ES2610576T3 - PEG-TRAIL modificado en N-terminal, procedimiento de preparación y usos del mismo - Google Patents

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Abstract

Un conjugado de PEG (polietilenglicol)-TRAIL (ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral) modificado en N-terminal que comprende: un TRAIL trimérico que comprende los motivos de cremallera de aminoácidos que favorecen la formación de trímeros en los N-terminales de los mismos; y un PEG, en el que el PEG está unido al N-terminal de un monómero del TRAIL trimérico.

Description

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DESCRIPCION
PEG-TRAIL modificado en N-terminal, procedimiento de preparacion y usos del mismo rCampo tecnicol
La presente invencion se refiere a un conjugado polietilenglicol (PEG)-TRAIL modificado en N-terminal y un procedimiento de preparacion y uso del mismo. Mas particularmente, la presente invencion se refiere a un conjugado de PEG-TRAIL modificado en N-terminal en el que PEG se une al extremo N de TRAIL, un procedimiento de preparacion del conjugado, y un agente para prevenir y tratar enfermedades proliferativas o enfermedades autoinmunes que comprende el conjugado como un ingrediente eficaz.
ITecnica antecedentesl
El ligando inductor de la apoptosis relacionado con el factor de la necrosis tumoral (TNF) (TRAIL) es un elemento tfpico de la familia de TNF, y es una protema de membrana que participa en la apoptosis. TRAIL es una protema que consiste en 281 aminoacidos en la que un dominio extracelular que comprende los aminoacidos de arginina en la posicion 114 a glicina en la posicion 281 afecta a la apoptosis. Tres moleculas de TRAIL forman un tnmero estructuralmente modificado. El tnmero de TRAIL se ensambla con receptores que participan en la muerte celular para inducir la apoptosis.
Una diferencia principal entre TRAIL y otros miembros de la superfamilia de TNF, tal como TNF y CD95L, es su capacidad para no inducir la muerte celular en tejidos normales. Se han intentado una diversidad de aplicaciones medicas o farmaceuticas en TNF y CD95L, ya que estas protemas inducen la muerte celular. Dado que las protemas de TNF y CD95L afectan a las celulas normales y tambien inducen la muerte de las celulas cancerosas y las celulas inmunitarias sobreactivadas, tienen una aplicabilidad limitada. Por el contrario, TRAIL induce la apoptosis en una amplia gama de celulas cancerosas y celulas inmunitarias sobreactivadas poco efecto sobre las celulas normales. Esto se debe a la expresion diferencial de los receptores de TRAIL entre los tipos celulares. Se han identificado cinco receptores de TRAIL. Entre ellos, DR4(TRAIL-R1) y DR5(TRAIL-R2) son receptores relacionados con la muerte de celulas representativos. Cuando TRAIL se une a DR4 o DR5, se activa un dominio de muerte intracelular del receptor se activa y, por los tanto, transduce senales de apoptosis a traves de diversas rutas de transduccion de senales, lo que conduce a la muerte celular apoptotica. TRAIL tambien puede unirse a DcR1, DcR2 y osteoprotegerina (OPG), que no inducen la apoptosis. No se ha observado una diferencia marcada en los niveles de expresion de los receptores inductores de la muerte celular DR4 y DR5 entre las celulas normales y tumorales. Por el contrario, los otros tres receptores que no inducen la apoptosis se expresan a altos niveles en las celulas normales, pero se expresan a bajos niveles o no se expresan en absoluto en las celulas tumorales. Por lo tanto, en las celulas normales, TRAIL se une en su mayor parte a DcR1, DcR2 y OPG, que no contienen un dominio de muerte y, por lo tanto, no inducen la muerte celular. Por el contrario, en las celulas cancerosas y las celulas inmunitarias sobreactivadas, la apoptosis se induce por la union de TRAIL a DR4 y DR5, que contienen un dominio de muerte. Dicha induccion de la apoptosis selectiva de TRAIL parece ser una caractenstica particularmente atractiva en aplicaciones medicas o farmaceuticas.
Se ha observado la apoptosis mediada por TRAIL en diversos tipos de celulas cancerosas, incluyendo celulas de carcinoma de colon, glioma, carcinoma de pulmon, carcinoma de prostata, tumores cerebrales y mieloma multiple. Se ha demostrado que TRAIL tiene una actividad contra el cancer muy elevada en los animales. La buena eficacia contra el cancer de TRAIL se ha obtenido a traves del uso de TRAIL en solitario, asf como en combinacion con otros agentes anticancerosos, tales como paclitaxel y doxorrubicina, y radioterapia. Los ensayos clmicos se estan realizando actualmente por Genentech y Amgen usando TRAIL, que tiene una buena eficacia contra el cancer en los tumores solidos. Ademas del cancer, se han hecho diversos enfoques usando TRAIL en la artritis, una enfermedad autoinmune, para aliviar y tratar la artropatfa mediante la induccion de la muerte de las celulas inmunitarias sobreactivadas. Ademas de la terapia de protemas, se ha intentado la terapia genica a traves de la administracion del gen TRAIL. Por lo tanto, TRAIL puede ser util en el tratamiento de diversos tipos de cancer que se han mencionado anteriormente, asf como en el tratamiento de trastornos autoinmunes mediados por linfocitos T, tales como encefalomielitis autoinmune experimental, artritis reumatoide y diabetes de tipo I.
Sin embargo, TRAIL nativo tiene algunos problemas que deben superarse para la aplicacion del mismo. El principal problema es la baja relacion de la formacion de tnmeros de TRAIL nativo. Los monomeros de TRAIL no se unen a los receptores de TRAIL que se han mencionado anteriormente y, por lo tanto, no inducen la apoptosis. A este respecto, se han realizado muchos estudios con el objetivo de mejorar la estructura trimerica y la relacion de la formacion de tnmeros de TRAIL. En TRAIL nativo, se ha conocido que el ion de cinc desempena un papel cntico en la trimerizacion. Ademas, el analisis estructural de TRAIL se ha realizado usando un ordenador, y se han desarrollado mutantes de TRAIL en base a los resultados de los analisis. Para la formacion de tnmeros de TRAIL, el procedimiento mas util parece ser la introduccion de una novedosa secuencia aminoaddica que favorezca el pliegue trimerico. Dichas secuencias incluyen un motivo de cremallera de leucina y un motivo de cremallera de isoleucina. Henning Walczak indico la eficacia anticancerosa de un derivado de TRAIL trimerico en el que se anade un motivo de cremallera de leucina al extremo N de TRAIL nativo (H. Walczak, y col. Nature Medicine 1999, 5, 157-163). Dai- Wu Seol y col. indicaron un derivado de TRAIL que contema un motivo de cremallera de isoleucina novedoso y que
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tema buena actividad apoptotica (MH Kim, y col. BBRC 2004, 321, 930-935).
Otro problema en las aplicaciones clmicas de TRAIL implica la citotoxicidad mostrada en las celulas normales de algunos tejidos. La mayor parte de las celulas normales son resistentes a la citotoxicidad, como resultado de la expresion de los diversos receptores de TRAIL que se han mencionado anteriormente, pero algunos hepatocitos y queratinocitos son sensibles a la citotoxicidad mediada por TRAIL (H. Yagita, y col. Cancer Sci. 2004, 95, 777-783; M. Jo y col. Nature Medicine 2000, 6, 564-567; S.J. Zheng, y col. J. Clin. Invest. 2004, 113, 58-64).
Ademas de la toxicidad hacia algunas celulas normales, TRAIL tiene una corta semivida in vivo, que debena resolverse para la aplicacion clmica con exito de TRAIL. TRAIL tiene diferentes semividas de acuerdo con las especies de animales usados en los ensayos. Por ejemplo, se ha indicado que TRAIL tiene una semivida de varios minutos en roedores y aproximadamente 30 minutos en los simios (H. Xiang, y col. Drug Metabolism and Disposition 2004, 32, 1230-1238). En particular, la mayor parte del TRAIL se excreta rapidamente a traves de los rinones. Esta corta semivida se considera un inconveniente para la utilidad farmaceutica de TRAIL, dando como resultado la necesidad de TRAIL o derivados del mismo que tengan una extensa semivida. Otros problemas que deben resolverse incluyen la baja solubilidad y estabilidad en solucion de TRAIL.
Mientras tanto, polietilenglicol (PEG) es un polfmero que tiene una estructura de HO-(-CH2CH2O-)n-H. Debido a su elevada hidrofilicidad, PEG permite un aumento en la solubilidad de las protemas farmacologicas cuando se une a las mismas. Ademas, al unirse adecuadamente a una protema, PEG aumenta el peso molecular de la protema modificada al mismo tiempo que mantiene las funciones biologicas principales, tal como la actividad enzimatica y la union al receptor, reduciendo de esta manera la excrecion urinaria, protegiendo la protema de las celulas y los anticuerpos que reconocen los antfgenos exogenos, y disminuyendo la degradacion proteica por proteasas. El peso molecular de PEG, capaz de unirse a las protemas, vana de aproximadamente 1.000 a 100.000. Se sabe que PEG con un peso molecular de mas de 1.000 tiene muy poca toxicidad. PEG con un peso molecular entre 1.000 y 6.000 se distribuye ampliamente por todo el cuerpo y se metaboliza a traves del rinon. En particular, PEG con un peso molecular de 40.000 se distribuye en la sangre y los organos, incluyendo el tngado, y se metaboliza en el tngado.
En general, las protemas medica y farmaceuticamente utiles administradas a traves de rutas parenterales son desventajosas en cuanto a ser inmunogenas en el cuerpo, ser deficientemente solubles en agua y ser eliminadas de la circulacion en un corto periodo de tiempo. Se han realizado muchos estudios para superar dichos problemas. La patente de Estados Unidos n.° 4.179.337 menciona que, al usarse como productos terapeuticos, las protemas pegiladas y las enzimas tienen efectos que incluyen una inmunogenicidad reducida, una solubilidad aumentada y un tiempo de residencia in vivo ampliado, todos los cuales son ventajas de PEG. Despues de esta patente, se ha hecho una diversidad de esfuerzos para superar las desventajas de las protemas bioactivas a traves de la pegilacion. Un ejemplo es Veronese y col. pegylated ribonuclease and superoxide dismutase (Veronese y col., 1985). La Patente de Estados Unidos n.° 4.766.106 y 4.917.888 describe la conjugacion de protemas con un polfmero que incluye PEG para aumentar la solubilidad en agua del mismo. Ademas, la Patente de Estados Unidos n.° 4.902.502 describe la conjugacion de protemas recombinantes con PEG u otros polfmeros para reducir la inmunogenicidad y extender la semivida in vivo circulante.
Sin embargo, a pesar de las desventajas que se han mencionado anteriormente, existen algunos problemas con la pegilacion de protemas, como se indica a continuacion. PEG se conjuga tfpicamente con una protema diana a traves de la union covalente a uno o mas residuos de lisina libre (Lys). En este momento, si PEG se une a una region directamente asociada a la actividad de protemas entre las regiones superficiales de la protema, la region unida a PEG pierde funciones biologicas, lo que conduce a un descenso de la actividad proteica. Ademas, dado que la union de PEG a residuos de lisina se produce en su mayor parte de manera aleatoria, existen como una mezcla diversos tipos de conjugados de PEG-protema, correspondientes a sitios de union particulares. A partir de esta mezcla, un conjugado deseado es diffcil de purificar y de aislar.
El documento WO 2004/001009 describe polipeptidos de variantes de ligando Apo-2/TRAIL, que pueden comprender opcionalmente sustituciones de cistema, y la conjugacion o union de grupos de poliol, tal como PEG, a los mismos.
TRAIL tambien alberga problemas similares a los causados por la pegilacion que se ha descrito anteriormente. El TRAIL nativo tiene once residuos de lisina, algunos de los cuales participan en la interaccion entre TRAIL y sus receptores analogos o estan dentro de un sitio activo. Por lo tanto, la adicion de moleculas de polietilenglicol a traves de la reaccion con residuos de lisina puede actuar como un factor inhibitorio muy importante contra la bioactividad de TRAIL. En el caso de la superfamilia de TNF, varios estudios han senalado que la union entre los residuos de lisina y las moleculas de polietilenglicol inhibe la activacion (Y. Yamamoto, y col. Nature Biotechnology 2003, 21, 546-552; H. Shibata y col. Clin. Cancer Res. 2004, 10, 8293-8300).
A este respecto, los presentes inventores unieron selectivamente PEG o un derivado de PEG a un extremo N de TRAIL. Se descubrio que dicha pegilacion reducfa la captacion del farmaco y la eliminacion por los hepatocitos y el sistema reticuloendotelial hepatico, conduciendo a un descenso de la hepatotoxicidad mediada por TRAIL, y aumentaba notablemente la solubilidad y la estabilidad de TRAIL. Ademas, se descubrio que la pegilacion mejoraba las propiedades farmacocineticas de un farmaco unido con un almacenamiento a largo plazo en diversas
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formulaciones, reduciendo de esta manera las frecuencias de administracion del farmaco y permitiendo una duracion sostenida de los efectos del farmaco. De esta manera, los presentes inventores obtuvieron un conjugado de PEG- TRAIL modificado en N-terminal y descubrieron un procedimiento de preparacion del conjugado, conduciendo de esta manera a la presente invencion.
rDivulgacionl
rProblema tecnicol
Por lo tanto, es un objeto de la presente invencion proporcionar un conjugado de PEG-TRAIL modificado en N- terminal o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
Es otro objeto de la presente invencion proporcionar un procedimiento de preparacion del conjugado de PEG-TRAIL modificado en N-terminal.
Es un objeto adicional de la presente invencion proporcionar el uso del conjugado de PEG-TRAIL modificado en N- terminal.
rSolucion tecnical
Con el fin de realizar los objetos anteriores, la presente invencion proporciona un conjugado de PEG-TRAIL modificado en N-terminal que comprende: un TRAIL trimerico que comprende los motivos de cremallera de aminoacidos que favorecen la formacion de tffmeros en los N-terminales de los mismos; y un PEG, en el que el PEG esta unido al N-terminal de un monomero del TRAIL trimerico, un procedimiento de preparacion del mismo, y un agente preventivo o terapeutico para enfermedades proliferativas o enfermedades autoinmunes que comprende el mismo como un ingrediente eficaz.
rEfectos ventaiososl
Un conjugado de PEG-TRAIL modificado en N-terminal preparado de acuerdo con la presente invencion tiene una solubilidad y estabilidad muy elevadas en comparacion con el TRAIL nativo. Ademas, el TRAIL pegilado ha aumentado notablemente la semivida in vivo conservando al mismo tiempo una actividad biologica similar a la del TRAIL nativo. Por lo tanto, el TRAIL pegilado puede ser muy util como agente preventivo o terapeutico para enfermedades proliferativas o enfermedades autoinmunes.
rDescripcion de los dibuiosl
La figura 1 muestra esquematicamente la estructura de hTRAIL recombinante (ILz-hTRAIL, monomero) para expresar hTRAIL trimerico;
la figura 2 es un cromatograma del hTRAIL recombinante purificado a traves de cromatograffa de afinidad de Ni (lavado 1 (w1): lavado con tampon fosfato que contiene imidazol 10 mM; lavado 2 (w2): lavado con tampon fosfato que contiene imidazol 50 mM);
la figura 3 muestra el resultado de SDS-PAGE del hTRAIL recombinante purificado (EJ: lisados de E. coli; UB: TRAIL no pegilado; lavado 1 (w1): lavado con tampon fosfato que contiene imidazol 10 mM; lavado 2 (w2): lavado con tampon fosfato que contiene imidazol 50 mM);
la figura 4 muestra el resultado de una cromatograffa por exclusion de tamano de productos de acuerdo con las relaciones de reaccion de PEG con respecto a TRAIL;
la figura 5 muestra el resultado de una cromatograffa por exclusion de tamano de TRAIL (ILz-hTRAIL), una mezcla de reaccion y un conjugado de PEG-TRAIL modificado en N-terminal purificado (PEG5K-ILz-hTRAIL); la figura 6 muestra el resultado de la electroforesis de una mezcla de reaccion, un conjugado de PEG-TRAIL modificado en N-terminal y TRAIL sin reaccionar;
la figura 7 muestra el resultado de un ensayo de citotoxicidad contra celulas HeLa de carcinoma cervical humano de acuerdo con el peso molecular de PEG;
la figura 8 es una fotograffa microscopica que muestra la viabilidad celular de acuerdo con las concentraciones de farmaco en el ensayo de citotoxicidad contra las celulas HeLa;
la figura 9 muestra el resultado de un ensayo de citotoxicidad contra celulas HCT116 de carcinoma de colon humano de acuerdo con el peso molecular del PEG;
la figura 10 muestra la solubilidad en solucion de TRAIL no pegilado y un conjugado de PEG-TRAIL modificado en N-terminal;
la figura 11 muestra los perfiles farmacocineticos de TRAIL no pegilado; y
la figura 12 muestra los perfiles farmacocineticos de un conjugado de PEG-TRAIL modificado en N-terminal. [Meior modol
En un aspecto, la presente invencion proporciona un conjugado de PEG-TRAIL modificado en N-terminal como se define por la reivindicacion 1.
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TRAIL puede obtenerse en una forma nativa o geneticamente modificada (recombinante), y puede incluir un grupo terminal que facilita el aislamiento y la purificacion del mismo.
TRAIL puede estar en la forma humana, que tiene una secuencia aminoaddica de 281 aminoacidos de longitud, o puede tener una secuencia aminoaddica de arginina-114 a glicina-281 de la forma humana de longitud completa (1281).
TRAIL puede unirse a una cremallera de isoleucina en su extremo N.
PEG puede ser una forma lineal o ramificada. Preferiblemente, PEG incluye, pero sin limitacion, propionato de metoxi PEG succinimidilo (mPEG-SPA), metoxi PEG N-hidroxisuccinimida (mpEG-NHS), metoxi PeG aldeddo (mPEG-ALD), metoxi PEG maleimida (mPEG-MAL) y PEG de multiples ramificaciones.
PEG puede tener un peso molecular entre 1.000 y 100.000, tal como entre 1.000 y 40.000, y preferiblemente entre
5.000 y 40.000.
En otro aspecto, la presente invencion proporciona un procedimiento de preparacion del conjugado de PEG-TRAIL modificado en N-terminal, como se define adicionalmente por la reivindicacion 9.
El conjugado de PEG-TRAIL modificado en N-terminal puede obtenerse haciendo reaccionar una amina N-terminal de un TRAIL trimerico que comprende los motivos de cremallera de aminoacidos en los N-terminales de los mismos con un grupo aldeddo de PEG en presencia de un agente reductor.
PEG puede estar en una forma lineal o ramificada. Preferiblemente, PEG incluye propionato de metoxi PEG succinimidilo (mPEG-SPA), metoxi PEG N-hidroxisuccinimida (mPEG-NHS), metoxi PEG aldeddo (mPEG-ALD), metoxi PEG maleimida (mPEG-MAL) y derivados de polietilenglicol de multiples ramificaciones.
PEG puede tener un peso molecular entre 1.000 y 100.000, tal como entre 1.000 y 40.000, y preferiblemente entre
5.000 y 40.000.
En el presente procedimiento, PEG y TRAIL reaccionan en una relacion molar (PEG/TRAIL) de 2 a 10, y preferiblemente de 5 a 7,5.
TRAIL puede obtenerse en una forma nativa o geneticamente modificada (recombinante). Preferiblemente, TRAIL puede incluir un grupo terminal que facilita el aislamiento y la purificacion del mismo.
TRAIL puede estar en la forma humana, que tiene una secuencia aminoaddica de 281 aminoacidos de longitud, o puede tener una secuencia aminoaddica de arginina-114 a glicina-281 de la forma humana de longitud completa (1281).
TRAIL puede unirse a una cremallera de isoleucina en su extremo N.
El agente reductor puede incluir NaCNBH3 y NaBH4.
En un aspecto adicional, la presente invencion se proporcionar para el uso del conjugado de PEG-TRAIL modificado en N-terminal de la presente invencion en la fabricacion de un medicamento para tratar o prevenir el cancer, o una enfermedad autoinmune.
El cancer puede incluir preferiblemente carcinoma de colon, glioma, carcinoma de pulmon, carcinoma de prostata, tumor cerebral y mieloma multiple.
La enfermedad autoinmune incluye encefalomielitis autoinmune experimental, artritis reumatoide y diabetes de tipo I.
El medicamento que comprende el conjugado de PEG-TRAIL modificado en N-terminal como un ingrediente eficaz de acuerdo con la presente invencion puede formularse en diversas formulaciones para su administracion oral o parenteral tras la aplicacion clfnica, pero no se limita a lo mismo.
En la formulacion, pueden usarse diluyentes o excipientes, y se ilustran por cargas, espesantes, aglutinantes, humectantes, disgregantes y tensioactivos. Los ejemplos de formulaciones solidas para administracion oral incluyen comprimidos, pfldoras, polvos, granulos y capsulas. Las formulaciones solidas pueden incluir, ademas del conjugado de PEG-TRAIL, al menos un excipiente seleccionado de entre almidon, carbonato calcico, sacarosa, lactosa, gelatina, etc. Ademas, las formulaciones solidas pueden incluir, ademas de un unico excipiente, un lubricante tal como estearato de magnesio o talco. Los ejemplos de formulaciones lfquidas para administracion oral incluyen suspensiones, soluciones internas, emulsiones y jarabes. Las formulaciones lfquidas pueden incluir, ademas de los diluyentes individuales de uso comun, tales como agua y parafina lfquida, diversos excipientes, que se ilustran por humectantes, edulcorantes, aromatizantes y conservantes. Los ejemplos de preparaciones para administracion parenteral incluyen soluciones esteriles acuosas, soluciones no acuosas, suspensiones, emulsiones, preparaciones liofilizadas y supositorios. En la formulacion en las soluciones y suspensiones no acuosas, pueden usarse propilenglicol, PEG, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y esteres inyectables, tales como oleato de etilo.
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Una formulacion puede complementarse con calcio o vitamina D3 con el fin de mejorar su eficacia como un agente terapeutico para enfermedades proliferativas o enfermedades autoinmunes.
La dosificacion para un paciente espedfico puede variar segun el peso del paciente, edad, sexo, estado de salud y la dieta, la duracion de administracion, v^as de administracion, tasas de excrecion y la gravedad de la enfermedad. Tfpicamente, es posible administrar una dosis eficaz una vez cada una o dos semanas. Ademas, la dosis se puede tomar en una dosis unica o en varias dosis divididas dentro de una dosis eficaz diaria.
rModo para la invencion!
Se puede obtener una mejor comprension de la presente invencion a traves de los siguientes ejemplos y ejemplos de ensayo, que se exponen para ilustrar la presente invencion.
Ejemplo 1: Preparacion del conjugado de PEG-TRAIL modificado en N-terminal
1-1: Cultivo de E. coli transformado con el gen TRAIL y expresion de proteinas
La forma truncada de TRAIL humano (hTRAIL) usada en este ensayo contema aminoacidos que inclrnan de arginina-114 a glicina-281 de la forma de longitud completa (1-281) de hTRAIL. El TRAIL recombinante se expreso y se produjo en BL21(DE3) de E. coli, y se uso un plasmido de expresion pET3a. Se anadio una cremallera de isoleucina (ILz) que favoreda el pliegue trimerico a un extremo N del hTRAIL recombinante. Despues, el hTRAIL recombinante se etiqueto con seis residuos de histidina (6 x His) en su extremo N-terminal con el fin de facilitar el aislamiento y la purificacion. La figura 1 muestra esquematicamente la estructura del hTRAIL recombinante resultante (monomero) para expresar hTRAIL trimerico (etiquetado con His y unido a la cremallera de isoleucina).
El E. coli transformado se cultivo en medio LB esteril a 37 °C con agitacion durante aproximadamente 12 h en presencia de ampicilina (50 mg/l) para el cultivo selectivo de un transformante. Despues de la proliferacion del E. coli transformado para el cultivo, se anadio isopropil-p-D-tiogalactosido (IPTG) al medio de cultivo para inducir la expresion del genotipo de E. coli. Despues de la incubadora de agitacion y la reduccion del cultivo de E. coli a 27 °C, se anadio 1 ml de solucion 1 M de IPTG al medio de cultivo. Las celulas se cultivaron adicionalmente durante aproximadamente 7 h con agitacion para inducir la expresion de proteinas. Las celulas cultivadas se cosecharon por centrifugacion a 5.000 g durante 10 min.
1-2: Purificacion del hTRAIL recombinante de E. coli
El hTRAIL recombinante se aislo de las celulas de E. coli transformadas cosechadas en el Ejemplo 1-1 usando una cromatograffa de afinidad de Ni. En primer lugar, el sedimento celular obtenido por centrifugacion se suspendio en tampon fosfato 20 mM (pH 7,5), y se sonico para alterar la membrana celular, liberando asf el TRAIL expresado en E. coli. Despues de eliminar los sustratos celulares insolubles a traves de centrifugacion a 10.000 rpm durante 20 min, el sobrenadante se paso lentamente a traves de una columna prerrellenada con resina de Ni-NTA. El hTRAIL recombinante se union selectivamente a la columna a traves de la interaccion entre los seis residuos de histidina etiquetados N-terminalmente y la quelacion de los iones de mquel. La columna se lavo con tampon fosfato (pH 7,5) y tampon fosfato que contema imidazol 10 mM y 50 mM para eliminar las impurezas, incluyendo proteinas distintas del hTRAIL recombinante. Despues, el hTRAIL recombinante unido a la columna se eluyo con tampon fosfato que contema imidazol 500 mM. Las fracciones de elucion que conteman TRAIL se sometieron a ultrafiltracion para eliminar las altas concentraciones de imidazol. El producto finalmente aislado purificado se puso en tampon acetato 50 mM a un pH de 5,0 con una alta pureza (98 % o mas). Los resultados se dan en la figura 2.
La figura 3 muestra el resultado de SDS-PAGE (gel al 14%) del hTRAIL recombinante aislado y purificado y las fracciones de elucion obtenidas de la columna de Ni-NTA (EJ: lisados de E. coli; UB: TRAIL no pegilado; lavado 1 (w1): lavado con tampon fosfato que contiene imidazol 10 mM; lavado 2 (w2): lavado con tampon fosfato que contiene imidazol 50 mM). Como se muestra en la figura 2, el hTRAIL recombinante (ILz-hTRAIL) aislado en el Ejemplo 1-2 se observo que elrna a un tiempo de retencion entre 135 y 145 min. El resultado electroforetico representado en la figura 3 indico que ILz-hTRAIL se aislo y se purifico con exito usando la columna de Ni-NTA.
1-3: Sintesis y aislamiento de conjugados de PEG-TRAIL
El hTRAIL recombinante preparado en el Ejemplo 1-2 se diluyo a 200 pg/ml en tampon acetato 50 mM (pH 5,0), y se mezclo con metoxi polietilenglicol 5000 propionaldeddo (PEG5k). Se anadio un agente reductor NaCNBH3 a la mezcla a una concentracion final de 20 mM, y la mezcla se dejo reaccionar a 4 °C durante aproximadamente 8 a 12 h. Se anadio PEG5k a TRAIL a relaciones molares de la reaccion de PEG5k de 2,5, 5, 7,5 y 10 con el fin de preparar un conjugado de PEG-TRAIL modificado en N-terminal. Por separado, se preparo otro conjugado de PEG- TRAIL modificado en N-terminal usando metoxi polietilenglicol 20000 propionaldeddo como se ha descrito anteriormente. Las mezclas de reaccion se sometieron a cromatograffa de exclusion de tamano, y los resultados se dan en la figura 4.
Como se muestra en la figura 4, la cantidad de TRAIL pegilado aumento con cantidades crecientes de PEG. Sin embargo, el PEG excesivo reacciono con las aminas de cadena lateral de residuos de lisina internos, asf como un
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residuo de lisina N-terminal deseado, dando como resultado cantidades crecientes de subproductos. En este caso, un conjugado resultante tema un peso molecular superior y se eluyo en un momento anterior tras la cromatograffa de exclusion de tamano (solucion de elucion: tampon fosfato que contema NaCl 150 mM, pH 6,0). Estos resultados indican que es eficaz ajustar la relacion de reaccion de PEG con respecto a TRAIL dentro de un intervalo optimo de manera que no sea muy algo o muy bajo.
Un conjugado de PEG-TRAIL modificado en N-terminal, preparado usando PEG y TRAIL en una relacion de reaccion de 7, se aislo y se purifico a traves de cromatograffa de exclusion de tamano. Los resultados se dan en la figura 5.
Como se muestra en la figura 5, el conjugado de PEG-TRAIL modificado en N-terminal purificado se detecto en un volumen de elucion relativamente mas alto en comparacion con el hTRAIL recombinante no pegilado producido en y aislado de E. coli. Ademas, el cromatograma indico que el conjugado de PEG-TRAIL modificado en N-terminal purificado era altamente puro y no contema ningun TRAIL sin reaccionar.
La figura 6 muestra los resultados de la electroforesis de la mezcla de reaccion de este ejemplo, el hTRAIL recombinante purificado y el conjugado de PEG-TRAIL modificado en N-terminal purificado.
Como se muestra en la figura 6, al compararse con la banda de TRAIL monomerico, se descubrio que los monomeros de TRAIL exisffan en el conjugado de PEG-TRAIL modificado en N-terminal purificado. Esto indica que el PEG se unio al extremo terminal de uno o dos monomeros de TRAIL trimerico. Ademas, en el gel de electroforesis, excepto para el TRAIL monomerico y los monomeros del conjugado de PEG-TRAIL modificado en N- terminal, no se observo ninguna impureza, lo que indicaba que el TRAIL pegilado finalmente purificado tema una alta pureza.
Ejemplo experimental 1: Comparacion de la bioactividad de TRAIL no pegilado y los conjugados de PEG- TRAIL modificados en N-terminal (ensayo de la apoptosis)
Se examinaron TRAIL no pegilado y los conjugados de PEG-TRAIL modificados en N-terminal para determinar la bioactividad, como se indica.
Se realizo un ensayo de la apoptosis para el TRAIL recombinante no pegilado y los conjugados de PEG-TRAIL modificados en N-terminal usando celulas HeLa de carcinoma cervical humano y celulas HCT116 de carcinoma de colon humano. Las celulas HeLa se cultivaron en DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco), y las celulas HCT116 en RPMI-1640. Cada lmea celular se sembro sobre una placa de 96 pocillos a una densidad de 1 x 104 celulas/pocillo, y se cultivo durante aproximadamente 24 h para estabilizarla. Las celulas se dosificaron con un TRAIL de control (adquirido en R&D systems), el hTRAIL recombinante se preparo de acuerdo con el metodo de los Ejemplos 1-1 y 1-2, y los conjugados de PEG-TRAIL modificados en N-terminal (PEG5K-ILz-hTRAIL y PEG20K-ILz- hTRAIL) a una concentracion final de 1 ng/ml a 5 pg/ml durante aproximadamente 24 h. Despues, se anadieron 20 pl de una solucion de MTS (Promega) a cada pocillo, y la placa se incubo durante aproximadamente 2 h. La absorbancia se midio a 490 nm, y la viabilidad celular se calculo a partir de la absorbancia. Los resultados se dan en las figuras 7, 8 y 9.
Como se muestra en las figuras 7 y 8, de forma similar a TRAIL no pegilado, se descubrio que los conjugados de PEG-TRAIL modificados en N-terminal teman citotoxicidad contra celulas HeLa de una manera dependiente de la dosis. Se observo que los conjugados de PEG-TRAIL modificados en N-terminal teman una citotoxicidad relativamente baja con un peso molecular creciente del PEG unido. Estos resultados fueron coherentes con los resultados microscopicos mostrados en la figura 8, en la que las celulas tratadas con TRAIL se observaron microscopicamente.
Como se muestra en la figura 9, los conjugados de PEG-TRAIL mostraron citotoxicidad contra las celulas HCT116 de carcinoma de colon de una manera similar a la observada en la figura 7. Ademas, el efecto del PEG sobre la citotoxicidad contra las celulas HCT116 fue similar a la observada contra las celulas HeLa.
Ejemplo experimental 2: Evaluacion de la solubilidad en solucion de conjugados de PEG-TRAIL modificados en N-terminal
El TRAIL recombinante no pegilado y los conjugados de PEG-TRAIL modificados en N-terminal se examinaron para determinar la solubilidad en solucion, como se indica a continuacion.
La solubilidad del TRAIL no pegilado y pegilado se ensayo en el tiempo para investigar la estabilidad en solucion del mismo. El TRAIL no pegilado y los conjugados de PEG-TRAIL modificados en N-terminal se prepararon de forma individual a 200 pg/ml en tampon acetato 50 mM, se diluyeron en una relacion 1:1 con tampon fosfato 100 mM para ajustar el valor del pH fisiologico, y despues se analizaron para determinar la solubilidad en el tiempo a 37 °C. Las muestras se recogieron en pequenas cantidades en 5, 15, 30, 60, 120 y 180 min. Las muestras recogidas se centrifugaron para separar las fracciones solubles y precipitadas. Para las fracciones solubles obtenidas de esta manera (como sobrenadantes), las concentraciones de protema se determinaron usando un kit de ensayo de protemas de BCA. Los resultados se dan en la figura 10.
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Como se muestra en la figura 10, se observo una diferencia notable en la estabilidad en solucion entre el TRAIL no pegilado y los conjugados de PEG-TRAIL modificados en N-terminal. La mayor parte del TRAIL no pegilado (mas del 80 % del mismo) se precipito en 5 min. Por el contrario, los conjugados de pEG-TRAIL modificados en N-terminal mostraron una estabilidad en solucion muy alta, y esta estabilidad aumento con los pesos moleculares crecientes de PEG. PEG5K-ILz-hTRAIL mostro una estabilidad de aproximadamente el 70%, y PEG20K-ILz-hTRAIL mostro una estabilidad de aproximadamente el 95 %.
Ejemplo experimental 3: Evaluacion de los perfiles farmacocineticos de un conjugado de PEG-TRAIL modificado en N-terminal
El TRAIL no pegilado (ILz-hTRAIL) y el conjugado de PEG-TRAIL modificado en N-terminal (PEG5K-ILz-hTRAIL) se examinaron para determinar los perfiles farmacocineticos, como se indica a continuacion.
Con el fin de estimar el comportamiento in vivo del TRAIL no pegilado y el conjugado de PEG-TRAIL modificado en N-terminal, se realizo previamente un analisis farmacocinetico usando ratas Sprague-Dawley de 6 semanas. Con el fin de facilitar la recogida de muestras de sangre del animal, la vena yugular derecha de cada una de las ratas se canulo insertando un extremo de una longitud de entubado PE-10 en la vena yugular aproximadamente 2,5 cm de profundidad, y suturandola en el lugar. El otro extremo del entubado se paso a traves de la espalda del animal y se conecto a un tubo de recogida de sangre en el exterior. Despues, se dejo que las ratas se aclimatasen y se recuperasen durante aproximadamente 24 h. El TRAIL no pegilado y el conjugado de PEG-TRAIL modificado en N- terminal se administraron por via subcutanea a las ratas en una dosificacion de 10 pg/kg. Las muestras de sangre (0,2 ml cada vez) se recogieron en puntos temporales determinados durante un periodo de 48 h (la primera muestra de sangre se recogio en 5 min). Despues de la centrifugacion de las muestras de sangre recogidas, las muestras de plasma se analizaron para determinar el comportamiento in vivo del TRAIL no pegilado y el conjugado de PEG- TRAIL modificado en N-terminal usando un kit ELISA de TRAIL humano. Los resultados se dan en las figuras 11 y 12, respectivamente.
Como se muestra en las figuras 11 y 12, hubo una diferencia en el comportamiento in vivo entre el TRAIL no pegilado y el conjugado de PEG-TRAIL modificado en N-terminal. El TRAIL no pegilado (ILz-hTRAIL) se absorbio rapidamente, y mostro la mayor concentracion en la sangre despues de aproximadamente una hora, pero la concentracion de sangre del mismo se disminuyo mediante excrecion renal rapida y la metabolizacion. Por el contrario, el conjugado de PEG-TRAIL modificado en N-terminal (PEG5K-ILz-hTRAIL) se absorbio lentamente de la region subcutanea administrada, y se mantuvo a altas concentraciones en la sangre durante un largo periodo de 48 h o mas. Esto se considero que se debfa a la baja excrecion renal y la baja metabolizacion hepatica de TRAIL resultante de la pegilacion.
Los resultados del analisis farmacocinetico se dan en la Tabla 1.
TABLA 1
Perfiles farmacocineticos de TRAIL no pegilado y el conjugado de PEG-TRAIL modificado en N-terminal
ILz-hTRAIL PEG5K-ILz-hTRAIL
AUC (ng.h/ml)
7,71 + 1,1, 7628,2 + 321,6
Cmax (ng/ml)
3,38 + 0,48 298,3 + 24,8
Tmax (h)
0,96 + 0,19 19,0 + 1,0
T1/2 (h)
0,79 + 0,01 24,5 + 4,0
Como se muestra en la Tabla 1, en comparacion con ILz-hTRAIL, PEG5K-ILz-hTRAIL existfa a niveles mas altos en la sangre, y tema un Tmax (tiempo hasta alcanzar la concentracion maxima) mas de 19veces mas alto y T1/2 30 veces mas largo. Estos resultados indican que el conjugado de PEG-TRAIL modificado en N-terminal de acuerdo con la presente invencion es un farmaco farmacocineticamente bueno.
En lo sucesivo en el presente documento, se daran formulaciones ejemplares del presente conjugado de PEG- TRAIL.
Ejemplos de formulacion: Preparacion de formulaciones farmaceuticas
Las formulaciones farmaceuticas que comprenden el conjugado de PEG-TRAIL modificado en N-terminal de acuerdo con la presente invencion se prepararon como se indica a continuacion.
1. Preparacion de polvos
conjugado de PEG-TRAIL modificado en N-terminal 2 g Lactosa 1 g
Los componentes anteriores se mezclaron y se pusieron en un envase hermetico, dando de este modo polvos.
2. Preparacion de comprimidos
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conjugado de PEG-TRAIL modificado en N-terminal 100 mg Almidon de mafz 100 mg
Lactosa 100 mg
Estearato de magnesio 2 mg
Los componentes anteriores se mezclaron y se formaron en comprimidos de acuerdo con un procedimiento de preparacion de comprimidos comun, dando de esta manera comprimidos.
3. Preparacion de capsulas
conjugado de PEG-TRAIL modificado en N-terminal 100 mg Almidon de mafz 100 mg
Lactosa 100 mg
Estearato de magnesio 2 mg
10 Los componentes anteriores se mezclaron y se cargaron en capsulas de gelatina de acuerdo con un procedimiento de preparacion de capsulas comun, dando de esta manera capsulas.
4. Preparacion de una solucion inyectable
conjugado de PEG-TRAIL modificado en N-terminal 10 pg/ml Acido clorhudrico diluido BP hasta pH 3,5
Cloruro sodico inyectable BP maximo 1 ml
El conjugado de PEG-TRAIL modificado en N-terminal se disolvio en un volumen adecuado de cloruro sodico 15 inyectable BP, y se ajusto a un pH de 3,5 usando acido clorhudrico diluido BP. Se anadio adicionalmente cloruro sodico inyectable BP para conseguir un volumen deseado, y la solucion se mezclo suficientemente. Despues, la solucion de mezcla se cargo en una ampolla de 5 de tipo I hecha de vidrio transparente. El vidrio se fundio para sellar la ampolla, que se trato en autoclave a 120 °C durante 15 min, dando de esta manera una solucion inyectable.

Claims (16)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un conjugado de PEG (polietilenglicol)-TRAIL (ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral) modificado en N-terminal que comprende:
    un TRAIL trimerico que comprende los motivos de cremallera de aminoacidos que favorecen la formacion de tnmeros en los N-terminales de los mismos; y un PEG,
    en el que el PEG esta unido al N-terminal de un monomero del TRAIL trimerico.
  2. 2. El conjugado de PEG-TRAIL modificado en N-terminal de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el PEG tiene una forma lineal o ramificada.
  3. 3. El conjugado de PEG-TRAIL modificado en N-terminal de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el PEG es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en propionato de metoxipolietilenglicol succinimidilo, metoxipolietilenglicol N-hidroxisuccinimida, metoxipolietilenglicol aldetudo, metoxipolietilenglicol maleimida y polietilenglicol de multiples ramificaciones, preferiblemente metoxipolietilenglicol aldetudo.
  4. 4. El conjugado de PEG-TRAIL modificado en N-terminal de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el PEG tiene un peso molecular entre 1.000 y 100.000, tal como entre 1.000 y 40.000, preferiblemente entre 5.000 y 40.000.
  5. 5. El conjugado de PEG-TRAIL modificado en N-terminal de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el TRAIL se obtiene en una forma nativa o modificada geneticamente (recombinante).
  6. 6. El conjugado de PEG-TRAIL modificado en N-terminal de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el TRAIL es TRAIL humano, que tiene una secuencia aminoaddica de 281 aminoacidos de longitud.
  7. 7. El conjugado de PEG-TRAIL modificado en N-terminal de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el TRAIL tiene una secuencia aminoaddica de arginina-114 a glicina-281 de la forma TRAIL humana de longitud completa (1-281).
  8. 8. El conjugado de PEG-TRAIL modificado en N-terminal de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el motivo de cremallera de aminoacidos es una cremallera de isoleucina.
  9. 9. Un metodo de preparacion del conjugado de PEG-TRAIL modificado en N-terminal de la reivindicacion 1, que comprende hacer reaccionar una amina N-terminal de un TRAIL trimerico que comprende los motivos de cremallera de aminoacidos en los N-terminales de los mismos con un grupo aldeddo de un PEG en presencia de un agente reductor.
  10. 10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 9, en el que el PEG y el TRAIL reaccionan en una relacion molar (PEG/TRAIL) de 2 a 10, preferiblemente de 5 a 7,5.
  11. 11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 9, en el que el motivo de cremallera de aminoacidos es una cremallera de isoleucina.
  12. 12. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 9, en el que el agente reductor es NaCNBH3 o NaBH4.
  13. 13. Uso del conjugado de PEG-TRAIL modificado en N-terminal de la reivindicacion 1, en la fabricacion de un medicamento para prevenir o tratar el cancer, preferiblemente uno cualquiera seleccionado del grupo que consiste en carcinoma de colon, glioma, carcinoma de pulmon, carcinoma de prostata, tumor cerebral y mieloma multiple.
  14. 14. El conjugado de PEG-TRAIL modificado en N-terminal de la reivindicacion 1, para su uso en la prevencion o el tratamiento del cancer, preferiblemente uno cualquiera seleccionado del grupo que consiste en carcinoma de colon, glioma, carcinoma de pulmon, carcinoma de prostata, tumor cerebral y mieloma multiple.
  15. 15. Uso del conjugado de PEG-TRAIL modificado en N-terminal de la reivindicacion 1, en la fabricacion de un medicamento para prevenir o tratar una enfermedad autoinmune, preferiblemente una cualquiera seleccionada del grupo que consiste en encefalomielitis autoinmune experimental, artritis reumatoide y diabetes de tipo I.
  16. 16. El conjugado de PEG-TRAIL modificado en N-terminal de la reivindicacion 1, para su uso en la prevencion o el tratamiento de una enfermedad autoinmune, preferiblemente una cualquiera seleccionada del grupo que consiste en encefalomielitis autoinmune experimental, artritis reumatoide y diabetes de tipo I.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100886783B1 (ko) 2006-06-12 2009-03-04 성균관대학교산학협력단 N-말단이 수식된 peg-trail 결합체, 이의 제조방법 및 이의 용도
AU2009303304A1 (en) * 2008-10-10 2010-04-15 Anaphore, Inc. Polypeptides that bind TRAIL-RI and TRAIL-R2
US11299528B2 (en) 2014-03-11 2022-04-12 D&D Pharmatech Inc. Long acting TRAIL receptor agonists for treatment of autoimmune diseases
KR20150133576A (ko) * 2014-05-20 2015-11-30 삼성전자주식회사 화학적 개질된 표적화 단백질 및 그의 이용
WO2016074033A1 (en) * 2014-11-13 2016-05-19 The Heart Research Institute Ltd Tumour necrosis factor (tnf)-related apoptosis-inducing ligand (trail): compositions and methods for treating wound healing
CA3008392C (en) 2015-12-17 2021-11-09 The Johns Hopkins University Ameliorating systemic sclerosis with death receptor agonists
EA201892260A1 (ru) 2016-04-07 2019-03-29 Дзе Джонс Хопкинс Юниверсити Композиции и способы для лечения панкреатита и боли с применением агонистов рецептора смерти
US11767353B2 (en) 2020-06-05 2023-09-26 Theraly Fibrosis, Inc. Trail compositions with reduced immunogenicity

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1007082T3 (da) * 1997-01-15 2007-02-19 Phoenix Pharmacologics Inc Modificeret tumor nekrose faktor
US6329336B1 (en) 1999-05-17 2001-12-11 Conjuchem, Inc. Long lasting insulinotropic peptides
KR100396983B1 (ko) * 2000-07-29 2003-09-02 이강춘 고반응성의 가지 달린 고분자 유도체 및 고분자와 단백질또는 펩타이드의 접합체
US6908963B2 (en) * 2001-10-09 2005-06-21 Nektar Therapeutics Al, Corporation Thioester polymer derivatives and method of modifying the N-terminus of a polypeptide therewith
US20060141561A1 (en) * 2002-06-24 2006-06-29 Kelley Robert F Apo-2 ligand/trail variants and uses thereof
JP2006501820A (ja) 2002-09-06 2006-01-19 バイエル・フアーマシユーチカルズ・コーポレーシヨン 修飾ｇｌｐ−１受容体アゴニストおよびそれらの薬理学的使用法
WO2005082934A2 (en) * 2004-02-20 2005-09-09 Five Prime Therapeutics, Inc. Novel apo2l and il-24 polypeptides, polynucleotides, and methods of their use
WO2006042848A2 (en) 2004-10-18 2006-04-27 Novo Nordisk A/S Growth hormone conjugates
US20060228352A1 (en) 2005-02-24 2006-10-12 Schoenberger Stephen P TRAIL and methods of modulating T cell activity and adaptive immune responses using TRAIL
KR100694994B1 (ko) * 2005-06-13 2007-03-14 씨제이 주식회사 사람 과립구 콜로니 형성인자 동종체
KR100886783B1 (ko) 2006-06-12 2009-03-04 성균관대학교산학협력단 N-말단이 수식된 peg-trail 결합체, 이의 제조방법 및 이의 용도
WO2012018616A2 (en) 2010-07-26 2012-02-09 Anaphore, Inc. Polypeptides that bind trail-r1 and trail-r2
US20130101553A1 (en) 2011-04-18 2013-04-25 The Regents Of The University Of California Inducing inactivation of fibrogenic myofibroblasts

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