KR102620924B1 - 글리세롤로부터의 1,3-프로판디올 생산을 위한 클로스트리디아를 포함하는 미생물 컨소시엄 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 높은 글리세린 함량을 갖는, 구체적으로 고농도의 산업용 글리세린을 갖는 배양 배지로부터의 성장 및 1,3-프로판디올 생산을 위해 특별히 적응된 미생물 컨소시엄에 관한 것이다. 보다 특히, 이러한 미생물 컨소시엄은 적어도 1종의 균주 씨. 아세토부틸리쿰, 및 씨. 스포로게네스의 균주 및/또는 씨. 스페노이데스의 균주 중에서 선택된 적어도 1종의 균주를 포함한다. 본 발명은 또한 상기 미생물 컨소시엄을 배양하여 이들 특정한 상이한 미생물의 공동-배양물을 생성함으로써 1,3-프로판디올을 생산하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 높은 글리세롤 함량을 갖는, 구체적으로 산업용 글리세린으로부터 유래된 고농도의 글리세롤을 갖는 배양 배지로부터의 성장 및 1,3-프로판디올 생산을 위해 특별히 적응된 미생물 컨소시엄에 관한 것이다. 보다 특히, 이러한 미생물 컨소시엄은 적어도 1종의 균주 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 및 클로스트리디움 스포로게네스(Clostridium sporogenes)의 균주 및/또는 클로스트리디움 스페노이데스(Clostridium sphenoides)의 균주 중에서 선택된 적어도 1종의 균주를 포함한다. 본 발명은 또한 상기 미생물 컨소시엄을 배양하여 이들 특정한 상이한 미생물의 공동-배양물을 생성함으로써 1,3-프로판디올을 생산하는 방법에 관한 것이다.
트리메틸렌 글리콜 또는 프로필렌 글리콜로도 지칭되는 1,3-프로판디올 (PDO)은 가장 오래된 공지된 발효 산물 중 하나이다. 이는 원래 클로스트리디움 파스테우리아눔(Clostridium pasteurianum)을 함유하는 글리세린 발효된 배양물에서 오거스트 프로인트(August Freund)에 의해 1881년도에 일찍 확인되었다. PDO는 글리세린 발효의 전형적인 산물이고, 다른 유기 기질의 혐기성 전환에서 발견되었다. 모든 박테리아 중에서 극소수의 유기체만이 이를 형성할 수 있다. 이들은 클레브시엘라(Klebsiella) 속 (케이. 뉴모니아에(K. pneumoniae)), 엔테로박터(Enterobacter) 속 (이. 아글로머란스(E. agglomerans)) 및 시트로박터(Citrobacter) 속 (씨. 프로인디(C. freunddi)), 락토바실리(Lactobacilli) 속 (엘. 브레비스(L. brevis) 및 엘. 부흐네리(L. buchneri)) 및 클로스트리디아(Clostridia) 속 (씨. 부티리쿰(C. butyricum) 및 씨. 파스테우리아눔 군)의 엔테로박테리아를 포함한다.
PDO는, 이관능성 유기 화합물로서, 잠재적으로 여러 합성 반응을 위해, 특히 폴리에스테르, 폴리에테르, 풀리우레탄, 특히 폴리트리메틸렌 테레프탈레이트 (PTT)를 생산하기 위한 중축합용 단량체로서 사용될 수 있다. 이들의 구조 및 반응성 특색은 화장품, 텍스타일 (의류 섬유 또는 바닥재) 또는 플라스틱 (자동차 산업 및 패킹 또는 코팅)에서의 몇몇 적용으로 이어진다.
PDO는 상이한 화학적 경로에 의해 생산될 수 있지만, 이들은 극도의 오염 물질을 함유하는 폐기물 스트림을 생성하고, 생산 비용이 높다. 따라서, 화학적으로 생산된 PDO는 1,2-에탄디올, 1,2-프로판디올 및 1,4-부탄디올과 같이 석유화학에서 이용가능한 디올과 경쟁할 수 없다. 이러한 경쟁력을 증가시키기 위해, 1995년도에 듀폰(DuPont)은 글루코스에서 PDO로의 생물학적 전환을 위한 연구 프로그램을 시작하였다. 이러한 공정이 환경 친화적이기는 하지만, 이는 i) 매우 고가의 조효소인 비타민 B12를 사용하고, ii) 생산 균주의 불안정성으로 인해 불연속 공정이라는 단점을 갖는다.
이와 대조적으로, 바이오디젤 산업에 의해 생산된 다량의 글리세롤의 이용가능성으로 인해, 연속적인 비타민-B12-무함유 공정이 보다 높은 탄소 수율을 가지면서 유리할 것이다.
PDO가 특히 바이오디젤 생산으로부터의 원치않는 부산물인 글리세린 (염 및 물과 혼합된 대략 80-85%의 글리세롤을 함유함)으로부터 생산될 수 있음이 관련 기술분야에서 공지되어 있다.
씨. 부티리쿰은 뱃치 및 2-단계 연속 발효에 의해 산업용 글리세린에 함유된 글리세롤로부터 성장하고 PDO를 생산할 수 있는 것으로 이전에 기재되었다 (Papanikolaou et al., 2000). 그러나, 가장 높은 글리세롤 농도에서, 수득된 최대 PDO 역가는 0.02 h-1의 희석률에서 48.1 g.L-1이었고, 이는 0.96 g.L-1.h-1의 생산성을 의미한다. 90 g.L-1의 공급 배지에서 효모 추출물 (박테리아 바이오매스 생산을 증가시키는데 도움이 되는 것으로 관련 기술분야의 기술자에게 공지된 유기 질소를 함유하는 고가의 화합물)의 존재 하에 글리세린으로부터 유래된 최대 농도의 글리세롤을 이용하여 배양을 수행하였다.
출원 WO 2006/128381은 천연 PDO 생산 유기체, 예컨대 클레브시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae), 씨. 부티리쿰 또는 씨. 파스테우리아눔을 이용하는 뱃치 및 페드-뱃치 배양에 의해 PDO를 생산하기 위해 이러한 글리세롤을 사용하는 것을 개시한다. 추가로, WO 2006/128381에서 사용된 배지는 효모 추출물을 또한 함유한다. 이 특허 출원에 기재된 바와 같이, 도달한 최대 생산성은 0.8 내지 1.1 g.l-1.h-1에 포함되었다.
씨. 부티리쿰으로부터 비타민 B12-비의존성 글리세린-데히드라타제 및 PDO-데히드로게나제를 함유하도록 변형된 씨. 아세토부틸리쿰 균주 ("씨. 아세토부틸리쿰 DG1 pSPD5" 균주로 지칭됨)의 성능은 문헌 [Gonzalez-Pajuelo et al., 2005]에 기재되어 있다. 이러한 균주는 원래, 최대 120 g.l-1의 순수한 글리세롤을 함유하는 공급 배지에서 성장하고 PDO를 생산한다. 또한, 최대 60 g.l-1의 순수한 글리세롤 또는 산업용 글리세린에 함유된 글리세롤을 함유하는 공급 배지에서 분석한 결과, 어떠한 차이도 없었다. 이들 결과는 효모 추출물의 존재 하에 수득된 것이다. 더욱이, 60 g.l-1 초과의 산업용 글리세린으로부터 유래된 글리세롤 농도를 이용하여 수행한 시험이 없다. 야생형 씨. 부티리쿰과 변형된 미생물 "씨. 아세토부틸리쿰 DG1 pSPD5"를 비교하면, 전반적으로 유사한 거동이 관찰되었다.
특허 출원 WO 2010/128070에서, 발명자들은 문헌 [Gonzalez-Pajuelo et al. (2005)]에 기재된 것과 같은 씨. 아세토부틸리쿰 DG1 pSPD5의 균주를 산업용 글리세린에 함유된 고농도의 글리세롤을 갖는 배지에서 효모 추출물 없이 성장하도록 적응시키는 공정을 기재하였다. 씨. 아세토부틸리쿰 DG1 pSPD5 적응된 균주의 생성된 집단은 산업용 글리세린에 함유된 글리세롤을 최대 120 g.l-1로 함유하는 배지에서 최대 53.5 g.L-1의 PDO 역가, 최대 0.53 g.g-1의 수율 및 최대 2.86 g.L-1.h-1의 생산성으로 PDO를 생산할 수 있었다. 특허 출원 WO 2012/062832에서, 발명자들은 WO 2010/128070 특허 출원에 기재된 것과 동일한 공정에 의해 수득된 씨. 아세토부틸리쿰 DG1 pSPD5 적응된 균주의 또 다른 집단으로부터의 클론의 단리를 기재하였다. 이러한 두번째 집단은 산업용 글리세린에 함유된 글리세롤을 대략 105 g.L-1로 함유하는 배지에서 최대 50.45 g/L-1의 PDO 역가, 최대 0.53 g.g-1의 수율 및 최대 3.18 g.L-1.h-1의 생산성으로 PDO를 생산할 수 있었던 반면에, 단리된 클론은 산업용 글리세린에 함유된 글리세롤을 대략 105 g.L-1로 함유하는 배지에서 최대 51.30 g/L-1의 PDO 역가, 최대 0.50 g.g-1의 수율 및 최대 3.05 g.L-1.h-1의 생산성으로 PDO를 생산할 수 있었다.
본 특허 출원에서, 본 발명자들은 씨. 아세토부틸리쿰 DG1 pSPD5 적응된 균주의 집단과 상이한 미생물의 공동-배양물, 소위 미생물 컨소시엄이, 미생물 컨소시엄 없이 씨. 아세토부틸리쿰 DG1 pSPD5 적응된 균주의 집단의 성능에 비해 보다 높은 PDO 역가, 보다 양호한 수율 및 보다 적은 잔류 글리세롤로 PDO의 개선된 생산을 제공한다는 것을 주목하였다. 특히, 이러한 미생물 컨소시엄은 산업용 글리세린에 함유된 고농도의 글리세롤 (산업용 글리세린으로부터의 최대 105 g.L-1의 글리세롤)의 존재 하에 이러한 개선된 수준으로 PDO를 생산할 수 있다. 따라서, 미생물 컨소시엄 없이 씨. 아세토부틸리쿰 DG1 pSPD5 적응된 균주 단독에 비해 상기 공동-배양물에 의해 잔류 글리세롤이 감소되기 때문에, 본 발명의 공동-배양물의 이용은 보다 양호한 PDO 생산 뿐만 아니라, 보다 용이한 정제 공정을 가능하게 한다.
본 발명은 적어도 1종의 균주 클로스트리디움 아세토부틸리쿰, 및 클로스트리디움 스포로게네스의 균주 및/또는 클로스트리디움 스페노이데스의 균주 중에서 선택된 적어도 1종의 균주를 포함하는 미생물 컨소시엄에 관한 것이다.
특히, 본 발명에 따른 미생물 컨소시엄은 적어도 85%의 씨. 아세토부틸리쿰, 0.2% 미만의 씨. 스포로게네스, 바람직하게는 0.001% 내지 0.2%의 씨. 스포로게네스, 및/또는 15% 미만의 씨. 스페노이데스, 바람직하게는 0.1% 내지 15%의 씨. 스페노이데스를 포함하였다.
본 발명의 특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 미생물 컨소시엄에서, 균주 씨. 아세토부틸리쿰은 높은 글리세롤 함량을 갖는, 구체적으로 산업용 글리세린으로부터 유래된 고농도의 글리세롤을 갖는 배양 배지로부터의 성장 및 1,3-프로판디올 생산을 위해 적응된 것이다.
적어도 1종의 균주 씨. 아세토부틸리쿰 및 적어도 1종의 균주 씨. 스포로게네스를 포함하거나, 또는 적어도 1종의 균주 씨. 아세토부틸리쿰 및 적어도 1종의 균주 씨. 스페노이데스를 포함하는 본 발명의 미생물 컨소시엄은 공동-배양물로 명명될 수 있고, 이러한 경우에 상기 공동-배양물은 바람직하게는 높은 글리세롤 함량을 갖는, 구체적으로 산업용 글리세린에 함유된 고농도의 글리세롤을 갖는 배양 배지로부터의 성장 및 1,3-프로판디올 생산을 위해 사전에 적응된 균주 씨. 아세토부틸리쿰을 포함한다.
본 발명은 또한 탄소의 단독 공급원으로서 글리세롤을 포함하는 배양 배지에서 본 발명에 따른 미생물 컨소시엄을 배양하고, 배양 배지로부터 생산된 1,3-프로판디올을 회수하는 것을 포함하는, 1,3-프로판디올을 생산하는 방법에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 탄소의 단독 공급원으로서 고농도의 글리세롤을 함유하는 배양 배지에서 적어도 1종의 균주 씨. 아세토부틸리쿰과 공동-배양함으로써 발효 공정으로부터의 1,3-프로판디올의 생산을 개선시키기 위한, 보다 특히 PDO의 수율 및 역가를 개선시키기 위한 적어도 1종의 균주 씨. 스포로게네스 및/또는 적어도 1종의 균주 씨. 스페노이데스의 용도에 관한 것이다.
특히, 적어도 1종의 균주 씨. 스포로게네스 및/또는 적어도 1종의 균주 씨. 스페노이데스는, PDO를 생산하기 위한 발효 공정에서 탄소의 단독 공급원으로서 고농도의 글리세롤을 함유하는 배양 배지에서의 성장 및 PDO 생산을 위해 사전에 적응된 적어도 1종의 균주 씨. 아세토부틸리쿰과의 공동-배양물로서 사용된다.
용어 "미생물 컨소시엄" 또는 "공동-배양물"은 발효 공정에서 2가지 이상의 미생물 종의 사용을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다.
제1 측면에서, 본 발명은 적어도 1종의 균주 씨. 아세토부틸리쿰, 및 씨. 스포로게네스의 균주 및/또는 씨. 스페노이데스의 균주 중에서 선택된 적어도 1종의 균주를 포함하는 미생물 컨소시엄에 관한 것이다.
본 발명에 따른 미생물 컨소시엄은 몇몇 클로스트리디아 균주의 조합물이며, 이 중에서 대부분은 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 종에 속한다.
유리한 실시양태에서, 본 발명의 미생물 컨소시엄은 적어도 1종의 균주 씨. 아세토부틸리쿰, 적어도 1종의 균주 씨. 스포로게네스 및/또는 적어도 1종의 균주 씨. 스페노이데스를 포함한다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 미생물 컨소시엄은 적어도 1종의 균주 씨. 아세토부틸리쿰, 적어도 1종의 균주 씨. 스포로게네스 및 적어도 1종의 균주 씨. 스페노이데스를 포함한다.
특히, 본 발명에 따른 미생물 컨소시엄은, 배양물에 함유된 전체 세포가 100%에 상응하는 것으로 고려하여, 적어도 85%의 씨. 아세토부틸리쿰, 0.001% 내지 0.2%의 씨. 스포로게네스, 및/또는 0.1% 내지 15%의 씨. 스페노이데스를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 미생물 컨소시엄은 85% 내지 99.8%의 씨. 아세토부틸리쿰, 0.001% 내지 0.15%의 씨. 스포로게네스 및/또는 0.2% 내지 15%의 씨. 스페노이데스를 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 미생물 컨소시엄은 90% 내지 99.8%의 씨. 아세토부틸리쿰, 0.002% 내지 0.13%의 씨. 스포로게네스 및/또는 0.2% 내지 10%의 씨. 스페노이데스를 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 미생물 컨소시엄은 적어도 1종의 균주 씨. 아세토부틸리쿰 및 적어도 1종의 균주 씨. 스페노이데스로 이루어진다. 보다 더 바람직하게는, 본 발명의 미생물 컨소시엄은 적어도 1종의 균주 씨. 아세토부틸리쿰, 적어도 1종의 균주 씨. 스페노이데스 및 적어도 1종의 균주 씨. 스포로게네스로 이루어진다. 이들 구체적인 실시양태에 따라, 상기 언급된 각각의 클로스트리디아의 각각의 백분율은 또한 준용하여 적용된다.
유리한 실시양태에서, 본 발명에 따른 미생물 컨소시엄은 높은 글리세롤 함량을 갖는 적절한 배양 배지에서 배양할 때 1,3-프로판디올의 생산에 유용하고 그의 생산을 가능하게 한다.
따라서, 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 미생물 컨소시엄에서 균주 씨. 아세토부틸리쿰은 높은 글리세롤 함량을 갖는, 구체적으로 산업용 글리세린에 함유된 고농도의 글리세롤을 갖는 배양 배지로부터의 성장 및 1,3-프로판디올 생산을 위해 적응된 것이다.
"적응된 씨. 아세토부틸리쿰", "사전에 적응된 씨. 아세토부틸리쿰", 또는 "적응되어 있는 씨. 아세토부틸리쿰"은 고농도의 산업용 글리세린 상에서 성장할 수 있도록 변형된 씨. 아세토부틸리쿰을 의미한다.
글리세롤 대사를 1,3-프로판디올의 생산에 대해 지시하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, WO 2006/128381, Gonzalez-Pajuelo & al. 2006 참조).
예를 들어, 씨. 아세토부틸리쿰 균주는 WO 2010/128070 특허 출원에서 개시된 바와 같이 선택 압력 배양 공정에 의해 높은 글리세롤 함량을 갖는, 구체적으로 산업용 글리세린으로부터 유래된 고농도의 글리세롤을 갖는 배양 배지에서 성장하도록 적응될 수 있다.
또한, 예를 들어, 탄소의 단독 공급원으로서의 글리세롤로부터의 1,3-프로판디올의 생산을 위해 유전적으로 변형된 씨. 아세토부틸리쿰의 균주가 관련 기술분야에 공지되어 있고, 특히 출원 WO 2001/04324 및 WO 2010/128070에 개시되어 있다.
표현 "유전적으로 변형된"은, 균주가 그의 유전적 특징을 변화시키는 것을 목적으로 형질변형된 것을 의미한다. 내인성 유전자가 감쇠되거나, 결실되거나 또는 과다-발현될 수 있거나, 또는 바람직하게는 외인성 유전자가 도입되거나, 플라스미드에 의해 보유되거나 또는 균주의 게놈에 통합되어, 세포에서 발현될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "플라스미드" 또는 "벡터"는 세포의 중심적인 대사의 일부가 아닌 유전자를 종종 보유하며 일반적으로 원형 이중-가닥 DNA 분자의 형태를 갖는 추가의 염색체 요소를 지칭한다.
출원 WO 2008/040387 (그의 내용이 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 것과 같이 클로스트리디움에서 돌연변이 발생 및/또는 유전자 교환의 임의의 표준 기술은, 높은 글리세롤 함량을 갖는, 구체적으로 산업용 글리세린으로부터 유래된 고농도의 글리세롤을 갖는 배양 배지로부터의 성장 및 1,3-프로판디올 생산을 위해 씨. 아세토부틸리쿰 균주를 적응시키기 위해 사용될 수 있다.
균주 씨. 아세토부틸리쿰의 적응은 바람직하게는 기술자에게 널리 공지된 기술인 혐기성 연속 공정에 의해 수행된다. 관련 기술분야의 기술자에게 공지된 이러한 공정의 특징 중에서, 예를 들어 공급 배지가 발효기에 연속적으로 첨가되고, 그와 동시에 미생물에 의해 전환된 영양분 용액의 동등한 양이 시스템으로부터 제거되는 것이 언급될 수 있다. 영양분 교환율은 희석률로서 표현된다. 따라서, 상기 희석률이 배양 배지에 적용되고, 미생물의 최대 성장 속도를 고려하며, 배지의 섭취율 및 제거율에 영향을 미친다.
균주 씨. 아세토부틸리쿰의 적응을 위한 연속 공정은 바람직하게는 혐기성 조건에서 수행된다.
관련 기술분야의 기술자는 이들 각각의 실험 조건을 어떻게 다루는지, 본 발명에 따라 사용된 클로스트리디아 균주를 위한 배양 조건을 어떻게 정의하는지를 알고 있다. 특히 클로스트리디아 균주는 씨. 아세토부틸리쿰의 경우에 20℃ 내지 60℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃의 온도에서 발효된다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 미생물 컨소시엄에서, 균주 씨. 아세토부틸리쿰은 바람직하게는 혐기성 연속 공정에 의해 높은 글리세롤 함량을 갖는 배양 배지로부터의 성장 및 1,3-프로판디올 생산을 위해 사전에 적응된 것이며, 비타민 B12-비의존성 1,3-프로판디올 경로에 수반되는 씨. 부티리쿰 코딩 효소로부터의 1,3-프로판디올 오페론의 가외의 카피를 도입시킴으로써 1,3-프로판디올 생산의 증가된 플럭스를 제공한다. 특히, 씨. 부티리쿰으로부터의 1,3-프로판디올 오페론은 플라스미드에 의해 과다-발현되거나, 또는 적응시키고자 하는 균주 씨. 아세토부틸리쿰의 염색체에 통합된다. 예를 들어, pSPD5 플라스미드는 1,3-프로판디올 오페론의 과다-발현을 위해 사용될 수 있다 (Gonzalez-Pajuelo et al., 2006).
유리한 실시양태에서, 본 발명의 미생물 컨소시엄에서, 균주 씨. 아세토부틸리쿰은 연속 배양 공정 동안 성장 및 1,3-프로판디올 생산을 위해 사전에 적응된 것이며, 여기서 공급 배지가, 90 내지 120 g/L에 포함된, 바람직하게는 약 105 g/L의, 산업용 글리세린으로부터 유래된 글리세롤의 농도를 함유한다.
생산 미생물의 "적응"은, 낮은 희석률에서 높은 산업용 글리세린 함량을 갖는 배양 배지에서 미생물을 배양하고, 산업용 글리세린으로부터 유래된 고농도의 글리세롤을 갖는 배양 배지에서 성장할 수 있는 적응된 미생물을 선택함으로써 수득된다.
이를 위해, 유리하게는 균주 씨. 아세토부틸리쿰을 24시간 내지 10일, 바람직하게는 2일 초과, 보다 바람직하게는 약 8일 초과의 기간에 걸쳐 낮은 희석률에서 배양한다.
희석률은 일반적으로 0.005 내지 0.1 h-1, 바람직하게는 0.005 내지 0.02 h-1에 포함된다. 희석률은 적응 방법 동안에 변화될 수 있으며, 궁극적으로 제1 단계에서는 0.005 내지 0.02 h-1에 포함되고, 제2 단계에서는 희석률이 0.1 h-1, 보다 바람직하게는 0.07 h-1까지 증가된다. 희석률이 적응 방법 동안에 변화되는 경우, 0.005 내지 0.02 h-1의 희석률은 "낮은 희석률"로 지칭되는 반면에, 0.02 내지 0.1 h-1의 희석률은 일반적인 희석률로 지칭된다.
본 발명의 구체적인 실시양태에서, 적응시키고자 하는 균주 씨. 아세토부틸리쿰을 90 내지 120 g/L의 글리세롤, 바람직하게는 약 105 g.L-1의 비가공 글리세롤을 함유하는 공급 배지를 이용하여 0.005 내지 0.02 h-1에 포함된, 바람직하게는 0.02 h-1의 낮은 희석률에서 연속 배양으로 배양한다. 최대 10일, 바람직하게는 5 내지 8일의 기간에 걸쳐, 균주 씨. 아세토부틸리쿰을 공급 배지에 존재하는 높은 글리세린 농도에 적응시키고, 희석률을 0.1 h-1까지, 바람직하게는 0.07 h-1까지 증가시킬 수 있다.
바람직하게는, 균주 씨. 아세토부틸리쿰은 WO 2010/128070 및 WO 2012/062832에 기재된 공정에 의해 사전에 적응된 것이다.
본 발명의 미생물 컨소시엄은 적어도 1종의 균주 씨. 아세토부틸리쿰 및 적어도 1종의 균주 씨. 스포로게네스를 포함하거나, 또는 적어도 1종의 균주 씨. 아세토부틸리쿰 및 적어도 1종의 균주 씨. 스페노이데스를 포함하고, 상기 미생물 컨소시엄은 공동-배양물로서 명명될 수 있고, 이러한 경우에 상기 공동-배양물은 바람직하게는 높은 글리세롤 함량을 갖는, 구체적으로 산업용 글리세린에 함유된 고농도의 글리세롤을 갖는 배양 배지로부터의 성장 및 1,3-프로판디올 생산을 위해 사전에 적응된 균주 씨. 아세토부틸리쿰을 포함한다. 높은 글리세린 함량을 갖는, 구체적으로 상기 언급된 산업용 글리세린으로부터 유래된 고농도의 글리세롤을 갖는 배양 배지로부터의 성장 및 1,3-프로판디올 생산을 위해 적응된 균주 씨. 아세토부틸리쿰에 관한 모든 바람직한 실시양태는 또한 이러한 구체적인 실시양태에 준용하여 적용된다.
상기 기재된 모든 바람직한 실시양태를 비롯하여, 적어도 1종의 균주 씨. 아세토부틸리쿰 및 적어도 1종의 균주 씨. 스포로게네스를 포함하거나 또는 그로 이루어지는 공동-배양물, 또는 적어도 1종의 균주 씨. 아세토부틸리쿰 및 적어도 1종의 균주 씨. 스페노이데스를 포함하거나 또는 그로 이루어지는 공동-배양물 또한 본 발명의 측면이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 탄소의 단독 공급원으로서 글리세롤을 포함하는 공급 배지에서 본 발명에 따른 미생물 컨소시엄을 배양하고, 배양 배지로부터 생산된 1,3-프로판디올을 회수하는 것을 포함하는, 글리세롤의 연속 발효 공정으로 1,3-프로판디올을 생산하는 방법에 관한 것이다.
"적절한 배양 배지" 또는 "배양 배지"는 클로스트리디움 균주의 성장 및 디올-생산을 위해 최적화된 배양 배지를 지칭한다. 일반적으로 발효 공정은 사용된 클로스트리디움 종에 대해 적응되고 글리세린을 함유하는 공지된 정의된 조성을 갖는 합성의, 특히 무기의 배양 배지를 갖는 반응기에서 수행된다.
용어 "글리세린"은 글리세롤 분자를 함유하는 용액을 지칭한다.
특정한 실시양태에서, 글리세롤은 적어도 50%의 글리세롤, 바람직하게는 적어도 85%의 글리세롤을 포함하는 글리세린 조성물의 형태로 배양 배지에 첨가된다.
유리하게는, 본 발명의 배양 배지에서 사용되는 글리세린은 산업용 글리세린이다. "산업용 글리세린"은 실질적으로 정제하지 않고 산업적 공정으로부터 수득된 글리세린 산물을 의미한다. 산업용 글리세린은 "비가공 글리세린"으로도 지칭된다. 산업용 글리세린은 70% 초과, 바람직하게는 80% 초과의 글리세롤, 물 및 불순물, 예컨대 메탄올, 미네랄 염 또는 지방산을 포함한다. 산업용 글리세린 중 글리세롤의 최대 함량은 일반적으로 90%, 보다 일반적으로 약 85%이다.
산업용 글리세린이 수득되는 산업적 공정은, 그중에서도 지방 및 오일, 특히 식물 기원의 지방 및 오일 또는 동물 기원의 지방 및 오일 또는 사용된 쿠킹 오일을 산업용 제품, 예컨대 세제 또는 윤활제로 가공하는 제작 방법이다. 이러한 제작 방법에서, 산업용 글리세린은 부산물로 간주된다.
한 실시양태에서, 1,3-프로판디올을 생산하는 방법에서 사용되는 글리세롤은 산업용 글리세린에 의해 제공된다.
특정한 실시양태에서, 산업용 글리세린은 바이오디젤 생산으로부터의 부산물이며, 약 80 내지 85%의 글리세롤을 염, 메탄올, 물 및 일부 다른 유기 화합물, 예컨대 지방산과 함께 포함하는, 바이오디젤 생산으로부터 수득된 글리세린의 공지된 불순물을 포함한다. 바이오디젤 생산으로부터 수득된 산업용 글리세린을 지방산 제거를 위한 산성화 단계에 추가로 적용할 수 있다. 관련 기술분야의 기술자는 산성화 기술을 알고 있으며, 사용되는 글리세린에 따른 최상의 산성화 조건을 정의할 수 있다.
용어 "높은 글리세롤 함량" 또는 "고농도의 글리세롤"은 공급 배지 중 90 g.L-1 초과의 글리세롤을 의미한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 농도는, 글리세린 용액에 함유된, 90 내지 200 g.L-1의 글리세롤, 보다 특히 90 내지 140 g/L의 글리세롤, 바람직하게는 약 120 g.L-1의 글리세롤 및 보다 바람직하게는 약 105 g.L-1의 글리세롤에 포함된다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 1,3-프로판디올의 생산 방법에서, 공급 배지 중 글리세롤 농도는, 글리세린 용액에 함유된, 90 및 120 g/L의 글리세롤에 포함되고, 바람직하게는 약 105 g/L의 글리세롤이다.
본 발명의 방법에서, 1,3-프로판디올의 생산은 바람직하게는 탄소의 단독 공급원으로서 글리세롤을 포함하는 배양 배지에서 상기 기재된 본 발명의 미생물 컨소시엄 또는 공동-배양물을 배양함으로써 혐기성 연속 발효 공정에 의해 수행되며, 상기 배양 배지는 유기 질소의 첨가 없는 최소 배지이다.
용어 "최소 배지"는 유기체가 글리세린 용액으로부터 성장하는, 화학적으로 정의된 조성을 포함하는, 엄격하게 미네랄인 배양 배지를 의미한다.
이러한 배양 배지는 관련 기술분야, 특히 WO 2010/128070 (05/05/2010 출원) 및 WO 2011/042434 (5/10/2010 출원)에 개시되어 있으며, 이들의 내용은 본원에 참조로 포함된다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법으로부터 이렇게 수득된 1,3-프로판디올을 추가로 정제한다.
발효 배지로부터 1,3-프로판디올을 회수하고 최종적으로 정제하는 방법은 기술자에게 공지되어 있다. 1,3-프로판디올은 증류에 의해 단리될 수 있다. 대부분의 실시양태에서, 1,3-프로판디올은 부산물, 예컨대 아세테이트와 함께 발효 배지로부터 증류된 다음, 공지된 방법에 의해 추가로 정제된다.
특히 바람직한 정제 방법은 출원 WO 2009/068110 및 WO 2010/037843에 개시되어 있으며, 이들의 내용은 본원에 참조로 포함된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 탄소의 단독 공급원으로서 고농도의 글리세롤을 함유하는 배양 배지에서 적어도 1종의 균주 씨. 아세토부틸리쿰과 공동-배양함으로써 발효 공정으로부터의 1,3-프로판디올의 생산, 특히 PDO의 수율 및 역가를 개선시키기 위한 적어도 1종의 균주 씨. 스포로게네스 및/또는 적어도 1종의 균주 씨. 스페노이데스의 용도에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 용도는 적어도 1종의 균주 씨. 아세토부틸리쿰, 보다 바람직하게는 높은 글리세롤 함량을 갖는, 구체적으로 산업용 글리세린으로부터 유래된 고농도의 글리세롤을 갖는 배양 배지로부터의 성장 및 1,3-프로판디올 생산을 위해 적응된 적어도 1종의 균주 씨. 아세토부틸리쿰에 대한 적어도 1종의 균주 씨. 스포로게네스 및/또는 적어도 1종의 균주 씨. 스페노이데스의 용도이다. 높은 글리세린 함량을 갖는 배양 배지로부터의 성장 및 1,3-프로판디올 생산을 위해 적응된 균주 씨. 아세토부틸리쿰과 관련하여, 상기 모든 바람직한 실시양태는 발효 공정으로부터의 1,3-프로판디올의 생산, 특히 1,3-프로판디올의 수율 및 역가를 개선시키는 용도와 관련된 본 발명의 이러한 측면에 준용하여 적용된다.
그의 상이한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법 및 용도는 0.069 h-1의 희석률의 경우에 최대 52.9 g.L-1의 역가, 최대 0.5 g.g-1의 수율 및 최대 3.65 g.L-1.h-1의 생산성으로 1,3-프로판디올의 생산으로 이어진다.
실시예:
본원에 개시된 방법 및 시스템은 하기 실시예에서 추가로 설명되며, 하기 실시예는 설명의 목적으로 제공되는 것이고, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
관련 기술분야의 기술자는 본 섹션에 기재된 특색을 적합화하기 위한 적용 및 필요한 변형을 잘 알 것이다. 대안적으로, 상기 방법을 관련 기술분야의 기술자에게 공지된 다른 표준 방법에 의해 수행할 수 있다.
프로토콜
배양 배지 및 조건
배양을 위해 이용되는 배지 및 조건은 특허 출원 WO 2010/128070에 이미 기재되어 있다:
- 플라스크 배양: 합성 및 풍부 (CGM: 클로스트리디아 성장 배지) 배지
- 혐기성 연속 배양
DNA 단리
프리셀리스(Precellys)®24 용해기/균질화기 (베르뗑 떼끄놀로지즈(Bertin Technologies, 프랑스 생 깡땡 이블린))를 이용하여, 게놈 DNA를 1 ml의 배양물로부터 추출하고, 균질화하고, 유리 비드 튜브 키트(Glass Bead Tube Kit) 0.1 mm을 갖는 2 ml 튜브로 옮겼다. 프리셀리스®24 설정은 다음과 같았다: 6500 rpm, 20초 주기 기간, 주기들 사이에 5초 지연 시간, 총 2회 사이클. 프리셀리스 추출 이후, 용해물을 10,000 g에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액은 마슈레(Macherey) (마슈레 나겔(Macherey Nagel), 프랑스 호에)로부터의 뉴클레오스핀(NucleoSpin)® 겔 및 PCR 클린-업을 이용하여 전체 게놈 추출을 위해 사용하였다.
정량적인 PCR에 의해 특정한 미생물로부터 특정한 데옥시리보핵산 서열의 정량화
분자 기술, 예컨대 PCR 기술에서의 최근의 진보는 예를 들어 이 특허 출원에서 발효적 생산으로부터의 배양물 브로쓰로서 상이한 유형의 환경에서 잠재적인 미생물의 신속하고 특이적이며 민감한 검출 및 식별을 가능하게 한다.
샘플에서 절대적 정량화는 에스에스오 어드밴스드 유니버셜 사이버 그린 수퍼믹스(Sso Advanced Universal SYBR Green Supermix) (바이오-라드(Bio-rad, 프랑스 미트리 모리))를 이용하여 정량적인 PCR (qPCR)에 의해 측정하였다. qPCR은 CFX96™ 리얼-타임 시스템(Real-Time System) (바이오-라드, 프랑스 미트리 모리)을 구비한 바이오-라드 C1000™ 열 순환기 상에서 수행하였다.
반응 혼합물은 1x 에스에스오 어드밴스드 유니버셜 사이버 그린 수퍼믹스 (바이오-라드, 프랑스 미트리 모리), 6 μL의 각각의 정방향 (F) 및 역방향 (R) 프라이머 (1 μM), 2 μL의 희석된 샘플 (나노드롭(Nanodrop) 측정으로부터 2 ng/μL), 및 20 μL의 최종 부피가 되게 하는 뉴클레아제 무함유 물로 이루어졌다. 증폭은 하기 열 주기 프로그램에 따라 달성하였다: 98℃에서 2분 동안 초기 용융 (1 주기), 이어서 98℃에서 10초 동안 용융의 40 주기, 프라이머의 어닐링, 및 60℃에서 30초 동안 신장 (65 내지 95℃의 용융 곡선, 5초마다 0.5℃ 증가).
각각의 미생물에 대해 공지된 농도에서 게놈 DNA의 계열 희석의 Cq 값을 이용하여 표준 곡선을 측정하였다. 각각의 웰 (표준 곡선 및 샘플)에 대한 Cq 값을 씨에프엑스 매니저(CFX Manager™) 3.1 소프트웨어에 의해 측정하였다. 샘플을 표준 곡선에 대해 플롯하여, 핵산의 존재비를 측정하였다. 절대적 정량화는 씨. 아세토부틸리쿰의 경우에 세포당 1 gapC 유전자 카피, 씨. 스페노이데스의 경우에 세포당 1 cpn60 유전자 카피 및 씨. 스포로게네스의 경우에 세포당 1 tpi 유전자 카피를 기반으로 하였다. 추출 효율을 측정할 수 없었기 때문에, 계산의 목적을 위해, 핵산 추출은 완벽한 것으로 가정하였다.
특허 출원 WO2012062832A1에 기재된 바와 같이 씨. 부티리쿰으로부터 1,3-프로판디올 오페론을 과다발현하고 고농도의 산업용 글리세린을 갖는 배양 배지로부터의 성장 및 1,3-프로판디올 생산을 위해 적응된 미생물 씨. 아세토부틸리쿰 집단은 "유형 174P 집단"으로 명명하였고, 본원에서 참조로 사용되었다.
이 특허 출원에서, "유형 174P 집단" 및 다른 미생물 씨. 스페노이데스 및 씨. 스포로게네스를 포함하는 미생물 컨소시엄을 사용하여, 높은 글리세린 함량을 갖는 배양 배지로부터의 1,3-프로판디올의 생산을 개선시켰다. 이러한 미생물 컨소시엄은 "유형 192P 미생물 컨소시엄"으로 명명하였다.
실시예 1: 고농도의 비가공 글리세린을 사용하는 연속 배양에 의해 케모스타트에서 "유형 174P 집단" 및 "유형 192P 미생물 컨소시엄"의 성능
박테리아 균주:
- 유형 174P 집단: 고농도의 비가공 글리세린 상에서 진화된 씨. 아세토부틸리쿰 균주 DG1 pSPD5 PD0001VE05의 집단
- 유형 192P 미생물 컨소시엄: 유형 174P 집단 및 다른 미생물 씨. 스페노이데스 및 씨. 스포로게네스의 컨소시엄.
배양 배지:
클로스트리디아 뱃치 배양에서 사용된 합성 배지는 수돗물 리터당 다음을 함유하였다: 글리세롤, 30g; KH2PO4, 0.5g; K2HPO4, 0.5g; MgSO4, 7H2O, 0.2g; CoCl2 6H2O, 0.01g; H2SO4, 0.1ml; NH4Cl, 1.5g; 비오틴, 0.16mg; p-아미노 벤조산, 32mg 및 FeSO4, 7H2O, 0.028g. 상기 배지의 pH는 NH4OH 3N에 의해 6.3으로 조정하였다. 에스디에스 카를로_에르바(SDS Carlo_Erba)로부터 구입한 시판 글리세롤 (순도 99%)을 뱃치 배양을 위해 사용하였다. 연속 배양의 경우에는 공급 배지가 수돗물 리터당 다음을 함유하였다: 비가공 글리세린으로부터의 글리세롤, 105g; KH2PO4, 0.45g; K2HPO4, 0.45g; MgSO4, 7H2O, 0.2g; CoCl2 6H2O, 0.013g; 비오틴, 0.08mg; p-아미노 벤조산, 16mg; FeSO4, 7H2O, 0.04g; 소포제, 0.05ml; ZnSO4, 7H2O, 8mg; CuCl2, 2H2O, 4mg; MnSO4, H2O, 20mg. 배지 pH는 H2SO4 96%에 의해 3.5 내지 4로 조정하였다. 바이오디젤에 대한 에스테르 교환 공정으로부터의 비가공 글리세린을 상이한 공급처로부터 제공받았고 (노반스(Novance), ADM, 디에스테르 인더스트리즈(Diester Industries), 그린에너지(Greenergy), 카로테크 버하드(Carotech Berhad)), 이들은 80 내지 86% (w/w)에 포함된 순도를 가졌다. 이들 글리세린을 혼합하고, 산성화에 의해 전처리하였다.
실험 설정:
연속 배양은 2000 mL의 작업 부피를 갖는 5L 생물반응기 (트리톤(Tryton), 프랑스 피에르 게랭)에서 수행하였다. 배양물 부피는 배양물 수준의 자동 조절에 의해 2000 mL로 일정하게 유지하였다. 배양물을 200 RPM에서 교반하고, 온도를 35℃로 설정하고, NH4OH 5.5 N의 자동 첨가에 의해 pH를 6.5로 일정하게 유지하였다. 혐기성 조건을 생성하기 위해, 용기 중의 멸균된 배지를 멸균 O2-무함유 질소에 의해 60℃에서 1시간 동안 플러싱하고, 35℃에 도달할 때까지 다시 플러싱하였다 (2시간 동안 플러싱). 생물반응기 기체 배출구를 피로갈롤 배열에 의해 산소로부터 보호하였다 (Vasconcelos et al., 1994). 멸균시킨 후, 실온에 도달할 때까지 공급 배지를 또한 멸균 O2-무함유 질소로 플러싱하고, O2 유입을 피하기 위해 질소 하에 유지하였다.
뱃치 및 연속 배양 공정:
평가를 위해 이용된 공정은 특허 출원 WO 2010/128070 (실시예 2)에 기재되어 있다.
지수적 성장 단계의 마지막에 취한 합성 배지 (뱃치 배양의 경우에는 상기 기재된 것과 동일하지만, 아세트산, 2.2 g.L-1 및 MOPS, 23.03 g.L-1을 첨가하였음) 상에서 100 mL 페니실린 플라스크에서 성장하는 배양물을 접종물 (5% v/v)로서 사용하였다.
배양물을 먼저 뱃치식으로 성장시켰다. 초기 지수적 성장 단계에서, 본 발명자들은 비가공 글리세린으로부터 글리세롤의 펄스를 수행하였다: 펄스의 경우, 비가공 글리세린으로부터 105 g.L-1의 글리세롤을 갖는 합성 배지 (공급 배양물에 대해 상기 기재된 것과 동일함)를 3시간 동안 고정된 유량으로 첨가하였다 (즉, 18 g.L-1의 글리세롤 첨가). 이어서, 뱃치식으로 계속 성장시켰고, 지수적 성장 단계의 종료 이전에 0.035 h-1의 희석률로 연속 공급을 시작하였다: 공급 배지는 비가공 글리세린으로부터 105 g.L-1의 글리세롤을 함유하였다. 생물반응기의 접종 6-8일 후에 및 4 체류 시간 (RT) 후에, 희석률을 5일에 걸쳐 0.035 h-1 내지 0.070 h-1로 증가시켰다. 그 후에, 배양물의 안정화에 이어서, 하기 기재된 HPLC 프로토콜을 이용하는 1,3-프로판디올 생산 및 글리세롤 소모가 이어졌다. 특히, 본 발명자들은 잔류 글리세린의 농도가 가능한 한 낮을 때까지 기다렸다.
유형 192P 미생물 컨소시엄의 전반적인 성능을 표 1에 나타내었고, 동일한 조건 하에 고농도의 비가공 글리세린 상에서 진화된 씨. 아세토부틸리쿰 균주 DG1 pSPD5 PD0001VE05만을 함유하는 유형 174P 집단의 성능과 비교하였다.
분석 절차:
세포 농도를 비탁법에 의해 620 nm에서 측정하고, 직접적으로 측정된 세포 건조 중량에 의해 보정하였다. 글리세롤, 1,3-프로판디올, 에탄올, 락테이트, 아세트산 및 부티르산 농도를 HPLC 분석에 의해 측정하였다. 분리는 바이오라드 아미넥스(Biorad Aminex) HPX-87H 칼럼 상에서 수행하였고, 검출은 굴절률에 의해 달성되었다. 작업 조건은 다음과 같았다: 이동상 황산 0.5 mM; 유량 0.5 ml/min, 온도, 25℃.
표 1: 연속 배양으로 성장한 씨. 아세토부틸리쿰 유형 174P 집단 및 유형 192P 미생물 컨소시엄의 성능 (각각 20 및 19 케모스타트로부터의 평균 데이터). 공급 배지는 비가공 글리세린으로부터 글리세롤을 105 g.L-1로 함유하였고, 희석률은 0.035 h-1 및 0.070h-1이었다. 값은 0.070h-1의 희석률에서 적어도 9 체류 시간 후에 분석한 샘플의 평균에 상응한다.
Y1,3-PDO : PDO 수율 (g/g 글리세롤 관련)
Q1,3PDO : PDO 부피 생산성
이들 결과는, 유형 192P 미생물 컨소시엄이 유형 174P 집단에 비해 더 양호한 PDO 생산 결과를 나타냄을 보여준다 (PDO의 보다 높은 역가 및 수율, 및 보다 낮은 잔류 글리세린).
실시예 2: 미생물 컨소시엄 정량화
CFX96™ 리얼-타임 시스템을 구비한 바이오-라드 C1000™ 열 순환기 상에서 에스에스오 어드밴스드 유니버셜 사이버 그린 수퍼믹스 (바이오-라드, 프랑스 미트리 모리)를 이용하여 샘플 중 각각의 미생물의 존재비를 정량적인 PCR (qPCR)에 의해 측정하였다 (프로토콜에서 기재됨). 씨. 아세토부틸리쿰을 표적화하기 위해 사용된 gapC 유전자 기반 프라이머는 gapC_F, 5'-TGCTGCTGTAAGTATCATC-3' (서열식별번호(SEQ ID NO): 1) 및 gapC_R, 5'-GTTGGAACTGGAACTCTT-3' (서열식별번호: 2)이었다. 씨. 스페노이데스를 표적하기 위해 사용된 cpn60 유전자 기반 프라이머는 cpn60_F, 5'-TTATATGTGCACCGATATG-3' (서열식별번호: 3) 및 cpn60_R, 5'-GAGAAGTCTTGCGCCGGAC-3' (서열식별번호: 4)이었다. 씨. 스포로게네스를 표적화하기 위해 사용된 tpi 유전자 기반 프라이머는 tpi_F, 5'-CCAGCGGTATTAGAAGAA-3' (서열식별번호: 5) 및 tpi_R, 5'-GTCCTATAATTACATAATGAACTC-3' (서열식별번호: 6)이었다.
하기 2개의 표에서, 각각의 배양물에 함유된 전체 세포는가 100%에 상응하는 것으로 고려하여, 유형 174P 집단 및 유형 192P 미생물 컨소시엄의 배양물에 존재하는 상이한 종을 대표하는 백분율이 제공된다.
표 2: 상이한 배양 단계에서 "유형 174P 집단" 조성
1,3-프로판디올 생산에 대한 "유형 174P 집단" 발효는 어떠한 씨. 스페노이데스 또는 씨. 스포로게네스 박테리아도 함유하지 않는다. 이러한 집단은 컨소시엄이 아니다.
표 3: 상이한 배양 단계에서 "유형 192P 미생물 컨소시엄" 조성. 상이한 실험을 실시하였고, 수득된 최소 및 최대 비율을 나타낸다.
대조적으로, 상기 표 3은 모든 배양 단계에서 및 생산 발효 동안에 씨. 스페노이데스 및 씨. 스포로게네스 박테리아가 "유형 192P 미생물 컨소시엄"에 존재함을 나타낸다. 각각의 미생물의 비율은 연속 배양 단계에 걸쳐 변하였다.
상기 정의된 것과 동일한 조건에서 수행한 추가의 실험에 따라, "유형 192P 미생물 컨소시엄"의 확립된 영구 상태 배양물에 존재하는 상이한 종은 다음과 같았다:
- 씨. 아세토부틸리쿰 96.34% - 98.64%
- 씨. 스페노이데스 1.29% - 3.63%
- 씨. 스포로게네스 0.03% - 0.11%.
실시예 3: 씨. 스페노이데스 및 씨. 스포로게네스 뱃치식 배양 검정
본 발명의 대조군으로서, 씨. 스페노이데스 및 씨. 스포로게네스를 함께 배양하거나 또는 시판 글리세롤 또는 글리세린으로부터 유래된 글리세롤 (30 g/L)을 함유하는 풍부 배지 (CGM: 프로토콜에서 기재된 클로스트리디아 성장 배지)에서 독립적으로 배양하였다. 미생물의 성장에도 불구하고, 글리세롤/글리세린이 소모되지 않았고, 1,3-프로판디올이 생산되지 않았다.
달리, 글리세롤 / 글리세린 (30 g/L)을 갖는 합성 최소 배지 (프로토콜에서 기재됨)를 함유하는 플라스크 배양물에서 씨. 스페노이데스 또는 씨. 스포로게네스 또는 씨. 스페노이데스 및 씨. 스포로게네스를 성장시키기 위해 몇몇 검정을 수행하였지만, 성장이 관찰되지 않았다.
이들 모든 데이터는, 씨. 스페노이데스 및 씨. 스포로게네스 모두 단독 탄소 공급원으로서의 글리세롤/글리세린으로부터 1,3-프로판디올을 생산할 수 없으며, "유형 192P 미생물 컨소시엄"의 1,3-프로판디올의 연속 생산에서 그들의 성장 및 지속이 어느 정도 씨. 아세토부틸리쿰의 존재 때문임을 시사한다. 더욱이, 실시예 1, 2, 3 및 4로부터의 결과는, 씨. 스페노이데스 및/또는 씨. 스포로게네스가 씨. 아세토부틸리쿰과의 컨소시엄에서 중추적인 역할을 하여 고농도의 산업용 비가공 글리세린에서 PDO 생산 성능을 개선시킴을 나타낸다.
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Claims (13)
- 적어도 1종의 균주 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 적어도 1종의 균주 클로스트리디움 스포로게네스(Clostridium sporogenes) 및 적어도 1종의 균주 클로스트리디움 스페노이데스(Clostridium sphenoides)를 포함하는 미생물 컨소시엄.
- 제1항에 있어서, 적어도 85%의 씨. 아세토부틸리쿰, 0.001% 내지 0.2%의 씨. 스포로게네스 또는 0.1% 내지 15%의 씨. 스페노이데스를 포함하는 미생물 컨소시엄.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 85% 내지 99.8%의 씨. 아세토부틸리쿰, 0.001% 내지 0.15%의 씨. 스포로게네스 또는 0.2% 내지 15%의 씨. 스페노이데스를 포함하는 미생물 컨소시엄.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 90% 내지 99.8%의 씨. 아세토부틸리쿰, 0.002% 내지 0.13%의 씨. 스포로게네스 또는 0.2% 내지 10%의 씨. 스페노이데스를 포함하는 미생물 컨소시엄.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 적어도 1종의 균주 씨. 아세토부틸리쿰, 적어도 1종의 균주 씨. 스포로게네스 및 적어도 1종의 균주 씨. 스페노이데스로 이루어지는 미생물 컨소시엄.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 균주 씨. 아세토부틸리쿰이, 90 g/L 초과의 글리세롤을 갖는 배양 배지로부터의 성장 및 1,3-프로판디올 생산을 위해 사전에 적응된 것이며, 비타민 B12-비의존성 1,3-프로판디올 경로에 수반되는 씨. 부티리쿰(C. butyricum) 코딩 효소로부터의 1,3-프로판디올 오페론의 가외의 카피를 도입함으로써 1,3-프로판디올 생산의 증가된 플럭스를 제공하는 것인 미생물 컨소시엄.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 균주 씨. 아세토부틸리쿰이, 90 g/L 초과의 글리세롤을 갖는, 구체적으로 산업용 글리세린으로부터 유래된 글리세롤을 갖는 배양 배지로부터의 성장 및 1,3-프로판디올 생산을 위해 적응된 것인 미생물 컨소시엄.
- 제6항에 있어서, 상기 씨. 아세토부틸리쿰이 연속 배양 공정 동안 성장 및 1,3-프로판디올 생산을 위해 사전에 적응된 것이며, 여기서 공급 배지가, 90 내지 120 g/L의 글리세롤에 포함된, 또는 105 g/L의 글리세롤의, 산업용 글리세린으로부터 유래된 글리세롤의 농도를 함유하는 것인 미생물 컨소시엄.
- 탄소의 단독 공급원으로서 글리세롤을 포함하는 공급 배지에서 제1항 또는 제2항에 따른 미생물 컨소시엄을 배양하고, 배양 배지로부터 생산된 1,3-프로판디올을 회수하는 것을 포함하는, 글리세린의 연속 발효 공정으로 1,3-프로판디올을 생산하는 방법.
- 제9항에 있어서, 공급 배지 중 글리세린 농도가, 글리세린 용액에 함유된, 90 내지 120 g/L의 글리세롤에 포함되거나, 또는 105 g/L의 글리세롤인 방법.
- 제9항에 있어서, 배양 배지가 유기 질소의 첨가 없는 최소 배지인 방법.
- 제9항에 있어서, 1,3-프로판디올을 추가로 정제하는 것인 방법.
- 탄소의 단독 공급원으로서 90 g/L 초과의 글리세롤을 함유하는 배양 배지에서 적어도 1종의 균주 씨. 아세토부틸리쿰과 공동-배양함으로써 발효 공정으로부터의 1,3-프로판디올의 생산을 개선시키기 위해 적어도 1종의 균주 씨. 스포로게네스 및 적어도 1종의 균주 씨. 스페노이데스를 사용하는 방법.
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