロストリジウム、ピロミセス、バクテロイデス、ストレプトミセス、ヘモフィルス、バークホルデリア、エンテロコッカス、サーモトガ、フソバクテリウム、ゲオバチルス、アルスロバクター、ホヤ、ニセツリガネゴケ、セルビブリオ、キチノファガ、サッカロポリスポラまたはサリニバクターに由来する遺伝子であり、好ましくは、クロストリジウム・フィトフェルメンタスに由来するか、またはピロミセス種由来の遺伝子である。
さらに、Ｃ５糖を代謝できる菌株Ａは以下の改変を含む：
− アルドースレダクターゼをコードする遺伝子、好ましくはＧＲＥ３遺伝子の少なくとも１つのコピー、好ましくは少なくとも２つのコピーは欠失される、
− キシルロキナーゼをコードする外来遺伝子、好ましくは、ＸＫＳ１遺伝子は、嫌気状態によって、または任意の炭素源により誘導される異化抑制によって抑制されない遺伝子のプロモーターの制御下に置かれ、アルコール発酵の間に強力に発現される、
− 好ましくは、ＲＰＥ１、ＲＫＩ１、ＴＫＬ１およびＴＡＬ１遺伝子から選択される、ペントースリン酸経路の非酸化部分の少なくとも１つの外来遺伝子、特に好ましくはこれらの遺伝子の全ては、嫌気状態によって、または任意の炭素源により誘導される異化抑制によって抑制されない遺伝子のプロモーターの制御下に置かれ、アルコール発酵の間に強力に発現される。
遺伝子組換えの方法は、国際公開第２０１１／１２８５５２号または国際公開第２０１２／７２７９３号に記載されているもののうちの１つであってもよい。
菌株Ａはまた、菌株標的化法によって選択され得る。上記に定義されるキシロースでの増殖試験および／またはＣＰ培地での増殖試験の要件を満たす菌株のみが選択される。
菌株Ｂはまた、菌株スクリーニング法によって選択され得る。参照適用効率の少なくとも８０％に等しい、好ましくは少なくとも９５％に等しい、さらにより好ましくは１０５％に等しい適用効率ＡＥを有する菌株のみが選択される。
菌株が製パン菌株である場合、選択される菌株（Ｂ）は、５ｍＬ・２ｈ−１ｇ（粉末）−１超、好ましくは６ｍＬ・２ｈ−１ｇ（粉末）−１超、さらにより好ましくは８ｍＬ・２ｈ−１ｇ（粉末）−１超の発酵出力を有する。
分離個体を得る工程を使用する方法はまた、分離個体Ｘをスクリーニングする工程および／または分離個体Ｙをスクリーニングする工程を含んでもよい。上記に定義されるキシロースでの増殖試験および／またはＣＰ培地での増殖試験の要件を満たす分離個体Ｘのみが選択される。参照適用効率の少なくとも８０％に等しい、好ましくは少なくとも９５％に等しい、さらにより好ましくは１０５％に等しい適用効率ＡＥを有する分離個体Ｙのみが選択される。
好ましくは、分離個体Ｘは、Ｎｏ．Ｉ−４６７２およびＩ−４６７３としてＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅｓ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ，２８ ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ，７５７２４ Ｐａｒｉｓ ｃｅｄｅｘ １５）に２０１２年８月２３日に寄託された菌株から選択され、分離個体Ｙは、Ｉ−４６６９としてＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅｓ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ，２８ ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ，７５７２４ Ｐａｒｉｓ ｃｅｄｅｘ １５）に２０１２年８月２３日に寄託された菌株から選択される。
本発明の別の主題は、上記の菌株由来の少なくとも１つのＣ５糖を含む基質で酵母を産生するための好気性「フェドバッチ」法である。好気性「フェドバッチ」法とは、本明細書において、培養培地と共に漸進的に供給されるが、そこから培地の容積は引かれない、発酵槽（またはリアクタ）における培養を指す、「半連続様式で培養すること」または「半連続培養すること」または「半連続様式」と称される。このような方法において、培養容積は発酵槽において可変であり（および一般的に増加し）、供給速度は一定であっても、可変であってもよい。
「フェドバッチ」法は一般に、Ｖａｎ Ｎｏｓｔｒａｎｄ Ｒｅｉｎｈｏｌｄ、ＩＳＢＮ ０−４４２−３１８９２−８によって公開されている、参照文献「Ｙｅａｓｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、第６章、第２版、１９９１、Ｇ．ＲｅｅｄおよびＴ．Ｗ．Ｎａｇｏｄａｗｉｔｈａｎａに記載されている条件下で実施される。
本発明によれば、増殖率は概して１．１６である。一般に、本発明の菌株によるＣ５糖の使用率はこれらの菌株の性質に依存し、特定の条件下で最大１００％に到達し得る。したがって、製パンにおける最終用途を意図する菌株は、その増殖において、発酵基質に含まれる最大５０％のＣ５糖を使用できるのに対して、エタノール産生の適用を意図する菌株は最大１００％のＣ５糖を使用できる。
本発明の別の主題は、製パン、バイオマス産生、フレーバー産生、二次代謝産物の産生、タンパク質産生、ＲＮＡ産生、エタノール産生、醸造、または酵母エキスの産生から選択される少なくとも１つの工業用途における、得られた酵母の使用である。
以下の実施例はその範囲を限定することなく本発明を示す。
実施例１：分離個体Ｙの調製
菌株ＣＮＣＭ Ｉ−４５３８の分離個体を得るために、後者を、１０ｇ／ｋｇの酵母エキス（ＥＸＬ）型Ｊ１００、１０ｇ／ｋｇのペプトンおよび２０ｇ／ｋｇのグルコースを含有するＹＰＧ培地中で２４時間培養した。得られた細胞の懸濁液を、次いで、２０ｇ／ｋｇのアガロースおよび７．５ｇ／ｋｇの酢酸ナトリウムからなるＳＡＡ培地を含有するペトリ皿に移した。３０℃でのインキュベーションの５日後、マイクロマニピュレータを使用して４つに切断する。このように調製した皿を３０℃にて４８時間インキュベートする。
得られた分離個体の使用に対する制限の１つは、それらの性シグナルに関する。実際に、キシロースを発酵できる菌株の分子生物学による構築の時に、この経路に必須であるいくつかの遺伝子が、Ｍａｔ αに遺伝的に連結される遺伝子座に導入された。したがって、この点は、参照ＣＮＣＭ Ｉ−４５３８としてＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅｓ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｐａｓｔｅｕｒ，２８ ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ，７５７２４ Ｐａｒｉｓ ｃｅｄｅｘ １５）に２０１１年１０月５日に寄託した
菌株由来の全ての分離個体は、キシロースを代謝でき、Ｍａｔ αシグナルを有することを示す。この制限を取り除くために、これらの分離個体の性シグナルを変化させた。この目的のために、天然に存在するプロセスを使用した。実際に、いくつかの野生型酵母は、半数体である場合、性シグナルを変化させることができる。このプロセスはＨＯリコンビナーゼの作用下で生じる。後者は、参照ＣＮＣＭ Ｉ−４５３８としてＣＮＣＭに寄託した菌株において機能的ではなく、したがってそれはまた、この菌株において機能的ではない。機能的ＨＯリコンビナーゼをコードする遺伝子を含有する複製プラスミドを対象の分離個体内に導入した。この方法は１９９１年に公開されたＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚおよびＪｅｎｓｅｎの研究に基づく。問題のあるプラスミドによって保持されるＨＯ遺伝子を、ガラクトースによって誘導されるプロモーターの依存下に置いた。このように形質転換した分離個体を、１０ｇ／ｋｇのＥＸＬ型Ｊ１００、１０ｇ／ｋｇのペプトンおよび２０ｇ／ｋｇのガラクトースを含有する培地中で１６時間インキュベートした。次いで細胞を、１０ｇ／ｋｇのＥＸＬ型Ｊ１００、２０ｇ／ｋｇのアガロースおよび２０ｇ／ｋｇのグルコースを含有する固体培地上に播いた。クローンを得た後、性シグナルの変化を、性シグナルの発現の遺伝子座上でＰＣＲを実施することによって確認した。この反応は、マトリクスとして各々の潜在的な分離個体のゲノムＤＮＡを使用して実施される。オリゴヌクレオチドは、一方で、酵母の第ＩＩＩ染色体で発現されるＭＡＴ遺伝子座に特異的なプライマー（プライマーＭａｔ１：ＡＧＴＣＡＣＡＴＣＡＡＧＡＴＣＧＴＴＴＡＴＧＧ）および２つの他のプライマー、１つはＭａｔ αに特異的（プライマーＭａｔ２：ＧＣＡＣＧＧＡＡＴＡＴＧＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＧ）であり、他はＭａｔ ａに特異的（プライマーＭａｔ３：ＡＣＴＣＣＡＣＴＴＣＡＡＧＴＡＡＧＡＧＴＴＴＧ）である。
酵母のＭａｔ ａ遺伝子型は、０．８％にてアガロースゲル上で検出可能である５４４塩基対の単位複製配列の存在によって特徴付けられる。
得られた結果を図１に示す。
実施例２：分離個体Ｙの調製およびハイブリダイゼーション後に高い発酵出力を伝達する分離個体の能力の検証
分離個体の調製：Ｎｏ．Ｉ−４６６９としてＣＮＣＭに寄託した分離個体を、Ｎｏ．Ｉ−２９７０としてＣＮＣＭに寄託した製パン菌株から調製した。使用した調製方法は実施例１に記載されているものと同一である。
伝達の検証：ハイブリッド４５３９および４５５０を、Ｎｏ．９５５としてＮＣＹＣおよびＮｏ．Ｉ−２９７０としてＣＮＣＭに寄託された製パン菌株由来の分離個体のハイブリダイゼーションによって調製した。
以下の表に示した２ｇ（ＳＤ２ｇ）での通常の生地（Ｎｏｒｍａｌ Ｄｏｕｇｈ）（ＮＤ）および甘味生地（Ｓｗｅｅｔｅｎｅｄ Ｄｏｕｇｈ）に対する発酵出力は、分離個体Ｉ−４６６９が、ハイブリダイゼーション後に高い発酵出力を伝達できることを示す。
実施例３：ハイブリダイゼーション
調製した異なる分離個体を以下の表に示したように交配した。
実施例４：スクリーニング
上記の実施例３において得られたハイブリッド菌株を以下の異なるスクリーニングに供した：
１／キシロースでの増殖試験
この第１の試験は炭素源としてキシロースを使用して増殖する能力に関する。
炭素源としてキシロースを使用して増殖する菌株の能力を決定するために、それらを５０ｍＬのＹＦＸ培地（組成は以下に与える）中で２×１０６細胞／ｍＬにて接種し、それらを１５０ｒｐｍにて撹拌しながら３０℃に維持した。
バイオマスの変化を、６００ｎｍの波長にて分光光度計で測定した濁度をモニタリングすることによって決定する。このモニタリングの結果を図２に表す。
ＹＦＸ培地でのバイオマスの変化により、４つの菌株を選択できる。それらは、炭素源としてキシロースを使用する良好な能力を有する菌株ＨＣ５−Ａ、ＨＣ５−Ｂ、ＨＣ５−ＣおよびＨＣ５−Ｄである。さらに、これらの菌株はキシロースを迅速に処理できるのに対して、ハイブリッドＨＣ５−ＫおよびＨＣ５−Ｌは、キシロースでの増殖の開始のそれらの遅延のために、維持しなかった。
２／ＣＰ培地での増殖試験
別の重要な基準は細胞の増殖の最大速度である。それを決定するために、酵母を２×１０６細胞／ｍＬで５０ｍＬのＣＰ培地中に接種した。この培地は、１０ｇ／ｋｇのＥＸＬおよび１０ｇ／ｋｇのバクトペプトンならびに１００ｇ／ｋｇのスクロースを含有するので非常にリッチである。濁度の変化を６００ｎｍにて分光光度法によって測定する。次に、増殖の最大速度を、バイオマスが指数関数的に増殖する間の時間を識別することによって分析する。図３は、対数目盛で、培養時間の関数として濁度の変化を表す。
３．５時間から７．５時間の間隔において、濁度の変化は指数関数的であり、対数目盛を使用するグラフでの直線の出現によって確認される。増殖速度は時間の関数として６００ｎｍで濁度の変化の導関数として定義される。ここで、種々のラインは平行であるように見えるので、これは、増殖の速度が、この培地上で参照ＮＣＹＣ９９５としてＮＣＹＣに寄託された菌株および参照ＣＮＣＭ Ｉ−４５３８としてＣＮＣＭに寄託された菌株のものに匹敵するようであることを示唆している。
３／偽フェドバッチ後の発酵出力の試験
ハイブリッドＨＣ５−ＢおよびＨＣ５−Ｃ（菌株Ｉ−４６７０およびＩ−４６７１）は炭素源としてラフィノースを使用して増殖した。この三糖の使用により、酵母に糖を漸進的に送達することができる。実際に、ラフィノースは酵母のインベルターゼによってゆっくり加水分解される。ＳＭＡＲＴシステム５（商標）装置（ＣＥＭ社、ＵＳＡ）を使用して容積単位当たりの乾燥酵母物質の量を測定することによって異なる生成物のバイオマスの量を標準化した後、リソグラフ発酵分析（ｒｉｓｏｇｒａｐｈ ｆｅｒｍｅｎｔｏｍｅｔｅｒ）を使用して気体放出を分析した。図４に示される、通常の生地での試験についての気体放出の変化は以下のように実施される：
・ 酵母の懸濁は以下のように調製される：試験される酵母の１ｇの乾燥物質に等しい量を懸濁し、２７ｇ／ＬのＮａＣｌおよび４ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４を含有する溶液で１００ｍＬにする。
・ １５ｍｌの上記懸濁液（これは１５０ｍｇの乾燥酵母物質）を３０℃の温度にて１５分間平衡化する。
・ この懸濁液に、３０℃にて一晩事前に平衡化した２０ｇの粉末を加える。全て３５秒間均質化する。
・ 形成した生地を３０℃に置いた密閉した容器中でインキュベートする。気体放出（７６０ｍｍＨｇ下でｍＬで表す）を合計で１２０分間記録する。
甘味生地（ＳＤ）における試験についての気体放出の測定プロトコルは、糖（ここで２ｇ）を他の乾燥成分と共に加えたことを除いてＮＤに従ったものと同一である。
得られたプロファイルは、異化抑性が、製パン用途に不適当とされる「マルトース遅延」と称される重要なジオキシー現象を誘導する、参照ＣＮＣＭ Ｉ−４５３８としてＣＮＣＭに寄託した菌株において高いことを示す。他方で、Ｎｏ．ＮＣＹＣ ９９５としてＮＣＹＣに寄託された菌株より遅いが、ハイブリッドＨＣ５−Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは興味のあるプロファイルを有するようであることが留意されるべきである。ハイブリッドＨＣ５−ＢおよびＨＣ５−Ｃ（菌株Ｉ−４６７０および４６７１）は最適な結果を生じる。
実施例５：
Ｎｏ．Ｉ−４６７０およびＮｏ．Ｉ−４６７１として寄託した菌株の各々を、キシロースでの増殖試験、ＣＰ培地での増殖試験に供し、それらの発酵出力を測定した。
得られた結果を以下の表に示す：
実施例６：
Ｎｏ．Ｉ−４６７０およびＮｏ．Ｉ−４６７１として寄託した菌株の各々を、１８時間、好気性フェドバッチ法に従って増殖させた。乾燥後に得られた酵母の発酵出力を、通常の生地（ＮＤ）試験および甘味生地２グラム試験（ＳＤ２ｇ）に従って測定した。得られた結果を以下に示す：

Claims (31)

  1. 少なくとも１つのＣ５糖を含む基質において好気性条件下で増殖できるサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母菌株であって、キシロースでの増殖試験の要件を満たすか、またはＣＰ培地での増殖試験の要件を満たすように増殖の最大速度を有し、前記酵母菌株のゲノムにおいて、ペントース経路の各遺伝子は調節解除され、アルドースレダクターゼをコードするＧＲＥ３遺伝子のコピーは欠失され、天然ＸＫＳ１遺伝子は過剰発現され、キシロースデヒドロゲナーゼをコードするピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ Ｓｔｉｐｉｔｉｓ）遺伝子の少なくとも１つのコピーが導入され、キシロースレダクターゼをコードするピキア・スティピティス遺伝子の少なくとも１つのコピーが導入されている、酵母菌株。
  2. 少なくとも１つのＣ５糖を含む基質において好気性条件下で増殖できるサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母菌株であって、キシロースでの増殖試験の要件を満たすか、またはＣＰ培地での増殖試験の要件を満たすように増殖の最大速度を有し、前記酵母菌株のゲノムにおいて、ペントース経路の各遺伝子は調節解除され、アルドースレダクターゼをコードするＧＲＥ３遺伝子のコピーは欠失され、天然ＸＫＳ１遺伝子は過剰発現され、キシロースデヒドロゲナーゼをコードするピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ Ｓｔｉｐｉｔｉｓ）遺伝子の少なくとも１つのコピーが導入され、キシロースイソメラーゼをコードするピキア・スティピティス遺伝子の少なくとも１つのコピーが導入されている、酵母菌株。
  3. キシロースイソメラーゼをコードする遺伝子が、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属の細菌に由来する、好ましくはクロストリジウム・フィトフェルメンタス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）に由来する、請求項２に記載の菌株。
  4. キシロースでの増殖試験の要件を満たし、ＣＰ培地での増殖試験の要件を満たすように増殖の最大速度を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の菌株。
  5. サッカロミセス属、好ましくはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の菌株。
  6. 乾燥試験の要件を満たす、請求項１〜５のいずれか一項に記載の菌株。
  7. 参照適用効率の少なくとも８０％に等しい、好ましくは少なくとも９５％に等しい、さらにより好ましくは少なくとも１０５％に等しい適用効率ＡＥを有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の菌株。
  8. 前記適用効率が、発酵出力、生存率、バイオマスの収率、フレーバー、二次代謝産物、タンパク質、ＲＮＡまたはエタノールの産生からなる群から選択される、請求項７に記載の菌株。
  9. 製パン酵母菌株である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の酵母菌株。
  10. 適用効率が、発酵出力であり、２０ｇの粉末から２時間で１００ｍＬのＣＯ２である参照発酵出力の少なくとも９５％に等しい、請求項９に記載の菌株。
  11. Ｎｏ．Ｉ−４６７０として２０１２年８月２３日にＣＮＣＭに寄託された、請求項１０に記載の酵母菌株。
  12. Ｎｏ．Ｉ−４６７１として２０１２年８月２３日にＣＮＣＭに寄託された、請求項１０に記載の酵母菌株。
  13. Ｃ５糖を代謝できるようにするために、参照適用効率を有する菌株Ａの遺伝子組み換えの工程を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の菌株を得る方法。
  14. Ｃ５糖を代謝できる菌株Ｂを、参照適用効率を有する菌株Ａと交配する工程を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の菌株を得る方法。
  15. 菌株Ａの前記参照適用効率が、参照発酵出力、生存率、バイオマスの参照収率、フレーバー、二次代謝産物、タンパク質、ＲＮＡまたはエタノールの産生からなる群から選択される、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
  16. キシロースでの増殖試験、ＣＰ培地での増殖試験および乾燥試験から選択される試験のうちの少なくとも１つの要件を満たすか、または菌株Ａの参照適用効率の少なくとも９０％に等しい、好ましくは少なくとも９８％に等しい、さらにより好ましくは少なくとも１０５％に等しい、適用効率ＡＥを有する菌株を選択できるようにするスクリーニング工程をさらに含む、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. キシロースレダクターゼをコードするピキア・スティピティス遺伝子の少なくとも１つのコピーおよびキシロースデヒドロゲナーゼをコードするピキア・スティピティス遺伝子の少なくとも１つのコピーを菌株Ａのゲノム内に導入する工程を含む、請求項１３または請求項１６に記載の方法。
  18. キシロースイソメラーゼをコードする外来遺伝子の少なくとも１つのコピーおよびピキア属、好ましくはピキア・スティピティスの酵母に由来するキシリトールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の少なくとも１つのコピーを菌株Ａのゲノム内に導入する工程を含む、請求項１３または請求項１６に記載の方法。
  19. キシロースイソメラーゼをコードする遺伝子が、クロストリジウム属の細菌に由来する、好ましくはクロストリジウム・フィトフェルメンタスに由来する、請求項１８に記載の方法。
  20. 以下の工程：
    Ｃ５糖を代謝できる菌株（Ａ）の選択、
    工業用途に適合する性能を有する菌株（Ｂ）の選択、
    菌株（Ａ）と菌株（Ｂ）のハイブリダイゼーション
    を含む、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
  21. 以下の工程：
    Ｃ５糖を代謝できる菌株（Ａ）の選択、
    分離個体Ｘを得るために前記菌株（Ａ）の胞子形成、
    工業用途に適合する性能を有する菌株（Ｂ）の選択、
    分離個体Ｙを得るために前記菌株（Ｂ）の胞子形成、
    ＸとＹのハイブリダイゼーション
    を含む、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
  22. 菌株（Ａ）の選択が、キシロースでの増殖試験および／またはＣＰ培地での増殖試験の要件を満たす菌株のみを選択するスクリーニングによって行われ、および／または菌株（Ｂ）の選択が、参照適用効率の少なくとも９０％に等しい、好ましくは少なくとも９８％に等しい、さらにより好ましくは少なくとも１０５％に等しい適用効率ＡＥを有する菌株のみを選択するスクリーニングによって行われる、請求項２０または請求項２１に記載の方法。
  23. 分離個体Ｘをスクリーニングする工程および／または分離個体Ｙをスクリーニングする工程を含む、請求項２１に記載の方法。
  24. 分離個体ＸがＮｏ．Ｉ−４６７２およびＮｏ．Ｉ−４６７３として２０１２年８月２３日に寄託された菌株から選択され、分離個体ＹがＮｏ．Ｉ−４６６９として２０１２年８月２３日に寄託された菌株から選択される、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 製パン、バイオマス産生、フレーバー産生、二次代謝産物の産生、タンパク質産生、ＲＮＡ産生、エタノール産生、醸造または酵母エキスの産生から選択される工業用途における、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の菌株を培養することによって得られるか、または請求項１３〜２４のいずれか一項に記載の方法によって得られる酵母の使用。
  26. 請求項１〜１２のいずれか一項に記載の菌株または請求項１３〜２４のいずれか一項に記載の方法によって得られる菌株から、少なくとも１つのＣ５糖を含む基質において酵母を産生するための好気性「フェドバッチ」法。
  27. 製パン、バイオマス産生、フレーバー産生、二次代謝産物の産生、タンパク質産生、ＲＮＡ産生、エタノール産生、醸造、ワイン生産または酵母エキスの産生から選択される工業用途における、請求項２６に記載の方法によって産生される酵母の使用。
  28. 前記Ｃ５の基質が少なくとも１つのＣ６糖を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の菌株または請求項１３〜２４および２６のいずれか一項に記載の方法。
  29. Ｃ５／Ｃ６糖の割合が０．１から２である、請求項２８に記載の菌株または方法。
  30. Ｃ５糖がキシロースである、請求項２８または請求項２９に記載の菌株または方法。
  31. Ｃ６糖が、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノースから選択されるか、またはスクロース、マルトース、トレハロースもしくはイソマルトースなどの二糖の分解に由来する、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の菌株または方法。
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