JP2006516263A - 化学修飾されたヒト成長ホルモンコンジュゲート - Google Patents

化学修飾されたヒト成長ホルモンコンジュゲート Download PDF

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Abstract

本発明は水溶性重合体を蛋白に結合することにより製造した化学修飾されたヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）を提供する。本発明により化学修飾された蛋白は未修飾のｈＧＨよりもはるかに長時間持続するｈＧＨ活性を有し、用量および予定投薬回数を低減することを可能にする。

Description

本発明は米国特許法第１１９条の下に２００１年１１月２０日に仮出願された６０／３３１,９０７号の優先権を主張する２００２年１１月２０日に出願された米国特許出願１０／３００.８２２号の一部継続出願であり、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明はヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の化学的および／または生理学的特徴が変化するｈＧＨおよびそのアゴニスト変異体の化学修飾に関する。ペギル化（ＰＥＧ化）されたｈＧＨは増大した血漿中残留時間、低下したクリアランス速度、向上した安定性、低下した抗原性、または、これらの組み合わせを有する。本発明はまたｈＧＨの修飾のための方法に関する。更にまた本発明は修飾されたｈＧＨを含む医薬組成物に関する。別の実施形態は成長および発達の障害の治療のための修飾されたｈＧＨの使用である。
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）はジスルフィド架橋２つにより交差結合された１９１アミノ酸の１本鎖を含む蛋白であり、そして、単量体形態は２２ｋＤａの分子量を有する。ヒトＧＨは脳下垂体から分泌され、組み換え遺伝子工学によっても生産できる。ｈＧＨは成長可能な全ての身体組織における成長をもたらす。組み換えｈＧＨは数年間市販されてきている。治療上有用な組み換えｈＧＨ製剤の２つの型が市販されており、真正のもの、例えばＧｅｎｏｔｒｏｐｉｎTMまたはＮｕｔｒｏｐｉｎTMおよびＮ末端に付加的なメチオニン残基を有する類縁体、例えばＳｏｍａｔｏｎｏｒｍTMがある。ｈＧＨは成長ホルモン欠乏症（ＧＨＤ）またはＴｕｒｎｅｒ症候群とも称される脳下垂体機能低下性小人症の患者における直線的成長を刺激するために使用されるが、他の適応症も示されており、例えば未熟児（ＳＧＡ）で出生した小児における成長障害の長期治療、Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ症候群（ＰＷＳ）、慢性腎不全（ＣＲＩ）、ＡＩＤＳ消耗および加齢を伴う患者の治療のために使用される。
成長ホルモン（ＧＨ）の主要な生物学的作用は幼若哺乳類における成長の促進および加齢哺乳類における組織の維持である。対象となる臓器系には骨、結合組織、筋肉および内臓、例えば肝臓、腸および腎臓が含まれる。成長ホルモンは標的細胞膜上の特定の受容体との相互作用を介してその作用を発揮する。ｈＧＨは胎盤ラクトゲン、プロラクチンおよび他の遺伝子的および種の変異体または成長ホルモンを含む相同性を有するホルモンファミリーのメンバーである（Ｎｉｃｏｌｌ，Ｃ．Ｓ.，ｅｔ ａｌ.，（１９８６）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ ７：１６９）。ｈＧＨはそれが広範な種特異性を示し、クローニングされた体形成性（Ｌｅｕｎｇ，Ｄ．Ｗ.，ｅｔ ａｌ.［１９８７］Ｎａｔｕｒｅ ３３０；５３７）またはプロラクチン受容体（Ｂｏｕｔｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ.
［１９８８］Ｃｅｌｌ；５３：６９）の何れかに結合するという点でそれらの中では通常とは異なる。ｈＧＨに対してクローニングされた遺伝子はエシェリシア・コリにおいて分泌型として発現されており（Ｃｈａｎｇ，Ｃ．Ｎ．ｅｔ ａｌ.，［１９８７］Ｇｅｎｅ
５５：１８９）、そして、そのＤＮＡおよびアミノ酸配列が報告されている（Ｇｏｅｄｄｅｌ，ｅｔ ａｌ.，［１９７９］Ｎａｔｕｒｅ ２８１：５４４，Ｇｒａｙ，ｅｔ ａｌ.［１９８５］Ｇｅｎｅ ３９：２４７）。
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は正常なヒトの成長および発達の調整の大部分に関与している。この脳下垂体ホルモンは複数の生物学的作用、例えば直線的成長（体細胞発達）、乳汁分泌、マクロファージの活性化、インスリン様および特に糖尿病原性の作用を示す（Ｃｈａｗｌａ， Ｒ．Ｋ．（１９８３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．３４，５１９；Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｃ．Ｋ．ｅｔ ａｌ.，（１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９，７６９；Ｔｈｏｍｅｒ，Ｍ．Ｏ.，ｅｔ ａｌ.，（１９８８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８１：７４５）。小児における成長ホルモン欠乏症は小人症をもたらし、これはｈＧＨの外因性投与により１０数年間良好に治療されてきた。
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は１９１アミノ酸よりなる１本鎖ポリペプチド（分子量２１,５００）である。ジスルフィド結合が５３位と１６５位および１８２位と１８９位を連結している（Ｎｉａｌｌ， Ｎａｔｕｒｅ，Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２３０：９０（１９７１））。ｈＧＨは特に窒素、リン、カリウムおよびカルシウムの保持による強力な同化剤である。下垂体切除ラットにＧＨを投与することによりラットの成長速度が少なくとも部分的に回復できる。Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ.，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２２：１９２０−２９２６（１９８８）。脳下垂体機能低下（ＧＨ不全）患者におけるその最も顕著な作用のうち、骨生育板軟骨の直線的成長の加速は、身長の増大をもたらす。Ｋａｐｌａｎ，Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｉｎ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ ａｎｄ Ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｓ（Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，ＩＬ：Ｃｈａｒｌｅｓ Ｃ．Ｔｈｏｍａｓ，１９６４。
ｈＧＨは種々の動物モデルにおいて種々の生理学的および代謝的な作用、例えば直線的骨成長、乳汁分泌、マクロファージの活性化、インスリン様および糖尿病原性の作用等をもたらす（Ｒ．Ｋ．Ｃｈａｗｌａ ｅｔ ａｌ.，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．３４：５１９（１９８３）；Ｏ．Ｇ．Ｐ．Ｉｓａｋｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ.，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．４７，４８３（１９８５）；Ｃ．Ｋ．Ｅｄｗａｒｄｓ ｅｔ ａｌ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９，７６９（１９８８）；Ｍ．Ｏ．Ｔｈｏｍｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｌ．Ｖａｎｃｅ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８２：７４５（１９８８）；Ｊ．Ｐ．Ｈｕｇｅｓ ａｎｄ Ｈ．Ｇ．Ｆｒｉｅｓｅｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．４７：４６９（１９８５））。特に閉経後の女性においてＧＨ分泌は加齢に従って低下することが報告されている。Ｍｉｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ.，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ，１１：２２９−２３５（１９９０）；Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ.，Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ Ｍ．Ｌ６− １３７−１４２（１９８７）。またＲｕｄｍａｎ ｅｔ ａｌ.，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，６７：１３６１−１３６９（１９８１）およびＢｌａｃｋｍａｎ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ，１６：９８１（１９８７）も参照できる。更にまた減少した除脂肪体重（ｌｅａｎ ｂｏｄｙ ｍａｓｓ）、脂肪組織の容積の拡大および皮膚の薄弱化を含む加齢の顕在化の一部が一週間に３回のＧＨの投与により低減できるという報告がある。例えばＲｕｄｍａｎ ｅｔ ａｌ.，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ.，３２３：１−６（１９９０）およびＤｒ．Ｖａｎｃｅによる同雑誌の付属文献（５２−５４頁）を参照できる。これらの生物学的作用はｈＧＨと特定の細胞受容体との間の相互作用に由来している。２種類のヒト受容体、即ちｈＧＨ肝受容体（Ｄ．Ｗ．Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ.，Ｎａｔｕｒｅ ３３０：５３７（１９８７））およびヒトプロラクチン受容体（Ｊ．Ｍ．Ｂｏｕｔｉｎ ｅｔ ａｌ.，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．３：１４５５（１９８９））がクローニングされている。しかしながら、ヒト胎盤ラクトーゲン受容体を含む他のものも存在すると考えられる（Ｍ．Ｆｒｅｅｍａｒｋ，Ｍ．Ｃｏｍｅｒ，Ｇ．Ｋｏｍｅｒ ａｎｄ Ｓ．Ｈａｎｄｗｅｒｇｅｒ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ／１２０：１８６５（１９８７））。これらの相同的な受容体はグリコシル化細胞外ホルモン結合ドメイン、単一の膜貫通ドメインおよび原形質ドメインを含有しており、これは配列および大きさにおいてかなり異なっている。１つまたはそれ以上の受容体がｈＧＨへの生理学的応答において決定的役割を果たしていると推定される。
身体に投与された生理学的に活性な蛋白は、身体内でのその高いクリアランス速度のため、その生理学的活性を僅か短期間のみしか示すことができないことが一般的にわかっている。更にまた、これらの蛋白の相対的な疎水性がその安定性および／または可溶性を制限している。
治療用蛋白のクリアランス速度を低下させ、安定性を改善し、または抗原性を減少する目的のために、蛋白を水溶性重合体で化学的に修飾する幾つかの方法が提案されている。この種の化学修飾は蛋白骨格そのものとの物理的接触から蛋白分解酵素を効果的にブロックし、これにより分解を防止する。特定の水溶性重合体の化学的結合は分子の増大した水力学的容量により、腎クリアランスを効果的に低減できる。別の利点としては、特定の状況下における治療用蛋白の増大した安定性および循環時間、増大した溶解性および低下した免疫原性が挙げられる。ポリ（アルキレンオキシド）、特にポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）は治療用蛋白製品の製造において使用されているこのような化学部分の１つである（「ペギル化（ｐｅｇｙｌａｔｅ）」という動詞はＰＥＧ分子を少なくとも１つを結合させることを意味する）。ポリ（エチレングリコール）の結合は蛋白分解に対して保護することがわかっており（Ｓａｄａ， ｅｔ ａｌ.，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７１：１３７−１３９（１９９１））、そして特定のポリ（エチレングリコール）部分の結合のための方法が使用できる。米国特許４,１７９,３３７号、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ.，“Ｎｏｎ−Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ”、１９７９年１２月１８日発行；および米国特許４,００２,５３１号、Ｒｏｙｅｒ，“Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ ｗｉｔｈ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ Ｔｈｅｒｅｂｙ”，１９７７年１月１１日発行を参照できる。総説としては、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ.，Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｓ Ｄｒｕｇｓ （Ｊ．Ｓ．Ｈｏｌｃｅｒｂｅｒｇ ａｎｄ Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，ｅｄｓ．ｐｐ．３６７−３８３（１９８１））を参照できる。
他の水溶性重合体も使用されており、例えばエチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィン系アルコール）、ポリ（アクリロイルモルホリン）、ポリ（オキサゾリン）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（１，３−ジオキソラン）、ポリ（１，３，６−トリオキサラン）、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（単独重合体またはランダム共重合体）が挙げられる。
ペギル化治療用蛋白の多くの例が報告されている。ＡＤＡＧＥＮ(R)、即ちアデノシンデアミナーゼのペギル化製剤は重度の複合免疫不全疾患の治療について認可されている。ＯＮＣＡＳＰＡＲ(R)、即ちペギル化Ｌ−アスパラギナーゼは高感受性ＡＬＬ患者の治療について認可されている。ペギル化スーパーオキシドジスムターゼは頭部傷害の治療のための臨床治験に付されている。ペギル化αインターフェロン（米国特許５,７３８,８４６、５,３８２,６５７）は肝炎の治療について認可されており；ペギル化グルコセレブロシダーゼおよびペギル化ヘモグロビンは前臨床試験に付されていることが報告されている。別の例は、ＩＬ−６に付加されているポリ（エチレングリコール）分子を開示しているＥＰ０４４２７２４、表題「修飾ｈＩＬ−６」のペギル化ＩＬ−６である。
化学修飾されている別の特定の治療用蛋白は顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）である。Ｇ−ＣＳＦは好中球顆粒球の急速な増殖および血流中への放出を誘導し、これにより感染に対抗する治療効果をもたらす。“Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ”と題された１９９０年１２月１２日公開の欧州特許出願ＥＰ０４０１３８４号はポリ（エチレングリコール）分子を結合したＧ−ＣＳＦの製造のための材料および方法を記載している。修飾されたＧ−ＣＳＦおよびその類縁体はまたポリ（エチレングリコール）のような水溶性粒状重合体に共有結合的にコンジュゲートした種々のＧ−ＣＳＦおよび誘導体の使用を記載した“Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ａ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ｔｏ Ａ Ｗａｔｅｒ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒ”と題された１９９２年３月４日公開のＥＰ０４７３２６８号において報告されている。ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有する修飾ポリペプチドは１９８９年１０月４日公開のＥＰ０３３５４２３号において報告されている。米国特許５,８２４,７８４号はＮ末端修飾蛋白またはその類縁体のための方法、および、その結果得られる新しいＮ末端化学修飾Ｇ−ＣＳＦ組成物を含む組成物を提供している。米国特許５,８２４,７７８号は化学修飾されたＧ−ＣＳＦを開示している。
ポリ（エチレングリコール）については、種々の手段を用いることによりポリ（エチレングリコール）分子を蛋白に結合している。一般的には、ポリ（エチレン繰りオール）分子を蛋白上に存在する反応性の基を介して蛋白に連結する。
リシン残基上またはＮ末端に存在するアミノ基はこのような結合に好都合である。例えば、Ｒｏｙｅｒ（米国特許４,００２,５３１号、上記）は酵素へのポリ（エチレングリコール）分子の結合のために還元的アルキル化を用いたことを説明している。Ｗｒｉｇｈｔの１９９３年４月２８日公開のＥＰ０５３９１６７号、“Ｐｅｇ Ｉｍｉｄａｔｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｔｈｅｒｅｏｆ”はペプチドおよび遊離アミノ基を有する化合物をＰＥＧのイミデート誘導体または関連の水溶性有機重合体で修飾することを説明している。米国特許５,２９８,６４３号および米国特許５,６３７,７４９号はＰＥＧアリールイミデートを開示している。
Ｃｈａｍｏｗ ｅｔ ａｌ.，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：１３３−１４０（１９９４）は還元的アルキル化を介したモノメトキシポリ（エチレングリコール）アルデヒドによるＣＤ４免疫付着因子の修飾を報告している。著者等は、ＣＤ４−Ｉｇの５０％が、ペギル化の程度の制御を可能とする条件下にＭｅＰＥＧ修飾されたことを報告している。前出、１３７頁。著者等はまた修飾ＣＤ４−Ｉｇの（蛋白ｐｇ１２０への）インビトロでの結合能力は、同様にＭｅＰＥＧ化の程度に相関する割合で低下したことを報告している。前出。１９９０年２月２７日に発行されたＳｈａｗの米国特許４,９０４,５８４号は反応性アミン基を介したポリ（エチレングリコール）分子の結合のための蛋白におけるリジン残基の数の変更に関連している。
重合体を蛋白に結合させる多くの方法は連結基として機能するべき部分の使用を含んでいる。しかしながらこのような部分は抗原性を有する場合がある。連結基を使用しないトレシルクロリド法が使用可能であるが、この方法は、トレシルクロリドの使用が毒性の副生成物を生成する可能性があることから、治療用製品の製造のために用いることは困難であると考えられる。Ｆｒａｎｃｉｓ ｅｔ ａｌ.，Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ： ｉｎ ｖｉｖｏ ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｒａｔｅｉｅｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ（Ｅｄｓ．Ａｈｅｒｎ，Ｔ．ａｎｄ Ｍａｎｎｉｎｇ，Ｍ．Ｃ．）Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）、更にまた、Ｄｅｌｇａｄｏ ｅｔ ａｌ.，“Ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ ＰＥＧ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｙ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｔｒｅｓｙｌ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｅｌｌ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ”，Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｕｓｉｎｇ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｐｈａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ.，ｅｄｓ．Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｗ.，１９８９ ｐｐ．２１１−２１３を参照できる。
更にまたＲｏｓｅ ｅｔ ａｌ.，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２：１５４−１５９（１９９１）も参照でき、これは蛋白基質（インスリン）のＣ末端カルボキシル基へのリンカー基カルボヒドラジドの選択的結合を報告している。
国際特許出願ＷＯ９３／００１０９は３日間またはそれ以上の期間、連続的で有効な血漿中ＧＨ濃度を維持することを含む、哺乳類またはトリ類のＧＨ応答性組織の刺激のための方法に関する。このような血漿中濃度を達成するための１つの方法はＰＥＧ（ポリエチレングリコール）のような巨大分子基質にカップリングされたＧＨの使用であると説明している。巨大分子へのカップリングは向上した半減期をもたらすと説明されている。ｍＰＥＧアルデヒド−５０００およびｍＰＥＧ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ｍＰＥＧ−ＮＨＳ−５０００）を用いたＰＥＧ化ヒト成長ホルモンが国際特許出願ＷＯ９３／００１０９において報告されている。ｍＰＥＧ−ＮＨＳの使用は多重にＰＥＧ化された形態のｈＧＨの非均質な混合物を与えている。国際特許出願ＷＯ９３／００１０９はまた、システインｈＧＨ変異体をＰＥＧ化するためのｍＰＥＧ−マレイミドの使用を開示している。
国際特許出願ＷＯ９９／０３８８７はＰＥＧ化されたシステイン変異体成長ホルモンを開示している。ＢＴ−００５と表記されたこのコンジュゲートは成長ホルモン欠損ラットにおける体重増加促進においてより効果的であり、そしてｈＧＨより長い半減期を有するとされている。
カルボキシメチル化ＰＥＧのスクシンイミジルエステルを用いてＰＥＧ化されたヒト成長ホルモンがＣｌａｒｋ等により報告されている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７１：２１９６９−２１９７７，１９９６）。Ｃｌａｒｋ等は第一級アミンに選択的にコンジュゲートするｍＰＥＧ−ＮＨＳ−５０００を用いた漸増サイズのｈＧＨの誘導体を記載している。ＰＥＧ修飾の程度が上昇するに従ってその受容体に対する親和性が低下し、そして、１５００倍まで細胞系試験におけるＥＣ50が上昇した。Ｏｌｓｏｎ等のＰｏｌｙｍｅｒ Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ ３８：５６８−５６９，１９９７は多重にＰＥＧ化されたｈＧＨ種を得るためのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）ＰＥＧおよびスクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ）ＰＥＧの使用を開示している。
国際特許出願ＷＯ９４／２００６９は肺デリバリー用の製剤の部分としてのＰＥＧ化ｈＧＨを予言的に開示している。
米国特許４,１７９,３３７号は生理学的に活性な非免疫原性の水溶性ポリペプチドコンジュゲートを得るための、酵素およびホルモンをＰＥＧ化する方法を開示している。ＧＨはＰＥＧ化すべきホルモンの一例として言及されている。
ＥＰ４５８０６４Ａ２はソマトトロピンにおける、導入された、または天然に存在するシステイン残基のＰＥＧ化を開示している。ＥＰ４５８０６４Ａ２はまた野生型ウシソマトトロピンにおける残基１０２〜１１２に位置するとされているオメガループと称されるループへのシステイン残基２個の取り込みを記載しており、より詳しくは、ＥＰ４５８０６４Ａ２はそれぞれ、ＳｅｒからＣｙｓおよびＴｙｒからＣｙｓへのウシソマトトロピンの残基１０２および１１２番の置換を開示している。
国際特許出願ＷＯ９５／１１９８７は親分子中に存在するか、または部位特異的突然変異により導入されたシステイン残基のチオール基へのＰＥＧの結合を示唆している。国際特許出願ＷＯ９５／１１９８７はプロテアーゼであるネキシン−１のＰＥＧ化に関するが、ｈＧＨおよび他の蛋白の一般的なＰＥＧ化もまた示唆されている。
国際特許出願ＷＯ９９／０３８８７は例えばセリン残基に対する追加システインの挿入、および導入されたシステイン残基へのＰＥＧの結合により修飾された成長ホルモンを開示している。
国際特許出願ＷＯ００／４２１７５はＰＥＧの結合のための遊離のシステイン残基を含有する蛋白の製造方法に関する。国際特許出願ＷＯ００／４２１７５は以下のｈＧＨ突然変異蛋白（ｍｕｔｅｉｎ）、即ちＴ３Ｃ、Ｓ１１４ＣおよびＴ１４８ＣおよびそのシステインＰＥＧ化を開示している。
国際特許出願ＷＯ９７／１１１７８（並びに米国特許５,８４９,５３５号、米国特許６,００４,９３１号および米国特許６,０２２,７１１号）はｈＧＨのアゴニストまたはアンタゴニストとしてのＧＨ変異体の使用に関する。ＷＯ９７／１１１７８はまたリシンのＰＥＧ化を含むｈＧＨのＰＥＧ化およびリシンの導入または置き換え（例えばＫ１６８ＡおよびＫ１７２Ｒ）を開示している。国際特許出願ＷＯ９７／１１１７８はまた置換Ｇ１２０Ｋを開示している。
ＰＥＧ化ｈＧＨの以前の報告は、腎濾過の７０Ｋ分子量カットオフより大きい水力学的容量を達成するために、望ましくない生成物の非均質性をもたらす複数のＰＥＧの結合を要する（Ｋｎａｕｆ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ.，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１５０
６４−１５０７０，１９８８）。
より長い循環半減期を有するＧＨ分子は必要な投与回数を減らし、より至適な治療用ｈＧＨ濃度と同時に増強された治療効果を与える可能性がある。
本発明は低減した非均質性、低下したクリアランス速度、増大した血漿中残留時間、向上した溶解度、向上した安定性、低下した抗原性、または、これらの組み合わせを有する化学修飾ｈＧＨコンジュゲートを提供する。
本発明は化学修飾されたｈＧＨおよびそのアゴニスト変異体に関し、これは例えば、それには限定されないが、低下したクリアランス速度、増大した血漿中残留時間、向上した安定性、向上した溶解度、および低下した抗原性、から選択される進歩した化学的または生理学的特性少なくとも１つを有する。即ち、以下に更に詳細に記載する通り、本発明はｈＧＨおよびそのアゴニスト変異体を化学修飾すること、並びに、種々のポリ（エチレングリコール）部分を用いた特定の修飾に関する多くの様相を有する。
本発明はまた化学修飾されたｈＧＨおよびそのアゴニスト変異体の製造方法に関する。
本発明はまた化学修飾されたｈＧＨおよびそのアゴニスト変異体を含む組成物に関する。
本発明の修飾ｈＧＨおよびそのアゴニスト変異体は例えば、それには限定されないが、小人症（ＧＨＤ）、成人ＧＨＤ、Ｔｕｒｎｅｒ症候群の治療、未熟児（ＳＧＡ）で出生した小児の成長障害の長期治療、Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ症候群（ＰＷＳ）、慢性腎不全（ＣＲＩ）、ＡＩＤＳ消耗、加齢および最終段階の腎不全および嚢胞性線維症の患者の治療において有用である。
次に図面を説明する。
図１はｈＧＨと２０Ｋ ＰＥＧ−ＡＬＤの反応生成物およびアニオン交換精製された２０Ｋ ＰＥＧ−ＡＬＤ ｈＧＨの還元型および非還元型のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の写しである。レーン１はＭＷ蛋白標準物質；レーン２は還元ｈＧＨ−１０μｇ；レーン３は還元２０Ｋ直鎖ＰＥＧ−ＡＬＤ ｈＧＨ反応混合物−１０μｇ；レーン４は還元アニオン交換精製２０Ｋ直鎖ＰＥＧ−ＡＬＤ ｈＧＨ−１０μｇ；レーン５はブランク；レーン６は非還元ｈＧＨ−１０μｇ；レーン７は非還元２０Ｋ直鎖ＰＥＧ−ＡＬＤ ｈＧＨ反応混合物−１０μｇ；レーン８は非還元アニオン交換精製２０Ｋ直鎖ＰＥＧ−ＡＬＤ ｈＧＨ−１０μｇ；レーン９はブランク；レーン１０はＭＷ蛋白標準物質である。
図２は種々のアニオン交換精製ペギル化ｈＧＨ分子の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の写しである。レーン１はＭＷ蛋白標準物質；レーン２はｈＧＨ−１０μｇ；レーン２は４−６×５Ｋ ＰＥＧ−ＳＰＡ ｈＧＨ−１０μｇ；レーン３は２０Ｋ直鎖ＰＥＧ−ＡＬＤ ｈＧＨ−１０μｇ；レーン４は２０Ｋ分枝鎖ＰＥＧ−ＡＬＤ ｈＧＨ−１０μｇ；レーン５は４０Ｋ分枝鎖ＰＥＧ ｈＧＨ−１０μｇである。
図３はｈＧＨ、４０Ｋ ＢｒＰＥＧ−ＡＬＤ ｈＧＨおよび４０Ｋ Ｂｒ ＰＥＧ−ＮＨＳ ｈＧＨのトリプシン消化物のＲＰ−ＨＰＬＣ溶出プロフィルの写しを示す。主にｈＧＨのＮ末端へのＰＥＧカップリング（４０Ｋ Ｂｒ ＡＬＤ ｈＧＨで示すとおり）によりＮ末端（Ｔ１）フラグメントピークの還元が起こり、新しいＰＥＧ化Ｔ１ピークが発生する。
図４は１１日間の期間中の下垂体切除ラットにおける体重増加を示すことにより、６日おきに１回皮下（ＳＣ）投与（１.８ｍｇ／ｋｇ）されたモノＰＥＧ化ｈＧＨに対して毎日投与（０．３ｍｇ／ｋｇ／日）された非ＰＥＧ化ｈＧＨのインビボでの生物活性を比較したものである。
図５は１１日間の期間中の下垂体切除ラットにおける体重増加を示すことにより、６日おきに１回ＳＣ投与（１.８ｍｇ／ｋｇ）された４−６×５Ｋ ＰＥＧ−ＳＰＡ−ｈＧＨ、モノＰＥＧ化２０Ｋ分枝鎖ＰＥＧ−ＡＬＤ ｈＧＨ、およびモノＰＥＧ化４０Ｋ分枝鎖ＰＥＧ−ＡＬＤ ｈＧＨに対して毎日ＳＣ投与（０.３ｍｇ／ｋｇ／日）された非ＰＥＧ化ｈＧＨのインビボの生物活性を比較したものである。
図６は１１日間の期間中の下垂体切除ラットにおける脛骨生育の増加を示すことにより、６日おきに１回ＳＣ投与（１.８ｍｇ／ｋｇ）された４−６×５Ｋ ＰＥＧ−ＣＭＨＢＡ−ｈＧＨ、モノＰＥＧ化２０Ｋ直鎖ＡＬＤ、モノＰＥＧ化３０Ｋ直鎖ＡＬＤ、モノＰＥＧ化２０Ｋ分枝鎖ＰＥＧ−ＡＬＤ ｈＧＨおよびモノＰＥＧ化４０Ｋ分枝鎖ＰＥＧ−ＡＬＤ ｈＧＨに対して毎日ＳＣ投与（０.３ｍｇ／ｋｇ／日）された非ＰＥＧ化ｈＧＨのインビボの生物活性を比較したものである。
図７は９日間の期間中の下垂体切除ラットにおける血漿中ＩＧＦ−１濃度の増加を示すことにより、単回１.８ｍｇ／ｋｇ ＳＣ投与した非ＰＥＧ化ｈＧＨ、モノＰＥＧ化５Ｋ直鎖ＰＥＧ−ＡＬＤ ｈＧＨ、モノＰＥＧ化２０Ｋ直鎖ＰＥＧ−ＡＬＤ ｈＧＨ、モノＰＥＧ化２０Ｋ分枝鎖ＰＥＧ−ＡＬＤ ｈＧＨ、モノＰＥＧ化２０Ｋ直鎖ＰＥＧ−ヒドラジドｈＧＨ、モノＰＥＧ化３０Ｋ直鎖ＰＥＧ−ＡＬＤ ｈＧＨ、モノＰＥＧ化４０Ｋ分枝鎖ＰＥＧ−ＡＬＤ ｈＧＨ、４−６×５Ｋ ＰＥＧ ＳＰＡ ｈＧＨ、４−６×５Ｋ ＰＥＧ−ＣＭＨＢＡ ｈＧＨを比較したものである。
〔発明の詳細な説明〕
ｈＧＨおよびそのアゴニスト変異体は、米国特許４,６５８,０２１号および米国特許５,６３３,３５２号に記載されている通り、組換え蛋白のファミリーのメンバーである。それら組換え体の製造および使用方法は米国特許４,３４２,８３２号、４,６０１,９８０号、米国特許４,８９８,８３０号、米国特許５,４２４,１９９号および米国特許５,７９５,７４０号に詳述されている。
組換え遺伝子手法を用いて形質転換またはトランスフェクトされたＥ．ｃｏｌｉまたは動物細胞のような宿主細胞により生産される、何れの精製され単離されたｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体も本発明において使用できる。別のｈＧＨ変異体は１９９１年６月１４日出願の米国特許出願０７／７１５,３００号および１９９１年８月９日出願の米国特許出願０７／７４３,６１４号および１９９２年６月１１日公開の国際特許出願ＷＯ９２／０９６９０号に記載されている。これらのうち、形質転換Ｅ．ｃｏｌｉにより生産されるｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体が特に好ましい。このようなｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体は高い純度および均質性を有するものとして大量に得ることができる。例えば、上記のｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体は米国特許４,３４２,８３２号、４,６０１,９８０号、４,８９８,８３０号、５,４２４,１９９号および５,７９５,７４５号に開示されている方法に従って製造できる。「実質的に以下のアミノ酸配列を有する」という表現は、上記のアミノ酸配列が、アミノ酸の変換（欠失、付加、挿入または置換）によりｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の機能において何れかの不都合な非類似性がもたらされない限り、このような変換１つまたはそれ以上を含んでよいことを意味する。リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、非対システイン残基、遊離のＮ末端αアミノ基または遊離のＣ末端カルボキシル基の少なくとも１つが含まれるアミノ酸配列を実質的に有するｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体を使用することがより好ましい。
本発明によればポリ（エチレングリコール）はｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体のアミノ酸残基を介して共有結合する。種々の異なった官能基、リンカー、立体配置および分子量を有する種々の活性化ポリ（エチレングリコール）が当該分野で知られており、これらを使用してＰＥＧ−ｈＧＨコンジュゲートまたはＰＥＧ−ｈＧＨアゴニスト変異体コンジュゲートを作成することができる（総説はＲｏｂｅｒｔｓ Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ.，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．５４：４５９−４７６（２００２），Ｈａｒｒｉｓ Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ.，Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ ４０：５３８−５５１，２００１を参照できる）。アミノ酸残基は例えば遊離のアミノ、カルボキシル、スルフヒドリル（チオール）、ヒドロキシル、グアニジニルまたはイミダゾリル基を有するどのような反応性のものであってよく、これに活性化ポリ（エチレングリコール）の末端反応基が結合することができる。遊離のアミノ基を有するアミノ酸残基はリシン残基および／またはＮ末端アミノ酸残基を包含することができ、遊離のカルボキシル基を有するものはアスパラギン酸、グルタミン酸および／またはＣ末端アミノ酸残基を包含することができ、システインのような遊離のスルフヒドリル（チオール）を有するもの、セリンまたはスレオニンのような遊離のヒドロキシルを有するもの、アルギニンのような遊離のグアニジニルを有するもの、およびヒスチジンのような遊離のイミダゾリル基を有するものが挙げられる。
別の実施形態においてはオキシム化学（Ｌｅｍｉｅｕｘ＆Ｂｅｒｔｏｚｚｉ Ｔｉｂ Ｔｅｃｈ １６：５０６−５１３，１９９８）を用いてＮ末端セリン残基をターゲティングする。
本発明において使用するポリ（エチレングリコール）はどのような特定の型または分子量範囲にも限定されない。ポリ（エチレングリコール）の分子量は５００〜１００,０００であってよい。通常は５００〜６０,０００、好ましくは、１,０００〜４０,０００の分子量を使用する。より好ましくは分子量は５,０００超〜約４０,０００である。
別の実施形態においては、ポリ（エチレングリコール）は結合した１個以上のＰＥＧ部分を有する分枝鎖ＰＥＧである。分枝鎖ＰＥＧの好ましい例は米国特許５,９３２,４６２号、５,３４２,９４０号、５,６４３,５７５号、５,９１９,４５５号、６,１１３,９０６号、５,１８３,６６０号、国際特許出願ＷＯ０２／０９７６６号、Ｋｏｄｅｒａ Ｙ.，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５：２８３−２８８（１９９４）；およびＹａｍａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ.，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ.，５２：２１２５−２１２７，１９９８に記載されている。好ましい実施形態においては、分枝鎖ＰＥＧの各ポリ（エチレングリコール）の分子量は５,０００〜２０,０００である。
ポリ（アルキレンオキシド）、特にポリ（エチレングリコール）は末端反応基を介してｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体に結合し、これはＰＥＧおよび蛋白との間に連結部分（スペーサー）を残存させてもさせなくても良い。本発明のｈＧＨコンジュゲートまたはそのアゴニスト変異体を形成するためには、ポリ（アルキレンオキシド）のような重合体を活性化形態に変換し、この用語については当業者の知るとおりである。例えば反応基は末端反応基であり、これはアミノ、カルボキシルまたはチオール基のような蛋白上の化学部分とポリ（エチレングリコール）との間の結合を媒介する。典型的には、末端重合体ヒドロキシル末端基（即ちアルファおよびオメガ末端ヒドロキシル基）の一方または両方を共有結合コンジュゲーションを可能とする反応性の官能基に変換する。この方法は「活性化」と称する場合が多く、そして、反応基を有するポリ（エチレングリコール）産物は以後、「活性化されたポリ（エチレングリコール）」と称する。αおよびε連結基の両方を含む重合体は「ビス活性化されたポリ（エチレンオキシド）」と称し、「二官能性」と称する。αおよびε末端ヒドロキシル上に同じ反応基を含む重合体は場合により「ホモ二官能性」または「ホモビス活性化された」と称する。αおよびε末端ヒドロキシル上に異なる反応基を含む重合体は場合により「ヘテロ二官能性」（例えば国際特許出願ＷＯ０１／２６６９２参照）または「ヘテロビス活性化された」と称する。単一の反応基を含む重合体は「モノ活性化された」ポリアルキレンオキシドまたは「モノ官能性」と称する。他の実質的に非抗原性の重合体は同様に「活性化された」または「官能性付与された」ものである。
即ち活性化された重合体または反応性の重合体はα−またはε−アミノ、カルボキシルまたはチオール基のような蛋白の化学部分とポリ（エチレングリコール）との間の結合を媒介するために適している。ビス活性化された重合体はこの態様において蛋白分子２つと、または、別の実施形態においては蛋白分子１つおよび反応性の小分子と反応することにより効果的に蛋白重合体または蛋白−小分子コンジュゲートを交差結合を介して形成することができる。
ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体中に存在するリシンのアミノ末端α−アミノ基またはε−アミノ基のいずれかと反応できる官能基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（米国特許５,６７２,６６２号）；カーボネートエステル、例えばｐ−ニトロフェニルまたはスクシンイミジルエステル（米国特許５,８０８,０９６号、５,６５０,２３４号、５,６１２,４６０号、５,３２４,８４４号、５,１２２,６１４号）；カルボニルイミダゾール；アズラクトン（米国特許５,３２１,０９５号、５,５６７,４２２号）；環状イミドチオン（米国特許５,４０５,８７７号、５,３４９,００１号）；ジクロロトリアジン（米国特許５,１４７,５３７号）；イミデート（米国特許５,１０９,１２０号）またはチオイミデート；酸クロリド；イソシアネートまたはイソチオシアネート（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ Ｒ．Ｂ.，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ.，６０：３３１−３３６，１９９５）；トレシルクロリド（ＥＰ７１４４０２、ＥＰ４３９５０８）；ハロゲンホルメート（ＷＯ９６／４０７９２）、アルデヒド（米国特許４,００２,５３１号）またはアルデヒド水和物（米国特許５,９９０,２３７号）；およびカルボン酸と活性化剤、例えばＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ−（ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）またはイソブチルクロロホルメートの組み合わせを包含する（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ，２ｎｄ ｅｄ.，Ｍｉｋｌｏｓ Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｒｇ，Ｂｅｒｌｉｎｍ１９９３）。
ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体上のカルボン酸基、反応性カルボニル基および酸化炭水化物部分と反応することができる官能基は、第一級アミン；ならびにヒドラジンおよびヒドラジド官能基、例えばアシルヒドラジド、カルバゼート、セミカーバメート、チオカルバゼート等を包含する（ＷＯ０１／７０６８５）。
ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体上に存在する場合は、メルカプト基もまた、チオール、マレイミド、スルホンおよびフェニルグリオキサールのような反応基を有する適切に活性化された重合体に対する結合部位として使用でき、例えば米国特許５,０９３,５３１号を参照でき、これは参照により本明細書に組み込まれる。親電子中央部分と反応できる他の親核物質は例えば、それには限定されないが、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシル、チオール、活性メチレン等を包含する。
更にまた、米国特許５,３５９,０３０号および５,６８１,８１１号、５,４３８,０４０号および５,３５９,０３０号に開示されている親油性および親水性の部分を含む重合体も包含される。
同様に、蛋白にＰＥＧを直接共有結合させる、アミノ、チオール基および芳香族ヒドロキシル基と反応できるハロゲン化ＰＥＧもＷＯ９８／３２４６６に開示されている。
本発明の１つの好ましい実施形態においては、第二級アミンまたはアミド結合はｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体のＮ末端α−アミノ基またはリシンのε−アミノ基および活性化ＰＥＧを用いて形成される。本発明の別の好ましい実施形態においては、第二級アミン結合はＣｈａｍｏｗ ｅｔ ａｌ.，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：１３３−１４０（１９９４）および米国特許５,８２４,７８４号に記載の通り、ＮａＣＮＢＨ3、ＮａＢＨ4、ピリジンボラン等のような適切な還元剤を用いた還元によりｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体のＮ末端第一級α−またはε−アミノ基と単一または分枝鎖のＰＥＧアルデヒドとの間に形成される。
好ましい実施形態においては、ポリ（エチレングリコール）の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８３％、好ましくは少なくとも８４％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、そして、最も好ましくは少なくとも９８％が、アミノ末端α−アミノ基上にある。
本発明の別の好ましい実施形態においては、スクシンイミジルエステル、環状イミドチオン等のようなアミド形成リンカーにより活性化された重合体を用いることにより、ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体と重合体との間の連結を行い、例えば米国特許５,３４９,００１号、５,４０５,８７７号およびＧｒｅｅｎｗａｌｄ ｅｔ ａｌ.，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．１７：１０１−１６１，２０００を参照でき、これらは参照により本明細書に組み込まれる。ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の遊離アミノ基に結合できる好ましい活性化されたポリ（エチレングリコール）の１つは単一または分枝鎖のＮ−ヒドロキシスクシンイミドポリ（エチレングリコール）を包含し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドによりポリ（エチレングリコール）のコハク酸エステルを活性化することにより製造できる。
本発明の他の好ましい実施形態はε−アミノまたは他の基を介したｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体との重合体の共有結合を形成するために他の活性化重合体を使用することを包含する。例えば末端活性化された重合体のイソシアネートまたはイソチオシアネートの形態を用いてリジンアミノ基との尿素またはチオ尿素系結合を形成できる（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ Ｒ．Ｂ.，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ.，６０：３３１−３３６，１９９５）。
本発明の別の好ましい実施形態においては、参照により本明細書に組み込まれる米国特許５,１２２,６１４号、５,３２４,８４４号および５,６１２,６４０号に記載の通りカーバメート（ウレタン）結合を蛋白アミノ基と共に形成する。例としてはＮ−スクシンイミジルカーボネート、ｐ−ニトロフェニルカーボネートおよびカルボニルイミダゾール活性化重合体が挙げられる。本発明の別の好ましい実施形態においては、ＰＥＧのベンゾトリアゾールカーボネート誘導体がｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体のアミノ基に連結する。
本発明の別の特徴は、酵素的またはｐＨ指向性加水分解により予測的に分解されて遊離のｈＧＨもしくはそのアゴニスト変異体、または、他のｈＧＨもしくはそのアゴニスト変異体誘導体を放出することのできる官能性リンカーにより、ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体分子に結合したポリ（エチレングリコール）のような水溶性重合体を含むｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体のプロドラッグまたは除放性形態である。プロドラッグはまたカスケード潜伏性（ｃａｓｃａｄｅ ｌａｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を用いることを包含する「二重プロドラッグ」であってもよい（Ｂｕｎｄｇａａｒｄ， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ３：３９−６５，１９８９）。この系においては、加水分解反応には初期の律速（緩徐）酵素的またはｐＨ指向性の工程および第１の工程が起こった後にのみ起こる急速な非酵素的加水分解を含む第２の工程を包含する。このような放出可能な重合体は、ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体を持続的に排出する、非恒久的であり貯留槽として機能する蛋白コンジュゲートを与える。このような官能性リンカーは米国特許５,６１４,５４９号、５,８４０,９００号、５,８８０,１３１号、５,９６５,１１９号、５,９６５,５６５号、６,０１１,０４２号、６,１５３,６５５号、６,１８０,０９５号、６,４１３,５０７号、Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ Ｒ．Ｂ．ｅｔ ａｌ.，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４２：３６５７−３６６７，１９９９；Ｌｅｅ，Ｓ．ｅｔ ａｌ.，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ １２：１６３−１６９，２００１；Ｇａｒｍａｎ Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ.，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２２３：３６１−３６５，１９８７；Ｗｏｇｈｉｒｅｎ Ｃ．ｅｔ ａｌ.，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．４：３１４−３１８，１９９３；Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｍ．Ｊ.，ｅｔ ａｌ.，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８７；１４４０−１４４５，１９９８；Ｚｈａｏ Ｘ.，Ｎｉｎｔｈ Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｒｉｖａｒｙ Ｓｙｓｔ．１９９；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ ｅｔ ａｌ.，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．１７：１０１−１６１，２０００；Ｚａｌｉｐｓｋｙ ｅｔ ａｌ.，２８ｔｈ Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．Ｏｎ Ｃｏｎｃｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ １；７３−７４，２００１に記載されている。
ペギル化反応と称されるコンジュゲーション反応は歴史的には重合体のモル過剰量の溶液中、重合体の蛋白への結合部位を考慮することなく行われている。しかしながら、このような一般的な方法は、十分な生物活性を維持しつつ非抗原性重合体に生物活性蛋白をコンジュゲートするためには概して不十分であることがわかっている。ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の生物活性を維持するための１つの方法は、重合体カップリング過程において、ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の受容体結合部位に関わる反応性の基のコンジュゲーションを実質的に回避することである。本発明の別の様相は保持された活性の高い水準を維持しながらｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体にポリ（エチレングリコール）をコンジュゲートさせる方法を提供することである。
共有結合を介した化学修飾は活性化ポリ（エチレングリコール）と生物活性物質との反応において一般的に採用されているどのような適切な条件下においても実施できる。コンジュゲーション反応はｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の不活性化を回避するために、比較的穏やかな条件下で実施する。穏やかな条件とは反応溶液のｐＨを３〜１０の範囲に、そして反応温度を約０〜３７℃の範囲に維持することを包含する。ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体中の反応性アミノ酸残基が遊離のアミノ基を有する場合は、上記した修飾は好ましくは４〜３７℃で１〜４８時間、リン酸塩、ＭＥＳ、クエン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩またはＨＥＰＥＳを含む適切な緩衝液（ｐＨ３〜１０）で行う。ＰＥＧアルデヒドのような試薬を用いてＮ末端アミノ基をターゲティングする場合は、ｐＨ４〜８を維持することが好ましい。活性化されたポリ（エチレングリコール）はｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の遊離のアミノ基の数のモル量の約０.０５〜１００倍、好ましくは約０.０１〜２.５倍で使用できる。一方、ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の反応性アミノ酸残基が遊離のカルボキシル基を有する場合は、上記の修飾は好ましくは約３.５〜約５.５のｐＨで行い、例えば、ポリ（オキシエチレンジアミン）による修飾は４℃〜３７℃で１〜２４時間カルボジイミド（ｐＨ３.５〜５）の存在下に行う。活性化されたポリ（エチレングリコール）はｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の遊離のカルボキシル基の数のモル量の０.０５〜３００倍で使用できる。
別の実施形態においては、コンジュゲーション反応において使用される重合体の量の上限は約１.１から、高分子量物質種の実質的な量が形成されることなく活性化重合体とｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体とを反応させることの可能な範囲、即ちｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の分子当り重合体の鎖を約１個より多く含むコンジュゲートの約２０％超にまで拡張される。例えば本発明のこの様相において、約６：１までの比を用いて所望のコンジュゲートの実質的な量を形成し、これをその後あらゆる高分子量物質種から単離することができることが意図される。
本発明の別の実施形態において、二官能性の活性化ＰＥＧ誘導体を、複数のｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体分子をＰＥＧを介して交差結合させる重合体のｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体−ＰＥＧ分子を作成するために用いることができる。本明細書に記載した反応条件は実質的な量の未修飾のｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体を与える場合があるが、未修飾のｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体はその後のバッチで容易に再使用でき、別のコンジュゲーション反応に付すことができる。本発明の方法は、意外にも、高分子量物質種およびｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体分子当り重合体を鎖１個より多くを含む物質種を極めて少量、即ち約３０％未満、より好ましくは約１０％未満を生成させるのみである。これらの反応条件は、重合体コンジュゲーション反応のために典型的に使用されている活性化重合体が標的に対して数倍モル過剰量で存在するものとは対照的である。本発明の別の様相においては、重合体はアミノ基当り約０.１〜ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の等量当り約５０等量の量で存在する。本発明の別の様相においては、重合体はｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の等量当り約１〜約１０等量の量で存在する。
本発明のコンジュゲーション反応はまず、モノおよびジ−ＰＥＧ−ｈＧＨコンジュゲート、未反応のｈＧＨ、未反応の重合体および通常は約２０％未満の高分子量物質種を含有する反応混合物またはプールを与える。高分子量物質種は１個より多い重合体鎖および／または重合体化ＰＥＧ−ｈＧＨもしくはそのアゴニスト変異体の物質種を含有するコンジュゲートを含む。未反応の物質種および高分子量物質種が除去された後、主にモノおよびジ重合体−ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体コンジュゲートを含有する組成物を除去する。大部分のコンジュゲートが単一の重合体鎖を含むという事実に基づけば、コンジュゲートは実質的に均質である。これらの修飾されたｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体は、標準的なＦＤＣ−Ｐ１細胞増殖試験（Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ.，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７１：２１９６９−２１９７７，１９９６）、受容体結合試験（米国特許５,０５７,４１７号）、または下垂体切除ラットの成長（Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ.，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７１：２１９６９−２１９７７，１９９６）を用いて測定した場合、ネイティブまたは未修飾のｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体に関連するインビトロの生物学的活性の少なくとも約０.１％を有する。しかしながら、本発明の好ましい様相においては、修飾されたｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体はインビトロの生物学的活性の約２５％を有し、より好ましくは、修飾されたｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体はインビトロの生物学的活性の約５０％を有し、より好ましくは、修飾されたｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体はインビトロの生物学的活性の約７５％を有し、そして最も好ましくは、修飾されたｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体は同等かまたは向上したインビトロの生物学的活性を有する。
本発明の方法は好ましくはｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体に対してむしろ限定された比の重合体を包含する。即ち、ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体コンジュゲートは重合体の僅か１個の鎖を含有する物質種に主に限定されることがわかっている。更にまた、ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の反応基に対する重合体の結合は重合体リンカーのより高モル過剰量を使用する場合よりも実質的に低いランダム度となる。コンジュゲーション反応がクエンチングされた後に、反応プール中に存在する未修飾のｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体は、イオン交換またはサイズ排除クロマトグラフィーまたは同様の分離手法を用いて後の反応のために再利用することができる。
ポリ（エチレングリコール）修飾ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体、即ち本発明の化学修飾蛋白は、透析、塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、ゲルクロマトグラフィーおよび電気泳動のような蛋白の精製のために使用されている従来の方法により反応混合物から精製できる。イオン交換クロマトグラフィーは未反応のポリ（エチレングリコール）およびｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体を除去する際に特に有効である。本発明の更に別の実施形態において、モノおよびジ重合体−ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の物質種は高分子量の物質種および未修飾のｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体を除去するために反応混合物から単離される。分離はｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体−重合体コンジュゲートの約０.５〜１０ｍｇ／ｍｌを含有する緩衝液中に混合された物質種を入れることにより行われる。適切な溶液は約４〜約８のｐＨを有する。溶液は好ましくはＫＣｌ、ＮａＣｌ、Ｋ2ＨＰＯ4、ＫＨ2ＰＯ4、Ｎａ2ＨＰＯ4、ＮａＨ2ＰＯ4、ＮａＨＣＯ3、ＮａＢＯ4、ＣＨ3ＣＯ2ＨおよびＮａＯＨから選択される緩衝塩を１つまたは１つより多く含有する。
反応緩衝液に応じて、ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体重合体コンジュゲート溶液はまず緩衝液交換／限外濾過に付すことによりすべての未反応の重合体を除去しなければならない場合がある。例えば、ＰＥＧ−ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体コンジュゲート溶液を低分子量カットオフ（１０,０００〜３０,０００ダルトン）メンブレンを通して限外濾過することにより大部分の未反応重合体、界面活性剤、もし存在すればこれらに類したもののような望ましくない物質を除去することができる。
所望の物質種を含有するプールへのコンジュゲート分画は好ましくはイオン交換クロマトグラフィー媒質を用いて実施する。このような媒質は、ある程度予測可能な態様で変化する電荷の差を介してＰＥＧ−ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体コンジュゲートに選択的結合できる。例えば、ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の表面電荷は蛋白の表面上の使用可能な荷電された基の数により決定される。これ等の荷電された基は典型的にはポリ（アルキレンオキシド）重合体の潜在的な結合点として機能する。従って、ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体コンジュゲートは選択的単離を可能にするために、他の物質種とは異なる電荷を有することになる。
それぞれ第四級アミンまたはスルホプロピル樹脂のような強い極性のアニオンまたはカチオン交換樹脂を本発明の方法のために使用する。イオン交換樹脂が特に好ましい。本発明と共に使用する場合に適する市販のカチオン交換樹脂の非限定的な例はＳＰ−ｈｉｔｒａｐ(R)、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ(R) およびＳｅｐｈａｒｏｓｅ(R) ｆａｓｔ ｆｌｏｗである。他の適当なカチオン交換樹脂、例えばＳおよびＣＭ樹脂も使用できる。本発明と共に使用する場合に適する市販のアニオン交換樹脂をお含むアニオン交換樹脂の非限定的な例はＱ−ｈｉｔｒａｐ(R)、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ(R) およびＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ(R) ｆａｓｔ ｆｌｏｗである。他の適当なアニオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥ樹脂もまた使用できる。
例えば、アニオンまたはカチオン交換樹脂は好ましくはカラムに充填し、従来の方法で平衡化する。コンジュゲートしたｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の溶液と同じｐＨおよひ浸透圧を有する緩衝液を使用する。溶離用の緩衝液は好ましくはＫＣｌ、ＮａＣｌ、Ｋ2ＨＰＯ4、ＫＨ2ＰＯ4、Ｎａ2ＨＰＯ4、ＮａＨ2ＰＯ4、ＮａＨＣＯ3、ＮａＢＯ4および（ＮＨ4）2ＣＯ3から選択される塩１つまたは１つより多くを含有する。次にコンジュゲート含有溶液をカラム上に吸着させ、その際、未反応の重合体および一部の高分子量物質種は保持されないようにする。ローディングの終了時に、漸増塩濃度の溶離用緩衝液の勾配流動をカラムに適用することによりポリアルキレンオキシド−コンジュゲートｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の所望の画分を溶出させる。溶出しプールされた画分は好ましくはカチオンまたはアニオン交換分離工程の後の均一の重合体コンジュゲートに限定される。次にすべての未コンジュゲートのｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体分子種は従来の手法でカラムから洗い戻すことができる。所望により、モノおよびマルチペギル化されたｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体分子種は、別のイオン交換クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィーを介して更に相互に分離することができる。
漸増する塩濃度またはｐＨの多段定組成工程を利用した手法も用いてよい。漸増濃度の多段定組成溶離工程によりジ、次いでモノ−ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体重合体コンジュゲートの逐次的溶離が行われる。
溶離のための温度範囲は約４℃〜約２５℃である。好ましくは溶離は約４℃〜約２２℃の温度で行う。例えばＰＥＧ−ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の画分の溶離は２８０ｎｍのＵＶ吸光度により検出する。画分の採取は単純な時間溶離プロファイルを介して行ってよい。
界面活性剤をｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体部分にポリ（エチレングリコール）重合体をコンジュゲートする方法において使用することができる。適切な界面活性剤はドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のようなイオン型の物質を包含する。他のイオン系界面活性剤、例えばドデシル硫酸リチウム、第四級アンモニウム化合物、タウロコール酸、カプリル酸、デカンスルホン酸等もまた使用できる。非イオン系界面活性剤も使用できる。例えばポリ（オキシエチレン）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ）、ポリ（オキシエチレン）エーテル（Ｔｒｉｔｏｎ）のような物質を使用できる。Ｎｅｕｇｅｂａｕｅｒ， Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （１９９２） Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐ．も参照できる。本発明の方法において使用する界面活性剤に関する唯一の制約事項は、ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の実質的に不可逆的な変性を起こさず、そして重合体コンジュゲーションを完全に抑制しない条件下および濃度においてそれらを使用するという点である。界面活性剤は反応混合物中約０.０１〜０.５％；好ましくは０.０５〜０.５％；そして最も好ましくは約０.０７５〜０.２５％の量で存在する。界面活性剤の混合物もまた意図される。
界面活性剤は一時的な可逆的保護系を重合体コンジュゲーション過程の間に与えあると考えられる。界面活性剤はリシン系またはアミノ末端系のコンジュゲーションを進行させながら重合体の凝集を選択的に抑制する場合に有効であることがわかっている。
本発明のポリ（エチレングリコール）修飾ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体は恐らくはその延長されたインビボ半減期に起因すると考えられるより長時間持続する薬理学的作用を有する。
更にまた、本発明のポリ（エチレングリコール）修飾ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体は脳下垂体機能不全小人症（ＧＨＤ）、成人成長ホルモン欠乏症、Ｔｕｒｎｅｒ症候群、未熟児（ＳＧＡ）で出生した小児における成長障害、Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ症候群（ＰＷＳ）、慢性腎不全（ＣＲＩ）、ＡＩＤＳ消耗および加齢の治療のために有用である。
本発明のポリ（エチレングリコール）修飾ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体はこれを患者に投与するために、薬学手に許容される希釈剤、等張液を調製するための薬剤、ｐＨ調節剤等も含有する医薬品に製剤化することができる。
上記した医薬品は、治療の目的に応じて、皮下、筋肉内、静脈内、肺、皮内または経口投与してよい。用量は治療すべき患者の障害の種類および症状に基づくことができ、通常は成人に対して、注射の場合は０.１ｍｇ〜５ｍｇ、そして経口投与の場合は０.１ｍｇ〜５０ｍｇである。
包含される重合体物質はまた好ましくは室温で水溶性である。このような重合体の非限定的な例は、ポリ（アルキレンオキシド）単独重合体、例えばポリ（エチレングリコール）またはポリ（プロピレングリコール）、ポリ（オキシエチレン化ポリオール）、これ等の共重合体およびこれ等のブロック共重合体を包含するが、ただしブロック共重合体の水溶性は維持されなければならない。
ＰＥＧ系重合体の代替としては、効果的に非抗原性である物質、例えばデキストラン、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（ビニルアルコール）、炭水化物系重合体等を使用できる。実際、これ等の重合体物質のα−およびω末端基の活性化を、ポリ（アルキレンオキシド）を変換するために使用したものと同様の態様で行うことができ、即ちこれは当業者には明らかである。当業者の知るとおり、上記した例は説明を目的とするのみであり、本明細書に記載した性質を有する全ての重合体物質が意図される。本発明の目的のために、「効果的に非抗原性である」とは当該分野においては、非毒性であり哺乳類において明らかな免疫原性の応答を誘発しないものとする。
定義
略記法および本発明において互換に用いる相当する意味を以下に列挙する。
ｇ：グラム
ｍｇ：ミリグラム
ｍｌまたはｍＬ：ミリリットル
ＲＴ：室温
ＰＥＧ：ポリ（エチレングリコール）
本開示内において引用する全ての出版物、特許および特許出願の完全な内容は各個々の出版物、特許および特許出願が特定され個別に参照により組み込まれるものとして示されるものであるように、参照により本明細書に組み込まれる。
上記した発明は理解を明確化する目的のために説明および例示により幾分詳細に説明したが、本発明の精神および範囲を外れることなく変更や改変が可能であることは本発明の記載を参考にすれば当業者には明らかなことである。以下の実施例は例示を目的とするのみであり、上記した広範な意味において記載された本発明の範囲を限定する意図はない。
以下の実施例においてｈＧＨは配列番号１のものである。ポリペプチドのｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体のファミリーの他のメンバーもまた以下の実施例において例示する方法と同様にしてペギル化される。
本明細書において引用した全ての参考文献、特許または出願がそれらが本明細書内に記載されているように参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明を以下の実施例を参照することにより更に説明するが、これ等は本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１
直鎖２０,０００ＭＷ ＰＥＧ−ＡＬＤ ｈＧＨ
ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−ｈＧＨ
本実施例は還元的アルキル化によるＮ末端モノペギル化ｈＧＨの実質的に均質な調製物の作成のための方法を示す。約２０,０００ＭＷのメトキシ直鎖ＰＥＧプロピオンアルデ
ヒド試薬（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐ.）を、リシン残基のε−アミノ位における
第一級アミンのｐＫａ値に対する、Ｎ末端における第一級アミンの相対的ｐＫａ値が異なることを利用することにより、ｈＧＨのＮ末端に還元的アミノ化を介して選択的にカップリングさせた。２５ｍＭ ＭＥＳ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，
ＭＯ）ｐＨ６.０、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）ｐＨ７.０、または、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）ｐＨ４.５中に、１０ｍｇ／ｍＬで溶解したｈＧＨ蛋白
をメトキシ−ＰＥＧ−プロピオンアルデヒド、即ちＭ−ＰＥＧ−ＡＬＤ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐ.，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）と、Ｍ−ＰＥＧ−ＡＬＤの添加により反応させ、アミン当り０.１：０.７の相対的ＰＥＧ：ｈＧＨモル比とした（場合により８％アセトニトリルを添加してよい）。反応は終濃度１０〜５０ｍＭとなるように水中に溶解した保存用１Ｍ ＮａＣＮＢＨ4（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加することにより触媒した。反応は１８〜２４時間、４℃〜ＲＴで暗所において実施した。反応は１Ｍ Ｔｒｉｓ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）〜ｐＨ７.６を最終Ｔｒｉｓ濃度５０ｍＭとなるように添加することにより停止するか、または適切な緩衝液中に即時精製のために希釈した。
実施例２
直鎖３０,０００ＭＷ ＰＥＧ−ＡＬＤ1 ｈＧＨ
メトキシ直鎖３０,０００ＭＷ ＰＥＧ−プロピオンアルデヒド試薬（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐ.）を実施例１に記載した操作法を用いてｈＧＨのＮ末端にカップリングさせた。
実施例３
直鎖５,０００ＭＷ ＰＥＧ−ＡＬＤ ｈＧＨ
メトキシ直鎖５,０００ＭＷ ＰＥＧ−プロピオンアルデヒド試薬（Ｆｌｕｋａ）を実施例１に記載した操作法を用いてｈＧＨのＮ末端にカップリングさせた。
実施例４
分枝鎖４０,０００ＭＷ ＰＥＧ−ＡＬＤ ｈＧＨ
Figure 2006516263
 メトキシ分枝鎖４０,０００ＭＷ ＰＥＧ−アルデヒド（ＰＥＧ２−ＡＬＤ）試薬（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐ.）を実施例１に記載した操作法を用いてｈＧＨのＮ末端にカップリングさせた。
実施例５
分枝鎖２０,０００ＭＷ ＰＥＧ−ＡＬＤ ｈＧＨ
メトキシ分枝鎖２０,０００ＭＷ ＰＥＧ−アルデヒド（ＰＥＧ２−ＡＬＤ）試薬（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐ.）を、アミン当り０.１〜０.５のＰＥＧのｈＧＨに対するモル比を用いながら、実施例１に記載した操作法を用いてｈＧＨのＮ末端にカップリングさせた。
実施例６
直鎖３０,０００ＭＷ ＳＰＡ−ＰＥＧ ｈＧＨ
Figure 2006516263
 本実施例はＮ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）活性エステルを用いたモノペギル化ｈＧＨの実質的に均質な調製物の作成のための方法を示す。ｈＧＨ蛋白保存溶液を０.２５Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７.２中に１０ｍｇ／ｍＬで溶解した（場合により８％アセトニトリルを添加してよい）。次に溶液をメトキシ−ＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ−ＰＥＧ）と、ＳＰＡ−ＰＥＧ添加により反応させ、アミン当り０.１〜０.６５の相対的ＰＥＧ：ｈＧＨモル比とした。反応は５分〜１時間、４℃〜ＲＴで実施した。０.１Ｎ酢酸でｐＨを４.０まで低下させるか、または、Ｔｒｉｓ ＨＣｌの５×モル過剰量を添加することにより反応を停止した。
実施例７
直鎖２０,０００ＭＷ ＳＰＡ−ＰＥＧ ｈＧＨ
直鎖の２０,０００ＭＷ ＳＰＡ−ＰＥＧ試薬（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐ.）を実施例６に記載した操作法を用いてｈＧＨのＮ末端にカップリングさせた。
実施例８
直鎖３,４００ＭＷビオチン−ＳＰＡ−ＰＥＧ−ｈＧＨ
Figure 2006516263
 ３,４００ＭＷのビオチン−ＰＥＧ−ＣＯ2−ＮＨＳ試薬（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐ.）を実施例６に記載した操作法を用いてｈＧＨにカップリングさせた。
実施例９
分枝鎖１０,０００ＭＷ ＮＨＳ−ＰＥＧ−ｈＧＨ
Figure 2006516263
 １０,０００ＭＷの分枝鎖ＰＥＧ２−ＮＨＳ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐ.）を実施例６に記載した操作法を用いてｈＧＨにカップリングさせた。
実施例１０
分枝鎖２０,０００ＭＷ ＮＨＳ−ＰＥＧ−ｈＧＨ
２０,０００ＭＷの分枝鎖ＰＥＧ２−ＮＨＳ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐ.）を実施例６に記載した操作法を用いてｈＧＨにカップリングさせた。
実施例１１
分枝鎖４０,０００ＭＷ ＮＨＳ−ＰＥＧ−ｈＧＨ
４０,０００ＭＷの分枝鎖ＰＥＧ２−ＮＨＳ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐ.）を実施例６に記載した操作法を用いてｈＧＨにカップリングさせた。
実施例１２
直鎖２０,０００ＭＷ ＰＥＧ−ＢＴＣ−ｈＧＨ
Figure 2006516263
 ２０,０００ＭＷのＰＥＧ−ＢＴＣ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐ.）を実施例６に記載した操作法を用いてｈＧＨにカップリングさせる。この実施例はＰＥＧのベンゾトリアゾールカーボネート誘導体を用いたペギル化ｈＧＨの実質的に均質な調製物の作成のための方法を示す。
実施例１３
直鎖５,０００ＭＷ ＰＥＧ−ＳＳ−ｈＧＨ
Figure 2006516263
 ５,０００ＭＷのスクシンイミジルスクシネート−ＰＥＧ（ＳＳ−ＰＥＧ）（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐ.）を実施例６に記載した操作法を用いてｈＧＨにカップリングさせる。この実施例は加水分解可能な結合を用いたペギル化ｈＧＨの実質的に均質な調製物の作成のための方法を示す。
実施例１４
直鎖２０,０００ＭＷ ＰＥＧ−ＣＭ−ＨＢＡ−ｈＧＨ
Figure 2006516263
 ２０,０００ＭＷのカルボキシメチルヒドロキシ酪酸−ＰＥＧ（ＣＭ−ＨＢＡ−ＰＥＧ）（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐ.）を実施例６に記載した操作法を用いてｈＧＨにカップリングさせた。この実施例は加水分解可能な結合を用いたペギル化ｈＧＨの実質的に均質な調製物の作成のための方法を示す。
実施例１５
直鎖２−４×５,０００ＭＷ ＰＥＧ−ＣＭ−ＨＢＡ−ｈＧＨ
５,０００ＭＷのＰＥＧ−ＣＭ−ＨＢＡ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐ.）を実施例１３に記載した操作法を用いてｈＧＨにカップリングさせた。
実施例１６
直鎖２０,０００ＭＷ ＨＺ−ＰＥＧ ｈＧＨ
Figure 2006516263
 本実施例は２０,０００ＭＷメトキシ−ＰＥＧ−ヒドラジド、ＨＺ−ＰＥＧ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐ.）を用いたペギル化ｈＧＨの実質的に均質な調製物の作成のための方法を示す。ｈＧＨ蛋白保存溶液を１０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ４.０中に１０ｍｇ／で溶解した。次に溶液をＨＺ−ＰＥＧと固体の添加により反応させ、カルボキシ基当り０.１〜５.０の相対ＰＥＧ：ｈＧＨモル比とした。反応は２ｍＭ〜４ｍＭの終濃度でカルボジイミド（ＥＤＣ、ＥＯＡＣ、ＥＤＥＣ）で触媒した。反応は２時間〜終夜、４℃で、または、１０分〜終夜、室温で実施した。カチオン交換精製により未コンジュゲートのＰＥＧおよびカルボジイミドを除去することにより反応を停止した。
実施例１７
多重ペギル化分子種
結合したＰＥＧが２つ以上である（多重ペギル化）修飾ｈＧＨもまた実施例１および４から得られ、そしてアニオン交換クロマトグラフィーによりモノペギル化分子種から分離した。結合したＰＥＧが２つ以上である（多重ペギル化）修飾ｈＧＨはまたカチオン交換クロマトグラフィーによりモノペギル化分子種から分離される。
結合したＰＥＧが２つ以上である（多重ペギル化）修飾ｈＧＨはまた実施例２、３、５〜１３から得られ、そして、実施例１および４と同様の態様で精製される。
実施例１８
ペギル化ｈＧＨの精製
ペギル化ｈＧＨ分子種を単一のイオン交換クロマトグラフィー工程を用いて＞９５％（ＳＥＣ分析）まで反応混合物から精製した。
アニオン交換クロマトグラフィー
ＰＥＧｈＧＨ分子種を単一のアニオン交換クロマトグラフィー工程を用いて＞９５％（ＳＥＣ分析）まで反応混合物から精製した。モノペギル化ｈＧＨはアニオン交換クロマトグラフィーを用いて未修飾ｈＧＨおよび多重ペギル化ｈＧＨ分子種から精製した。上記した典型的な２０ＫのアルデヒドｈＧＨ混合物（５〜１００ｍｇ蛋白）は２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.３（緩衝液Ａ）で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｔｒａｐカラム（１または５ｍＬ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）またはＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔ ｆｌｏｗカラム（２６／２０、７０ｍＬ床容量）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）上で精製した。反応混合物を緩衝液Ａで５〜１０×稀釈し、２.５ｍＬ／分の流量でカラム上にロードした。カラムを緩衝液Ａの８カラム容量で洗浄した。その後、種々のｈＧＨ分子種を緩衝液Ａの８０〜１００カラム容量および０〜１００ｍＭのＮａＣｌ線形勾配で溶離した。溶離液を２８０ｎｍの吸光度（Ａ280）によりモニタリングし、５ｍＬ画分を収集した。画分をペギル化の程度、例えばモノ、ジ、トリ等によりプールした（実施例１５において評価したように）。次にプールをＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐＹＭ１０濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ，Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｔｈｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）中で０.５〜５ｍｇ／ｍＬマイクロディセクション濃縮した。プールの蛋白濃度を０.７８の吸光係数を用いてＡ280により求めた。この方法から精製されたモノ２０Ｋ ＰＥＧ−アルデヒドｈＧＨの総収率は２５〜３０％であった。
カチオン交換クロマトグラフィー
カチオン交換クロマトグラフィーは１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４.０（緩衝液Ｂ）で平衡化させたＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ高性能カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＸＫ２６／２０，７０ｍｌ床容量）上で実施する。反応混合物を緩衝液Ｂで１０×稀釈し、５ｍＬ／分の流量でカラム上にロードする。次にカラムを緩衝液Ｂの５カラム容量、次いで１２％緩衝液Ｃ（１０ｍＭアセテート、ｐＨ４.５、１Ｍ ＮａＣｌ）の５カラム容量で洗浄する。その後、ＰＥＧ−ｈＧＨ分子種を２０カラム容量の１２〜２７％緩衝液Ｃの線形勾配を用いてカラムから溶離する。溶離液は２８０ｎｍでモニタリングし、１０ｍＬ画分を収集する。画分をペギル化の程度（モノ、ジ、トリ等）に従ってプールし、１０ｍＭ酢酸塩、ｐＨ４.５中に交換し、Ａｍｉｃｏｎ ＹＭ１０膜を装着した攪拌セル中で１〜５ｍｇ／ｍＬに濃縮する。プールの蛋白濃度を０.７８の吸光係数を用いてＡ２８０で測定する。この方法から得られるモノペギル化ｈＧＨの総収率は１０〜５０％である。
実施例１９
生化学的特徴付け
精製したペギル化ｈＧＨプールを還元型および非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、非変性および変性サイズ排除クロマトグラフィー、分析アニオン交換クロマトグラフィー、Ｎ末端配列決定、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび逆相ＨＰＬＣにより特徴付けた。
サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）
ｈＧＨに対して種々の結合化学状態、大きさ、リンカーおよび幾何学的状態のメトキシ−ＰＥＧの反応、アニオン交換精製プールおよび最終精製生成物を非変性ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて評価した。分析非変性ＳＥＣ−ＨＰＬＣはＴｏｓｏｈａａｓＧ４０００ＰＷＸＬカラム、７.８ｍｍ×３０ｃｍ（Ｔｏｓｏｈａａｓ Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、または、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて２０ｍＭホスフェート、ｐＨ７.２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中、流量０.５ｍＬ／分で行った。ペギル化により蛋白の水力学的容量は大きく増大し、より早い保持時間へのシフトが起こった。新しい物質種は未修飾ｈＧＨと共に、ＰＥＧアルデヒドｈＧＨ反応混合物中で観察された。これ等のペギル化および非ペギル化分子種はＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー上で分離し、得られた精製モノＰＥＧ−アルデヒドｈＧＨ分子種はその後非変性ＳＥＣ上で単一のピークとして溶出することがわかった（＞９５％純度）。Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー工程は遊離のＰＥＧ、ｈＧＨおよび多重ペギル化ｈＧＨ分子種をモノペギル化ｈＧＨから効果的に除去した。非変性ＳＳＥＣ−ＨＰＬＣは、種々のペギル化ｈＧＨの効果的な大きさはその対応する理論的な分子量よりもはるかに大きいことを示していた（表１）。
Figure 2006516263
変性ＳＥＣ−ＨＰＬＣ
ｈＧＨとの種々のメトキシ−ＰＥＧの反応、アニオン交換精製、および最終精製生成物を変性ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて試験した。分析変性ＳＳＥＣ−ＨＰＬＣはＴｏｓｏｈａａｓ ３０００ＳＷＸＬカラム、７.８ｍｍ×３０ｃｍ（Ｔｏｓｏｈａａｓ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて１００ｍＭリン酸塩、ｐＨ６.８、０.１％ＳＤＳ中、流量０.８ｍＬ／分で行った。ペギル化により蛋白の水力学的容量が大きく増大し、より早い保持時間へのシフトが起こった。新しい物質種は未修飾ｈＧＨと共に２０Ｋ ＰＥＧアルデヒドｈＧＨ反応混合物中で観察された。これ等のペギル化および非ペギル化分子種はＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー上で分離し、得られた精製モノ２０Ｋ ＰＥＧ−アルデヒドｈＧＨはその後、非変性ＳＥＣ上で単一のピークとして溶出することがわかった（＞９５％純度）。Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー工程は遊離のＰＥＧ、ｈＧＨおよび多重ペギル化ｈＧＨ分子種をモノペギル化ｈＧＨから効果的に除去した。
ＳＥＳ ＰＡＧＥ／ＰＶＤＦ転移
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてｈＧＨとの種々のＰＥＧ試薬の反応および精製された最終生成物を試験した。この手法の例はモノ２０Ｋ直鎖または分枝の２０Ｋおよび４０ＫのＰＥＧアルデヒド、および、４×６ ５Ｋ ＳＰＡ ＰＥＧと共に示す（図１および２）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは１ｍｍ厚みの１０〜２０％Ｔｒｉｓトリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）上で、還元型および非還元型の条件下で行い、そして、Ｎｏｖｅｘ Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ＣｏｏｍａｓｓｉｅＴＭ Ｇ−２５０染色キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて染色した。精製したモノＰＥＧ−アルデヒドｈＧＨ物質種はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で１つの大型のバンドとして移動する。後のＮ末端配列の同定のためにバンドをＰＶＤＦメンブレンにブロッティングした。
分析アニオン交換ＨＰＬＣ
分析アニオン交換ＨＰＬＣを用いてｈＧＨとの種々のｍＰＥＧの反応、アニオン交換精製画分、および、最終精製生成物を試験した。分析アニオン交換ＨＰＬＣはＴｏｓｏｈａａｓ Ｑ５ＰＷまたはＤＥＡＥ−ＰＷアニオン交換カラム、７.５ｍｍ×７５ｍｍ（Ｔｏｓｏｈａａｓ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔｗａｙ，ＮＪ）を用いて、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８.６中、流量１ｍＬ／分で実施した。試料は５〜２００ｍＭ、ＮａＣｌの線形勾配で溶離した。
逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）
ＰＥＧ−ＧＨ反応混合物、および、精製されたペギル化生成物をＲＰ−ＨＰＬＣで分析することによりｈＧＨ物質種、モノおよび多重ペギル化ｈＧＨ分子種を解明し、そして、酸化ｈＧＨ型と同時に種々の部位（例えばＮ末端ｖｓリシンε−アミノ基）において連結した単一のＰＥＧを有するＰＥＧ、ｈＧＨアイソフォームをモニタリングした。ＲＰ−ＨＰＬＣはＺｏｒｂａｘ、ＳＢ−ＣＮ１５０または２５０ｍｍ×４.６ｍｍ（３.５ｍｍまたは５ｍｍ）逆相ＨＰＬＣカラムを利用して実施した。実験は、試料当り蛋白１０ｍｇの典型的な負荷量に対して、周囲温度で実施した。緩衝液Ａは、水中０.１％トリフルオロ酢
酸；緩衝液Ｂは、アセトニトリル中０.１％トリフルオロ酢酸とする。分当りＢを1／2％増大させる勾配は以下の通りである。
Figure 2006516263
Ｎ末端配列およびペプチドのマッピング
自動化エドマン分解化学法を用いてＮＨ２末端蛋白配列を決定した。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４９４型Ｐｒｏｃｉｓｅシーケンサー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ）を用いて分解を行った。該当するＰＴＨ−ＡＡ誘導体をＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｉｍｅｒ／Ｂｒｏｗｎｌｅｅ２.１ｍｍ内径 ＰＴＨ−Ｃ１８カラムを装着したＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ １４０Ｃ型ＰＴＨ分析器を用いた、オンライン方式のＲＰ−ＨＰＬＣにより同定した。ＰＶＤＦメンブレンに移行させた２０Ｋ直鎖および２０および４０Ｋ分枝鎖のＰＥＧ−ＡＬＤｈＧＨ蛋白バンド、または、精製された２０Ｋの直鎖または分枝鎖の２０および４０ＫのＰＥＧ−ＡＬＤｈＧＨの溶液を、配列決定した。精製された２０Ｋ直鎖ＰＥＧ−ｈＧＨはＮ末端アミノ酸が無いこと以外はｈＧＨの予測配列を有していた大きいシグナル（約８８％収率）を示す精製２０Ｋ直鎖ＰＥＧ−ｈＧＨが観察された。この結果はアルデヒド化学を介してＮ末端ペギル化された蛋白について予測されたとおりである。第１のサイクルの残留物は結合ＰＥＧ部分のため回収不可能である。小さいシグナル（約１２％収率）は正しいＮ末端アミノ酸配列を有していた。ＲＰ−ＨＰＬＣで収集されたピークが１００％ペギル化されることを考慮すると、これ等のデータはＰＥＧ修飾のほぼ８８％がＮ末端で起こり、残余は見かけ上は数個の可能なリシン残基の１つに連結していることが示唆される。
トリプシン消化を１ｍｇ／ｍＬの濃度で実施し、そして典型的には物質５０μｇを一消化当り使用した。トリプシンはトリプシンのＰＥＧ−ｈＧＨに対する比が１：３０（ｗ／ｗ）となるように添加した。トリス緩衝液は３０ｍＭ、ｐＨ７.５で存在させた。試料を１６±０.５時間室温でインキュベートした。消化用溶液ｍＬ当り１Ｎ ＨＣｌ ５０μＬを添加することにより、反応をクエンチングした。試料はオートサンプラーに入れる前に６.２５％アセトニトリル中に０.２５ｍｇ／ｍｌの終濃度まで希釈した。アセトニトリルをまず添加し（１９.８％アセトニトリルとなるまで）、穏やかに混合し、次に水を最終容量（出発容量の４倍）となるまで添加する。過剰な消化溶液を除去し、−２０℃で１週間まで保存できる。
Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９５ＨＰＬＣシステムを分析のために用いたが、他のシステムでも同様の結果が得られるはずである。使用したカラムはＡｓｔｅｃ Ｃ−４重合体の２５ｃｍ×４.６ｍｍカラム、粒径５μｍとした。実験は試料当り蛋白５０μｇの典型的な負荷量に対して周囲温度で実施した。緩衝液Ａは、水中０.１％トリフルオロ酢酸；緩衝液Ｂは、アセトニトリル中０.０８５％トリフルオロ酢酸とした。勾配は以下の通りである。
Figure 2006516263
カラムを加熱ジャケットを用いて４０℃まで加熱する。Ｗａｔｅｒｓ ９９６ ＰＤＡ検出器を用いてピークを検出し、２１０〜３００ｎｍの間でデータを収集した。２１４ｎｍで得られたクロマトグラムを用いて試料を分析することにより表２に示すＮ末端ペギル化（Ｔ−１フラグメントの消失）の範囲を求めた。
Figure 2006516263
実施例２０
薬力学的試験
下垂体切除ラットにおける薬効試験
Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｓにおいて下垂体切除された雌性Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットを７〜１０日間成長速度に関して予備スクリーニングした。その後成長試験を１１日間実施した。ラットは６〜８匹の群に分割した。群１は毎日または第０日および第６日の何れかに溶媒を皮下投与した。群２には毎日ＧＨ（０.３ｍｇ／ｋｇ／投与）を皮下投与した。群３には第０日および第６日にＧＨを皮下投与した（１.８ｍｇ／ｋｇ／投与）。群４には第０、６日にＰＥＧ−ＧＨを皮下投与した（１.８ｍｇ／ｋｇ／投与）。下垂体切除ラットは試験期間中少なくとも一日おきに計量することにより体重増加をモニタリングした。１週当り１回２０Ｋ ＰＥＧ−ＡＬＤ ｈＧＨ、２０Ｋおよび４０Ｋの分枝ＰＥＧ−ＡＬＤ ｈＧＨおよび４〜６×５ＰＥＧ−ＳＰＡ ｈＧＨに関する体重増加（平均±ＳＥＭ）はｈＧＨの毎日投与の場合と類似であった（図３および４）。表３はｈＧＨの毎日投与と比較した場合の種々のペギル化ｈＧＨ分子の週当たり１回投与の場合の第１１日における総体重増加（平均±ＳＥＭ）をまとめたものである。
Figure 2006516263
各成長試験の終了時に動物を屠殺して骨（脛骨）の長さを分析した。図６は第０日および第６日に投与した種々のＰＥＧ−ＧＨコンジュゲート、または、毎日投与のｈＧＨに応答した、第１１日における脛骨長さ（平均±ＳＥＭ）の変化を示す。
下垂体切除ラットにおけるＩＧＦ−１濃度
実験は体重増加試験に関して上記したとおりに実施したが、血液試料は第０、１、２、３、４、５および第９日の動物屠殺時に採取した。ＩＧＦ−１濃度はＥＬＩＳＡで測定した。図７はｈＧＨの毎日投与、または、ｈＧＨの単回投与、または、ペギル化ｈＧＨの第０、６日投与の何れかの後の下垂体切除ラットにおける血清中ＩＧＦ−１濃度（平均±ＳＥＭ）の増加を示す。
薬物動態試験
薬物動態試験は正常Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雄性ラット、マウスおよびカニクイザルにおいて行った。注射は１.８ｍｇ／ｋｇの単回皮下投与として、または、１.０ｍｇ／ｋｇの単回ｉｖ投与として、ＧＨまたはＰＥＧ−ＧＨをラットおよびマウスに対し、群当りラット６匹およびマウス６０匹以下を用いて行った。カニクイザルについては、０.１８ｍｇ／ｋｇのＧＨまたはＰＥＧ−ＧＨを単回皮下投与およびｉｖ投与の両方につき、群当りサル２〜４匹を用いて行った。血液試料は該当するＰＫパラメーターの評価に適するものとして１〜５日間に渡り採取した（表４）。（ｔ1／2）＝最終半減期、（Ｃｌ）＝クリアランス、（Ｔｍａｘ）＝最高濃度到達時間、Ｖｓｓ＝定常状態における体積分布（見掛け）、および（Ｃｍａｘ）＝最高濃度のＧＨおよびＰＥＧ−ＧＨ血中濃度をイムノアッセイにより各試料採取時にモニタリングした。
ｈＧＨイムノアッセイ
ラット、マウスおよびカニクイザルの血漿中のｈＧＨおよびペギル化ｈＧＨ蛋白濃度を適切なＰＥＧｈＧＨを用いながらｈＧＨ ＡｕｔｏＤＥＬＦＩＡキット蛍光イムノアッセイ（ＰｅｒｌｏｍＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて測定し、標準曲線を作成した。
Figure 2006516263
ｈＧＨと２０ＫＰＥＧ−ＡＬＤの反応生成物およびアニオン交換精製された２０Ｋ ＰＥＧ−ＡＬＤ ｈＧＨの還元型および非還元型のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の写しである。 種々のアニオン交換精製ペギル化ｈＧＨ分子の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の写しである。 ｈＧＨ、４０Ｋ Ｂｒ ＰＥＧ−ＡＬＤ ｈＧＨおよび４０Ｋ Ｂｒ ＰＥＧ−ＮＨＳ ｈＧＨのトリプシン消化物のＲＰ−ＨＰＬＣ溶出プロフィルの写しを示す。 １日間の期間中の下垂体切除ラットにおける体重増加を示すことにより、６日おきに１回皮下（ＳＣ）投与（１.８ｍｇ／ｋｇ）されたモノＰＥＧ化ｈＧＨに対して毎日投与（０.３ｍｇ／ｋｇ／日）された非ＰＥＧ化ｈＧＨのインビボでの生物活性を比較したものである。 １１日間の期間中の下垂体切除ラットにおける体重増加を示すことにより、６日おきに１回ＳＣ投与（１.８ｍｇ／ｋｇ）された４−６×５Ｋ ＰＥＧ−ＳＰＡ−ｈＧＨ、モノＰＥＧ化２０Ｋ分枝鎖ＰＥＧ−ＡＬＤｈＧＨ、およびモノＰＥＧ化４０Ｋ分枝鎖ＰＥＧ−ＡＬＤｈＧＨに対して毎日ＳＣ投与（０.３ｍｇ／ｋｇ／日）された非ＰＥＧ化ｈＧＨのインビボの生物活性を比較したものである。 １１日間の期間中の下垂体切除ラットにおける脛骨生育の増加を示すことにより６日おきに１回ＳＣ投与（１.８ｍｇ／ｋｇ）された４−６×５Ｋ ＰＥＧ−ＣＭＨＢＡ−ｈＧＨ、モノＰＥＧ化２０Ｋ直鎖ＡＬＤ、モノＰＥＧＰＥＧ化３０Ｋ直鎖ＡＬＤ、モノＰＥＧ化２０Ｋ分枝鎖ＰＥＧ−ＡＬＤ ｈＧＨおよびモノ化４０Ｋ分枝鎖ＰＥＧ−ＡＬＤ ｈＧＨに対して毎日ＳＣ投与（０.３ｍｇ／ｋｇ／日）された非ＰＥＧ化ｈＧＨのインビボの生物活性を比較したものである。 ９日間の期間中の下垂体切除ラットにおける血漿中ＩＧＦ−１濃度の増加を示すことにより，単回１.８ｍｇ／ｋｇ ＳＣ投与した非ＰＥＧ化ｈＧＨ、モノＰＥＧ化５Ｋ直鎖ＰＥＧ−ＡＬＤ ｈＧＨ、モノＰＥＧ化２０Ｋ直鎖ＰＥＧ−ＡＬＤ ｈＧＨ、モノＰＥＧ化２０Ｋ分枝鎖ＰＥＧ−ＡＬＤ ｈＧＨ、モノＰＥＧ化２０Ｋ直鎖ＰＥＧ−ヒドラジドｈＧＨ、モノＰＥＧ化３０Ｋ直鎖ＰＥＧ−ＡＬＤ ｈＧＨ、モノＰＥＧ化４０Ｋ分枝鎖ＰＥＧ−ＡＬＤ ｈＧＨ、４−６×５Ｋ ＰＥＧＳＰＡ ｈＧＨ、４−６×５Ｋ ＰＥＧ−ＣＭＨＢＡ ｈＧＨを比較したものである。 化学修飾されたｈＧＨは未修飾のｈＧＨよりも長時間持続するｈＧＨ活性を有することを示す。

Claims (82)

  1. 生物学的に活性なヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリペプチドまたはそのアゴニスト変異体のアミノ酸残基少なくとも１つにおいて、共有結合した水溶性重合体分子少なくとも１つを含むコンジュゲート。
  2. ｈＧＨポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１記載のコンジュゲート。
  3. 重合体がポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（オレフィン系アルコール）、ポリ（アクリロイルモルホリン）、ポリ（オキサゾリン）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、デキストランおよびこれらの誘導体よりなる群から選択される、請求項１または２記載のコンジュゲート。
  4. ポリ（アルキレンオキシド）分子がポリ（エチレングリコール）分子である、請求項３記載のコンジュゲート。
  5. ポリ（エチレングリコール）が遊離のアミノ基、カルボキシル基またはスルフヒドリル基を有するアミノ酸残基においてポリペプチドに結合している、請求項４記載のコンジュゲート。
  6. 活性化ポリ（エチレングリコール）を用いて形成された、請求項５記載のコンジュゲート。
  7. 活性化ポリ（エチレングリコール）が反応性官能基を有する、請求項６記載のコンジュゲート。
  8. 結合が遊離のアミノ基を有する該ポリペプチドのアミノ酸において行われる、請求項７記載のコンジュゲート。
  9. 反応性官能基がカーボネートエステル、カルボン酸の活性エステル、ジクロロトリアジン、トレシレート、アズラクトン、環状イミデチオン、イソシアネートまたはイソチオシアネート、イミデート、チオイミデート、カルボニルジイミダゾール、アルデヒド、アルデヒド水和物、酸クロリドおよびカルボン酸よりなる群から選択され、ここで該カルボン酸はジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ−（ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド、ジフェニルホスホリルアジド、イソブチルクロロホルメートおよびエチルクロロホルメートよりなる群から選択される活性化剤の存在下にある、請求項８記載のコンジュゲート。
  10. 反応性官能基がカーボネートエステルまたはカルボニルジイミダゾールである、請求項９記載のコンジュゲート。
  11. 活性化ポリ（エチレングリコール）が下記式：
    Figure 2006516263
     よりなる群から選択される、請求項１０記載のコンジュゲート。
  12. 下記式：
    Figure 2006516263
     ［式中、Ｒはヒト成長ホルモンポリペプチドである］の請求項１１記載のコンジュゲート。
  13. ヒト成長ホルモンポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１２記載のコンジュゲート。
  14. 反応性官能基が環状イミデチオンである、請求項９記載のコンジュゲート。
  15. 活性化ポリ（エチレングリコール）が下記式：
    Figure 2006516263
     ［式中、Ｌは−Ｏ−、−ＮＨ−、−ＯＣＨ2−、−ＮＨ−ＣＯ（ＣＨ2）n−、−ＮＨ−ＣＯ（ＣＨ2）nＯ−、−ＣＯ−ＮＨ（ＣＨ2）n−、−Ｓ−、−ＣＯ−ＮＨ（ＣＨ2）nＯ−、−Ｏ（ＣＨ2）nＯ−、−Ｏ（ＣＨ2）n−、−ＳＣＨ2ＣＨ2−、および−ＮＨ（ＣＨ2）n−よりなる群から選択される］よりなる群から選択される、請求項１４記載のコンジュゲート。
  16. 反応性官能基がアズラクトンである、請求項９記載のコンジュゲート。
  17. 活性化ポリ（エチレングリコール）が下記式：
    Figure 2006516263
     ［式中、
    Ｒ1は水素、アルキル、シクロアルキル、炭素環および複素環の芳香族環、α、β−不飽和アルキルよりなる群から選択され；そして、
    Ｒ2およびＲ3は独立して水素、アルキル、アリールおよびアルキルアリールから選択される］よりなる群から選択される、請求項１６記載のコンジュゲート。
  18. 官能基がイソシアネートまたはイソチオシアネートである、請求項９記載のコンジュゲート。
  19. 活性化ポリ（エチレングリコール）が下記式：
    ｍＰＥＧ−Ｎ＝Ｃ＝ＯおよびｍＰＥＧ−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ
    よりなる群から選択される、請求項１８記載のコンジュゲート。
  20. 下記式：
    Figure 2006516263
     ［式中、Ｒはヒト成長ホルモンポリペプチドである］よりなる群から選択される式の請求項１９記載のコンジュゲート。
  21. 官能基がアルデヒド、アセタールアルデヒドまたはアルデヒド水和物である、請求項９記載のコンジュゲート。
  22. 活性化ポリ（エチレングリコール）が下記式：
    Figure 2006516263
     ［式中、ＸはＯまたはＳである］よりなる群から選択される、請求項２１記載のコンジュゲート。
  23. 下記式：
    Figure 2006516263
     ［式中、Ｒはヒト成長ホルモンポリペプチドである］よりなる群から選択される式の請求項２２記載のコンジュゲート。
  24. 反応性官能基がカルボン酸の活性エステルである、請求項９記載のコンジュゲート。
  25. 活性化ポリ（エチレングリコール）が下記式：
    Figure 2006516263
    Figure 2006516263
    Figure 2006516263
     よりなる群から選択される、請求項２４記載のコンジュゲート。
  26. 下記式：
    Figure 2006516263
     ［式中、Ｒはヒト成長ホルモンポリペプチドである］よりなる群から選択される式の請求項２５記載のコンジュゲート。
  27. ヒト成長ホルモンポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列を含む。請求項２６記載のコンジュゲート。
  28. 活性化ポリ（エチレングリコール）が下記式：
    ｍＰＥＧ−Ｏ−ＳＯ2−ＣＨ2ＣＦ3、および、
    Figure 2006516263
     よりなる群から選択される、請求項９記載のコンジュゲート。
  29. 下記式：
    ＰＥＧ−ＮＨ−Ｒ、および、
    Figure 2006516263
     ［式中、Ｒはヒト成長ホルモンポリペプチドである］よりなる群から選択される式の請求項２８記載のコンジュゲート。
  30. ヒト成長ホルモンポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項２９記載のコンジュゲート。
  31. 反応性官能基がイミデートまたはチオイミデートである、請求項９記載のコンジュゲート。
  32. 活性化ポリ（エチレングリコール）が下記式：
    Figure 2006516263
     ［式中、ＸはＯまたはＳである］、
    Figure 2006516263
     ［式中、ＸはＯまたはＳである］、
    Figure 2006516263
     ［式中、ｍは０〜２０であり、そして、ＸはＯまたはＳである］、および、
    Figure 2006516263
     ［式中、Ｒ1はアルキル、フェニル、フェニルアルキル、シクロアルキルであり、そして
    、ＸはＯまたはＳである］、
    よりなる群から選択される、請求項３１記載のコンジュゲート。
  33. 下記式：
    Figure 2006516263
     ［式中、ｍは０〜２０であり、そして、Ｒはヒト成長ホルモンポリペプチドである］よりなる群から選択される式の請求項３２記載のコンジュゲート。
  34. 遊離アミノ基がアミノ末端α−アミノ基である、請求項８記載のコンジュゲート。
  35. アミノ末端α−アミノ基がフェニルアラニンである、請求項３４記載のコンジュゲート。
  36. 結合が遊離のカルボキシル基を有するポリペプチドのアミノ酸において行われる、請求項８記載のコンジュゲート。
  37. 反応性官能基が第一級アミン、ヒドラジンおよびヒドラジド基よりなる群から選択される、請求項３６記載のコンジュゲート。
  38. 反応性官能基が下記式：
    ｍＰＥＧ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ2、ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ2、
    Figure 2006516263
     よりなる群から選択される、請求項３６記載のコンジュゲート。
  39. 結合が遊離のスルフヒドリル基を有するポリペプチドのアミノ酸において行われる、請求項８記載のコンジュゲート。
  40. 反応性官能基がチオール、マレイミド、ビニルスルホン、ヨードアセトアミドおよびフェニルグリオキサールよりなる群から選択される、請求項３９記載のコンジュゲート。
  41. 反応性官能基が下記式：
    Figure 2006516263
     よりなる群から選択される、請求項４０記載のコンジュゲート。
  42. 下記式：
    Figure 2006516263
     ［式中、Ｒはヒト成長ホルモンポリペプチドである］よりなる群から選択される式の請求項４１記載のコンジュゲート。
  43. ヒト成長ホルモンポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項４２記載のコンジュゲート。
  44. ポリ（エチレングリコール）が約０.５ｋＤａ〜約１００ｋＤａの分子量を有する、請求項８記載のコンジュゲート。
  45. ポリ（エチレングリコール）が約５ｋＤａ〜約４０ｋＤａの分子量を有する、請求項４４記載のコンジュゲート。
  46. ポリ（エチレングリコール）が分枝鎖重合体である、請求項８記載のコンジュゲート。
  47. 分枝鎖重合体が下記式：
    Figure 2006516263
     よりなる群から選択される、請求項４６記載のコンジュゲート。
  48. 下記式：
    Figure 2006516263
     ［式中、Ｒはヒト成長ホルモンポリペプチドである］のヒト成長ホルモン−ＰＥＧコンジュゲート。
  49. ヒト成長ホルモンポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項４８記載のコンジュゲート。
  50. ポリ（エチレングリコール）の少なくとも８０％がアミノ末端フェニルアラニンにコンジュゲートしている、請求項４９記載のコンジュゲート。
  51. ポリ（エチレングリコール）の少なくとも９０％がアミノ末端フェニルアラニンにコンジュゲートしている、請求項５０記載のコンジュゲート。
  52. 各ｍＰＥＧが約２０ｋＤａの平均分子量を有する、請求項５１記載のコンジュゲート。
  53. 下記式：
    Figure 2006516263
     ［式中、Ｒはヒト成長ホルモンポリペプチドである］のヒト成長ホルモン−ＰＥＧコンジュゲート。
  54. ヒト成長ホルモンポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項５３記載のコンジュゲート。
  55. ポリ（エチレングリコール）の少なくとも８０％がアミノ末端フェニルアラニンにコンジュゲートしている、請求項５３記載のコンジュゲート。
  56. ポリ（エチレングリコール）の少なくとも９０％がアミノ末端フェニルアラニンにコンジュゲートしている、請求項５３記載のコンジュゲート。
  57. 各ｍＰＥＧが約２０ｋＤａの分子量を有する、請求項５４または５５記載のコンジュゲート。
  58. 下記式：
    ｍＰＥＧ−ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ−Ｒ
    ［式中、Ｒはヒト成長ホルモンポリペプチドである］のヒト成長ホルモン−ＰＥＧコンジュゲート。
  59. ヒト成長ホルモンポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項５８記載のコンジュゲート。
  60. ポリ（エチレングリコール）の少なくとも８０％がアミノ末端フェニルアラニンにコンジュゲートしている、請求項５８記載のコンジュゲート。
  61. ポリ（エチレングリコール）の少なくとも９０％がアミノ末端フェニルアラニンにコンジュゲートしている、請求項５８記載のコンジュゲート。
  62. 各ｍＰＥＧが約２０ｋＤａの平均分子量を有する、請求項５９または６０記載のコンジュゲート。
  63. ポリ（エチレングリコール）が二官能性重合体である、請求項７記載のコンジュゲート。
  64. ポリ（エチレングリコール）がプロドラッグである、請求項７記載のコンジュゲート。
  65. 請求項１記載のｈＧＨコンジュゲートおよび薬学的に許容される担体少なくとも１つを含む組成物。
  66. 請求項１記載のｈＧＨのコンジュゲートの治療有効量を成長または発達の障害を有する患者に投与することを含む、該患者の治療方法。
  67. 成長または発達の障害が成長ホルモン欠乏症（ＧＨＤ）である、請求項６６記載の方法。
  68. 成長または発達の障害がＴｕｒｎｅｒ症候群である、請求項６６記載の方法。
  69. 成長または発達の障害が慢性腎不全である、請求項６６記載の方法。
  70. 成長または発達の障害が未熟児（ＳＧＡ）である、請求項６６記載の方法。
  71. 請求項５１のｈＧＨコンジュゲートおよび薬学的に許容される担体少なくとも１つを含む組成物。
  72. 請求項５１記載のｈＧＨコンジュゲートの治療有効量を成長または発達の障害を有する患者に投与することを含む、該患者の治療方法。
  73. 成長または発達の障害が成長ホルモン欠乏症（ＧＨＤ）である、請求項７２記載の方法。
  74. 成長または発達の障害がＴｕｒｎｅｒ症候群である、請求項７２記載の方法。
  75. 成長または発達の障害が慢性腎不全である、請求項７２記載の方法。
  76. 成長または発達の障害が未熟児（ＳＧＡ）である、請求項７２記載の方法。
  77. 請求項５３または５８記載のｈＧＨコンジュゲートおよび薬学的に許容される担体少なくとも１つを含む組成物。
  78. 請求項５３または５８記載のｈＧＨコンジュゲートの治療有効量を成長または発達の障害を有する患者に投与することを含む、該患者の治療方法。
  79. 成長または発達の障害が成長ホルモン欠乏症（ＧＨＤ）である、請求項７８記載の方法。
  80. 成長または発達の障害がＴｕｒｎｅｒ症候群である、請求項７８記載の方法。
  81. 成長または発達の障害が慢性腎不全である、請求項７８記載の方法。
  82. 成長または発達の障害が未熟児（ＳＧＡ）である、請求項７８記載の方法。
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Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RS20050202A (en) 2002-09-09 2007-08-03 Nektar Therapeuticals Al.Corporation, Water-soluble polymer alkanals
CN1703421B (zh) * 2002-09-20 2010-06-23 法玛西亚公司 降低peg化蛋白的聚集体水平的方法
WO2004084948A1 (en) * 2003-03-28 2004-10-07 Biopolymed Inc. Biologically active material conjugated with biocompatible polymer with 1:1 complex, preparation method thereof and pharmaceutical composition comprising the same
US20060134736A1 (en) * 2003-03-28 2006-06-22 Jacobs John W Human growth hormone conjugated with biocompatible polymer
US20050281778A1 (en) * 2003-03-28 2005-12-22 Myung-Ok Park Human growth hormone conjugated with biocompatible polymer
GB0314472D0 (en) 2003-06-20 2003-07-23 Warwick Effect Polymers Ltd Polymer
EP1525890A1 (en) * 2003-10-02 2005-04-27 Complex Biosystems GmbH Protein-Proteophore complexes
JP4896745B2 (ja) 2004-02-02 2012-03-14 アンブレツクス・インコーポレイテツド 修飾されたヒトインターフェロンポリペプチドおよびこれらの使用
WO2006069220A2 (en) * 2004-12-22 2006-06-29 Ambrx, Inc. Modified human growth hormone
US20050171002A1 (en) * 2004-02-03 2005-08-04 Mohanty Dillip K. Polyoxyalkylene compound and method for making
JP2007522198A (ja) * 2004-02-09 2007-08-09 ファルマシア コーポレーション 化学修飾されたヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト結合体
MX2007007587A (es) 2004-12-22 2007-12-11 Ambrx Inc Formulaciones de la hormona del crecimiento humano que comprenden un aminoacido codificado de manera no natural.
KR20070100299A (ko) * 2004-12-22 2007-10-10 암브룩스, 인코포레이티드 재조합 인간 성장 호르몬의 발현 및 정제 방법
US20060233740A1 (en) * 2005-03-23 2006-10-19 Bossard Mary J Conjugates of an hGH moiety and a polymer
CL2008002399A1 (es) 2007-08-16 2009-01-02 Pharmaessentia Corp Conjugado sustancialmente puro que posee una porcion polimerica, una porcion proteica (interferon alfa 2b) y un ligante alifatico de 1 a 10 atomos de carbono, util en el tratamiento de las hepatitis b o c.
MX344559B (es) * 2008-04-29 2016-12-20 Ascendis Pharma As Compuestos de hormona de crecimiento humana recombinante unidos al peg.
US9238878B2 (en) 2009-02-17 2016-01-19 Redwood Bioscience, Inc. Aldehyde-tagged protein-based drug carriers and methods of use
US9540438B2 (en) 2011-01-14 2017-01-10 Redwood Bioscience, Inc. Aldehyde-tagged immunoglobulin polypeptides and methods of use thereof
CN103012770B (zh) * 2011-09-24 2015-03-04 复旦大学 聚乙二醇苯并噻唑衍生物及其制备方法和应用
BR112017009193A2 (pt) 2014-11-06 2018-01-30 Pharmaessentia Corporation método de tratamento de uma doença infecciosa, câncer, ou doença mieloproliferativa em um indivíduo; método de tratamento de uma doença mieloproliferativa em um indivíduo; e; interferon tipo i
US11208632B2 (en) 2016-04-26 2021-12-28 R.P. Scherer Technologies, Llc Antibody conjugates and methods of making and using the same
WO2020213015A1 (en) * 2019-04-15 2020-10-22 Nof Corporation Conjugate of bio-related substance and block polymer, and block polymer derivative for obtaining said conjugate

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4002531A (en) * 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
US4342832A (en) * 1979-07-05 1982-08-03 Genentech, Inc. Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes
US5618697A (en) * 1982-12-10 1997-04-08 Novo Nordisk A/S Process for preparing a desired protein
US4904584A (en) * 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
US5324844A (en) * 1989-04-19 1994-06-28 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5122614A (en) * 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5342940A (en) * 1989-05-27 1994-08-30 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Polyethylene glycol derivatives, process for preparing the same
JP3051145B2 (ja) * 1990-08-28 2000-06-12 住友製薬株式会社 新規なポリエチレングリコール誘導体修飾ペプチド
US5349001A (en) * 1993-01-19 1994-09-20 Enzon, Inc. Cyclic imide thione activated polyalkylene oxides
US5321095A (en) * 1993-02-02 1994-06-14 Enzon, Inc. Azlactone activated polyalkylene oxides
US5359030A (en) * 1993-05-10 1994-10-25 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5681811A (en) * 1993-05-10 1997-10-28 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized therapeutic agent compositions, delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5919455A (en) * 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5643575A (en) * 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5824784A (en) * 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5932462A (en) * 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
CA2230492C (en) * 1995-09-21 2009-05-26 Genentech, Inc. Human growth hormone variants
IL119029A0 (en) * 1996-08-07 1996-11-14 Yeda Res & Dev Long-acting drugs and pharamaceutical compositions comprising them
AU751898B2 (en) * 1997-07-14 2002-08-29 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of growth hormone and related proteins
US6753165B1 (en) * 1999-01-14 2004-06-22 Bolder Biotechnology, Inc. Methods for making proteins containing free cysteine residues
EP0922446A1 (en) * 1997-12-03 1999-06-16 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Solution-phase site-specific preparation of GRF-PEG conjugates
KR100396983B1 (ko) * 2000-07-29 2003-09-02 이강춘 고반응성의 가지 달린 고분자 유도체 및 고분자와 단백질또는 펩타이드의 접합체
AU2002219021A1 (en) * 2001-01-11 2002-07-24 Maxygen Aps Variant growth hormone molecules conjugated with macromolecular compounds
US6828305B2 (en) * 2001-06-04 2004-12-07 Nobex Corporation Mixtures of growth hormone drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US20040038892A1 (en) * 2001-11-20 2004-02-26 Rory Finn Chemically-modified human growth hormone conjugates
HUP0500997A2 (en) * 2001-11-20 2007-11-28 Pharmacia Corp Chemically-modified human growth hormone conjugates
US20040142870A1 (en) * 2002-11-20 2004-07-22 Finn Rory F. N-terminally monopegylated human growth hormone conjugates, process for their preparation, and methods of use thereof
TWI281864B (en) * 2002-11-20 2007-06-01 Pharmacia Corp N-terminally monopegylated human growth hormone conjugates and process for their preparation

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