CN111893118A - 一种来源于甘蓝型油菜的双向启动子及其应用 - Google Patents

一种来源于甘蓝型油菜的双向启动子及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及具体涉及一种来源于甘蓝型油菜的双向启动子及其应用。所述双向启动子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。将本发明的PBn265启动子序列以正反两个方向分别插入载体pEG‑mCherry和pBI121‑GFP中后，能分别启动mCherry和GFP表达。功能转化试验证明，本发明分离的双向启动子可用于构建植物双价表达载体、培育植物新品种以及改良植物种质资源等方面。

Description

一种来源于甘蓝型油菜的双向启动子及其应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种来源于甘蓝型油菜的双向启动子及应用。
背景技术
双向启动子因为可以同时启动其两侧基因的表达而受到人们越来越多的关注。双向启动子(Bidirectional promoter)是指位于一对“头对头”的基因的两个转录起始点之间，富含GC序列，其长度没有具体严格的标准，短的只有100bp左右，长的超过2.0kb的启动子。双向启动子是可分别驱动正链与负链下游结构基因表达的基因组序列，因此其在多基因转化应用中具有其独有的优势——因为传统启动子一个启动子只能启动一个基因，双向启动子可以同时启动两个基因。
中国是世界油菜生产大国，种植面积高达7×106hm2，总产1.1×107吨，均占全世界的三分之一，因此，甘蓝型油菜遗传改良的重要性和必要性不言而喻，多基因的导入则是其中较为关键的一步。
鉴于双向启动子可以同时驱动两个基因的特性，使其在多基因表达相关的基因工程和代谢工程研究中具有巨大的潜力。例如，很多外源蛋白在油菜中需要整株表达，所以大部分所用启动子都以组成型居多，但当多基因表达时，重复利用启动子又易造成基因沉默等结果，而从油菜中分离获得双向启动子，则可以同时启动两个基因且有效避免出现基因沉默的现象。
发明内容
本发明目的之一在于提供一种从甘蓝型油菜(Brassica napus)中分离得到的具有双向启动功能的DNA片段。
本发明目的之二在于提供含有上述DNA片段的重组表达载体以及含有该重组表达载体的重组宿主细胞。
本发明的目的之三是将所述的DNA片段以及含有该DNA片段的重组表达载体应用于构建转基因植物、改良植物性状以及改良植物种质资源等方面。
本发明提供的双向启动子功能的DNA片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，序列表中SEQ ID NO:1的序列是由265个脱氧核糖核苷酸组成，是甘蓝型油菜基因BnaA01g26780D和BnaA01g26770D基因之间的序列。
本发明在该启动子正链下游或者负链下游连接一个报告基因GFP和mCherry，构建得到可稳定表达的植物重组载体；转化实验证明，这两个方向均能驱动两个报告基因在烟草叶片中进行表达，说明这个启动子具有双向启动子的功能。
可以采用任何植物转化方法，包括但不限于农杆菌介导的转化、原生质体转化、Ti质粒、 Ri质粒、植物病毒载体、显微注射、电穿孔法、微粒轰击等，将本发明所构建的重组植物表达载体引入到目标植物的细胞、组织或器官中，得到转化体；再由转化体通过植物组织培养方法再生得到完整植株及其无性系或其后代；所述目标植物包括单子叶植物、双子叶植物，所述双子叶植物可为十字花科植物，优选为甘蓝型油菜(Brassica napus)。
因此，本发明有望为复合性状转基因植物的培育提供更佳的启动元件，在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。
附图说明
图1：本发明涉及的pBI121-PBn265-F-GFP植物双元表达载体图谱。
图2：本发明涉及的pEG-PBn265-R-mCherry植物双元表达载体图谱。
图3：本发明的正向启动子驱动GFP表达分析结果。附图标记说明：图3中的A图、图3中的B图、图3中的C图分别为转染pBI121-GFP的本氏烟草叶片在GFP激发光下、明场、激发光和明场两者重叠的显微镜照片；图3中的D图、图3中的E图、图3中的F图分别为转染 pBI121-PBn265-F-GFP的本氏烟草叶片在GFP激发光下、明场、激发光和明场两者重叠的烟草叶片显微镜照片。
图4：本发明的反向启动子驱动mCherry表达分析结果。附图标记说明：图4中的A图、图 4中B图、图4中的C图分别为转染pEG-mCherry的本氏烟草叶片在mCherry激发光、明场、激发光和明场两者重叠的显微镜照片；图4中的D图、图4中的E图、图4中的F图分别为转染pEG-PBn265-R-mCherry的本氏烟草叶片在mCherry激发光、明场、激发光和明场两者重叠的显微镜照片。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地解释本发明，但并不限于本发明。下列实施例中的试验方法如无特殊说明均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料如无特殊说明均为常规生化试剂从公司购买。以下实施例中的定量试验均设置三次重复，结果取平均值。
实施例1、启动子的分离
1、针对甘蓝型油菜“ZS11”的基因组 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/203？genome_assembly_id＝335272)的分析，发现了可能为双向启动子的一段序列，以甘蓝型油菜品种科乐油(四川省农业厅行政审批公告 (2011年第017号)，为公开推广应用的品种)基因组DNA为模板，用下述引物对该段序列进行PCR扩增：
正向引物：PBn265-F：5-CTTAGGTTTGTCAGACCAAC-3
反向引物：PBn265-R：5-CGTTCGGATACTATACCATG-3
2、PCR的反应条件：
反应体系为：基因组DNA 1μL，正向引物PBn265-F 1μL，反向引物PBn265-R 1μL，诺维赞10×Taq MIX(南京诺维赞生物科技公司)13μL，ddH2O 9μL。
反应程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性15秒，57℃退火15秒，72℃延伸20秒，35个循环；最后充分延伸5分钟。
3、将PCR扩增产物进行直接纯化回收，并连接到pEASY-Blunt载体(购自北京全式金生物技术有限公司)克隆载体上，转化大肠杆菌pEASY1-T1感受态(购自北京全式金生物技术有限公司)，经测序鉴定后，扩增产物命名为PBn265，将其正链方向命名为PBn265-F，负链方向命名为PBn265-R。其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
实施例2、重组表达载体的构建
一、重组表达载体pBI121-PBn265-F-GFP的构建
1、以上述pEASY-Blunt-PBn265质粒为模板，采用PBn265-F-F引物和PBn265-F-R引物对其进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
正向引物：PBn265-F-F:gaccatgattacgccaagcttCTTAGGTTTGTCAGACCAACACAAG
反向引物：PBn265-F-R:ccatggtacccccggggatccCGTTCGGATACTATACCATGTGGA
上述引物中，下划线分别标注HindⅢ和BamHⅠ酶切位点。
2、PCR的反应条件：
反应体系为：基因组DNA 1μL，正向引物(PBn265-F-F)1μL，反向引物(PBn265-F-R)1 μL，诺维赞10×Taq MIX 13μL，ddH2O 9μL。
反应程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性15秒，57℃退火15秒，72℃延伸20秒，35个循环；最后充分延伸5分钟。
3、用限制性内切酶HindⅢ和BamHⅠ双酶切植物表达载体pBI121-GFP，回收酶切后的载体骨架。
4、将步骤1的PCR产物和步骤2得到的载体骨架通过同源重组酶连接。
反应体系：载体骨架2μL，上述PCR产物6μL，同源重组酶(购自湖南一诺唯真科技有限公司)2μL。
反应程序：37℃，30分钟。
得到重组表达载体pBI121-PBn265-F-GFP。根据测序结果，对重组表达载体 pBI121-PBn265-F-GFP进行结构描述如下：将植物表达载体pBI121-GFP的HindⅢ和BamHⅠ酶切位点之间的片段取代为序列表1自5’端第1至第265位核苷酸所示的DNA分子。重组表达载体结构如图1所示。
二、重组表达载体pEG-PBn265-R-mCherry的构建
1、以上述pEASY-Blunt-PBn265质粒为模板，采用PBn265-R-F引物和PBn265-R-R引物对其进行PCR 扩增，得到PCR扩增产物。
正向引物：PBn265-R-F：GACGCGTCGTTCGGATACTATACCATGTGGA
反向引物：PBn265-R-R:TCTCGAGCTTAGGTTTGTCAGACCAACACAAG
上述引物中，下划线分别标注MluⅠ和XhoⅠ酶切位点
PCR的反应条件为：
反应体系为：基因组DNA 1μL，正向引物(PBn265-R-F)1μL，反向引物(PBn265-R-R)1 μL，诺维赞10×Taq MIX 13μL，ddH2O 9μL。
反应程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性15秒，57℃退火15秒，72℃延伸20秒，35个循环；最后充分延伸5分钟。
2、用限制性内切酶MluⅠ和XhoⅠ双酶切植物表达载体pEG-mCherry，回收约9529bp的载体骨架。
3、将步骤1的PCR产物纯化回收后使用MluⅠ和XhoⅠ进行双酶切。
3、将步骤3的酶切产物和步骤2得到的载体骨架通过T4连接酶酶连接，连接反应条件：
反应体系：载体骨架2μL，酶切片段产物6μL，T4连接酶(购自宝生物工程有限公司)1μL，buffer 1μL。
反应程序：16℃，12小时。
得到重组表达载体pEG-PBn265-R-mCherry。根据测序结果，对重组表达载体 pEG-PBn265-R-mCherry进行结构描述如下：将植物表达载体pEG-mCherry的MluⅠ和XhoⅠ酶切位点之间的片段取代为序列表1自5’端第1至第265位核苷酸所示的DNA分子。重组表达载体结构如图2所示.
实施例3、PBn265作为双向启动子功能的验证
一、转化植物并培养
植物瞬时表达载体分别为：pBI121-GFP和pEG-mCherry。实施例2构建的重组表达载体 pBI121-PBn265-F-GFP、重组表达载体pEG-PBn265-R-mCherry。借助根癌农杆菌GV3101将上述各个植物瞬时表达载体分别本氏烟草的叶片进行瞬时转染，具体步骤如下：
1、将构建的重组瞬时表达载体导入根癌农杆菌GV3101(上海唯地生物技术有限公司)，得到重组农杆菌。
具体操作过程如下：取-80℃保存的农杆菌GV3101感受态细胞于室温或手心片刻待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中。加入5μL上述重组质粒DNA，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟。加入700μl无抗生素的LB培养基或YEB液体培养基，于28℃振荡培养2～3小时。6000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌液，涂布于卡那霉素与利福平双抗生素的LB平板上，于28℃培养箱倒置培养2天，挑取单菌落，PCR及测序鉴定后即得到重组农杆菌。
2、在含卡那霉素与利福平双抗生素的LB液体培养基中培养步骤1所得重组农杆菌，离心收集菌体，使用重悬液重悬菌体并将菌液浓度调至OD600nm＝0.1-0.2。
重悬液体系：MES-KOH(2-(N-吗啉代)乙磺酸/氢氧化钾缓冲液)(pH＝5.7)10nM，MgCl2(氯化镁溶液)10mM，AS(乙酰丁香酮)200μM。
3、从实验室培养室中挑选长到6-8片真叶的本氏烟草植株，选取距离顶部最近的嫩叶进行叶下表皮注射，将步骤2的菌液注射至叶片面积的三分之二或者更多。
4、将步骤3中注射过菌液的植株在80％的湿度下黑暗培养12-16小时。
5、完成步骤4后，在50％的湿度环境中，以16小时光照/8小时黑暗的明暗交替下培养 3天。
6、完成步骤5后，取注射过重组农杆菌的烟草叶片，用Leica DM4B正置荧光显微镜(德国徕卡公司)进行GFP和mCherry表达分析。
二、基因表达检测
选取待测样本制作载玻片，在Leica DM4B正置荧光显微镜(德国徕卡公司)下进行观察并拍照。
GFP和mCherry表达结果如图4所示。在图4中，第一排为转染pBI121-GFP的叶片，第二排为瞬时转染pBI121-PBn265-F-GFP的叶片。结果表明：瞬时转染pBI121-GFP和 pBI121-PBn265-F-GFP的叶片中都能观察到明显的绿色荧光信号，瞬时转染pEG-mCherry和 pEG-PBn265-R-mCherry的叶片中都能观察到明显的红色荧光信号。
上述步骤进行五次重复实验，结果一致。
结果表明，PBn265正、反方向序列均具有启动子活性，说明PBn265具有双向启动子的功能，可从正反两个方向驱动基因表达。
序列表
<110> 四川大学
<120> 一种来源于甘蓝型油菜的双向启动子及应用
<141> 2020-07-31
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 265
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(265)
<400> 1
cttaggtttg tcagaccaac acaagcgcga aaatagaaac aacgaataga tctcactaat 60
atttccggcg aatcacgcag ggccggggtg actcaatagg acaacgaaac cggacagcat 120
aaattttcat ccgccccgaa gattttattt tcatttatag tacttcacaa caaacgggct 180
tttaaaaggc ccattaacta agcccattat gagaccgaga agaagaagag gaaaaatctt 240
atccacatgg tatagtatcc gaacg 265

Claims (2)

1.一段从甘蓝型油菜中分离得到的具有双向启动子功能的DNA片段，其特征在于，所述双向启动子功能的DNA片段的核苷酸序列如下所示：
Cttaggtttgtcagaccaacacaagcgcgaaaatagaaacaacgaatagatctcactaatatttccggcgaatcacgcagggccggggtgactcaataggacaacgaaaccggacagcataaattttcatccgccccgaagattttattttcatttatagtacttcacaacaaacgggcttttaaaaggcccattaactaagcccattatgagaccgagaagaagaagaggaaaaatcttatccacatggtatagtatccgaacg。
2.权利要求1所述的DNA片段作为启动子驱动目的基因在油菜或其他植物体内表达中的应用。
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