MX2014010209A - Agente inhibidor para acumulacion de fluido de la cavidad corporal. - Google Patents

Abstract

El objeto de la presente invención es proporcionar un agente inhibidor de la acumulación de fluido de la cavidad corporal, el cual ejerce una eficacia del fármaco en la acumulación de fluido de la cavidad corporal que es resistente a la administración de diuréticos, y es capaz de ejercer efectos terapéuticos incluso mediante la administración sistémica. La presente invención proporciona el agente inhibidor para la acumulación de fluido de la cavidad corporal que comprende, como ingrediente activo, un conjugado covalente de interferón con polialquilenglicol.

Description

AGENTE INHIBIDOR PARA ACUMULACION DE FLUIDO DE LA CAVIDAD CORPORAL Campo de la Invención La presente invención se refiere a un agente inhibidor para la acumulación de fluido de la cavidad corporal.

Antecedentes de la Invención Existe una gran cantidad de agua en un cuerpo animal, y fluido extracelular que principalmente llena espacios entre tejidos o en la cavidad corporal, conductos, o sistema circulatorio (por ejemplo, fluido de tejido, fluido de la cavidad corporal, sangre, o linfa) es referido como "fluido corporal" . En particular, el fluido existente en la cavidad corporal es referido como un "fluido de cavidad corporal" (por ejemplo, un derrame pleural, ascitis, o derrame pericárdico) , Si bien existen pequeñas cantidades de fluidos de la cavidad corporal en una persona sana, es conocido que grandes cantidades de fluidos de la cavidad corporal se conservan en el cuerpo de un paciente con, por ejemplo, una enfermedad hepática, una enfermedad renal, una enfermedad cardíaca, cáncer, o una enfermedad inflamatoria. Cuando la acumulación de fluido de la cavidad corporal avanza, se desarrollan síntomas tales como dolor de pecho, dolor abdominal, sensación de llenura, y dificultad respiratoria. Puesto que los síntomas investigados Ref . : 250489 disminuyen notablemente la calidad de vida (QOL, por sus siglas en inglés) de un paciente, es necesario un tratamiento para la eliminación de fluido de la cavidad corporal en una etapa temprana.

Aunque el tratamiento convencional para la acumulación de fluido de la cavidad corporal es terapia de fármacos con administración de diuréticos, se inserta un tubo en la cavidad corporal para eliminar un fluido directamente a través de la cavidad corporal de succión en casos con síntomas graves. En estudios clínicos, una dosis alta de a-interferón o ß-interferón es administrada tópicamente a la cavidad corporal de un paciente con, por ejemplo, cáncer del sistema digestivo o cáncer de ovario en un intento de inhibir la acumulación de un derrame pleural canceroso (o maligno) o ascitis (Documentos no de patentes 1 a 3) .

Sin embargo, no se han logrado los efectos de inhibición de la acumulación de fluido de la cavidad corporal pueden ser útiles en aplicación clínica.

En cuanto a interferón que es utilizado como un agente terapéutico para una enfermedad hepática mediada por virus, esclerosis múltiple, o cáncer, se han desarrollado preparaciones de interferón con sostenibilidad mejorada in vivo lograda a través de la unión covalente de interferón a polietilenglicol (documentos de patente 1 a 6 y Documentos no de patente 4 y 5) .

Lista de referencias Documentos de Patente : Documento de Patente 1: Patente Estadounidense No. 4,917,888 Documento de Patente 2: Publicación Internacional O 1987/00056 Documento de Patente 3: Publicación Internacional WO 1999/55377 Documento de Patente 4: Publicación Internacional WO 2000/23114 Documento de Patente 5: JP H9-25298 A (1997) Documento de Patente 6: Patente JP No 4850514 Documentos no de patente : Documento no de patente 1: Gavin et al, Cáncer, (1993) Vol 71, pp. 2027-2030 Documento no de patente 2: Wakui et al, bioterapia, (1988) Vol 2, pp.339-347 Documento no de patente 3: Gebbia et al, in vivo, (1991) Vol 5, pp. 579-582 Documento no de patente 4: Pepinsky et al, The journal of Pharmaceutical and Experimental Therapecut ics , (2001) Vol 297, pp. 1059-1066 Documento no de patente 5: Bailón et al, Bioconjugate Chemistry, (2001) Vol. 12, p . 195-202) Sumario de la Invención Problema a ser resuelto por la invención Sin embargo, el uso de diuréticos para el propósito del tratamiento de la acumulación de fluido de la cavidad corporal tiene un riesgo de causar desequilibrio electrolítico en un paciente al que se han administrado diuréticos, y causando con ello una sensación de malestar. En ese caso, hay un problema que, si la excreción de orina se vuelve difícil, la acumulación de fluido en la cavidad corporal se agrava. Además, los efectos de los diuréticos para la eliminación de fluido de la cavidad corporal son insuficientes en casos de diseminación peritoneal o ascitis, y los efectos terapéuticos de los mismos son limitados. A pesar de la gran carga impuesta a un paciente a causa de la punción, la extracción del fluido de la cavidad corporal a través de la succión directa simplemente tiene un efecto transitorio y tiene, además, un problema que hace que las condiciones de nutrición o condiciones inmunes se vuelvan deterioradas debido a una pérdida de albúmina y globulina.

En casos de derrame pleural maligno y ascitis, por tanto, ni la administración única de interferón-ß (Documento no de patente 3) , la administración intermitente de interferón-a (Documento no de patente 1) , o administración intraperitoneal (en este caso, tópica) de interferón-a ha resultado en la inhibición de la cantidad de fluido en la cavidad corporal a niveles clínicamente notables. En los casos de ascitis maligna, además, la administración tópica de 6,000,000 unidades de interferón-ß tres veces a la semana, que también se emplea para otras indicaciones, no ha producido ningún efecto terapéutico importante. Además, la administración diaria y tópica en una dosis de 18,000,000 unidades resultó solamente en el índice de respuesta tan baja como menos de 50% (Documento no de patente 2) . Incluso cuando interferón fue administrado por vía tópica en la cavidad corporal continuamente, en consecuencia, fue imposible lograr efectos de inhibir la acumulación de fluido de la cavidad corporal que podrían ser útiles en la aplicación clínica.

En consecuencia, es un objeto de la presente invención proporcionar un agente inhibidor para la acumulación de fluido de la cavidad corporal, el cual ejerce la eficacia del fármaco en la acumulación de fluido en la cavidad corporal que es resistente a la administración de diuréticos, y es capaz de ejercer efectos terapéuticos incluso a través de la administración sistémica.

Medios para resolver el problema Los presentes inventores han realizado estudios concentrados con el fin de resolver el problema. Como resultado, encontraron que un conjugado covalente de interferón con polialquilenglicol tenía un excelente efecto inhibidor sobre la acumulación de fluido en la cavidad corporal, y completaron la presente invención.

Específicamente, la presente invención proporciona un agente inhibidor para la acumulación de fluido de la cavidad corporal que comprende, como un ingrediente activo, un conjugado covalente de interferón con polialquilenglicol .

El polialquilenglicol es preferiblemente polietilenglicol .

El interferón es preferiblemente interferón tipo 1 o interferón-?, e interferón-a o interferón- ß es particularmente preferido entre varios tipos de interferón de tipo 1.

El agente inhibidor para la acumulación de fluido de la cavidad corporal preferiblemente inhibe la acumulación de derrame pleural o ascitis, y el derrame pleural o ascitis es preferiblemente un derrame pleural refractario o ascitis acumulada debido al cáncer, cirrosis o insuficiencia renal.

En particular, los efectos de la administración de diuréticos no se puede esperar en la mayoría de los casos de derrame pleural refractario o ascitis, y por lo tanto la importancia clínica del tratamiento utilizando el agente inhibidor para la acumulación de fluido en la cavidad corporal se considera que es notable.

El agente inhibidor de la acumulación de fluido en la cavidad corporal puede ser administrado tópicamente en una cavidad corporal, pero se usa preferiblemente para la administración sistémica. En ese caso, la administración sistémica es más preferiblemente seleccionada del grupo que consiste de la administración subcutánea, administración intracutánea, administración intramuscular, administración intravenosa, y administración intraarterial .

Mediante administración sistémica, los riesgos de la punción incorrecta a órganos viscerales durante la administración tópica en la cavidad corporal, infección intracavital , y la aceleración de metástasis en la presencia de células cancerosas en la cavidad corporal pueden ser reducidas. En comparación con la administración intracavital, la gama de servicios médicos y profesionales de la salud que pueden realizar la administración sistémica se ampliada. Además, la administración intramuscular o subcutánea puede llevarse a cabo a través de la auto- inyección .

Mientras que el agente inhibidor de la acumulación de fluido en la cavidad corporal puede ser administrado diariamente en el intervalo de una o dos veces al días, se prefiere la administración intermitente en el intervalo de una vez cada dos días o más, la administración intermitente en un intervalo de una vez cada dos días a un mes es más preferido, la administración intermitente en el intervalo de una o dos veces a la semana a una vez al mes se prefiere adicionalmente , y la administración intermitente en el intervalo de una o dos veces a la semana es particularmente preferido.

Además, el uso del agente inhibidor para la acumulación de fluido de la cavidad corporal en combinación con el agente antitumoral es eficaz. En ese caso, el agente antitumoral es preferiblemente por lo menos un agente antitumoral seleccionado del grupo que consiste de 5-FU, tegafur-uracilo, tegafur-gimeracil -oteracil , y capecitabina .

Efectos de la Invención El agente inhibidor para la acumulación de fluido en la cavidad corporal de acuerdo con la presente invención es capaz de inhibir la acumulación de fluido de la cavidad corporal y eliminar fluido de la cavidad corporal a través de administración sistémica, así como a través de administración tópica. Por lo tanto, el agente inhibidor para la acumulación de fluido de la cavidad corporal de acuerdo con la presente invención puede ejercer efectos terapéuticos sobre la acumulación de fluido de la cavidad corporal y aliviar el dolor en el pecho, dolor abdominal, sensación fuerte de plenitud, y dificultad respiratoria que resulta de la acumulación de fluido de la cavidad corporal.

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 muestra los efectos de la administración intraperitoneal de un conjugado covalente de interferón-ß con polietilenglicol para inhibir la acumulación de ascitis observada en modelos de ratón con metástasis peritoneal de cáncer gástrico.

La Figura 2 muestra los efectos de administración subcutánea de un conjugado covalente de ínterferón-ß con polietilenglicol para inhibir la acumulación de ascitis observada en modelos de ratón con metástasis peritoneal de cáncer gástrico.

La Figura 3 muestra los efectos de administración subcutánea de un conjugado covalente de interferón-a con polietileno glicol para inhibir la acumulación de ascitis observada en modelos de ratón con metástasis peritoneal de cáncer gástrico.

Las Figuras 4A y 4B muestran los efectos de la administración intraperitoneal de un conjugado covalente de interferón-ß con polietilenglicol para inhibir la recurrencia de acumulación de una ascitis (en este caso, reacumulación después de paracentesis ascítica) observada en modelos de ratón con metástasis peritoneal de cáncer gástrico.

La Figura 5 muestra los efectos de la administración subcutánea de un conjugado covalente de interferón-ß con polietilenglicol para inhibir la recurrencia de acumulación de ascitis (en este caso, después de la reacumulación de paracentesis ascítica) observada en modelos de ratón con metástasis peritoneal de cáncer de ovario.

La Figura 6 muestra los efectos de la administración subcutánea de un conjugado covalente de ínterferón-ß con polietilenglicol para mejorar la tasa de supervivencia observada en los modelos de ratón con metástasis peritoneal de cáncer de ovario.

Descripción Detallada de la Invención El agente inhibidor para la acumulación de fluido en la cavidad corporal de acuerdo con la presente invención es caracterizada en que comprende, como un ingrediente activo, un conjugado covalente de interferón con polialquilenglicol.

Una, o dos o más moléculas de polialquilenglicol se pueden unir a una molécula de interferón. El peso molecular total de las moléculas de polialquilenglicol que se une a una molécula de interferón es preferiblemente 5,000 hasta 240,000, más preferiblemente 10,000 hasta 80,000, y además preferiblemente 39,000 hasta 45,000. Aquí, cuando dos moléculas de polialquilenglicol que tienen un peso molecular de 20,000 están unidas de forma covalente a una molécula de interferón, esto significa que polialquilenglicol con un peso molecular de 40,000 se une de forma covalente a una molécula de interferón.

Una, o dos o más moléculas de interferón se pueden unir a una molécula de polialquilenglicol. Incluso en este caso, el peso molecular de una molécula de polialquilen glicol es preferiblemente 5,000 hasta 520,000, más preferiblemente 10,000 hasta 200,000, y además preferiblemente 39,000 hasta 45,000.

Una molécula de polialquilenglicol está compuesta de muchas unidades de repetición, y el peso molecular de polialquilenglicol generalmente varía de la molécula del individuo a molécula del individuo. Por lo tanto, un peso molecular de polialquilenglicol es expresado como un peso molecular promedio. En esta descripción, por lo tanto, el peso molecular del polialquilenglicol significa peso molecular promedio .

A medida que el polialquilenglicol, un compuesto polimérico que es aceptable como un portador de fármaco, o inactivo o tiene extremadamente baja actividad en un cuerpo vivo y es no tóxico o tiene toxicidad extremadamente baja, puede ser preferiblemente utilizado.

Los ejemplos del interferón incluyen una proteína que tiene la misma secuencia de aminoácidos igual que de un interferón de origen natural (en lo sucesivo, referido como un "interferón de origen natural"), un interferón imitante en aminoácidos que tiene una secuencia de aminoácidos derivada a partir de la secuencia de aminoácidos del interferón de origen natural por deleción, sustitución o adición de uno o varios aminoácidos y que tiene una actividad biológica de interferón (en adelante, referido por como "actividad de interferón"), un interferón con un resto de cadena de azúcar modificado del interferón de origen natural, y el interferón sin un resto de cadena de azúcar.

Los ejemplos del interferón, por lo tanto, incluyen un interferón recombinante preparado a través de la ingeniería genética sobre la base de la secuencia de aminoácidos o de la secuencia de nucleótidos de un interferón de origen natural.

El interferón puede ser obtenido a través de técnicas convencionales tales como extracción del tejido, síntesis de proteínas a través de la ingeniería genética, o producción biológica utilizando una célula natural o recombinante que expresa el interferón. Por lo tanto, un interferón disponible en el comercio también se puede usar como el interferón.

El interferón es preferiblemente interferón tipo 1 o interferón-? . Ejemplos de interferón de tipo 1 incluyen interferón-a, interferón- ß , interferón-?, interferón-e , y el interferón-?, y el interferón-a o interferón- ß es más preferido .

El término "conjugado covalente de interferón con polialquilenglicol" se refiere a un conjugado de una, o dos o más moléculas de polialquilenglicol unidas de forma covalente a una molécula de interferón y que tiene actividad del interferón, o un conjugado de una, dos o más moléculas de interferón unidas covalentemente a una molécula de polialquilenglicol y que tiene actividad de interferón. Se prefiere un conjugado de una, o dos o más moléculas de polialquilenglicol unidas de forma covalente a una molécula de interferón y que tiene actividad del interferón. El conjugado covalente de interferón con polialquilenglicol puede ser un conjugado de interferón directamente unido a polialquilenglicol o un conjugado de interferón unido a polialquilenglicol a través de un enlace o similar.

La dosis del conjugado covalente de interferón con polialquilenglicol puede ser sobreexpresada en el título de interferón (unidades; en lo sucesivo mostradas como "U" ) o una masa (g) . Un conjugado covalente de interferón con polialquilenglicol preferiblemente retiene por lo menos 10% de la actividad específica de interferón (en este caso, actividad de interferón en peso) en comparación con el interferón antes de que se una de forma covalente al polialquilenglicol.

En esta descripción, la unión de un compuesto polimérico a una proteína es también, referida como modificación química o modificación de una proteína con un compuesto polimérico. El conjugado covalente de interferón con polialquilenglicol es también referido como un interferón químicamente modificado con polialquilenglicol o simplemente como interferón modificado. En particular, el conjugado covalente de interferón con polietilenglicol (en lo sucesivo, abreviado como "PEG") es también referido como el interferón modificado con PEG, interferón pegilado, o interferón unido a PEG.

El interferón se une covalentemente a polialquilenglicol en, por ejemplo, un grupo amino, un grupo tiol, el extremo N-terminal, el extremo C-terminal, o una cadena de azúcar del interferón. Alternativamente, un aminoácido no natural que se ha introducido en el interferón a través de una técnica de ingeniería genética conocida se puede utilizar como un sitio de unión covalente .

La actividad del interferón del conjugado covalente de interferón con polialquilenglicol puede ser probada a través de una técnica de ensayo biológico conocido. Específicamente, para determinar la actividad del interferón, las células que son muy sensibles al interferón (por ejemplo, la célula FL) pueden ser tratadas con un analito que comprende un interferón, una cantidad dada de virus Sindbis infeccioso, virus de Vesicular stomatitis (abreviado como "VSV" ) o similares se pueden agregar a las células tratadas para infectar las células, y el grado de resistencia contra virus inducidos por el interferón (en lo sucesivo, referida como "actividad antivirus") puede ser probado. La actividad anti-virus es probada utilizando la inhibición de crecimiento del virus como un indicador, y puede ser expresada como una concentración de interferón (U) , con base en el factor de dilución de los analitos que inhibe 50% de los efectos citopáticos (abreviados como "CPE" ) para destruir las células como resultado de crecimiento del virus (Shigeyasu Kobayashi et al., "Menneki Seikagaku Jikkcnhou in Zoku Seikagaku Jikken Koza 5 (Successive Course on Biochemical Experiment 5 : Experimental Approaches in lmmunobiochemistry) , " Japanese Biochemical Soc. ed. , Tokyo Kagaku Doj in (1986). p 245).

El conjugado covalente de interferón con polialquilenglicol puede ser producido por una técnica conocida. Por ejemplo, un método para unir en forma covalente polialquilenglicol a un grupo amino de un interferón se describe en la Patente Estadounidense No 4,917,888 y la Publicación Internacional WO 1987/00056. Un método para unir en forma covalente polialquilenglicol a un grupo tiol de un interferón se describe en la Publicación Internacional WO 1999/55377. Un método para unir en forma covalente un polímero al extremo N-terminal de un interferón se describe en la Publicación Internacional WO 2000/23114 y JP H09-25298 A (1997) . Un método para unir en forma covalente polialquilenglicol a una cadena de azúcar de un interferón se describe en Macromolecular Chemistry (1978) Vol . 179, p. 301, y Patentes Estadounidenses No. 4,110,380 y 4,179,337. Un método para unir en forma covalente polialquilenglicol a un aminoácido no natural introducido en un interferón se describe en Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters (2004) vol. 14, pp . 5743-5745. La unión covalente de polialquilenglicol al extremo C-terminal de un interferón se puede hacer mediante la introducción en cisteína o un aminoácido no natural en el extremo C-terminal o en las proximidades del mismo.

Es necesario activar un extremo terminal de polialquilenglicol para ser sometido a una reacción de unión covalente dependiendo de un método de formar un enlace entre un interferón y polialquilenglicol. Un derivado de polialquilenglicol que comprende un extremo terminal activado con una estructura de éster de hidroxisuccinimida, éster de nitrobencenosulfonato, maleimida, disulfuro de orto-piridilo, vinilsulfona, maleimida, yodoacetamida, ácido carboxílico, azida, fosfina, o amina se puede utilizar para la unión covalente del interferón y polialquilenglicol, y tal derivado de polialquilenglicol puede ser sintetizado con técnicas conocidas .

El conjugado covalente de interferón con polialquilenglicol es preferiblemente un conjugado covalente de interferón con PEG. En un conjugado covalente de interferón preferido con PEG, una molécula de PEG con un peso molecular de 5,000 a 240,000, preferiblemente 80,000 hasta 10,000, y más preferiblemente 39,000 hasta 45,000 está unido de forma covalente a una molécula de interferón.

Un ejemplo preferido del conjugado covalente de interferón con PEG es un conjugado covalente de interferón- ß humano con PEG, que se puede preparar por el método descrito en, por ejemplo, la patente JP N° 4,850,514. PEG está unido preferiblemente a interferón- ß humano en el grupo amino de la lisina en la posición 19 o 134 de la secuencia de aminoácidos del interferón- ß humano, y un conjugado covalente de una molécula de PEG unida de forma covalente a interferón- humano en ese sitio es más preferido. Un ejemplo específico es un conjugado covalente de una molécula de PEG con un peso molecular de 40,000 o más (preferiblemente 42,000) unido covalentemente a interferón- ß humano en el grupo amino de lisina en la posición 134 de su secuencia de aminoácido.

El término "lisina en la posición 134 de la secuencia de aminoácido de interferón- ß humano" utilizado aquí se refiere a una lisina de aminoácido que se encuentra en la posición 134 del aminoácido N-terminal (metionina; designada como la posición 1) de la secuencia de amino ácido del interferón- ß humano consiste de 166 aminoácidos (SEC ID N0:1). Aquí, la posición del residuo de aminoácido dentro de un interferón se indica como un número de posición en relación con el aminoácido N-terminal de interferón designado como la posición 1.

Otro ejemplo preferido del conjugado covalente de interferón con PEG es un conjugado covalente de interferón-humano con PEG. Los ejemplos específicos incluyen un conjugado covalente de interferón-a con PEG en el que una molécula de PEG ramificada con un peso molecular de aproximadamente 40,000 se une de forma covalente a interferón humano-a-2a en uno de los residuos de lisina (sitios principales: posiciones 31, 121, 131, y 134) mediante un enlace amida (nombre general: peginterferón alfa-2a) ; y un conjugado covalente de interferón-a con PEG en el que una molécula metoxi-PEG con un peso molecular de aproximadamente 12,000 se une de forma covalente al interferón-a-2b humano en uno de los residuos del aminoácido (cisteína en la posición 1, histidina en la posición 7, lisina en la posición 31, histidina en la posición 34, lisina en la posición 49, lisina en la posición 83, lisina en la posición 112, lisina en la posición 121, tirosina en la posición 129, lisina en la posición 131, lisina en la posición 133, lisina en la posición 134, serina en la posición 163, o lisina en la posición 164) a través de un grupo carbonilo (nombre general: peginterferón-a-2b) .

El término "cavidad corporal" se refiere a un espacio en un cuerpo animal que se ha formado en un estado aislado desde el exterior del mismo, que incluye la cavidad torácica, la cavidad abdominal y la cavidad pericárdica. El término "fluido de la cavidad corporal" se refiere a líquido que está presente en una cavidad corporal, y líquido en la cavidad torácica, la cavidad abdominal, o la cavidad pericárdica se conoce como un derrame pleural, ascitis, derrame pericárdico, respectivamente .

El término "acumulación de fluido de la cavidad corporal" se refiere al que es más de una cantidad normal de un fluido de cavidad corporal en la cavidad corporal . El término "agente inhibidor de la acumulación de fluido de la cavidad corporal" se refiere a un fármaco que tiene un efecto para inhibir la acumulación de un fluido en la cavidad corporal y eliminar un fluido de la cavidad corporal .

El efecto que inhibe la acumulación de fluido de la cavidad corporal del agente inhibidor para la acumulación de fluido de la cavidad corporal puede ser probado utilizando modelos de enfermedad de las enfermedades subyacentes que causan la acumulación de fluido de la cavidad corporal (por ejemplo, cáncer) . Ejemplos tales de modelos de enfermedades examinadas incluyen modelos de ratones con metástasis peritoneal de cáncer gástrico (Cáncer Science, (2003) vol . 94, pp. 112-118) y modelos de ratón con metástasis peritoneal de cáncer de ovario (Molecular cáncer therapeutics , (2007) vol. 6, pp. 2959-2966) .

El agente inhibidor para la acumulación de fluido de la cavidad corporal puede ser utilizado para la prevención o tratamiento de la acumulación de un fluido de cavidad corporal, y por lo tanto se puede utilizar para inhibir su recurrencia después de la eliminación física del fluido de la cavidad corporal . El agente inhibidor para la acumulación de fluido de la cavidad corporal puede ser utilizado preferiblemente contra la acumulación de un derrame pleural o ascitis .

Ejemplos de enfermedades subyacentes que causan la acumulación de fluido de la cavidad corporal incluyen cáncer, enfermedades infecciosas (por ejemplo, bacteriana, tuberculosa, fúngica, neumonía atípica, virus, o infección parasitaria) , enfermedad inflamatoria (por ejemplo, pancreatitis, sarcoidosis, o pulmón causada por asbesto) , enfermedad del tejido conectivo (por ejemplo, reumatismo, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Sjogren, granulomatosis de Wegener, síndrome de Churg-Strauss) , enfermedades endocrinas (por ejemplo, mixedema) , enfermedad hepática (por ejemplo, cirrosis) , enfermedad renal (por ejemplo, síndrome nefrótico) , y enfermedad cardiaca (por ejemplo, insuficiencia cardíaca congestiva) . El agente inhibidor de la acumulación de fluido de la cavidad corporal puede ejercer efectos terapéuticos sobre la acumulación de fluido de la cavidad corporal causado por tales enfermedades.

Además, el agente inhibidor para la acumulación de fluido de la cavidad corporal, por lo tanto, puede ejercer efectos terapéuticos sobre una acumulación de fluido de la cavidad corporal refractario, y es particularmente utilizado preferiblemente contra un derrame pleural refractario o la acumulación de ascitis. El término "acumulación de fluido de la cavidad corporal refractario" se refiere a una acumulación de fluido de la cavidad corporal que es difícil de controlar a través de un tratamiento médico con, por ejemplo, diuréticos (en este caso, resistente a diurético o intolerante a diurético) e incluye, por ejemplo, un derrame pleural refractario, o ascitis acumulada debido a cáncer, cirrosis o insuficiencia renal.

Entre los derrames pleurales refractarios o ascitis refractaria, en particular, un derrame pleural y una ascitis acumulada debido a cáncer son referidos como derrame pleural canceroso (o maligno) y ascitis cancerosa (o maligna) , respectivamente, y sus síntomas son conocidos por ser graves. Sin embargo, el agente inhibidor para la acumulación de fluido de la cavidad corporal por lo tanto, puede ejercer efectos terapéuticos sobre la acumulación del derrame pleural maligno o ascitis maligna. El derrame pleural maligno o ascitis maligna se genera debido a la metástasis intratorácica o peritoneal del cáncer o pleuresía o peritonitis causada por el cáncer.

El agente inhibidor para la acumulación de fluido de la cavidad corporal es especialmente utilizado preferiblemente para el tratamiento o la prevención de un derrame pleural maligno o ascitis maligna entre derrames pleurales refractarios o ascitis refractaria.

El agente inhibidor para la acumulación de fluido de la cavidad corporal se puede utilizar en una mezcla con otros agentes en cantidad apropiada o utilizada en combinación con otros agentes para el propósito de complementar o mejorar los efectos de inhibir la acumulación de fluido de la cavidad corporal o reducir una dosis.

Ejemplos de fármacos que se pueden utilizar en combinación con el agente inhibidor para la acumulación de fluido de la cavidad corporal incluyen aquellos que son generalmente utilizados para el tratamiento de enfermedades subyacentes que causan la acumulación de un fluido de la cavidad corporal. Cuando una acumulación de fluido de la cavidad corporal canceroso será inhibida, por ejemplo, el agente inhibidor se puede utilizar en combinación con un agente antitumoral. Ejemplos de agentes anti-tumorales preferidos para ser utilizados en combinación incluyen un agente objetivo molecular, un agente alquilante, un antimetabolito, un agente que inhibe microtúbulos , un unhibidor de topoisomerasa, un fármaco de platino, y un agente antibiótico carcinostático . Los ejemplos más preferidos de los agentes antitumorales , son particularmente cisplatino carboplatino, hidrocloruro de irinotecán, 5-FU, tegafur-uracilo, tegafur-gimeracil-oteracil , capecitabina, taxol, taxotere, imatinib, y sunitinib. Tegafur-gimeracil-oteracil de potasio (nombre comercial: TS-l®) es una forma particularmente preferible de tegafur-gimeracil-oteracil. El agente inhibidor de la acumulación de fluido de la cavidad corporal para ser utilizado en combinación con el agente antitumoral se puede administrar simultáneamente con un agente antitumoral. Para mejorar los efectos de inhibir ascitis, alternativamente, el agente inhibidor puede ser administrado por separado de un agente antitumoral antes o después del tratamiento con el agente antitumoral.

El agente inhibidor para la acumulación de fluido de la cavidad corporal de la presente invención se puede administrar como una preparación mixta con el agente antitumoral a un solo sitio. Alternativamente, estos agentes pueden ser administrados por separado al mismo sitio o diferentes sitios.

La dosis (título) y la frecuencia de administración del agente inhibidor para la acumulación de fluido de la cavidad corporal son determinados adecuadamente dependiendo de la edad, peso corporal, y los síntomas del sujeto, forma de dosificación, vía de administración, y similares. El agente puede ser administrado diariamente a un sujeto humano en una dosis de 10,000 U hasta 18,000,000 U/dosis en el intervalo de una vez o dos veces al día. La administración intermitente se lleva a cabo preferiblemente en el intervalo de una vez cada dos o más días, más preferiblemente en el intervalo de una vez cada dos días a un mes, más preferiblemente en el intervalo de una vez o dos veces por semana a una vez al mes, y particularmente preferiblemente en el intervalo de una o dos veces a la semana .

El agente inhibidor de la acumulación de fluido de la cavidad corporal puede ser utilizado como un medicamento que es útil para el tratamiento y la prevención de la acumulación de fluido de la cavidad corporal contra un mamífero (por ejemplo, un ratón, rata, hámster, conejo, perro, mono, vaca, oveja, o humano) .

En un entorno clínico, el conjugado covalente de interferón con polialquilenglicol puede utilizarse directamente, o se puede utilizar en forma de una composición farmacéutica en mezcla con un portador, excipiente o similares farmacológicamente aceptables conocidos.

El agente inhibidor para la acumulación de fluido de la cavidad corporal puede ser sistémicamente o tópicamente administrado. Aquí, la administración tópica se refiere a la administración en un sitio en el que se desean los efectos directos; es decir, un sitio en el cual un fluido de cavidad corporal se acumularía o se ha acumulado. Por ejemplo, la administración intraperitoneal del agente inhibidor para la acumulación de fluido de la cavidad corporal contra una acumulación de ascitis cae en la categoría de acumulación tópica. La administración sistémica se refiere a un modo de administración que permite a un fármaco que se absorba a través del sistema digestivo o una vía diferente del sistema digestivo y proporciona los efectos por todo el cuerpo (no por vía tópica) , en un sitio diferente a un sitio en el cual se desean los efectos directos; es decir, en un sitio diferente de un sitio en el cual un fluido de la cavidad corporal se acumularía o se ha acumulado. Los ejemplos de administración sistémica incluyen administración oral, administración intraperitoneal (excepto en los casos de acumulación de ascitis) , administración subcutánea, administración intracutánea , administración intramuscular, administración intravenosa, y administración intraarterial . Hay que señalar que la administración intraperitoneal del agente inhibidor para la acumulación de fluido de la cavidad corporal contra una acumulación de ascitis corresponde a la administración tópica. Se prefiere qué el agente inhibidor para la acumulación de fluido de la cavidad corporal se puede administrar sistémicamente, y es más preferido que el agente inhibidor sea administrado por vía subcutánea, intracutánea, intramuscular, intravenosa, o intraarterial .

Los ejemplos preferidos del agente inhibidor para la acumulación de fluido de la cavidad corporal incluyen un agente inhibidor para la acumulación de fluido de la cavidad corporal que comprende, como un ingrediente activo en, un conjugado covalente de interferón con PEG, y es para uso en la administración sistémica y la administrac ón intermitente en el intervalo de dos o más días. En un ejemplo más preferido, el agente inhibidor para la acumulación de fluido de la cavidad corporal comprende, como un ingrediente activo, un conjugado covalente de interferón- o interferón- ß con PEG, y es para uso en la administración sistémica y administración intermitente en un intervalo de dos o más días. En un ejemplo preferido adicional, el agente inhibidor para la acumulación de fluido de la cavidad corporal comprende, como un ingrediente activo, un conjugado covalente de interferón-a o interferón- ß con PEG, y es para uso en la administración subcutánea y la administración intermitente en un intervalo de dos o más días. En un ejemplo particularmente preferido, el agente inhibidor para la acumulación de fluido de la cavidad corporal comprende, como ingrediente activo, un conjugado covalente de interferón-a o interferón-u- ß con PEG, y es para uso en la administración subcutánea en el intervalo de una o dos veces por semana y para uso en la inhibición de un derrame pleural refractario o acumulación de ascitis.

Ejemplos de formas de dosificación del agente inhibidor para la acumulación de fluido de la cavidad corporal para la administración oral incluyen tabletas, pildoras, cápsulas, gránulos, jarabes, emulsiones, y suspensiones. Las formas de dosificación pueden ser producidas de conformidad con las técnicas conocidas, y comprenden un portador o excipiente que es generalmente utilizado en el campo farmacéutico. Los ejemplos de portadores y excipientes usados para tabletas incluyen lactosa, maltosa, sacarosa, almidón, y estearato de magnesio .

Ejemplos de formas de dosificación del agente inhibidor para la acumulación de fluido de la cavidad corporal para la administración parenteral incluyen preparaciones inyectables, colirios, ungüentos, cataplasmas, supositorios, absorbentes transnasales, absorbentes transpulmonares , absorbentes transdérmicos y liberación controlada de agentes tópicos, y pueden ser producidos de acuerdo con técnicas conocidas. Las preparaciones líquidas se pueden preparar, por ejemplo, disolviendo el conjugado covalente de interferón con polialquilenglicol en una solución acuosa estéril para preparaciones inyectables o suspendiendo el conjugado en la solución de extracción, y emulsionante para incorporar el conjugado en un liposoma. Las preparaciones sólidas se pueden preparar mediante, por ejemplo, la adición de excipientes, tales como manitol, trehalosa, sorbitol, lactosa o glucosa, para el conjugado covalente de interferón con polialquilenglicol y la preparación de productos liofilizados. Además, tales productos liofilizados pueden estar en polvo y ser utilizados. Alternativamente, los polvos se pueden mezclar con ácido poliláctico o ácido glicólico, y la mezcla resultante puede ser solidificada y utilizada. Agentes de gel pueden ser preparados, por ejemplo, disolviendo el conjugado covalente de interferón con polialquilenglicol en un espesante o polisacárido, tal como glicerol, PEG, metilcelulosa, carboxi metil celulosa, ácido hialurónico, o sulfato de condroitina.

Los estabilizadores, tales como albúmina de suero humano, inmunoglobulina humana, OÍ2 -macroglobulina, o un aminoácido, se pueden agregar a cualquiera de las preparaciones anteriores, y agentes de dispersión o promotores de absorción tales como alcohol, alcohol de azúcar, tensioactivo iónico, o tensioactivo no iónico, pueden ser agregados, siempre que la actividad del interferón no se vea afectada. También, trazas de metales o sales de ácidos orgánicos se pueden agregar según sea apropiado.

Ej emplos La presente invención se describe en mayor detalle con referencia a los siguientes ejemplos, aunque el alcance técnico de la presente invención no se limita a los ejemplos de síntesis.

[Ejemplo 1] Preparación de conjugado covalente de interferón-ß con PEG De acuerdo con el método descrito en el ejemplo 6 de la patente JP No 4,850,514, el "conjugado covalente de interferón-ß con PEG" en el que una molécula de PEG con un peso molecular de 42,000 se une de forma covalente al grupo amino de lisina en la posición 134 de la secuencia de aminoácidos de interferón-ß humano recombinante (SEC ID NO: 1) fue preparado. Específicamente, etilenglicol (concentración final: 20%) fue agregado al interferón-ß humano recombinante (concentración final: 200 g/ml) que es disuelto en 100 mM de solución amortiguadora de acetato (pH 5.0) que contiene cloruro de sodio 0.5 M, y el pH fue ajustado a 7.6 con solución de fosfato disódico de hidrógeno. PEG activado con éster de hidroxisuccinimida (peso molecular: 42,000; producto No. 61G99122B01 ; NOF Corporation) se agregó al mismo y se mezclaron, y se sometió a una reacción de unión durante la noche a 4°C. A esta solución de reacción de unión, 10 mM de solución amortiguadora de acetato (pH 4.5) fue agregada en una cantidad de 5 veces mayor que el volumen de los mismos, y el resultante fue aplicado a una columna de intercambio catiónico (Toyo pearl CM 650 (S) ; Tosoh Corporation) equilibrado con 10 m de solución amortiguadora de acetato (pH 4.5). Las proteínas fueron eluidas y se fraccionron con el desarrollo de disolventes de desarrollo descritos a continuación. <Solventes de desarrollo> Solvente A: 10 mM de solución amortiguadora de acetato (pH 4.5) Solvente B: 10 mM de solución amortiguadora de acetato (pH 4.5) que contiene cloruro de sodio 1 M Mientras que una mezcla de un Solvente A y Solvente B se permitió pasar a través de la columna de intercambio catiónico en una cantidad de 40 veces de la cantidad de la resina de columna, una proporción de Solvente B para la liberación de líquido continuamente aumentó desde 0% hasta 65% para llevar a cabo la elución. La fracción eluida fue aplicada a la columna SP-5PW (Tosoh Corporation) y el "conjugado covalente de interferón-ß humano con PEG" en el que una molécula de PEG con un peso molecular de 42,000 se une de forma covalente al grupo amino de lisina en la posición 134 de la secuencia de aminoácidos de interferón-ß humano recombinantes (SEC ID NO: 1) fue aislado (en adelante, referidos como "PEG- IFN- ß" ) .

De la misma manera como con el método para la preparación de PEG- IFN- ß , un "conjugado covalente de interferón-ß de ratón con PEG" en el que una molécula de PEG con un peso molecular de 42,000 está unido de forma covalente a interferón-ß de ratón recombinante fue preparado (en lo sucesivo, referido como "PEG-mIFN-ß") .

El interferón-ß humano recombinante fue preparado de acuerdo con el método descrito en Nucleic Acid Research, 1980, vol . 8, pp. 4057-4074, el interferón-ß de ratón recombinante fue preparado de acuerdo con el método descrito en el Journal of Interferon Research, 1986, vol. 6, pp. 519-526.

[Ejemplo 2] Efecto de PEG-IFN-ß para inhibir la acumulación de ascitis mediante administración tópica Los modelos de ratón con metástasis peritoneal de cáncer gástrico fueron producidos, y el efecto de PEG-IFN-ß para inhibir la acumulación de ascitis por administración tópica fueron evaluados de acuerdo con el método de Nakanishi et al. (Cáncer Science, 2003, vol. 94, pp. 112-118).

Las células GCIY-EGFP preparadas introduciendo el plásmido pEGFP-Cl (Clontech) en las células de cáncer gástrico humanas GCIY (No. RCB0555) obtenidas del Banco de Células, RIKEN BioResource Center, fueron cultivadas y mantenidas utilizando medio de DMEM que contiene 10% de suero fetal bovino en una incubadora a 37°C y 5% de C02. Las células GCIY-EGFP fueron recolectadas con tripsina/EDTA y lavadas con solución salina equilibrada de Hank (HBSS) para preparar una suspensión de células GCIY-EGFP. La suspensión de células GCIY-EGFP (2.5 x 106 células/ratón), fue transplantada por vía intraperitoneal a ratones nude KSN macho (obtenido de Shizuoka Laboratory Animal Center) , y si las células GCIY-EGFP fueron implantadas se confirmó al día siguiente de acuerdo con el método de Ohashi et al. (International Journal of Oncology (2005) vol. 27, pp. 637-644). Ratones en los que el injerto de las células GCIY-EGFP fue confirmado se sometieron al experimento como modelos de ratones con metástasis peritoneal de cáncer gástrico.

® El interferón-ß humano de origen natural (Feron ; Toray Industries, Inc.) o PEG-IFN-ß preparado en el Ejemplo 1 fue administrado por vía intraperitoneal (en este caso, en forma tópica) a modelos de ratón con metástasis peritoneal de cáncer gástrico (n = 8) en cantidades de 5,000,000 U/ratón/dosis . La administración fue iniciada en el día después del trasplante y realizada una vez por semana durante 4 semanas. Ascitis fue recolectada de los modelos de ratón con metástasis peritoneal de cáncer gástrico bajo anestesia una semana después de la última administración, y el volumen de líquido fue medido.

Los resultados se muestran en la Figura 1. El eje vertical representa la cantidad de ascitis (mediana; mi) . En el eje horizontal, "IFN-ß" representa el resultado del grupo de administración tópica de interferón-ß humano de origen natural y "PEG-IFN-ß" representa el resultado del grupo de administración tópica de PEG-IFN-ß.

Como resultado, la acumulación de ascitis causada por la metástasis peritoneal de células de cáncer gástrico no fue inhibida en el grupo de administración tópica de interferón-ß humano de origen natural, pero la acumulación de ascitis fue inhibida a un nivel normal en el grupo de administración tópica de PEG-IFN-ß. Este demostró que interferón-ß sin modificar no presenta un efecto de inhibir la acumulación de ascitis por administración intermitente una vez a la semana incluso cuando se administra por vía tópica a una dosis elevada de 5,000,000 U/ atón/dosis dentro de una cavidad abdominal a la que las células de cáncer gástrico habían hecho metástasis, mientras que el conjugado covalente de interferón-ß con PEG exhibe un efecto notable de la acumulación de inhibición de ascitis con el mismo esquema de administración intermitente.

Los resultados indican que el conjugado covalente de interferón-ß con polialquilenglicol tiene un efecto de inhibir la acumulación de ascitis y es capaz de inhibir notablemente la acumulación de fluido de la cavidad corporal mediante administración tópica.

[Ejemplo 3] Efecto de PEG-IFN-ß para inhibir la acumulación de ascitis mediante administración sistémica Los modelos de ratón con metástasis peritoneal de cáncer gástrico fueron producidos mediante el trasplante de células de cáncer gástrico humano, células GCIY-EGFP, por vía intraperitoneal en ratones mide KSN macho de la misma manera como en el Ejemplo 2.

El interferón-ß humano de origen natural (Feron"5; Toray Industries, Inc.), o PEG-IFN-ß o PEG-mlF- ß preparado en el Ejemplo I se administró por vía subcutánea en las áreas dorsales (en este caso, a través de la administración sistémica) de los modelos de ratón con metástasis peritoneal de cáncer gástrico (n = 6) en una cantidad de 5,000 U/ratón/dosis . La administración se inició en el día después del trasplante y realizó dos veces por semana durante 4 semanas. Solución amortiguadora de fosfato (PBS) fue administrada al grupo de control de la misma manera. Ascitis fue recolectada de los modelos de ratón con metástasis peritoneal de cáncer gástrico bajo anestesia 2 semanas después de la administración final y el volumen de líquido fue medido.

Los resultados se muestran en la Figura 2. El eje vertical representa la cantidad de ascitis (mediana; mi) . En el eje horizontal, "Control (PBS)" representa el resultado del grupo de administración sistémica de solución amortiguadora de fosfato (PBS) (grupo de control) , "IFN-ß" representa el resultado del grupo de la administración sistémica de interferón-ß humano de origen natural, "PEG-IFN-ß" representa el resultado del grupo de administración sistémica de PEG-IFN-ß, y "PEG-mIFN-ß" representa el resultado del grupo de administración sistémica de PEG-mIFN- ß .

Como resultado, la cantidad de ascitis acumulada resultó ser mayor en el grupo de administración sistémica de interferón-ß humano de origen natural que en el grupo de administración sistémica de solución amortiguadora de fosfato (PBS) , y por lo tanto la acumulación de ascitis causada por metástasis peritoneal de cáncer gástrico no fue inhibida en el primer grupo, mientras que la acumulación de ascitis fue inhibida notablemente en ambos de los grupos de administración sistémica de PEG-IFN-ß y el grupo de administración sistémica de PEG-mIFN- ß. Esto demostró que interferón-ß sin modificar no presenta ningún efecto de inhibición de acumulación de ascitis mediante administración sistémica, mientras que el conjugado covalente de interferón-ß con PEG exhibe un efecto notable de la inhibición de acumulación de ascitis a través de la administración sistémica.

Los resultados indican que el conjugado covalente de interferón-ß con polialquilenglicol es capaz de inhibir notablemente la acumulación de fluido de la cavidad corporal, incluso cuando se administró por vía sistémica en dosis clínica en un horario intermitente.

[Ejemplo 4] Efecto del conjugado covalente de interferón-a con PEG para inhibir la acumulación de ascitis mediante la administración sistémica.

Los modelos de ratón con metástasis peritoneal de cáncer gástrico fueron producidos mediante el trasplante de células de cáncer gástrico humano, células de GCIY-EGFP, por vía intraperitoneal en ratones nude KSN macho en la misma manera que en el Ejemplo 2.

La cápsula TS-l® (en adelante abreviada como "TS-1") (Taiho Pharmaceutical Co. , LTD.) fue administrada por vía oral a los modelos de ratón con metástasis peritoneal de cáncer gástrico en una dosis de 0.5 mg de tegafur/ratón/día . La administración fue iniciada en el día después del trasplante y realizó diariamente durante 4 semanas.

Al mismo tiempo, el peginterferón-alfa-2a (conjugados covalentes de interferón- con PEG en el que una molécula de PEG ramificada con un peso molecular de aproximadamente 40,000 se une de forma covalente a un sitio de residuo de lisina del interferón-a-2a recombinante mediante un enlace de amida) (Pegasys® para inyección subcutánea, Chugai Pharmaceutical Co. Ltd.) fue administrado por vía subcutánea en las áreas dorsales (en este caso, a través de administración sistémica) de los modelos de ratón con metástasis peritoneal de cáncer gástrico (n = 6) en una cantidad de 5,000 U/ratón/dosis . La administración fue iniciada en el día después del trasplante y se realizó dos veces por semana durante 4 semanas. Como control, solución salina amortiguada con fosfato (PBS) fue administrada por vía subcutánea (en este caso, en forma sistémica) a los modelos de ratón con metástasis peritoneal de cáncer gástrico dos veces a la semana durante 4 semanas desde el día después del trasplante.

La ascitis fue recolectada de los modelos de ratón con metástasis peritoneal de cáncer gástrico con anestesia 2 semanas después de la última administración, y el volumen de líquido fue medido.

Los resultados se muestran en la Figura 3. El eje vertical representa la cantidad de ascitis (medio; mi) . En el eje horizontal, "TS-1 + PBS" representa el resultado del grupo de administración de TS-1 en combinación con solución amortiguadora de fosfato (PBS) (en este caso, TS-1 + grupo PBS) , y "TS-1 + PEG- IFN-a2a" representa el resultado del grupo de administración de TS-1 en combinación con peginterferón-alfa-2a (en este caso, grupo TS-l+PEG-IFN-a2a) .

Como resultado, la acumulación de ascitis causada por metástasis peritoneal de células de cáncer gástrico fue inhibida en el grupo TS-l+PBS y la acumulación de ascitis fue inhibida a un grado más notable en el grupo TS-l+PEG-IFN-a2a. Esto demostró que el agente antitumoral TS-1 ejerció efectos inhibitorios sobre la acumulación de ascitis al actuar sobre las células de cáncer gástrico que habían metastizado en la cavidad abdominal, y administración simultánea de TS-1 en combinación con el conjugado covalente de interferón-a con PEG tiene un notable efecto en la inhibición de la acumulación de ascitis.

Los resultados indican que el conjugado covalente de interferón-a con polialquilenglicol es capaz de inhibir notablemente la acumulación de fluido de la cavidad corporal incluso cuando se administra sistémicamente en un horario intermitente, y la administración simultánea del conjugado en combinación con un agente antitumoral tiene un efecto de inhibir la acumulación de ascitis en un grado más notable.

[Ejemplo 5] Efectos de PEG-IFN-ß y PEG-mIFN- ß para inhibir la reacumulación de ascitis lograda por administración tópica Los Modelos de ratón con metástasis peritoneal de cáncer gástrico fueron producidos utilizando células humanas de cáncer gástrico, células GCIY (RIKEN) . Células GCIY fueron cultivadas y mantenidas usando medio MEM que contenía 15% de suero bovino fetal en una incubadora a 37°C y 5% de CO2.

Una suspensión de células GCIY (lxlO7 células/ratón) preparada en la misma manera que en el Ejemplo 2 fue trasplantada en forma intraperitoneal en ratones nude KSN macho para producir modelos de ratón con metástasis peritoneal de cáncer gástrico. La ascitis fue recolectada de los ratones individuales 5 semanas después del trasplante de la suspensión de células GCIY ("paracentesis ascítica inicial"). La paracentesis ascítica fue realizada por punción en la cavidad abdominal con una aguja intravenosa (calibre 18) bajo anestesia y la recolección de ascitis través de la aguja.

PEG-IFN-ß y PEG-mIFN- ß preparados en el Ejemplo 1 se mezclaron entre sí, la mezcla resultante (en adelante, referida como "PEG- IFN- e" ) fue administrada por vía intraperitoneal (vía tópica) en dosis tales que PEG-IFN-ß y PEG-mIFN-ß fueron cada una administrada en una cantidad de 10,000 U/ratón/dosis, y la administración fue iniciada en el mismo día de la paracentesis ascítica inicial. La administración fue realizada en el intervalo de cada dos días, que era equivalente a la administración una vez a la semana para los seres humanos, y la administración fue realizada tres veces en total (n = 4) . En el grupo de control, en lugar de PEG-IFN-ps, el mismo volumen de 20 mM de solución amortiguadora de acetato (pH 4.5) que contenía 150 mM de cloruro de sodio fue administrada de la misma manera (n = 5) .

La ascitis que se había vuelto a acumular después de la paracentesis ascítica inicial fue recolectada a través de paracentesis ascítica de ratones individuales del grupo de PEG-IFN- s y el grupo de control bajo anestesia en el día siguiente del día de la administración final, y el peso de líquido fue medido (segunda paracentesis ascítica) . Ratones individuales cuya ascitis había sido recogida se sometieron a laparotomía bajo anestesia, las masas tumorales que habían metastasizado a la cavidad abdominal se eliminaron con pinzas y tijeras, y los pesos de los tumores fueron medidos.

El análisis estadístico fue realizado entre dos grupos; en este caso, el grupo control y el grupo PEG-IFN^s, y la prueba t de Student o la prueba de elch fue seleccionada sobre la base de la prueba para la igualdad de varianza (prueba F) . Con base en el análisis estadístico, los resultados fueron determinados por ser estadísticamente significativos cuando el valor P fue menos de 0.05.

Los resultados se muestran en la Figura 4. El eje vertical de la figura 4A representa el peso de las ascitis obtenida por la segunda paracentesis ascítica (n = 4 a 5; promedio + SE) , y el eje vertical de la figura 4B representa el peso del tumor (n = 4 a 5; promedio ± SE) . En el eje horizontal, "Control" representa el grupo de administración tópica de 20 mM de solución amortiguadora de acetato (pH 4.5) que contiene 150 mM de cloruro de sodio (el grupo control) , y "PEG- IFN- ße" representa el grupo de administración tópica de una mezcla de PEG-IFN- ß y PEG-mIFN- ß . El símbolo del asterisco en la figura indica que los datos del grupo de administración tópica de PEG-IFN- ß son estadísticamente significativos en comparación con el grupo de control (P <0.05) .

Como resultado, no se observó diferencia significativa en los pesos de los tumores que habían hecho metástasis en la cavidad abdominal entre el grupo de la administración tópica de PEG-IFN- ßß y el grupo de control (Fig. 4B) , pero la reacumulación de ascitis causada por metástasis peritoneal fue significativamente inhibida en el grupo de administración tópica de PEG-IFN- ßß, en comparación con el grupo de control (Fig. 4A) . Esto indica que el conjugado covalente de interferón-ß con PEG también tiene un efecto terapéutico a través de la inhibición de la recurrencia de acumulación de ascitis incluso cuando se administra por vía tópica en una etapa avanzada con acumulación de ascitis debido a la metástasis peritoneal de células de cáncer gástrico.

El interferón se sabe que tiene un efecto de inhibir el crecimiento de células de cáncer (en adelante, referido como "efecto an itumoral" ) - Sin embargo, los efectos de inhibir la reacumulación de ascitis mediante la administración de PEG-IFN- fueron observados en los casos en los que sus efectos antitumorales suficientes no fueron observados. Esto indica fuertemente que el efecto de inhibir la reacumulación de ascitis no es un efecto secundario debido al efecto antitumoral del interferón, pero es independiente del efecto antitumoral.

Los resultados indican que el conjugado covalente de interferón con polialquilenglicol exhibe, a través de la administración tópica, un efecto de inhibir la reacumulación de fluido de la cavidad corporal después de la eliminación del fluido de la cavidad corporal, y tal efecto es independiente de los efectos antitumorales.

[Ejemplo 6] Efecto de PEG-IFN-ß y PEG-mIFN- ß para inhibir la reacumulación de ascitis y mejorar una tasa de supervivencia mediante la administración sistémica El efecto terapéutico de un conjugado covalente de interferón- ß con PEG mediante la administración sistémica en la acumulación de ascitis maligna y la tasa de supervivencia fue examinado .

De acuerdo con el método de Huynh et al . (Molecular cáncer therapeutics, (2007) Vol . 6, pp 2959-2966), modelos de ratón con metástasis peritoneal de cáncer de ovario fueron producidos, y el efecto de PEG-IFN-ß para inhibir la reacumulación de ascitis mediante administración sistémica de fue evaluado con los mismos.

Las células de cáncer de ovario humano OV-90 (tipo CRL-11732 Amercian Type Culture Collection) fueron cultivadas y mantenidas utilizando un medio MEM que contiene 15 % de suero fetal bovino en una incubadora a 37°C y 5% de C02. Las células OV-90 fueron recolectadas con tripsina/EDTA y lavadas con solución amortiguadora de fosfato (PBS) para preparar una suspensión de células de OV-90. La suspensión de células de OV-90 resultante (5 x 106 células/ratón) fueron trasplantadas por vía intraperitoneal en ratones SCID hembra (CB-l7/lcr-scid/scid/j el ,- CLEA Japan Inc.).

La ascitis fue recolectada de los ratones individuales 46 días después del trasplante de la suspensión de células (paracentesis ascítica inicial) . La paracentesis ascítica fue realizada por punción en la cavidad abdominal con una aguja intravenosa (calibre 18) en un estado de vigilia y la recolección de ascitis a través de la aguja. El peso de ascitis (g) fue medido, y ratones individuales en los que fue observada la acumulación de ascitis de 0.1 g fueron sometidos al experimento siguiente.

PEG-IFN-ß y PEG-mIFN-ß preparados en el Ejemplo 1 se mezclaron entre sí, la mezcla resultante (en adelante, referida como "PEG-IFN-^s" ) fue administrada subcutáneamente (sistémicamente) en dosis tales que PEG-IFN- ß y PEG-mIFN-ß fueron cada una administrada en una cantidad de 50,000 U/ratón/dosis , y la administración fue iniciada en el mismo día de la paracentesis ascítica inicial. La administración fue realizada en el intervalo de cada dos días, que era equivalente a la administración una vez a la semana para los seres humanos (n = 6) . En el grupo de control, en lugar de PEG-IFN^s, el mismo volumen de 20 mM de solución amortiguadora de acetato (pH 4.5) que contenía 150 mM de cloruro de sodio fue administrada de la misma manera (n = 7) .

El día después de la finalización de la tercera administración (en este caso, 5 días después del inicio de la administración) , la ascitis que se había reacumulado después de la paracentesis ascítica inicial fue recolectada través paracentesis ascítica de ratones individuales del grupo de PEG-IFN^s y el grupo de control en el estado de vigilia, y el peso de líquido fue medido (la segunda paracentesis ascítica) .

Después de la segunda paracentesis ascítica, las administraciones posteriores fueron realizadas por vía subcutánea (en este caso, sistémicamente) tres veces cada dos días, y la administración fue seis veces en total. La tasa de supervivencia de cada grupo a partir de la fecha en que la administración fue iniciada al día 12 después de esto fue examinada.

Los resultados se muestran en las Figuras 4A, 4B y 5. El eje vertical de la figura 5 representa el peso de las ascitis obtenida por la segunda paracentesis ascítica (n = 6 hasta 7 ; promedio ± SE) . El eje vertical de la figura 6 representa la tasa de supervivencia y el eje horizontal representa los días después de día en el que la administración fue iniciada (día 0) . "Control" en el eje horizontal en la Figura5 y en la Figura 6 representa el grupo de administración subcutánea de 20 mM de solución amortiguadora de acetato (pH 4.5) que contiene 150 mM de cloruro de sodio (el grupo control) , y "PEG-IFN^s" representa el grupo de administración subcutánea de un mezcla de PEG-IFN-ß y PEG-mIFN- ß .

Como resultado, la reacumulación de ascitis resultante de la metástasis peritoneal fue inhibida en el grupo de administración sistémica de PEG-IFN s. Esto indica que el conjugado covalente de interferón-ß con PEG inhibió la recurrencia de acumulación de ascitis sistémica cuando se administra sistémicamente en etapa avanzada con acumulación de ascitis debido a la metástasis peritoneal de células de cáncer de ovario.

Todos los ratones en el grupo de administración sistémica de PEG-IFN-^s habían sobrevivido hasta 12 días después de la iniciación de la administración. En el grupo control, sin embargo, una muerte de ratón fue observada por primera vez 8 días después del inicio de la administración, y la tasa de supervivencia fue menos del 50% 12 días después de la iniciación de administración. Esto indica que el conjugado covalente de interferón-ß con PEG inhibe la agravación de condición generalizada y mejora la tasa de supervivencia cuando se administra sistémicamente en una etapa avanzada con acumulación de ascitis debido a metástasis peritoneal de células de cáncer de ovario.

Los resultados indican que el conjugado covalente del interferón con polialquilenglicol exhibe, incluso a través de la administración sistémica, un efecto de inhibir la reacumulación de fluido de la cavidad corporal después de la eliminación del fluido de la cavidad corporal. También mostraron el conjugado covalente inhibe agravamiento de la condición generalizada y mejora la tasa de supervivencia cuando se administra sistémicamente en la fase de cáncer avanzado con acumulación de fluido de la cavidad corporal .

Los ejemplos anteriores demuestran que un conjugado covalente de interferón con polialquilenglicol (preferiblemente, conjugado covalente del interferón-a o interferón- ß con PEG) permite la inhibición de una acumulación de ascitis refractaria, que no se podían realizar con interferón-a o interferón- ß . Más específicamente, se revela que un conjugado covalente de interferón con polialquilenglicol (preferiblemente, un conjugado covalente de interferón-a o interferón-ß con PEG) tiene un efecto de inhibir la acumulación de ascitis maligna a través de la administración sistémica tal como la administración subcutánea o la administración tópica en un programa intermitente en el que la administración se lleva a cabo en el intervalo de una vez cada dos o más días. Además, se muestra que el efecto inhibidor no es un efecto secundario debido a los efectos anti-tumorales, y tales efectos se ejercen independientemente del tipo de cáncer. También se muestra que, en comparación con el tratamiento convencional realizado a través de la administración diaria de interferón, el tratamiento a través de la administración del conjugado covalente de interferón con polialquilenglicol en un horario intermitente exhibe un efecto terapéutico mejorado en la ascitis maligna.

Aplicabilidad industrial La presente invención se puede utilizar como el agente inhibidor para la acumulación de fluido de la cavidad corporal en el campo farmacéutico.

Texto libre de listado de secuencias SEC ID NO: 1: la secuencia de aminoácidos de interferón- ß humano Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (10)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un agente inhibidor para la acumulación de fluido de la cavidad corporal caracterizado porque comprende, como un ingrediente activo, un conjugado covalente de interferón con polialquilenglicol .

2. El agente inhibidor para la acumulación de fluido de la cavidad corporal de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polialquilenglicol es polietilenglicol .

3. El agente inhibidor para la acumulación de fluido de la cavidad corporal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque el interferón es interferón tipo 1 o interferón-? .

4. El agente inhibidor para la acumulación de fluido de la cavidad corporal de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el interferón tipo 1 es interferón- o interferón- ß .

5. El agente inhibidor para la acumulación de fluido de la cavidad corporal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque inhibe la acumulación de un derrame pleural o ascitis.

6. El agente inhibidor para la acumulación de fluido de la cavidad corporal de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el derrame pleural o ascitis es un derrame pleural refractario o ascitis acumulada debido a cáncer, cirrosis o insuficiencia renal.

7. El agente inhibidor para la acumulación de fluido de la cavidad corporal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para usarse en la administración sistémica .

8. El agente inhibidor para la acumulación de fluido de la cavidad corporal de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la administración sistémica es seleccionada del grupo que consiste de administración subcutánea, administración intracut nea, administración intramuscular, administración intravenosa, y administración intraarterial .

9. El agente inhibidor para la acumulación de fluido de la cavidad corporal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para usarse en combinación con al agente antitumoral.

10. El agente inhibidor para la acumulación de fluido de la cavidad corporal de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el agente antitumoral es por lo menos un agente antitumoral seleccionado del grupo que consiste de 5-FU, tegafur-uracilo, tegafur-gimeracil-oteracil, y capecitabina .