CN102439036B - 双特异性egfr/igfir结合分子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及供诊断、研究和治疗应用中使用的双特异性分子，其包含EGFR结合域和独特的IGFIR结合域。本发明进一步涉及包含此类蛋白质的细胞、编码此类蛋白质或其片段的多核苷酸、和包含编码该新蛋白质的多核苷酸的载体。例示性双特异性分子包括基于第十纤连蛋白III型域的抗体样蛋白质二聚体。

Description

双特异性EGFR/IGFIR结合分子
序列表
本申请含有已经经由EFS网络提交的序列表，并且在此通过提及而将其完整收录。2009年11月23日创建的所述ASCII拷贝命名为COTH52WO.txt，并且大小为552,529字节。
相关申请
本申请要求2008年11月24日提交的美国临时专利申请号61/200,164；2008年11月26日提交的61/200,282；2009年4月17日提交的61/212,966；2009年5月14日提交的61/178,279；和2009年7月21日提交的61/227,330的权益，在此通过提及而将所述申请完整收录。
介绍
本发明涉及供诊断、研究和治疗应用中使用的EGFR结合域和包含EGFR结合域和独特的IGFIR结合域的双特异性分子。本发明进一步涉及包含此类蛋白质的细胞、编码此类蛋白质或其片段的多核苷酸、和包含编码该新蛋白质的多核苷酸的载体。例示性EGFR结合域和双特异性分子包括基于第十纤连蛋白III型域的抗体样蛋白质二聚体。
发明背景
受体酪氨酸激酶信号传导的活化对癌症形成至关重要(参见例如Grimberg A.Cancer Biol Ther.20032(6)：630-5及Mendelsohn J.J Clin Oncol.200321(14)：2787-99)。受体酪氨酸激酶具有保守域结构，包括胞外域、跨膜域和胞内酪氨酸激酶域。胞外域能结合配体，诸如多肽生长因子或细胞膜结合分子。通常，配体结合或配体结合诱导的受体酪氨酸激酶二聚化活化受体的胞内催化性酪氨酸激酶域和随后的信号转导。
受体酪氨酸激酶的例子包括但不限于ERBB受体(例如EGFR、ERBB2、ERBB3、ERBB4)、产促红细胞生成素肝细胞(EPH)受体、成纤维细胞生长因 子(FGF)受体(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FGFR5)、血小板源性生长因子(PDGF)受体(例如PDGFR-A、PDGFR-B)、血管内皮生长因子(VEGF)受体(例如VEGFR1/FLT1、VEGFR2/FLK1、VEGF3)、具有免疫球蛋白样和EGF样域的酪氨酸激酶(TIE)受体、胰岛素样生长因子(IGF)受体(例如INS-R、IGFIR、IR-R)、盘状域(Discoidin Domain，DD)受体、c-Met(MET)的受体、recepteur d’origine nantais(RON)(又称为巨噬细胞刺激1受体)、Flt3fins相关酪氨酸激酶3(Flt3)、集落刺激因子1(CSF1)受体、粘附相关激酶受体(例如Axl)、c-kit(KIT)的受体和胰岛素受体相关(IRR)受体。
对受体酪氨酸激酶的抑制已经作为用于某些人恶性肿瘤的有效治疗策略引起了人们的注意(综述可参见Roussidis AE，In Vivo.200216(6)：459-69)。
虽然靶向性单一疗法最初可以有效治疗癌症，但是往往随后出现治疗抗性，这可能是由于其它信号传导级联的上调所致(参见例如Nahta R等，Breast Cancer Res.20068(6)：215及Horn L等，Clin Lung Cancer.20078：S68-73)。因而，需要开发改良的癌症治疗剂。
发明概述
在一个方面，本申请提供了具有新序列的EGFR结合性第十纤连蛋白III型域(10Fn3)。还提供了具有共有序列的EGFR结合性10Fn3。此类EGFR结合性 10Fn3可以是单体，或者可以包含在融合蛋白内作为其一部分。
在另一个方面，本申请提供了结合EGFR和IGFIR的双特异性分子，在本文中称之为“E/I结合物”。本发明涵盖的E/I结合物包括配体结合支架蛋白(例如淀粉酶抑肽(tendamistat)、Affibody、纤连蛋白III型域、Anticalin、四连蛋白(tetranectin)、和锚蛋白)的二聚体和双特异性抗体。在构建为单条多肽链时，可以以任何取向构建E/I结合物，例如从N端至C端采取E-I排布或I-E排布。
在一个方面，提供了抗体样蛋白质二聚体，其包含与IGFIR结合性10Fn3共价或非共价连接的EGFR结合性10Fn3。10Fn3以小于500nM的KD结合其靶物(EGFR或IGFIR)。每个单独的10Fn3独立具有与SEQ ID NO：32至少70、80、85、90、95、98、或100％相同的氨基酸序列，其中n是1-20的整数，o是1-20的整数，而p是1-40的整数。在一些实施方案中，n是8-12的整数，o是4-8的整数，而p是4-28的整数。在一些实施方案中，n是10，o是6，而p是12。
在一些实施方案中，抗体样蛋白质二聚体包含经由多肽接头或聚乙二醇 模块与EGFR结合性10Fn3共价连接的IGFIR结合性10Fn3。在一些实施方案中，抗体样蛋白质二聚体包含与SEQ ID NO：20-31、53-58、87-92、98-105、118-133、149-154、164-169、179-184、192-197、205-210和211-216中任一项至少80、90、95、或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，E/I结合物包含具有SEQ ID NO：20-31、53-58、87-92、98-105、118-133、149-154、164-169、179-184、192-197、205-210和211-216中任一项的氨基酸序列，其中(i)EGFR结合性10Fn3和/或IGF-IR结合性10Fn3包含相对于SEQ ID NO：1的相应支架氨基酸具有0至20、0至15、0至10、0至8、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2、或0至1处替代、保守替代、缺失或添加的10Fn3支架，和/或(ii)EGFR结合性10Fn3相对于SEQ ID NO：5-8、52、66-68、106-108、112-114、140-142、155-157、170-172、182、185-187、198-200、或219-327中任一项的相应环序列具有0至15、0至10、0至8、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2、或0至1处替代、保守替代、缺失或添加，和/或IGF-IR结合性10Fn3相对于SEQ ID NO：3的相应环序列具有0至15、0至10、0至8、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2、或0至1处替代、保守替代、缺失或添加。
在一个方面，提供了药学可接受组合物，其包含如本文中所描述的抗体样蛋白质二聚体和药学可接受载体，其中所述组合物基本上没有热原。
在又一个方面，提供了用于在受试者中治疗过度增殖性病症诸如癌症的方法，包括对有所需要的受试者施用治疗有效量的包含如本文中所描述的抗体样蛋白质二聚体的药学可接受组合物。
在另一个方面，本申请提供了编码如本文中所描述的抗体样蛋白质二聚体的核酸。还提供了包含编码如本文中所描述的抗体样二聚体的核酸的载体。合适的载体包括例如表达载体。还提供了含有核酸、载体或表达载体的宿主细胞，所述核酸、载体或表达载体包含编码如本文中所描述的抗体样蛋白质二聚体的核酸。合适的宿主细胞包括原核和真核宿主细胞。例示性原核细胞是细菌细胞，诸如大肠杆菌(E.coli)。例示性真核细胞是哺乳动物细胞，诸如CHO细胞。还提供了用于生成如本文中所描述的抗体样蛋白质二聚体的方法，包括培养含有包含编码抗体样蛋白质二聚体的核酸的核酸、载体或表达载体的宿主细胞，并自培养基回收表达的抗体样蛋白质二聚体。
附图简述
图1.对I1-GS10-E2的SDS-PAGE分析。将来自HMS174(DE3)细菌细胞离心沉淀裂解物(表达I1-GS10-E2，并通过HisTrap层析柱加以纯化)的样品在4-12％NuPAGE微型胶上运行，通过Sypro-Orange染色，并通过STORM成像仪显现。Mark 12分子重量标准品(第1道)；可溶性裂解物(第2道)；不溶性裂解物(第3道)；HisTrap加载(第4道)；HisTrap未结合(第5道)；合并的HisTrap洗脱物(第6道)；透析入50mM NaOAc，150mM NaCl，pH 4.5中(第7道)；透析入PBS中(第8道)；透析入Tris，150mM NaCl，pH 8.5中(第9道)。
图2.A.对中等规模纯化的I1-GS10-E2的SEC分析。用流动相100mM NaPO4、100mM NaSO4、150mM NaCl，pH 6.8将22μg经HisTrap纯化的透析入PBS，pH 7.4中的I1-GS10-E2加载到Superdex 20010/30SEC柱(GE Healthcare)上，并使用A280来测量。I1-GS10-E2主要作为分子量范围为约24.6kDa(相对于球状凝胶过滤标准品(BioRad))的单一单体种类洗脱。B.对E2-GS10-I1的SEC分析。
图3.A.进行PBS中的中等规模纯化的I1-GS10-E2的差示扫描量热法(Differential Scanning Calorimetry，DSC)以测定Tm。在3个大气压下以每分钟1度的速率从5℃至95℃对1mg/mL I1-GS10-E2溶液扫描。相对于PBS缓冲液的对照运行分析数据。B.E2-GS10-I1的DSC。
图4.对H292细胞中的IGFR活性的抑制。用100ng/mL IGF-1和100ng/mLEGF刺激细胞，并用●I1、□E1、或△E1-GS10-I1HTPP制备物来处理。通过ELISA来测定酪氨酸1131上的IGFIR磷酸化。
图5.对H292细胞中的EGFR活性的抑制。用100ng/mL IGF-1和100ng/mLEGF刺激细胞，并用●I1、□E1、或△E1-GS10-I1HTPP制备物处理。通过ELISA来测定酪氨酸1068上的EGFR磷酸化。
图6.对H292细胞中的AKT磷酸化的抑制。用100ng/mL IGF-1和100ng/mLEGF刺激细胞，并用●I1、□E1、或△E1-GS10-I1HTPP制备物处理。通过ELISA来测定丝氨酸473上的AKT磷酸化。
图7.对RH41细胞增殖的抑制。用●I1、□E1、或△E1-GS10-I1HTPP制备物处理细胞，并测定百分比增殖抑制。
图8.对H292细胞增殖的抑制。用●I1、□E1、或△E1-GS10-I1HTPP制备物处理细胞，并测定百分比增殖抑制。
图9.分离的EGFR单连接素(mononectin)、在C端位置具有丝氨酸而没有添加的PEG的基于10Fn3的E/I结合物、和在C端位置具有半胱氨酸且与40kDa分枝PEG偶联的基于10Fn3的E/I结合物在基于细胞的功能性测定法中的IC50值的汇总。显示了代表性的数据。
图10.对在N端和C端位置具有E2的PEG化的基于10Fn3的E/I结合物的免疫印迹分析。尽管这两种构建体在抑制EGFR的H292细胞测定法中展现相当的活性，但是在C端位置具有E2的基于10Fn3的E/I结合物不降解EGFR，而在N端位置具有E2的基于10Fn3的E/I结合物降解了EGFR。这两种构建体在此细胞系中都显示非常弱的IGFR降解到无IGFR降解。引入β-肌动蛋白以证明所有泳道的加载量相同。还检查了EGFR、ERK和Shc的磷酸化状态。
图11.对H292细胞中的EGF刺激的EGFR磷酸化的抑制。这两种构建体在抑制EGFR的H292细胞测定法中展现出相当的活性。E2-GS10-I1(具有PEG)(○)、I1-GS10-E2(具有PEG)(□)、帕尼单抗(panitumumab)(----)。
图12.肿瘤异种移植物研究的结果。图12A：H292人肿瘤异种移植物模型中的临床前抗肿瘤活性。对下列各组显示自8只小鼠的组计算的平均肿瘤大小，以mg计：对照动物(■)、以100mg/kg剂量给药的E3-GS10-I1(w/PEG)(○)、以100mg/kg剂量给药的E2-GS10-I1(具有PEG)(□)、以1mg/小鼠(△)或0.1mg/小鼠剂量给药的帕尼单抗 x轴上的字母a指示所施用的E/I结合物剂量，而p指示所施用的帕尼单抗剂量。图12B：显示每个组在研究全过程里的平均重量变化。符号如图12A图注中所描述的。
图13.H292NSCLC肿瘤异种移植物模型中的药效学效果。在肿瘤裂解物中测定标识的分析物的水平，如实施例12中所描述的。(A)磷酸-EGFR、(B)磷酸-ErbB2、(C)磷酸-IGFR、和(D)总EGFR。方格图案的柱形＝帕尼单抗，空心柱形＝E2-GS10-I1(具有PEG)，阴影线的柱形＝E3-GS10-I1(具有PEG)。
图14.对MCF7r细胞的Western印迹分析，与MCF7亲本细胞做比较。
图15.裸鼠中的MCF7(小图A)和MCF7r(小图B)人肿瘤异种移植物研究。对自每组8只小鼠计算的这两项研究显示均值肿瘤大小。
图16.裸鼠中的GEO人肿瘤异种移植物研究。
图17.裸鼠中的H292人肿瘤异种移植物研究。
图18.用H292NSCLC细胞进行的集落形成测定法。A.显示单块平板的代表性数据。B.显示一种基于10Fn3的E/I结合物的IC50，误差棒从一式三份测 量值算出。
图19.表位定位测定法。在小图A中显示了多种EGFR结合抗体的表位结合的位置。实施例18，表11中提供了抗体的描述。表11的左栏中为每种抗EGFR抗体提供了一个编号，该编号与小图A中所显示的编号抗体相关。小图B显示了如实施例18中所描述的一个例示性表位定位测定。
图20.对基于10Fn3的E/I结合物——PEG化的I1-GS10-E5的DSC分析，测量的扫描范围的1mg/ml蛋白质浓度以15-95℃，结果Tm测量值为55.2℃。
图21.评估基于10Fn3的E/I结合物对H292细胞中的AKT磷酸化的抑制，通过ELISA测量。PEG化的I1-GS10-E5(○)比单独的PEG化的I1(■)或单独的PEG化的E5(▲)更有力地阻断IGF1刺激的AKT磷酸化。
图22.评估基于10Fn3的E/I结合物对H292细胞的细胞增殖的抑制。PEG化的I1-GS10-E5(□)比单独的PEG化的I1(▲)更有力地抑制H292细胞生长，而单独的PEG化的E5(●)仅具有弱的效果。测定一式三份实施。显示了代表性数据。
图23.评估基于10Fn3的E/I结合物对RH41细胞的细胞增殖的抑制。PEG化的I1-GS10-E5(□)抑制RH41细胞生长略强于单独的PEG化的I1(▲)和单独的PEG化的E5(●)，而帕尼单抗(虚线)几乎没有效果。测定一式三份实施。显示了代表性数据。
图24.基于10Fn3的结合物(PEG化的)对配体刺激的信号传导的抑制。基于 10Fn3的E/I结合物(PEG化的I1-GS10-E5)对DiFi(小图A)、H292(小图B)或BxPC3(小图C)细胞中的受体活化和细胞信号传导的影响。让细胞血清饥饿，并用1μM基于10Fn3的结合物处理2小时，之后用EGF、IGF1或EGF+IGF1的组合刺激。探查GAPDH以显示所有泳道中加载量相等。
图25.基于10Fn3的结合物(未PEG化的)对H292细胞中的配体刺激的信号传导的抑制。基于10Fn3的E/I结合物(E2-GS10-I1)对H292细胞中的受体活化和细胞信号传导的影响。让细胞血清饥饿，并用1μM基于10Fn3的结合物处理2小时，之后用EGF、IGF1或EGF+IGF1的组合刺激。并探查GAPDH以显示所有泳道中加载量相等。
图26.用基于10Fn3的E/I结合物进行的竞争结合研究。A.基于10Fn3的EGFR结合物不竞争EGFR抗体对EGFR的结合。初始注射基于10Fn3的EGFR结合物的显示对芯片表面上的EGFR的结合。第二次注射与等量的西妥昔单 抗(cetuximab)、帕尼单抗、或尼妥珠单抗(nimotuzumab)混合的基于10Fn3的EGFR结合物，没有显示基于10Fn3的EGFR结合物竞争抗体对EGFR的结合。B.基于10Fn3的E/I结合物能同时结合EGFR和IGF-IR。初始注射基于10Fn3的E/I结合物显示对芯片表面上固定化的EGFR的结合。第二次注射与等量的可溶性IGF-IR混合的基于10Fn3的E/I结合物显示sIGF-IR对固定化的基于10Fn3的E/I结合物的另一端的结合。
图27.异种移植物研究的最后一剂后4小时的TGF α血浆水平。在处理结束时自表24中所描述的BxPC3(小图A)、GEO(小图B)和H441(小图C)异种移植物研究采集血浆样品，对血浆样品分析TGF α的循环水平。
图28.不荷瘤裸鼠中PEG化的I1-GS10-E5给药后的TGF α和IGF1血浆水平。对不荷瘤小鼠给予单个剂量的PEG化的I1-GS10-E5基于10Fn3的结合物，并分析TGF α(小图A)和IGF1(小图B)的循环水平。
图29.使用基于10Fn3的E/I结合物进行的H292异种移植物研究，与帕尼单抗进行比较。对H292异种移植物不进行处理(■)，或一周三次给药PBS中配制的基于10Fn3的结合物及如图中所描述的各种构建体或每三天i.p.给药1mg/小鼠(○)或0.1mg/小鼠(□)的帕尼单抗。在x轴上标示基于10Fn3的结合物和帕尼单抗(▲)的实际剂量，其中帕尼单抗剂量最接近x轴，位于标示基于10Fn3的结合物剂量的各三角形的下方。图29A显示了到第43天的测量值。图29B显示了到第27天的测量值。
图30.PEG化的E2-GS10-I1在小鼠中的药动学参数谱。
图31.多种基于10Fn3的E/I结合物以100mg/kg和10mg/kg IP，及10mg/kg和64mg/kg SC的半衰期比较。
图32.PEG化的E2-GS10-I1在RH41模型中的抗肿瘤功效。
图33.测量肿瘤中的药效学终点。在处理结束时，在最后一剂后4小时从DiFi异种移植物模型(小图A)和H292异种移植物模型(小图B)取出肿瘤，并对其检查磷酸-EGFR、磷酸-IGFR、总EGFR和总IGFR的水平。将等量的总蛋白质裂解物加载到凝胶的每个泳道中，并用GAPDH探查印迹以证明所有泳道的加载量相等。
图34.抗EGFR结合物679F09的序列(SEQ ID NO：490)。将改变的环残基加下划线。
图35.BC环序列分析I。来自EGFR结合序列的BC环中每个位置上的氨基 酸的频率。使用WebLogo(Crooks GE，Hon G，Chandonia JM，Brenner SE.WebLogo：A sequence logo generator.Genome Research，14：1188-1190，2004)来产生图像。
图36.DE环序列分析1。来自EGFR结合序列的DE环(所分析的263种独特的DE环序列)中每个位置上的氨基酸的频率。
图37.FG环(10-aa长)序列分析I。FG环中每个位置上的氨基酸的频率，所述FG环来自具有长10个氨基酸的FG环(所分析的228种独特的长10个氨基酸的FG环)的EGFR结合序列。
图38.FG环(15-aa长)序列分析I。FG环中每个位置上的氨基酸的频率，所述FG环来自具有长15个氨基酸的FG环(所分析的349种独特的长15个氨基酸的FG环)的EGFR结合序列。
图39.BC环序列分析II。来自所有“强的”序列的BC环(所分析的85种独特的BC环序列)中每个位置上的氨基酸的频率。
图40.DE环序列分析II。来自所有“强的”序列的DE环(所分析的60种独特的DE环序列)中每个位置上的氨基酸的频率。
图41.FG环(10-aa长)序列分析II。FG环中每个位置上的氨基酸的频率，所述FG环来自所有具有长10个氨基酸的FG环(所分析的6种独特的长10个氨基酸的FG环)的“强”序列。
图42.FG环(15-aa长)序列分析II。FG环中每个位置上的氨基酸的频率，所述FG环来自所有具有长15个氨基酸的FG环(所分析的65种独特的长15个氨基酸的FG环)的“有力的”序列。
图43.如实施例22中所描述的基于10Fn3的E/I结合物的各种特征的汇总表。
图44.如实施例30中所描述的基于10Fn3的E/I结合物的各种药动学参数的汇总表。
图45.如实施例32中所描述的E单体的氨基酸序列。将每个序列中的BC、DE和FG环加下划线。
图46.野生型核心序列(SEQ ID NO：1的氨基酸9-94)与I1核心(SEQ ID NO：65)、E1核心(SEQ ID NO：66)、E2核心(SEQ ID NO：67)、E3核心(SEQ ID NO：68)、E4核心(SEQ ID NO：108)、E5核心(SEQ ID NO：114)、E85核心(SEQ ID NO：141)、E90核心(SEQ ID NO：156)、E96核心(SEQ ID NO：171)、E105核心 (SEQ ID NO：186)、和E112核心(SEQ ID NO：199)的比对。将野生型序列中的BC、DE和FG环以粗体显示，并加下划线。I和E核心的与野生型相比实际上发生了改变的氨基酸残基以粗体显示，并加下划线。
图47.E和I单体的核酸序列。除非另有规定，核苷酸序列编码具有N+10N端延伸、Ser尾部、和his标签的单体。
图48.基于10Fn3的E/I结合物的核酸序列。所有核苷酸序列编码基于10Fn3的E/I结合物，其具有构建体中的第一单体上的N+10N端延伸和构建体中的第二单体上的Cys尾部和his标签。GS10是SEQ ID NO：11；GSGCGS8是SEQID NO：218；而GSGC是SEQ ID NO：489。
发明详述
定义
如本文中所使用的，以下术语和短语应当具有下文所列的意义。除非另有定义，本文中所使用的所有技术和科学术语与本领域普通技术人员的通常理解具有相同的含义。
除非上下文另有明确规定，单数形式“一个”、“一种”、和“所述”包括复数的所指物。
术语“包含”以包含在内的开放意义使用，指可以包括别的元素。
术语“包括”用于指“包括但不限于”。“包括”和“包括但不限于”可互换使用。
术语“抗体样蛋白质”指具有“免疫球蛋白样折叠”的非免疫球蛋白蛋白质，即包含在结构上组织成一组β或β样链，形成β片层的约80-150个氨基酸残基，其中所述各β或β样链通过居间环部分来连接。β片层形成抗体样蛋白质的稳定核心，同时创建由连接所述各β或β样链的环构成的两个“面”。如本文中所描述的，这些环可以加以变化以创建定制的配体结合位点，而且可以在不破坏蛋白质总体稳定性的前提下产生此类变化。此类抗体样蛋白质的例子是“基于纤连蛋白的支架蛋白质”，其指基于纤连蛋白III型域(Fn3)的多肽。在一个方面，抗体样蛋白质基于第十纤连蛋白III型域(10Fn3)。
“多肽”指两个或更多个氨基酸的任何序列，而不管长度、翻译后修饰、或功能如何。“多肽”、“肽”、和“蛋白质”在本文中可互换使用。
“百分比(％)氨基酸序列同一性”在本文中定义为比对序列并在必要时 引入缺口以实现最大百分比序列同一性后，且在不将任何保守替代视为序列同一性的一部分的条件下，候选序列中与所选择序列中的氨基酸残基相同的氨基酸的百分比。用于确定百分比氨基酸序列同一性的比对可以以本领域技术范围内的多种方式来实现，例如使用公众可获得的计算机软件诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定用于测量比对的适宜参数，包括在所比较序列的全长上实现最大比对所需要的任何算法。然而，就本文而言，％氨基酸序列同一性值是如下文所描述的使用序列比较计算机程序ALIGN-2获得的。ALIGN-2序列比较计算机程序是由Genentech公司创作的，已经与用户文档一起提交给美国版权局(U.S.Copyright Office，Washington D.C.，20559)，登记为美国版权注册号TXU510087，而且公众可通过Genentech公司(South San Francisco，Calif.)获得。ALIGN-2程序应当编译成在UNIX操作系统、优选数字UNIX V4.0D上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不再变化。
就本文而言，给定氨基酸序列A对(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为给定氨基酸序列A具有或包含对、与、或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性)如下计算：100乘以分数X/Y，其中X是序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数目，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。应当理解的是，若氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度，则A对B的％氨基酸序列同一性会不等于B对A的％氨基酸序列同一性。
术语“治疗有效量”指在哺乳动物中有效治疗疾病或病症的药物量。在癌症的情况中，药物的治疗有效量可减少癌细胞的数目；缩小肿瘤的尺寸；抑制(即在一定程度上减缓，优选阻止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即在一定程度上减缓，优选阻止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上减轻一种或多种与病症有关的症状。以药物可阻止生长和/或杀死现有癌细胞为限，药物可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。对于癌症治疗，可通过例如评估疾病进展前时间(time to disease progression，TTP)和/或测定响应率(response rate，RR)来测量体内功效。
氨基酸序列或化合物的半衰期可一般性地定义为多肽的血清浓度在体内降低50％(例如由于序列或化合物的降解和/或天然机制对序列或化合物清除或隔绝)所花费的时间。可以以本领域中已知的任何方式来测定半衰期， 诸如通过药动学分析。参见例如M Gibaldi和D Perron“Pharmacokinetics”，由Marcel Dekker出版，第2次修订版(1982)。
术语“E/I结合物”指包含EGFR结合域和独特的IGFIR结合域的双特异性分子。两个域可以共价或非共价连接。例示性的E/I结合物是包含EGFR结合性10Fn3和IGFIR结合性10Fn3的抗体样二聚体，即基于10Fn3的E/I结合物。
概述
表皮生长因子受体(EGFR)和胰岛素样生长因子受体(IFGR)在数类人癌症的肿瘤发生中发挥至关重要的作用。对任一受体的抑制均可在临床前模型中及在临床上有效地降低肿瘤生长。阻断EGFR途径在体外肿瘤模型中诱导向IGFR途径的转换以驱动生长。因此，同时阻断这两种受体可以克服途径转换从而实现优于单独阻断任一途径的功效。在例示性的实施方案中，与E/I结合物的单体构件相比，E/I结合物的活性是协同的。
说明书描述了结合EGFR和IGFIR的双特异性分子，在本文中称为“E/I结合物”，等等。申请人已经发现了，此类双特异性分子以大于相应的单特异性结合物的效力抑制癌症模型细胞系的增殖(参见例如实施例9和图8)。
E/I结合物在众多治疗性应用中将会是有用的，尤其在癌症的治疗中。除了治疗性应用外，还可以在任何期望检测EGFR和/或IGFIR的场合使用E/I结合物。
E/I结合物具有EGFR结合域和独特的IGFIR结合域。典型的结合域包括抗体；因此，可以生成双特异性抗体以发挥E/I结合物的功能。包含成对互补的VH和VL区的双特异性抗体是本领域已知的。这些双特异性抗体包含两对VH和VL，每个VH/L对结合单一抗原。(参见例如Hu等，Cancer Res.199656：3055-306；Neri等，J.Mol.Biol.1995246：367-373；Atwell等，Mol.Immunol.1996 33：1301-1312；及Carter等，Protein Sci.1997 6：781-788)。一种例示性的双特异性抗体是双抗体，即具有两个抗原结合位点的小抗体片段，这样的片段包含在同一条多肽链中连接的轻链可变域与重链可变域(Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993 90：6444-6448)。
E/I结合物还涵盖配体结合支架蛋白质的二聚体。支架蛋白质在文献中有充分的描述，包括例如淀粉酶抑肽、Affibody、纤连蛋白III型域、Anticalin、四连蛋白、和锚蛋白。可用于生成E/I结合物的其它支架蛋白质见综述Binz等，Nature Biotech 23：1257-1268(2005)。支架蛋白质基于在决定和稳定化三 维结构中重要的刚性核心结构或“框架”。位于支架的固定或保守残基之间的是可变区(诸如环、表面或穴)，可以对其进行随机化以改变配体的结合。在固定的支架残基间的可变区提供极大的氨基酸多样性，以提供对靶分子的特异性结合。
一种例示性的配体结合支架蛋白质基于纤连蛋白III型域(Fn3)。纤连蛋白是一种在胞外基质的形成和细胞-细胞相互作用中发挥至关重要的作用的大蛋白质；其由三类(I、II、和III型)小域的许多重复组成。
Fn3是小的、单体的、可溶性的、及稳定的。它缺乏二硫键，因此在还原条件下是稳定的。Fn3的总体结构类似免疫球蛋白折叠。Fn3域以N端至C端的顺序包含：β或β样链A；环AB；β或β样链B；环BC；β或β样链C；环CD；β或β样链D；环DE；β或β样链E；环EF；β或β样链F；环FG；和β或β样链G。7条反平行β-链排列为两个β片层，它们形成稳定的核心，同时创建由连接β或β样链的环构成的两个“面”。环AB、CD、和EF位于一个面上，而环BC、DE、和FG位于相对的面上。环AB、BC、CD、DE、EF和FG中的任何或全部均可以参与配体结合。Fn3有至少15种不同模块，而且虽然这些分子间的序列同源性较低，但是它们在三级结构上都享有高度的相似性。
AdnectinsTM(Adnexus，Bristol-Myers Squibb的一家研发公司)是基于第十纤连蛋白III型域，即Fn3的第十个模块(10Fn3)的配体结合支架蛋白。SEQ ID NO：1中列出了天然存在的人10Fn3的氨基酸序列。
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKST ATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ ID NO：1)(着重显示BC、FG、和DE环)。
在SEQ ID NO：1中，AB环对应于残基15-16，BC环对应于残基21-30，CD环对应于残基39-45，DE环对应于残基51-56，EF环对应于残基60-66，而FG环对应于残基76-87。(Xu等，Chemistry&Biology 20029：933-942)。BC、DE和FG环沿着分子的一个面排列，而AB、CD和EF环沿着分子的相对面排列。
在SEQ ID NO：1中，β链A对应于残基9-14，β链B对应于残基17-20，β链C对应于残基31-38，β链D对应于残基46-50，β链E对应于残基57-59，β链F对应于残基67-75，而β链G对应于残基88-94。链经由相应的环彼此连接，例如链A和B经由环AB连接而形成链A、环AB、链B的排布，等等。涉及形成疏水核心(“核心氨基酸残基”)的残基包括与SEQ ID NO：1的下列氨基酸对应的 氨基酸：L8、V10、A13、L18、I20、W22、Y32、I34、Y36、F48、V50、A57、I59、L62、Y68、I70、V72、A74、I88、I90和Y92，其中核心氨基酸残基以后面有其位于SEQ ID NO：1内的位置的单字母氨基酸密码表示。参见例如Dickinson等，J.Mol.Biol.236：1079-1092(1994)。
如上文所描述的，与SEQ ID NO：1的残基21-30、51-56、和76-87对应的氨基酸残基分别限定BC、DE和FG环。然而，应当理解，不是每个在环区内的残基都需要进行修饰以实现对期望的靶物(诸如IGF-IR或EGFR)具有强亲和力的10Fn3结合物。例如，在本文中所描述的许多例子中，仅修饰与SEQ ID NO：1的氨基酸23-30、52-55和77-86对应的残基以生成高亲和力10Fn3结合物(参见图46)。因而，在某些实施方案中，BC环可以由与SEQ ID NO：1的残基23-30对应的氨基酸限定，DE环可以由与SEQ ID NO：1的残基52-55对应的氨基酸限定，而FG环可以由与SEQ ID NO：1的残基77-86对应的氨基酸限定。
10Fn3在结构和功能上与抗体，特别是抗体的可变区相似。虽然10Fn3域可以描述为“抗体模拟物”或“抗体样蛋白质”，但是它们确实提供许多超过常规抗体的优点。具体地，与抗体相比，它们展现出更好的折叠和热稳定性特性，而且它们缺乏二硫键，已知二硫键在某些条件下可妨碍或阻止正确的折叠。例示性的基于10Fn3的E/I结合物主要是单体的，Tm的平均为约50℃。
10Fn3的BC、DE、和FG环与来自免疫球蛋白的互补决定区(CDR)类似。这些环区中的氨基酸序列变化改变10Fn3的结合特异性。CDR样环外部的蛋白质序列与来自免疫球蛋白的框架区类似，而且在10Fn3的结构构象中发挥作用。以结构构象的改变不破坏配体结合为限，10Fn3的框架样区的变化是容许的。用于生成10Fn3配体特异性结合物的方法已经记载于PCT公开号WO00/034787、WO 01/64942、和WO 02/032925(其披露了高亲和力TNF α结合物)、PCT公开号WO 2008/097497(其披露了高亲和力VEGFR2结合物)、和PCT公开号WO 2008/066752(其披露了高亲和力IGFIR结合物)。讨论10Fn3结合物和选择结合物的方法的其它参考文献包括PCT公开号WO 98/056915、WO 02/081497、和WO 2008/031098及美国公开号2003186385。
基于10Fn3支架的抗体样蛋白质一般可以以以下序列限定：
VSDVPRDLEVVAATPTSLLI(X)nYYRITYGETGGNSPVQEFTV(X)oATISGLKPGVDYTITVYAV(X)pISINYRT(SEQ ID NO：32)，其中n是1-20的整数，o是1-20的整数，p是1-40的整数。BC、DE、和FG环分别以(X)n、(X)o、和(X)p 表示。
10Fn3一般以与SEQ ID NO：1的编号1对应的氨基酸残基开始。然而，本发明还涵盖具有氨基酸缺失的域。在一些实施方案中，将与SEQ ID NO：1的前8个氨基酸对应的氨基酸残基删除。也可以向N或C端添加额外的序列。例如，额外的MG序列可以放置于10Fn3的N端。M通常会被切去，在N端留下G。在一些实施方案中，可以在10Fn3域的C端放置序列，例如EIDKPSQ(SEQ ID NO：9)、EIDKPCQ(SEQ ID NO：10)、EGSGS(SEQ ID NO：96)或EGSGC(SEQ ID NO：97)。
可以改变10Fn3的非配体结合序列，即“10Fn3支架”，只要10Fn3保留配体结合功能和/或结构稳定性。在一些实施方案中，将Asp 7、Glu 9、和Asp 23中的一个或多个用另一种氨基酸诸如例如不带负电荷的氨基酸残基(例如Asn、Lys等)替换。已经有人报告，与野生型形式相比，这些突变具有促进突变型10Fn3在中性pH的更大稳定性的效果(参见PCT公开号WO 02/04523)。已经披露了在10Fn3支架中许多其它的有益或中性的变化。参见例如，Batori等，Protein Eng.200215(12)：1015-20；Koide等，Biochemistry 200140(34)：10326-33。
10Fn3支架可以通过一处或多处保守替代来修饰。10Fn3支架中多达5％、10％、20％或甚至30％或更多的氨基酸可以通过保守替代来改变，而基本上不改变10Fn3对配体的亲和力。例如，支架修饰优选地将10Fn3结合物对配体的结合亲和力降低小于100倍、50倍、25倍、10倍、5倍、或2倍。有可能的是，此类变化会改变10Fn3的体内免疫原性，而且在降低免疫原性的场合，此类变化会是理想的。如本文中所使用的，“保守替代”指物理或功能上与相应的参照残基相似的残基。也就是说，保守替代及其参照残基具有相似的大小、形状、电荷、化学特性，包括形成共价或氢键的能力，等等。优选的保守替代是那些满足Dayhoff等，Atlas of Protein Sequence and Structure 5：345-352(1978及增补)中对公认的点突变限定的标准的替代。保守替代的例子是下组内的替代：(a)缬氨酸、甘氨酸；(b)甘氨酸、丙氨酸；(c)缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；(d)天冬氨酸、谷氨酸；(e)天冬酰胺、谷氨酰胺；(f)丝氨酸、苏氨酸；(g)赖氨酸、精氨酸、甲硫氨酸；和(h)苯丙氨酸、酪氨酸。
E结合物
在一个方面，公开内容提供了包含EGFR结合性10Fn3域的抗体样蛋白质。 在某些实施方案中，EGFR结合性10Fn3可以作为融合蛋白或多聚体的一部分提供。例如，EGFR结合性10Fn3可以至少与第二10Fn3结合域共价或非共价连接。第二10Fn3结合域可以结合EGFR或另一不同的靶物。在一个例示性的实施方案中，EGFR结合性10Fn3可以与IGF-IR结合性10Fn3共价或非共价连接。
在例示性的实施方案中，本文中所描述的EGFR结合性10Fn3蛋白以小于500nM、100nM、50nM、10nM、1nM、500pM、100pM、50pM或10pM的KD结合EGFR。
在例示性的实施方案中，EGFR结合性10Fn3蛋白的BC环对应于SEQ ID NO：1的氨基酸23-30，EGFR结合性10Fn3蛋白的DE环对应于SEQ ID NO：1的氨基酸52-55，而EGFR结合性10Fn3蛋白的FG环对应于SEQ ID NO：1的氨基酸77-86。
在一个实施方案中，本发明提供了一种EGFR结合性10Fn3，其包含在与SEQ ID NO：1的氨基酸29和30对应的位置具有YQ的BC环。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种EGFR结合性10Fn3，其包含在与SEQ ID NO：1的氨基酸29和30对应的位置具有YQ的BC环，以及长度为15个氨基酸的FG环，例如由于在与SEQ ID NO：1的氨基酸77-86对应的残基间插入5个氨基酸而在长度上延伸5个氨基酸的FG环。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种EGFR结合性10Fn3，其包含在与SEQ ID NO：1的氨基酸29和30对应的位置具有YQ的BC环和在与SEQ ID NO：1的氨基酸54对应的位置具有V、I、L、M或A残基的DE环。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种EGFR结合性10Fn3，其包含在与SEQ ID NO：1的氨基酸29和30对应的位置具有YQ的BC环、在与SEQ ID NO：1的氨基酸54对应的位置具有V、I、L、M或A残基的DE环、和长度为15个氨基酸的FG环，例如由于在与SEQ ID NO：1的氨基酸77-86对应的残基间插入5个氨基酸而在长度上延伸5个氨基酸的FG环。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种EGFR结合性10Fn3，其包含在与SEQ ID NO：1的氨基酸29和30对应的位置具有YQ的BC环和在与SEQ ID NO：1的氨基酸77对应的位置包含D或N的FG环。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种EGFR结合性10Fn3，其包含在与SEQ ID NO：1的氨基酸29和30对应的位置具有YQ的BC环，以及FG环，所述FG环(i)长度为15个氨基酸，例如由于在与SEQ ID NO：1的氨基酸77-86对 应的残基间插入5个氨基酸而在长度上延伸5个氨基酸的FG环，及(ii)在与SEQ ID NO：1的氨基酸77对应的位置包含D或N。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种EGFR结合性10Fn3，其包含在与SEQ ID NO：1的氨基酸54对应的位置具有V、I、L、M或A残基的DE环和在与SEQ ID NO：1的氨基酸77对应的位置包含D或N的FG环。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种EGFR结合性10Fn3，其包含在与SEQ ID NO：1的氨基酸54对应的位置具有V、I、L、M或A残基的DE环，以及FG环，所述FG环(i)长度为15个氨基酸，例如由于在与SEQ ID NO：1的氨基酸77-86对应的残基间插入5个氨基酸而在长度上延伸5个氨基酸的FG环，及(ii)在与SEQ ID NO：1的氨基酸77对应的位置包含D或N。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种EGFR结合性10Fn3，其包含在与SEQ ID NO：1的氨基酸29和30对应的位置具有YQ的BC环、在与SEQ ID NO：1的氨基酸54对应的位置具有V、I、L、M或A残基的DE环、和在与SEQ ID NO：1的氨基酸77对应的位置包含D或N的FG环。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种EGFR结合性10Fn3，其包含在与SEQ ID NO：1的氨基酸29和30对应的位置具有YQ的BC环、在与SEQ ID NO：1的氨基酸54对应的位置具有V、I、L、M或A残基的DE环、和FG环，所述FG环(i)长度为15个氨基酸，例如由于在与SEQ ID NO：1的氨基酸77-86对应的残基间插入5个氨基酸而在长度上延伸5个氨基酸的FG环及(ii)在与SEQ ID NO：1的氨基酸77对应的位置包含D或N。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种EGFR结合性10Fn3，其含有包含氨基酸序列XXXXXXYQ的BC环、包含氨基酸序列XX(V/I/L/M/A)X的DE环、和包含氨基酸序列(D/N)Xn的FG环，其中X是任何氨基酸，而n是9-14个氨基酸。在一个例示性的实施方案中，n是14个氨基酸。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种EGFR结合性10Fn3，其包含与SEQ ID NO：1的氨基酸23-30对应且包含氨基酸序列XXXXXXYQ的BC环、与SEQ ID NO：1的氨基酸52-55对应且包含氨基酸序列XX(V/I/L/M/A)X的DE环、和与SEQ ID NO：1的氨基酸77-86对应且包含氨基酸序列(D/N)Xn的FG环，其中X是任何氨基酸，而n是9-14个氨基酸。在一个例示性的实施方案中，n是14个氨基酸。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种EGFR结合性10Fn3，其含有包 含氨基酸序列XXXXXXYQ的BC环、包含氨基酸序列XX(V/I/L/M/A)X的DE环、和包含选自下组的氨基酸序列的FG环：
i.
(D/N)(Y/M)(Y/A/M)(Y/H/F)(K/Q/V)(E/P/R)(Y/T/K)X(E/Y/Q)(Y/G/H)；和
ii.
D(Y/F/W)(Y/F/K)(N/D/P)(P/H/L)(A/T/V)(T/D/S)(H/Y/G)(E/P/V)(Y/H)(T/K/I)(Y/F)(H/N/Q)(T/Q/E)(T/S/I)；
其中X是任何氨基酸。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种EGFR结合性10Fn3，其含有包含氨基酸序列XXXXXXYQ的BC环、包含氨基酸序列(G/Y/H)(D/M/G)(V/L/I)X的DE环、和包含氨基酸序列(D/N)(Y/M)(Y/A/M)(Y/H/F)(K/Q/V)(E/P/R)(Y/T/K)X(E/Y/Q)(Y/G/H)的FG环，其中X是任何氨基酸。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种EGFR结合性10Fn3，其含有包含氨基酸序列XXXXXXYQ的BC环、包含氨基酸序列(G/Y/H)(D/M/G)(V/L/I)X的DE环、和包含氨基酸序列D(Y/F/W)(Y/F/K)(N/D/P)(P/H/L)(A/T/V)(T/D/S)(H/Y/G)(E/P/V)(Y/H)(T/K/I)(Y/F)(H/N/Q)(T/Q/E)(T/S/I)的FG环，其中X是任何氨基酸。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种EGFR结合性10Fn3，其含有包含氨基酸序列XXXXXXYQ的BC环、包含氨基酸序列XX(V/I/L/M/A)X的DE环、和包含选自下组的氨基酸序列的FG环：
i.DY(A/Y)GKPYXEY(SEQ ID NO：473)；
ii.DY(A/Y)Y(K/R/Q/T)PYXEY(SEQ ID NO：474)；
iii.(D/N)Y(A/Y)(Y/F)(K/R/Q/T)EYXE(Y/H)(SEQ ID NO：475)；
iv.DYY(H/Y)X(R/K)X(E/T)YX(SEQ ID NO：476)；
v.DYY(H/Y)(K/H/Q)(R/K)T(E/T)Y(G/P)(SEQ ID NO：477)；
vi.(D/N)MMHV(E/D)YXEY(SEQ ID NO：478)；
vii.DYMHXXYXEY(SEQ ID NO：479)；和
viii.D(M/Y)YHX(K/R)X(V/I/L/M)YG(SEQ ID NO：480)；
其中X是任何氨基酸。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种EGFR结合性10Fn3，其含有包 含氨基酸序列XXXXXXYQ的BC环、包含氨基酸序列XX(V/I/L/M/A)X的DE环、和包含选自下组的氨基酸序列的FG环：
i.D(Y/F)(Y/F)NPXTHEYXYXXX(SEQ ID NO：481)；
ii.D(Y/F)(Y/F)D(P/L)X(T/S)HXYXYXXX(SEQ ID NO：482)；和
iii.D(Y/F)(K/R)PHXDGPH(T/I)YXE(S/Y)(SEQ ID NO：483)；
其中X是任何氨基酸。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种EGFR结合性10Fn3，其含有包含氨基酸序列XXXXXXYQ的BC环、包含氨基酸序列XX(V/I/L/M/A)X的DE环、和包含氨基酸序列(D/N)(M/Y)(M/A/W)(H/F/Y)(V/K)EY(A/Q/R/S/T)E(Y/H/D)的FG环，其中X是任何氨基酸。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种EGFR结合性10Fn3，其含有包含氨基酸序列XXXXXXYQ的BC环、包含氨基酸序列XX(V/I/L/M/A)X的DE环、和包含氨基酸序列D(Y/F/W)(Y/F/K)(N/P/D)(P/H/L)X(T/D/S)(H/G/Y)(E/P/Y)(Y/H)XYXXX的FG环，其中X是任何氨基酸。
在多个实施方案中，EGFR结合性10Fn3的DE环可以包含序列(G/Y/H)(D/M/G)(V/L/I)X。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种EGFR结合性10Fn3，其含有包含选自下组的氨基酸序列的FG环：
i.D(Y/F)(Y/F)NPXTHEYXYXXX(SEQ ID NO：481)；
ii.D(Y/F)(Y/F)D(P/L)X(T/S)HXYXYXXX(SEQ ID NO：482)；和
iii.D(Y/F)(K/R)PHXDGPH(T/I)YXE(S/Y)(SEQ ID NO：483)；
其中X是任何氨基酸。
在某些实施方案中，EGFR结合性10Fn3包含上文所提供的任何共有序列，但须EGFR结合性10Fn3不包含下列一项或多项序列：
i.
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWQVPRPMYQRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGGVRTATISGLKPGVDYTITVYAVTDYMHSEYRQYPISINYRT(SEQ ID NO：484)，和
ii.
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWQVPRPMYQYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGGVRTATISGLKPGVDYTITVYAVTDYMHSEYRQYPISINYRT(SEQ  ID NO：485)，和
iii.
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWQVPRPMYQRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGGVRTATISGLKPGVDYTITVYAVTDYMHSEYRQYPISINYRTEIDKPCQ(SEQ ID NO：486)。
在某些实施方案中，包含上文所提供的共有序列之一的EGFR结合性 10Fn3与SEQ ID NO：1具有至少40％、50％、60％、70％、75％、或80％同一性。在某些实施方案中，包含上文所提供的共有序列之一的EGFR结合性10Fn3的总体结构类似于免疫球蛋白折叠。在某些实施方案中，包含上文所提供的共有序列之一的EGFR结合性10Fn3进一步包含支架的核心氨基酸残基。在某些实施方案中，包含上文所提供的共有序列之一的EGFR结合性10Fn3与SEQ ID NO：5-8、52、66-68、106-108、112-114、140-142、155-157、170-172、182、185-187、198-200、或219-327中任一项具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、或99％同一性。在某些实施方案中，包含上文所提供的共有序列之一的EGFR结合性10Fn3与SEQ ID NO：5-8、52、66-68、106-108、112-114、140-142、155-157、170-172、182、185-187、198-200、或219-327中任一项的与SEQ ID NO：1的E9到SEQ ID NO：1的T94对应的氨基酸残基的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、或99％同一性。在某些实施方案中，包含上文所提供的共有序列之一的EGFR结合性10Fn3包含相对于SEQ ID NO：1的支架氨基酸残基具有0至20、0至15、0至10、0至8、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2、或0至1处替代、保守替代、缺失或添加的10Fn3支架。
在某些实施方案中，本发明提供了一种EGFR结合性10Fn3，其包含具有SEQ ID NO：219-327中任一项的氨基酸23-30中所示的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO：219-327中任一项的氨基酸52-55中所示的氨基酸序列的DE环、和具有SEQ ID NO：219-327中任一项的氨基酸77-86中所列的氨基酸的FG环。在某些实施方案中，本发明提供了一种EGFR结合性10Fn3，其包含具有SEQ ID NO：219-327中任一项的氨基酸21-30中所示的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO：219-327中任一项的氨基酸51-56中所示的氨基酸序列的DE环、和具有SEQ ID NO：219-327中任一项的氨基酸76-87中所列的氨基酸的FG环。在某些实施方案中，本发明提供了一种EGFR结合性10Fn3，其包含 与SEQ ID NO：219-327中任一项至少60％、75％、80％、85％、90％、95％、或98％相同的氨基酸序列。
在一个实施方案中，提供了一种抗体样蛋白质，其包含以小于500nM的KD结合EGFR，而且包含具有SEQ ID NO：5的氨基酸21-30中所示的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO：5的氨基酸51-56中所示的氨基酸序列的DE环、和具有SEQ ID NO：5的氨基酸76-92中所列的氨基酸的FG环的第十纤连蛋白III型域(10Fn3)。在一些实施方案中，EGFR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列XgDSGRGSYQXh(SEQ ID NO：40)的BC环、具有氨基酸序列XiGPVHXj(SEQ ID NO：42)的DE环、和具有氨基酸序列XkDHKPHADGPHTYHEXl(SEQ ID NO：44)的FG环；其中X是任何氨基酸，而g、h、i、j、k、和l是独立选自0至5的整数。在一些实施方案中，EGFR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列SWDSGRGSYQ(SEQ ID NO：39)的BC环、具有氨基酸序列PGPVHT(SEQ ID NO：41)的DE环、和具有氨基酸序列TDHKPHADGPHTYHESP(SEQ ID NO：43)的FG环。在一些实施方案中，EGFR结合性10Fn3具有与SEQ ID NO：5或6至少80、90、95、或100％相同的氨基酸序列。
在一个实施方案中，提供了一种抗体样蛋白质，其包含以小于500nM的KD结合EGFR，而且包含具有SEQ ID NO：7的氨基酸21-30中所示的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO：7的氨基酸51-56中所示的氨基酸序列的DE环、和具有SEQ ID NO：7的氨基酸76-87中所列的氨基酸的FG环的第十纤连蛋白III型域(10Fn3)。在一些实施方案中，EGFR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列XmVAGAEDYQXn(SEQ ID NO：34)的BC环、具有氨基酸序列XoHDLVXp(SEQ ID NO：36)的DE环、和具有氨基酸序列XqDMMHVEYTEHXr(SEQ ID NO：38)的FG环；其中X是任何氨基酸，而m、n、o、p、q、和r是独立选自0至5的整数。在一些实施方案中，EGFR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列SWVAGAEDYQ(SEQ ID NO：33)的BC环、具有氨基酸序列PHDLVT(SEQ ID NO：35)的DE环、和具有氨基酸序列TDMMHVEYTEHP(SEQ ID NO：37)的FG环。在一些实施方案中，EGFR结合性10Fn3具有与SEQ ID NO：7或8至少80、90、95、或100％相同的氨基酸序列。
在一个实施方案中，提供了一种抗体样蛋白质，其包含以小于500nM的KD结合EGFR，而且包含具有SEQ ID NO：82的氨基酸23-30中所示的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO：82的氨基酸51-55中所示的氨基酸序列的DE 环、和具有SEQ ID NO：82的氨基酸76-86中所列的氨基酸的FG环的第十纤连蛋白III型域(10Fn3)。在一些实施方案中，EGFR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列XsLPGKLRYQXt(SEQ ID NO：60)的BC环、具有氨基酸序列XuHDLRXw(SEQ ID NO：62)的DE环、和具有氨基酸序列XyNMMHVEYSEYXz(SEQ ID NO：64)的FG环；其中X是任何氨基酸，而s、t、u、w、y和z是独立选自0至5的整数。在一些实施方案中，EGFR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列LPGKLRYQ(SEQ ID NO：59的残基3-13)的BC环、具有氨基酸序列PHDLR(SEQ ID NO：61的残基1-5)的DE环、和具有氨基酸序列TNMMHVEYSEY(SEQ ID NO：63的残基1-11)的FG环。在一些实施方案中，EGFR结合性10Fn3具有与SEQ ID NO：52或82至少80、90、95、或100％相同的氨基酸序列。
在一个实施方案中，提供了一种抗体样蛋白质，其包含以小于500nM的KD结合EGFR，而且包含具有SEQ ID NO：106的氨基酸23-30中所示的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO：106的氨基酸51-55中所示的氨基酸序列的DE环、和具有SEQ ID NO：106的氨基酸76-86中所列的氨基酸的FG环的第十纤连蛋白III型域(10Fn3)。在一些实施方案中，EGFR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列XgHERDGSRQXh(SEQ ID NO：134)的BC环、具有氨基酸序列XiGGVRXj(SEQ ID NO：135)的DE环、和具有氨基酸序列XkDYFNPTTHEYIYQTTXl(SEQ ID NO：136)的FG环；其中X是任何氨基酸，而g、h、i、j、k和l是独立选自0至5的整数。在一些实施方案中，EGFR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列SWHERDGSRQ(SEQ ID NO：109)的BC环、具有氨基酸序列PGGVRT(SEQ ID NO：110)的DE环、和具有氨基酸序列TDYFNPTTHEYIYQTTP(SEQ ID NO：111)的FG环。在一些实施方案中，EGFR结合性10Fn3具有与SEQ ID NO：106-108中任一项至少80、90、95、或100％相同的氨基酸序列。
在一个实施方案中，提供了一种抗体样蛋白质，其包含以小于500nM的KD结合EGFR，而且包含具有SEQ ID NO：112的氨基酸23-30中所示的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO：112的氨基酸51-55中所示的氨基酸序列的DE环、和具有SEQ ID NO：112的氨基酸76-86中所示的氨基酸的FG环的第十纤连蛋白III型域(10Fn3)。在一些实施方案中，EGFR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列XgWAPVDRYQXh(SEQ ID NO：137)的BC环、具有氨基酸序列XiRDVYXj(SEQ ID NO：138)的DE环、和具有氨基酸序列 XkDYKPHADGPHTYHESXl(SEQ ID NO：139)的FG环；其中X是任何氨基酸，而g、h、i、j、k和l是独立选自0至5的整数。在一些实施方案中，EGFR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列SWWAPVDRYQ(SEQ ID NO：115)的BC环、具有氨基酸序列PRDVYT(SEQ ID NO：116)的DE环、和具有氨基酸序列TDYKPHADGPHTYHESP(SEQ ID NO：117)的FG环。在一些实施方案中，EGFR结合性10Fn3具有与SEQ ID NO：112-114中任一项至少80、90、95、或100％相同的氨基酸序列。
在一个实施方案中，提供了一种抗体样蛋白质，其包含以小于500nM的KD结合EGFR，而且包含具有SEQ ID NO：141的氨基酸13-22中所示的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO：141的氨基酸43-48中所示的氨基酸序列的DE环、和具有SEQ ID NO：141的氨基酸68-84中所列的氨基酸的FG环的第十纤连蛋白III型域(10Fn3)。在一些实施方案中，EGFR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列XgTQGSTHYQXh(SEQ ID NO：146)的BC环、具有氨基酸序列XiGMVYXj(SEQ ID NO：147)的DE环、和具有氨基酸序列XkDYFDRSTHEYKYRTTXl(SEQ ID NO：148)的FG环；其中X是任何氨基酸，而g、h、i、j、k和l是独立选自0至5的整数。在一些实施方案中，EGFR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列SWTQGSTHYQ(SEQ ID NO：143)的BC环、具有氨基酸序列PGMVYT(SEQ ID NO：144)的DE环、和具有氨基酸序列TDYFDRSTHEYKYRTTP(SEQ ID NO：145)的FG环。在一些实施方案中，EGFR结合性10Fn3具有与SEQ ID NO：140-142中任一项至少80、90、95、或100％相同的氨基酸序列。
在一个实施方案中，提供了一种抗体样蛋白质，其包含以小于500nM的KD结合EGFR，而且包含具有SEQ ID NO：156的氨基酸13-22中所示的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO：156的氨基酸43-48中所示的氨基酸序列的DE环、和具有SEQ ID NO：156的氨基酸68-84中所列的氨基酸的FG环的第十纤连蛋白III型域(10Fn3)。在一些实施方案中，EGFR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列XgYWEGLPYQXh(SEQ ID NO：161)的BC环、具有氨基酸序列XiRDVNXj(SEQ ID NO：162)的DE环、和具有氨基酸序列XkDWYNPDTHEYIYHTIXl(SEQ ID NO：163)的FG环；其中X是任何氨基酸，而g、h、i、j、k和l是独立选自0至5的整数。在一些实施方案中，EGFR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列SWYWEGLPYQ(SEQ ID NO：158)的BC环、具 有氨基酸序列PRDVNT(SEQ ID NO：159)的DE环、和具有氨基酸序列TDWYNPDTHEYIYHTIP(SEQ ID NO：160)的FG环。在一些实施方案中，EGFR结合性10Fn3具有与SEQ ID NO：155-157中任一项至少80、90、95、或100％相同的氨基酸序列。
在一个实施方案中，提供了一种抗体样蛋白质，其包含以小于500nM的KD结合EGFR，而且包含具有SEQ ID NO：171的氨基酸13-22中所示的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO：171的氨基酸43-48中所示的氨基酸序列的DE环、和具有SEQ ID NO：171的氨基酸68-84中所列的氨基酸的FG环的第十纤连蛋白III型域(10Fn3)。在一些实施方案中，EGFR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列XgASNRGTYQXh(SEQ ID NO：176)的BC环、具有氨基酸序列XiGGVSXj(SEQ ID NO：177)的DE环、和具有氨基酸序列XkDAFNPTTHEYNYFTTXl(SEQ ID NO：178)的FG环；其中X是任何氨基酸，而g、h、i、j、k和l是独立选自0至5的整数。在一些实施方案中，EGFR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列SWASNRGTYQ(SEQ ID NO：173)的BC环、具有氨基酸序列PGGVST(SEQ ID NO：174)的DE环、和具有氨基酸序列TDAFNPTTHEYNYFTTP(SEQ ID NO：175)的FG环。在一些实施方案中，EGFR结合性10Fn3具有与SEQ ID NO：170-172中任一项至少80、90、95、或100％相同的氨基酸序列。
在一个实施方案中，提供了一种抗体样蛋白质，其包含以小于500nM的KD结合EGFR，而且包含具有SEQ ID NO：186的氨基酸13-22中所示的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO：186的氨基酸43-48中所示的氨基酸序列的DE环、和具有SEQ ID NO：186的氨基酸68-84中所列的氨基酸的FG环的第十纤连蛋白III型域(10Fn3)。在一些实施方案中，EGFR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列XgDAPTSRYQXh(SEQ ID NO：190)的BC环、具有氨基酸序列XiGGLSXj(SEQ ID NO：191)的DE环、和具有氨基酸序列XkDYKPHADGPHTYHESXl(SEQ ID NO：139)的FG环；其中X是任何氨基酸，而g、h、i、j、k和l是独立选自0至5的整数。在一些实施方案中，EGFR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列SWDAPTSRYQ(SEQ ID NO：188)的BC环、具有氨基酸序列PGGLST(SEQ ID NO：189)的DE环、和具有氨基酸序列TDYKPHADGPHTYHESP(SEQ ID NO：117)的FG环。在一些实施方案中，EGFR结合性10Fn3具有与SEQ ID NO：185-187中任一项至少80、90、95、或 100％相同的氨基酸序列。
在一个实施方案中，提供了一种抗体样蛋白质，其包含以小于500nM的KD结合EGFR，而且包含具有SEQ ID NO：199的氨基酸13-22中所示的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO：199的氨基酸43-48中所示的氨基酸序列的DE环、和具有SEQ ID NO：199的氨基酸68-84中所列的氨基酸的FG环的第十纤连蛋白III型域(10Fn3)。在一些实施方案中，EGFR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列XgDAGAVTYQXh(SEQ ID NO：203)的BC环、具有氨基酸序列XiGGVRXj(SEQ ID NO：135)的DE环、和具有氨基酸序列XkDYKPHADGPHTYHEYXl(SEQ ID NO：204)的FG环；其中X是任何氨基酸，而g、h、i、j、k和l是独立选自0至5的整数。在一些实施方案中，EGFR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列SWDAGAVTYQ(SEQ ID NO：201)的BC环、具有氨基酸序列PGGVRT(SEQ ID NO：110)的DE环、和具有氨基酸序列TDYKPHADGPHTYHEYP(SEQ ID NO：202)的FG环。在一些实施方案中，EGFR结合性10Fn3具有与SEQ ID NO：198-200中任一项至少80、90、95、或100％相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，EGFR结合性10Fn3域与EGF-IR结合性10Fn3域共价或非共价连接。在例示性的实施方案中，IGF-IR结合性10Fn3可以包含具有SEQ ID NO：3的氨基酸21-30中所示的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO：3的氨基酸51-56中所示的氨基酸序列的DE环、和具有SEQ ID NO：3的氨基酸76-83中所列的氨基酸的FG环。在一些实施方案中，IGF-IR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列XaSARLKVAXb(SEQ ID NO：46)的BC环、具有氨基酸序列XcKNVYXd(SEQ ID NO：48)的DE环、和具有氨基酸序列XeRFRDYQXf(SEQ ID NO：50)的FG环，其中X是任何氨基酸，而a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、和l是独立选自0至5的整数，或者其中a是2，而b-f是1，或者其中a-f是0。在一些实施方案中，IGF-IR结合性10Fn3具有与SEQ ID NO：3至少80、90、95、或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，IGF-IR结合性10Fn3包含相对于SEQ ID NO：1的支架氨基酸残基具有0至20、0至15、0至10、0至8、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2、或0至1处替代、保守替代、缺失或添加的10Fn3支架。在某些实施方案中，IGF-IR结合性10Fn3相对于SEQ ID NO：3的相应环序列具有0至15、0至10、0至8、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2、或0至1处替代、保守替代、缺失或添加。
10Fn3E/I结合物
本公开内容的一个方面提供了自抗体样蛋白质多聚体构建的E/I结合物。在一些实施方案中，抗体样蛋白质多聚体包含与至少一个IGFIR结合性10Fn3共价或非共价连接的至少一个EGFR结合性10Fn3。在某些实施方案中，本文中所描述的E/I结合物可以构建为单条多肽链，其中E和I亚基可以为任何取向，例如自N端至C端为E-I取向或I-E取向。
本公开内容部分涉及一个出人意料的发现，即经由多肽接头连接的多个 10Fn3彼此独立地正确折叠，保留高亲和力结合，而且每个域保留其功能特性(参见例如实施例5-10)。另外，这些基于10Fn3的E/I结合物显示出期望的生物物理特性，诸如低聚集和高熔解温度(Tm)(参见例如实施例4)。实施例表征了多种基于10Fn3的E/I结合物。SEQ ID NO：4中列出了一种例示性的IGFIR结合性10Fn3。SEQ ID NO：6、8、52、107、113、140、155、170、185和198中列出了例示性的EGFR结合性10Fn3。
在一些实施方案中，E/I结合物包含EGFR结合性10Fn3和IGFIR结合性 10Fn3，它们独立地具有与SEQ ID NO：1中所显示的人10Fn3域至少40、50、60、70、或80％相同的氨基酸序列。变异性大多出现在一个或多个环中。
在一些实施方案中，E/I结合物包含EGFR结合性10Fn3和IGFIR结合性 10Fn3，它们独立地具有与SEQ ID NO：32至少70、80、85、90、95、98、或100％相同的氨基酸序列，其中n是1-20的整数，o是1-20的整数，而p是1-40的整数。在一些实施方案中，n是8-12的整数，o是4-8的整数，而p是4-28的整数。在一些实施方案中，n是10，o是6，而p是12。
在一些实施方案中，本公开内容提供了具有至少一个选自环BC、DE、和FG的环的10Fn3多聚体，所述环BC、DE、和FG相对于人10Fn3的相应环的序列具有改变的氨基酸序列。“改变的”指相对于模板序列(相应的人纤连蛋白域)的一处或多处氨基酸序列变化，包括氨基酸添加、缺失、和替代。氨基酸序列的改变可以经由有意的、盲目的、或自发的序列变化(通常是核酸编码序列的序列变化)来实现，而且可以通过任何技术，例如PCR、易错PCR、或化学DNA合成来发生。在一些实施方案中，通过用天然存在的氨基酸替换或者添加天然存在的氨基酸来改变氨基酸序列。
在一些实施方案中，选自BC、DE、和FG中的一个或多个环可以相对于相应的人纤连蛋白环在长度上延伸或缩短。具体地，人10Fn3的FG环长12个 残基，而抗体重链中的相应环的范围为4-28个残基。因此，为了优化抗原结合，可以在长度及序列上改变10Fn3的FG环的长度，以获得在抗原结合上最大的可能的柔性和亲和力。
在10Fn3分子的一些实施方案中，改变的BC环具有多至10处氨基酸替代、多至9处氨基酸缺失、多至10处氨基酸插入、或替代和缺失或插入的组合。在一些实施方案中，改变的DE环具有多至6处氨基酸替代、多至5处氨基酸缺失、多至14处氨基酸插入、或替代和缺失或插入的组合。在一些实施方案中，FG环具有多至12处氨基酸替代、多至11处氨基酸缺失、多至28处氨基酸插入或替代和缺失或插入的组合。
天然存在的10Fn3在FG环中包含“精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸”(RGD)整联蛋白结合基序。优选的10Fn3多聚体缺乏RGD整联蛋白结合基序。//
在一些实施方案中，E/I结合物是抗体样蛋白质二聚体，其包含a)EGFR结合性10Fn3，其包含具有SEQ ID NO：5的氨基酸21-30中所示的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO：5的氨基酸51-56中所示的氨基酸序列的DE环、和具有SEQ ID NO：5的氨基酸76-92中所列的氨基酸的FG环；所述EGFR结合性 10Fn3与b)IGFIR结合性10Fn3共价或非共价连接，所述IGFIR结合性10Fn3包含具有SEQ ID NO：3的氨基酸21-30中所示的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO：3的氨基酸51-56中所示的氨基酸序列的DE环、和具有SEQ ID NO：3的氨基酸76-83中所示的氨基酸序列的FG环。在一些实施方案中，EGFR结合性 10Fn3具有与SEQ ID NO：5至少80、90、95、98、99、或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，IGFIR结合性10Fn3具有与SEQ ID NO：3至少80、90、95、98、99、或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，E/I结合物包含与SEQ ID NO：20、21、23、24、90、92、101或103至少80、90、95、98、99、或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，E/I结合物是一种抗体样蛋白质二聚体，其包含a)EGFR结合性10Fn3，其包含具有SEQ ID NO：7的氨基酸21-30中所示的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO：7的氨基酸51-56中所示的氨基酸序列的DE环、和具有SEQ ID NO：7的氨基酸76-87中所列的氨基酸的FG环；所述EGFR结合性10Fn3与b)IGFIR结合性10Fn3共价或非共价连接，所述IGFIR结合性 10Fn3包含具有SEQ ID NO：3的氨基酸21-30中所示的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO：3的氨基酸51-56中所示的氨基酸序列的DE环、和具有SEQ ID  NO：3的氨基酸76-83中所示的氨基酸序列的FG环。在一些实施方案中，EGFR结合性10Fn3具有与SEQ ID NO：7至少80、90、95、98、或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，IGFIR结合性10Fn3具有与SEQ ID NO：3至少80、90、95、98、或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，E/I结合物包含与SEQ ID NO：26、27、29、30、89、91、100或102至少80、85、90、95、98、或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，E/I结合物是一种抗体样蛋白质二聚体，其包含a)EGFR结合性10Fn3，其包含具有SEQ ID NO：82的氨基酸21-30中所示的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO：82的氨基酸51-56中所示的氨基酸序列的DE环、和具有SEQ ID NO：82的氨基酸76-87中所列的氨基酸的FG环；所述EGFR结合性10Fn3与b)IGFIR结合性10Fn3共价或非共价连接，所述IGFIR结合性10Fn3包含具有SEQ ID NO：3的氨基酸21-30中所示的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO：3的氨基酸51-56中所示的氨基酸序列的DE环、和具有SEQ ID NO：3的氨基酸76-83中所示的氨基酸序列的FG环。在一些实施方案中，EGFR结合性10Fn3具有与SEQ ID NO：82至少80、90、95、98、或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，IGFIR结合性10Fn3具有与SEQ ID NO：3至少80、90、95、98、或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，E/I结合物包含与SEQ ID NO：53、54、87、88、98、99、104或105至少80、85、90、95、98、或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，E/I结合物是一种抗体样蛋白质二聚体，其包含a)EGFR结合性10Fn3，其包含具有SEQ ID NO：106的氨基酸21-30中所示的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO：106的氨基酸51-56中所示的氨基酸序列的DE环、和具有SEQ ID NO：106的氨基酸76-92中所列的氨基酸的FG环；所述EGFR结合性10Fn3与b)IGFIR结合性10Fn3共价或非共价连接，所述IGFIR结合性10Fn3包含具有SEQ ID NO：3的氨基酸21-30中所示的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO：3的氨基酸51-56中所示的氨基酸序列的DE环、和具有SEQ ID NO：3的氨基酸76-83中所示的氨基酸序列的FG环。在一些实施方案中，EGFR结合性10Fn3具有与SEQ ID NO：106至少80、90、95、98、或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，IGFIR结合性10Fn3具有与SEQ ID NO：3至少80、90、95、98、或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，E/I结合物包含与SEQ ID NO：118-125至少80、85、90、95、98、或100％相同的 氨基酸序列。
在一些实施方案中，E/I结合物是一种抗体样蛋白质二聚体，其包含a)EGFR结合性10Fn3，其包含具有SEQ ID NO：112的氨基酸21-30中所示的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO：112的氨基酸51-56中所示的氨基酸序列的DE环、和具有SEQ ID NO：112的氨基酸76-92中所列的氨基酸的FG环；所述EGFR结合性10Fn3与b)IGFIR结合性10Fn3共价或非共价连接，所述IGFIR结合性10Fn3包含具有SEQ ID NO：3的氨基酸21-30中所示的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO：3的氨基酸51-56中所示的氨基酸序列的DE环、和具有SEQ ID NO：3的氨基酸76-83中所示的氨基酸序列的FG环。在一些实施方案中，EGFR结合性10Fn3具有与SEQ ID NO：112至少80、90、95、98、或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，IGFIR结合性10Fn3具有与SEQ ID NO：3至少80、90、95、98、或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，E/I结合物包含与SEQ ID NO：126-133至少80、85、90、95、98、或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，E/I结合物是一种抗体样蛋白质二聚体，其包含a)EGFR结合性10Fn3，其包含具有SEQ ID NO：141的氨基酸13-22中所示的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO：141的氨基酸43-48中所示的氨基酸序列的DE环、和具有SEQ ID NO：141的氨基酸68-84中所列的氨基酸的FG环；所述EGFR结合性10Fn3与b)IGFIR结合性10Fn3共价或非共价连接，所述IGFIR结合性10Fn3包含具有SEQ ID NO：3的氨基酸21-30中所示的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO：3的氨基酸51-56中所示的氨基酸序列的DE环、和具有SEQ ID NO：3的氨基酸76-83中所示的氨基酸序列的FG环。在一些实施方案中，EGFR结合性10Fn3具有与SEQ ID NO：140、141、142或300至少80、90、95、98、或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，IGFIR结合性10Fn3具有与SEQ ID NO：3至少80、90、95、98、或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，E/I结合物包含与SEQ ID NO：149-154至少80、85、90、95、98、或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，E/I结合物是一种抗体样蛋白质二聚体，其包含a)EGFR结合性10Fn3，其包含具有SEQ ID NO：156的氨基酸13-22中所示的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO：156的氨基酸43-48中所示的氨基酸序列的DE环、和具有SEQ ID NO：156的氨基酸68-84中所列的氨基酸的FG环；所述 EGFR结合性10Fn3与b)IGFIR结合性10Fn3共价或非共价连接，所述IGFIR结合性10Fn3包含具有SEQ ID NO：3的氨基酸21-30中所示的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO：3的氨基酸51-56中所示的氨基酸序列的DE环、和具有SEQ ID NO：3的氨基酸76-83中所示的氨基酸序列的FG环。在一些实施方案中，EGFR结合性10Fn3具有与SEQ ID NO：155、156、157或305至少80、90、95、98、或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，IGFIR结合性10Fn3具有与SEQ ID NO：3至少80、90、95、98、或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，E/I结合物包含与SEQ ID NO：158-166至少80、85、90、95、98、或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，E/I结合物是一种抗体样蛋白质二聚体，其包含a)EGFR结合性10Fn3，其包含具有SEQ ID NO：171的氨基酸13-22中所示的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO：171的氨基酸43-48中所示的氨基酸序列的DE环、和具有SEQ ID NO：171的氨基酸68-84中所列的氨基酸的FG环；所述EGFR结合性10Fn3与b)IGFIR结合性10Fn3共价或非共价连接，所述IGFIR结合性10Fn3包含具有SEQ ID NO：3的氨基酸21-30中所示的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO：3的氨基酸51-56中所示的氨基酸序列的DE环、和具有SEQ ID NO：3的氨基酸76-83中所示的氨基酸序列的FG环。在一些实施方案中，EGFR结合性10Fn3具有与SEQ ID NO：170、171、172或311至少80、90、95、98、或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，IGFIR结合性10Fn3具有与SEQ ID NO：3至少80、90、95、98、或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，E/I结合物包含与SEQ ID NO：179-184至少80、85、90、95、98、或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，E/I结合物是一种抗体样蛋白质二聚体，其包含a)EGFR结合性10Fn3，其包含具有SEQ ID NO：186的氨基酸13-22中所示的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO：186的氨基酸43-48中所示的氨基酸序列的DE环、和具有SEQ ID NO：186的氨基酸68-84中所列的氨基酸的FG环；所述EGFR结合性10Fn3与b)IGFIR结合性10Fn3共价或非共价连接，所述IGFIR结合性10Fn3包含具有SEQ ID NO：3的氨基酸21-30中所示的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO：3的氨基酸51-56中所示的氨基酸序列的DE环、和具有SEQ ID NO：3的氨基酸76-83中所示的氨基酸序列的FG环。在一些实施方案中，EGFR结合性10Fn3具有与SEQ ID NO：185、186、187或320至少80、90、95、 98、或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，IGFIR结合性10Fn3具有与SEQ ID NO：3至少80、90、95、98、或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，E/I结合物包含与SEQ ID NO：192-197至少80、85、90、95、98、或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，E/I结合物是一种抗体样蛋白质二聚体，其包含a)EGFR结合性10Fn3，其包含具有SEQ ID NO：199的氨基酸13-22中所示的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO：199的氨基酸43-48中所示的氨基酸序列的DE环、和具有SEQ ID NO：199的氨基酸68-84中所列的氨基酸的FG环；所述EGFR结合性10Fn3与b)IGFIR结合性10Fn3共价或非共价连接，所述IGFIR结合性10Fn3包含具有SEQ ID NO：3的氨基酸21-30中所示的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO：3的氨基酸51-56中所示的氨基酸序列的DE环、和具有SEQ ID NO：3的氨基酸76-83中所示的氨基酸序列的FG环。在一些实施方案中，EGFR结合性10Fn3具有与SEQ ID NO：198、199、200或327至少80、90、95、98、或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，IGFIR结合性10Fn3具有与SEQ ID NO：3至少80、90、95、98、或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，E/I结合物包含与SEQ ID NO：205-210至少80、85、90、95、98、或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，E/I结合物是一种抗体样蛋白质二聚体，其包含IGFIR结合性10Fn3，所述IGFIR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列XaSARLKVAXb(SEQ ID NO：46)的BC环、具有氨基酸序列XcKNVYXd(SEQ ID NO：48)的DE环、和具有氨基酸序列XeRFRDYQXf(SEQ ID NO：50)的FG环；所述IGFIR结合性10Fn3与EGFR结合性10Fn3共价或非共价连接，所述EGFR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列XgDSGRGSYQXh(SEQ ID NO：40)的BC环、具有氨基酸序列XiGPVHXj(SEQ ID NO：42)的DE环、和具有氨基酸序列XkDHKPHADGPHTYHEXl(SEQ ID NO：44)的FG环；其中X是任何氨基酸，而a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、和l是独立选自0至5的整数。在一些实施方案中，a、g、和l是2；b-f和i-k是1；而h是0。在一些实施方案中，a-l是0。
在一些实施方案中，E/I结合物是一种抗体样蛋白质二聚体，其包含IGFIR结合性10Fn3，所述IGFIR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列SWSARLKVAR(SEQ ID NO：45)的BC环、具有氨基酸序列PKNVYT(SEQ ID  NO：47)的DE环、和具有氨基酸序列TRFRDYQP(SEQ ID NO：49)的FG环；所述IGFIR结合性10Fn3与EGFR结合性10Fn3共价或非共价连接，所述EGFR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列SWDSGRGSYQ(SEQ ID NO：39)的BC环、具有氨基酸序列PGPVHT(SEQ ID NO：41)的DE环、和具有氨基酸序列TDHKPHADGPHTYHESP(SEQ ID NO：43)的FG环。
在一些实施方案中，E/I结合物是一种抗体样蛋白质二聚体，其包含IGFIR结合性10Fn3，所述IGFIR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列XaSARLKVAXb(SEQ ID NO：46)的BC环、具有氨基酸序列XcKNVYXd(SEQ ID NO：48)的DE环、和具有氨基酸序列XeRFRDYQXf(SEQ ID NO：50)的FG环；所述IGFIR结合性10Fn3与EGFR结合性10Fn3共价或非共价连接，所述EGFR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列XmVAGAEDYQXn(SEQ ID NO：34)的BC环、具有氨基酸序列XoHDLVXp(SEQ ID NO：36)的DE环、和具有氨基酸序列XqDMMHVEYTEHXr(SEQ ID NO：38)的FG环；其中X是任何氨基酸，而a、b、c、d、e、f、m、n、o、p、q、和r是独立地从0至5的整数。在一些实施方案中，a和m是2；b-f和o-r是1；而n是0。在一些实施方案中，a-f和m-r是0。
在一些实施方案中，E/I结合物是一种抗体样蛋白质二聚体，其包含IGFIR结合性10Fn3，所述IGFIR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列SWSARLKVAR(SEQ ID NO：45)的BC环、具有氨基酸序列PKNVYT(SEQ ID NO：47)的DE环、和具有氨基酸序列TRFRDYQP(SEQ ID NO：49)的FG环；所述IGFIR结合性10Fn3与EGFR结合性10Fn3共价或非共价连接，所述EGFR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列SWVAGAEDYQ(SEQ ID NO：33)的BC环、具有氨基酸序列PHDLVT(SEQ ID NO：35)的DE环、和具有氨基酸序列TDMMHVEYTEHP(SEQ ID NO：37)的FG环。
在一些实施方案中，E/I结合物是一种抗体样蛋白质二聚体，其包含IGFIR结合性10Fn3，所述IGFIR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列XaSARLKVAXb(SEQ ID NO：46)的BC环、具有氨基酸序列XcKNVYXd(SEQ ID NO：48)的DE环、和具有氨基酸序列XeRFRDYQXf(SEQ ID NO：50)的FG环；所述IGFIR结合性10Fn3与EGFR结合性10Fn3共价或非共价连接，所述EGFR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列XsLPGKLRYQXt(SEQ ID NO：60)的BC环、具有氨基酸序列XuHDLRXw(SEQ ID NO：62)的DE环、和具有氨基酸 序列XyNMMHVEYSEYXz(SEQ ID NO：64)的FG环；其中X是任何氨基酸，而a、b、c、d、e、f、s、t、u、w、y、和z是独立地从0至5的整数。在一些实施方案中，a和s是2；b-f、u、w、y和z是1；而t是0。在一些实施方案中，a-f、s-u、w、y和z是0。
在一些实施方案中，E/I结合物是一种抗体样蛋白质二聚体，其包含IGFIR结合性10Fn3，所述IGFIR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列SWSARLKVAR(SEQ ID NO：45)的BC环、具有氨基酸序列PKNVYT(SEQ ID NO：47)的DE环、和具有氨基酸序列TRFRDYQP(SEQ ID NO：49)的FG环；所述IGFIR结合性10Fn3与EGFR结合性10Fn3共价或非共价连接，所述EGFR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列SWLPGKLRYQ(SEQ ID NO：59)的BC环、具有氨基酸序列PHDLRT(SEQ ID NO：61)的DE环、和具有氨基酸序列TNMMHVEYSEYP(SEQ ID NO：63)的FG环。
在一些实施方案中，E/I结合物是一种抗体样蛋白质二聚体，其包含IGFIR结合性10Fn3，所述IGFIR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列XaSARLKVAXb(SEQ ID NO：46)的BC环、具有氨基酸序列XcKNVYXd(SEQ ID NO：48)的DE环、和具有氨基酸序列XeRFRDYQXf(SEQ ID NO：50)的FG环；所述IGFIR结合性10Fn3与EGFR结合性10Fn3共价或非共价连接，所述EGFR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列XgHERDGSRQXh(SEQ ID NO：134)的BC环、具有氨基酸序列XiGGVRXj(SEQ ID NO：135)的DE环、和具有氨基酸序列XkDYFNPTTHEYIYQTTXl(SEQ ID NO：136)的FG环；其中X是任何氨基酸，而a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k和l是独立地从0至5的整数。在一些实施方案中，a和g是2；b-f和i-l是1；而h是0。在一些实施方案中，a-l是0。
在一些实施方案中，E/I结合物是一种抗体样蛋白质二聚体，其包含IGFIR结合性10Fn3，所述IGFIR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列SWSARLKVAR(SEQ ID NO：45)的BC环、具有氨基酸序列PKNVYT(SEQ ID NO：47)的DE环、和具有氨基酸序列TRFRDYQP(SEQ ID NO：49)的FG环；所述IGFIR结合性10Fn3与EGFR结合性10Fn3共价或非共价连接，所述EGFR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列SWHERDGSRQ(SEQ ID NO：109)的BC环、具有氨基酸序列PGGVRT(SEQ ID NO：110)的DE环、和具有氨基酸序列TDYFNPTTHEYIYQTTP(SEQ ID NO：111)的FG环。
在一些实施方案中，E/I结合物是一种抗体样蛋白质二聚体，其包含IGFIR结合性10Fn3，所述IGFIR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列XaSARLKVAXb(SEQ ID NO：46)的BC环、具有氨基酸序列XcKNVYXd(SEQ ID NO：48)的DE环、和具有氨基酸序列XeRFRDYQXf(SEQ ID NO：50)的FG环；所述IGFIR结合性10Fn3与EGFR结合性10Fn3共价或非共价连接，所述EGFR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列XgWAPVDRYQXh(SEQ ID NO：137)的BC环、具有氨基酸序列XiRDVYXj(SEQ ID NO：138)的DE环、和具有氨基酸序列XkDYKPHADGPHTYHESXl(SEQ ID NO：139)的FG环；其中X是任何氨基酸，而a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k和l是独立地从0至5的整数。在一些实施方案中，a和g是2；b-f和i-l是1；而h是0。在一些实施方案中，a-l是0。
在一些实施方案中，E/I结合物是一种抗体样蛋白质二聚体，其包含IGFIR结合性10Fn3，所述IGFIR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列SWSARLKVAR(SEQ ID NO：45)的BC环、具有氨基酸序列PKNVYT(SEQ ID NO：47)的DE环、和具有氨基酸序列TRFRDYQP(SEQ ID NO：49)的FG环；所述IGFIR结合性10Fn3与EGFR结合性10Fn3共价或非共价连接，所述EGFR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列SWWAPVDRYQ(SEQ ID NO：115)的BC环、具有氨基酸序列PRDVYT(SEQ ID NO：116)的DE环、和具有氨基酸序列TDYKPHADGPHTYHESP(SEQ ID NO：117)的FG环。
在一些实施方案中，E/I结合物是一种抗体样蛋白质二聚体，其包含IGFIR结合性10Fn3，所述IGFIR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列XaSARLKVAXb(SEQ ID NO：46)的BC环、具有氨基酸序列XcKNVYXd(SEQ ID NO：48)的DE环、和具有氨基酸序列XeRFRDYQXf(SEQ ID NO：50)的FG环；所述IGFIR结合性10Fn3与EGFR结合性10Fn3共价或非共价连接，所述EGFR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列XgTQGSTHYQXh(SEQ ID NO：146)的BC环、具有氨基酸序列XiGMVYXj(SEQ ID NO：147)的DE环、和具有氨基酸序列XkDYFDRSTHEYKYRTTXl(SEQ ID NO：148)的FG环；其中X是任何氨基酸，而a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k和l是独立地从0至5的整数。在一些实施方案中，a和g是2；b-f和i-l是1；而h是0。在一些实施方案中，a-l是0。
在一些实施方案中，E/I结合物是一种抗体样蛋白质二聚体，其包含 IGFIR结合性10Fn3，所述IGFIR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列SWSARLKVAR(SEQ ID NO：45)的BC环、具有氨基酸序列PKNVYT(SEQ ID NO：47)的DE环、和具有氨基酸序列TRFRDYQP(SEQ ID NO：49)的FG环；所述IGFIR结合性10Fn3与EGFR结合性10Fn3共价或非共价连接，所述EGFR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列SWTQGSTHYQ(SEQ ID NO：143)的BC环、具有氨基酸序列PGMVYT(SEQ ID NO：144)的DE环、和具有氨基酸序列TDYFDRSTHEYKYRTTP(SEQ ID NO：145)的FG环。
在一些实施方案中，E/I结合物是一种抗体样蛋白质二聚体，其包含IGFIR结合性10Fn3，所述IGFIR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列XaSARLKVAXb(SEQ ID NO：46)的BC环、具有氨基酸序列XcKNVYXd(SEQ ID NO：48)的DE环、和具有氨基酸序列XeRFRDYQXf(SEQ ID NO：50)的FG环；所述IGFIR结合性10Fn3与EGFR结合性10Fn3共价或非共价连接，所述EGFR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列XgYWEGLPYQXh(SEQ ID NO：161)的BC环、具有氨基酸序列XiRDVNXj(SEQ ID NO：162)的DE环、和具有氨基酸序列XkDWYNPDTHEYIYHTIXl(SEQ ID NO：163)的FG环；其中X是任何氨基酸，而a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k和l是独立地从0至5的整数。在一些实施方案中，a和g是2；b-f和i-l是1；而h是0。在一些实施方案中，a-l是0。
在一些实施方案中，E/I结合物是一种抗体样蛋白质二聚体，其包含IGFIR结合性10Fn3，所述IGFIR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列SWSARLKVAR(SEQ ID NO：45)的BC环、具有氨基酸序列PKNVYT(SEQ ID NO：47)的DE环、和具有氨基酸序列TRFRDYQP(SEQ ID NO：49)的FG环；所述IGFIR结合性10Fn3与EGFR结合性10Fn3共价或非共价连接，所述EGFR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列SWYWEGLPYQ(SEQ ID NO：158)的BC环、具有氨基酸序列PRDVNT(SEQ ID NO：159)的DE环、和具有氨基酸序列TDWYNPDTHEYIYHTIP(SEQ ID NO：160)的FG环。
在一些实施方案中，E/I结合物是一种抗体样蛋白质二聚体，其包含IGFIR结合性10Fn3，所述IGFIR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列XaSARLKVAXb(SEQ ID NO：46)的BC环、具有氨基酸序列XcKNVYXd(SEQ ID NO：48)的DE环、和具有氨基酸序列XeRFRDYQXf(SEQ ID NO：50)的FG环；所述IGFIR结合性10Fn3与EGFR结合性10Fn3共价或非共价连接，所述 EGFR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列XgASNRGTYQXh(SEQ ID NO：176)的BC环、具有氨基酸序列XiGGVSXj(SEQ ID NO：177)的DE环、和具有氨基酸序列XkDAFNPTTHEYNYFTTXl(SEQ ID NO：178)的FG环；其中X是任何氨基酸，而a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k和l是独立地从0至5的整数。在一些实施方案中，a和g是2；b-f和i-l是1；而h是0。在一些实施方案中，a-l是0。
在一些实施方案中，E/I结合物是一种抗体样蛋白质二聚体，其包含IGFIR结合性10Fn3，所述IGFIR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列SWSARLKVAR(SEQ ID NO：45)的BC环、具有氨基酸序列PKNVYT(SEQ ID NO：47)的DE环、和具有氨基酸序列TRFRDYQP(SEQ ID NO：49)的FG环；所述IGFIR结合性10Fn3与EGFR结合性10Fn3共价或非共价连接，所述EGFR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列SWASNRGTYQ(SEQ ID NO：173)的BC环、具有氨基酸序列PGGVST(SEQ ID NO：174)的DE环、和具有氨基酸序列TDAFNPTTHEYNYFTTP(SEQ ID NO：175)的FG环。
在一些实施方案中，E/I结合物是一种抗体样蛋白质二聚体，其包含IGFIR结合性10Fn3，所述IGFIR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列XaSARLKVAXb(SEQ ID NO：46)的BC环、具有氨基酸序列XcKNVYXd(SEQ ID NO：48)的DE环、和具有氨基酸序列XeRFRDYQXf(SEQ ID NO：50)的FG环；所述IGFIR结合性10Fn3与EGFR结合性10Fn3共价或非共价连接，所述EGFR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列XgDAPTSRYQXh(SEQ ID NO：190)的BC环、具有氨基酸序列XiGGLSXj(SEQ ID NO：191)的DE环、和具有氨基酸序列XkDYKPHADGPHTYHESXl(SEQ ID NO：139)的FG环；其中X是任何氨基酸，而a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k和l是独立地从0至5的整数。在一些实施方案中，a和g是2；b-f和i-l是1；而h是0。在一些实施方案中，a-l是0。
在一些实施方案中，E/I结合物是一种抗体样蛋白质二聚体，其包含IGFIR结合性10Fn3，所述IGFIR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列SWSARLKVAR(SEQ ID NO：45)的BC环、具有氨基酸序列PKNVYT(SEQ ID NO：47)的DE环、和具有氨基酸序列TRFRDYQP(SEQ ID NO：49)的FG环；所述IGFIR结合性10Fn3与EGFR结合性10Fn3共价或非共价连接，所述EGFR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列SWDAPTSRYQ(SEQ ID NO：188)的BC环、具 有氨基酸序列PGGLST(SEQ ID NO：189)的DE环、和具有氨基酸序列TDYKPHADGPHTYHESP(SEQ ID NO：117)的FG环。
在一些实施方案中，E/I结合物是一种抗体样蛋白质二聚体，其包含IGFIR结合性10Fn3，所述IGFIR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列XaSARLKVAXb(SEQ ID NO：46)的BC环、具有氨基酸序列XcKNVYXd(SEQ ID NO：48)的DE环、和具有氨基酸序列XeRFRDYQXf(SEQ ID NO：50)的FG环；所述IGFIR结合性10Fn3与EGFR结合性10Fn3共价或非共价连接，所述EGFR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列XgDAGAVTYQXh(SEQ ID NO：203)的BC环、具有氨基酸序列XiGGVRXj(SEQ ID NO：135)的DE环、和具有氨基酸序列XkDYKPHADGPHTYHEYXl(SEQ ID NO：204)的FG环；其中X是任何氨基酸，而a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k和l是独立地从0至5的整数。在一些实施方案中，a和g是2；b-f和i-l是1；而h是0。在一些实施方案中，a-l是0。
在一些实施方案中，E/I结合物是一种抗体样蛋白质二聚体，其包含IGFIR结合性10Fn3，所述IGFIR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列SWSARLKVAR(SEQ ID NO：45)的BC环、具有氨基酸序列PKNVYT(SEQ ID NO：47)的DE环、和具有氨基酸序列TRFRDYQP(SEQ ID NO：49)的FG环；所述IGFIR结合性10Fn3与EGFR结合性10Fn3共价或非共价连接，所述EGFR结合性10Fn3包含具有氨基酸序列SWDAGAVTYQ(SEQ ID NO：201)的BC环、具有氨基酸序列PGGVRT(SEQ ID NO：110)的DE环、和具有氨基酸序列TDYKPHADGPHTYHEYP(SEQ ID NO：202)的FG环。
在一些实施方案中，E/I结合物是一种抗体样蛋白质二聚体，其包含a)IGFIR结合性10Fn3，所述IGFIR结合性10Fn3包含具有SEQ ID NO：3的氨基酸23-29中所示的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO：3的氨基酸52-55中所示的氨基酸序列的DE环、和具有SEQ ID NO：3的氨基酸77-82中所示的氨基酸序列的FG环；所述IGFIR结合性10Fn3与EGFR结合性10Fn3共价或非共价连接，所述EGFR结合性10Fn3包含如SEQ ID NO：219-327中任一项所列的BC、DE和FG环(参见例如图45，其中每个EGFR结合性10Fn3的BC、DE和FG环序列是加下划线的)。在一些实施方案中，E/I结合物是一种抗体样蛋白质二聚体，其包含a)IGFIR结合性10Fn3，所述IGFIR结合性10Fn3包含具有SEQ ID NO：3的氨基酸23-29中所示的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO：3的氨基酸 52-55中所示的氨基酸序列的DE环、和具有SEQ ID NO：3的氨基酸77-82中所示的氨基酸序列的FG环；所述IGFIR结合性10Fn3与EGFR结合性10Fn3共价或非共价连接，所述EGFR结合性10Fn3包含具有SEQ ID NO：5-8、52、66-68、106-108、112-114、140-142、155-157、170-172、182、185-187、198-200、或219-327中任一项的与SEQ ID NO：1的氨基酸残基23-30对应的氨基酸中所示的氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO：5-8、52、66-68、106-108、112-114、140-142、155-157、170-172、182、185-187、198-200、或219-327中任一项的与SEQ ID NO：1的氨基酸残基52-55对应的氨基酸中所示的氨基酸序列的DE环、和具有与SEQ ID NO：5-8、52、66-68、106-108、112-114、140-142、155-157、170-172、182、185-187、198-200、或219-327的氨基酸残基77-86对应的氨基酸中所示的氨基酸序列的FG环。在一些实施方案中，抗体样蛋白质二聚体的EGFR结合性10Fn3包含与SEQ ID NO：5-8、52、66-68、106-108、112-114、140-142、155-157、170-172、182、185-187、198-200、或219-327中任一项的与SEQ ID NO：1的E9到SEQ ID NO：1的T94对应的氨基酸残基的氨基酸序列至少80、90、95、或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体样蛋白质二聚体的IGFIR结合性10Fn3具有与SEQ ID NO：3的与SEQ ID NO：1的E9到SEQ ID NO：1的T94对应的氨基酸残基的氨基酸序列至少80、90、95、98、99、或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，E/I结合物包含与SEQ ID NO：20-31、53-58、87-92、98-105、118-133、149-154、164-169、179-184、192-197、205-210和211-216中任一项至少80、85、90、95、98、99、或100％相同的氨基酸序列。
优选地，如本文中所定义的X是天然存在的氨基酸。
在某些实施方案中，本文中所描述的E结合物或E/I结合物的E和/或I单体在与SEQ ID NO：1的丝氨酸62或丝氨酸91对应的位置可以含有Ser到Cys的氨基酸替代。
在某些方面，公开内容提供了介导EGFR结合的短肽序列。此类序列的例子包括与来自SEQ ID NO：5、7、82、106、112、141、156、171、186和199的BC、DE、和FG环对应的氨基酸残基。此类序列的其它例子包括与来自SEQ ID NO：219-327的BC、DE、和FG环对应的氨基酸残基。在一些实施方案中，肽以小于500nM、100nM、50nM、5nM或更小的解离常数(KD)结合其各自的配体。此类序列可以以分离的形式或者在插入特定的蛋白质结构诸 如免疫球蛋白或免疫球蛋白样域中时介导配体结合。
在一个实施方案中，抗体样蛋白质二聚体包含具有结构A-B-C的多肽，其中A是包含结合EGFR的10Fn3域，基本上由结合EGFR的10Fn3域组成，或由结合EGFR的10Fn3域组成的多肽，B是多肽接头，而C是包含结合IGF-IR的 10Fn3域，基本上由结合IGF-IR的10Fn3域组成，或由结合IGF-IR的10Fn3域组成的多肽。在另一个实施方案中，抗体样蛋白质二聚体包含具有结构A-B-C的多肽，其中A是包含结合IGF-IR的10Fn3域，基本上由结合IGF-IR的10Fn3域组成，或由结合IGF-IR的10Fn3域组成的多肽，B是多肽接头，而C是包含结合EGFR的10Fn3域，基本上由结合EGFR的10Fn3域组成，或由结合EGFR的 10Fn3域组成的多肽。具有结构A-B-C的抗体样蛋白质二聚体的具体例子是如下的多肽，其包含(i)具有SEQ ID NO：20-31、53-58、87-92、98-105、118-133、149-154、164-169、179-184、192-197、205-210和211-216中任一项中所示的氨基酸序列的多肽，或(ii)包含与SEQ ID NO：20-31、53-58、87-92、98-105、118-133、149-154、164-169、179-184、192-197、205-210和211-216中所列的任一种氨基酸序列至少85％、90％、95％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列的多肽。
在某些实施方案中，A或C区是包含结合EGFR的10Fn3域的多肽；其中 10Fn3域具有从N端至C端的结构：β链A、环AB、β链B、环BC、β链C、环CD、β链D、环DE、β链E、环EF、β链F、环FG、β链G；其中：(i)BC环具有SEQ ID NO：33或34的氨基酸序列，DE环具有SEQ ID NO：35或36的氨基酸序列，而FG环具有SEQ ID NO：37或38的氨基酸序列，(ii)BC环具有SEQ ID NO：39或40的氨基酸序列，DE环具有SEQ ID NO：41或42的氨基酸序列，而FG环具有SEQ ID NO：43或44的氨基酸序列，(iii)BC环具有SEQ ID NO：59或60的氨基酸序列，DE环具有SEQ ID NO：61或62的氨基酸序列，而FG环具有SEQ ID NO：63或64的氨基酸序列，(iv)BC环具有SEQ ID NO：109或134的氨基酸序列，DE环具有SEQ ID NO：110或135的氨基酸序列，而FG环具有SEQ ID NO：111或136的氨基酸序列，(v)BC环具有SEQ ID NO：115或137的氨基酸序列，DE环具有SEQ ID NO：116或138的氨基酸序列，而FG环具有SEQ ID NO：117或139的氨基酸序列，(vi)BC环具有SEQ ID NO：143或146的氨基酸序列，DE环具有SEQ ID NO：144或147的氨基酸序列，而FG环具有SEQ ID NO：145或148的氨基酸序列，(vii)BC环具有SEQ ID NO：158或161的氨基酸序列，DE 环具有SEQ ID NO：159或162的氨基酸序列，而FG环具有SEQ ID NO：160或163的氨基酸序列，(viii)BC环具有SEQ ID NO：173或176的氨基酸序列，DE环具有SEQ ID NO：174或177的氨基酸序列，而FG环具有SEQ ID NO：175或178的氨基酸序列，(ix)BC环具有SEQ ID NO：188或190的氨基酸序列，DE环具有SEQ ID NO：189或191的氨基酸序列，而FG环具有SEQ ID NO：117或139的氨基酸序列，(x)BC环具有SEQ ID NO：201或203的氨基酸序列，DE环具有SEQ ID NO：110或135的氨基酸序列，而FG环具有SEQ ID NO：202或204的氨基酸序列，或(xi)BC、DE和FG环具有如SEQ ID NO：219-327中任一项中所示的氨基酸序列(参见例如图45，其中SEQ ID NO：219-327中所列的BC、DE和FG环是加下划线的)；其中10Fn3域折叠成抗体重链可变区样结构；且其中多肽以小于100nM的KD结合EGFR。结合EGFR的10Fn3域优选地折叠成如下的结构，其中7条β链分布在彼此挤压(pack)形成稳定核心的两个β片层间，且其中各β链通过六个暴露于溶剂的环来连接。在例示性的实施方案中，10Fn3域的长度为80-150个氨基酸。
在例示性的实施方案中，A或C区是以小于100nM的KD结合EGFR的10Fn3域，其具有选自SEQ ID NO：83-85和466-472的序列，如下文所列的：
EVVAATXn1 SLLIXa1 Xa2 YYRITYGEXn2 QEFTVXa3 Xa4 ATIXn3 DYTITVYAVXa5 Xa6 ISINYRT(SEQ ID NO：83)；
EVVAATXn1 SLLIXa1 Xa2 YYRITYGEXn2 QEFTVXa3 Xa4 ATIXn3 DYTITVYAVXa5 Xa6 ISINYRT(SEQ ID NO：84)；或
EVVAATXn1 SLLIXa1 Xa2 YYRITYGEXn2 QEFTVXa3 Xa4 ATIXn3 DYTITVYAVXa5 Xa6 ISINYRT(SEQ ID NO：85)。
EVVAATXn1 SLLIXa1 Xa2 YYRITYGEXn2 QEFTVXa3 Xa4 ATIXn3 DYTITVYAVXa5 Xa6 ISINYRT(SEQ ID NO：466)。
EVVAATXn1 SLLIXa1 Xa2 YYRITYGEXn2 QEFTVXa3 Xa4 ATIXn3 DYTITVYAVXa5 Xa6 ISINYRT(SEQ ID NO：467)。
EVVAATXn1 SLLIXa1 Xa2 YYRITYGEXn2 QEFTVXa3 Xa4 ATIXn3 DYTITVYAVXa5 Xa6 ISINYRT(SEQ ID NO：468)。
EVVAATXn1 SLLIXa1 Xa2 YYRITYGEXn2 QEFTVXa3 Xa4 ATIXn3 DYTITVYAVXa5 Xa6 ISINYRT(SEQ ID NO：469)。
EVVAATXn1 SLLIXa1 Xa2 YYRITYGEXn2 QEFTVXa3 Xa4 ATIXn3 DYTITVYAVXa5 Xa6 ISINYRT(SEQ ID NO：470)。
EVVAATXn1 SLLIXa1 Xa2 YYRITYGEXn2 QEFTVXa3 Xa4 ATIXn3 DYTITVYAVXa5 Xa6 ISINYRT(SEQ ID NO：471)。
EVVAATXn1 SLLIXa1 Xa2 YYRITYGEXN2 QEFTVXa3 Xa4 ATIXn3 DYTITVYAVXa5 Xa6 ISINYRT(SEQ ID NO：472)。
在SEQ ID NO：83-85和466-472中，BC、DE和FG环具有如以粗体所显示的固定序列，或与以粗体显示的序列至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、或99％相同的序列，AB环以Xn1表示，CD以Xn2表示，而EF环以Xn3表示，并且β链A-G是加下划线的。X表示任何氨基酸，而X后的下标表示氨基酸数目的整数。具体地，n1可以是1-15、2-15、1-10、2-10、1-8、2-8、1-5、2-5、1-4、2-4、1-3、2-3、或1-2个氨基酸；n2和n3可以各自独立是2-20、2-15、2-10、2-8、5-20、5-15、5-10、5-8、6-20、6-15、6-10、6-8、2-7、5-7、或6-7个氨基酸；而a1-a6可以各自独立包含0-10、0-5、1-10、1-5、或2-5个氨基酸。在优选的实施方案中，n1是2个氨基酸，n2是7个氨基酸，n3是7个氨基酸，而a1-a6是0个氨基酸。相对于SEQ ID NO：1中所显示的相应氨基酸，β链的序列在所有7种支架区中可以具有0至10、0至8、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2、或0至1处替代、缺失或添加。在一个例示性的实施方案中，相对于SEQ ID NO：1中所显示的相应氨基酸，β链的序列在所有7种支架区中可以具有0至10、0至8、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2、或0至1处保守替代。在某些实施方案中，核心氨基酸残基是固定的，而且任何替代、保守替代、缺失或添加均发生在核心氨基酸残基之外的残基上。在某些实施方案中， EGFR结合物以下列氨基酸序列之一表示：
EVVAATPTSLLISW YYRITYGETGGNSPVQEFTVP TATISGLKPGVDYTITVYAVT PISINYRT(SEQ ID NO：66)；
EVVAATPTSLLISW YYRITYGETGGNSPVQEFTVP TATISGLKPGVDYTITVYAVT PISINYRT(SEQ ID NO：67)；
EVVAATPTSLLISW YYRITYGETGGNSPVQEFTVP TATISGLKPGVDYTITVYAVT PISINYRT(SEQ ID NO：68)；
EVVAATPTSLLISW YYRITYGETGGNSPVQEFTVP TATISGLKPGVDYTITVYAVT PISINYRT(SEQ ID NO：108)；或
EVVAATPTSLLISW YYRITYGETGGNSPVQEFTVP TATISGLKPGVDYTITVYAVT PISINYRT(SEQ ID NO：114)。
EVVAATPTSLLISW YYRITYGETGGNSPVQEFTVP TATISGLKPGVDYTITVYAVT PISINYRT(SEQ ID NO：141)
EVVAATPTSLLISW YYRITYGETGGNSPVQEFTVP TATISGLKPGVDYTITVYAVT PISINYRT(SEQ ID NO：156)
EVVAATPTSLLISW YYRITYGETGGNSPVQEFTVP TATISGLKPGVDYTITVYAVT PISINYRT(SEQ ID NO：171)
EVVAATPTSLLISW YYRITYGETGGNSPVQEFTVP TATISGLKPGVDYTITVYAVT PISINYRT(SEQ ID NO：186)
E112
EVVAATPTSLLISW YYRITYGETGGNSPVQEFTVP TATISGLKPGVDYTITVYAVT PISINYRT(SEQ ID NO：199)
在SEQ ID NO：66-68、108、114、141、156、171、186和199中，BC、 DE和FG环的序列具有如以粗体所显示的固定序列，或与以粗体显示的序列至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、或99％相同的序列，而加下划线的剩余序列(例如7个β链和AB、CD和EF环的序列)相对于SEQ ID NO：66-68、108、114、141、156、171、186和199中所显示的相应氨基酸具有0至20、0至15、0至10、0至8、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2、或0至1处替代、保守替代、缺失或添加。在某些实施方案中，核心氨基酸残基是固定的，而且任何替代、保守替代、缺失或添加均发生在与核心氨基酸残基不同的残基上。结合EGFR的10Fn3域可以任选地包含长度为1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-4、1-3、1-2、或1个氨基酸的N端延伸。例示性的N端延伸包括(以单字母氨基酸密码表示)M、MG、G、MGVSDVPRDL(SEQ ID NO：69)、GVSDVPRDL(SEQ ID NO：70)、和VSDVPRDL(SEQ ID NO：71)、或SEQ ID NO：69、70、或71中任一项的N端截短。其它合适的N端延伸包括例如，XnSDVPRDL(SEQ ID NO：72)、XnDVPRDL(SEQ ID NO：73)、XnVPRDL(SEQ ID NO：74)、XnPRDL(SEQ ID NO：75)、XnRDL(SEQ ID NO：76)、XnDL(SEQ ID NO：77)、或XnL，其中n＝0、1或2个氨基酸，其中在n＝1时，X是Met或Gly，而在n＝2时，X是Met-Gly。结合EGFR的10Fn3域可以任选地包含C端尾部。例示性的C端尾部包括长度为1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-4、1-3、1-2、或1个氨基酸的多肽。C端尾部的具体例子包括EIDKPSQ(SEQ ID NO：9)、EIDKPCQ(SEQ ID NO：10)、和EIDK(SEQ ID NO：78)。在其它实施方案中，合适的C端尾部可以是SEQ ID NO：9、10或78的C端截短片段，包括例如下列氨基酸序列之一(以单字母氨基酸密码表示)：E、EI、EID、EIDKP(SEQ ID NO：79)、EIDKPS(SEQ ID NO：80)、或EIDKPC(SEQ ID NO：81)。其它合适的C端尾部包括例如ES、EC、EGS、EGC、EGSGS(SEQ ID NO：96)、EGSGC(SEQ ID NO：97)、或EIEK(SEQ ID NO：217)。在某些实施方案中，结合EGFR的10Fn3域包含N端延伸和C端尾部两者。在例示性的实施方案中，A区包含以Gly或Met-Gly开始的N端延伸和不含半胱氨酸残基的C端延伸，而B区包含不以Met开始的N端延伸和含有半胱氨酸残基的C端延伸。结合EGFR的10Fn3域的具体例子是如下的多肽，其包含(i)具有SEQ ID NO：5-8、52、66-68、82-85、106-108、112-114、140-142、155-157、170-172、185-187、198-200、和219-327中任一项中所示的氨基酸序列的多肽，或(ii)包含与SEQ ID NO：5-8、52、66-68、82-85、106-108、112-114、140-142、155-157、170-172、 185-187、198-200、和219-327中任一项中所示的氨基酸序列至少85％、90％、95％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列的多肽。
在某些实施方案中，A或C区是包含结合IGF-IR的10Fn3域的多肽，其中 10Fn3域具有从N端至C端的结构：β链A、环AB、β链B、环BC、β链C、环CD、β链D、环DE、β链E、环EF、β链F、环FG、β链G，其中BC环具有SEQ ID NO：45或46的氨基酸序列，DE环具有SEQ ID NO：47或48的氨基酸序列，而FG环具有SEQ ID NO：49或50的氨基酸序列，其中10Fn3域折叠成抗体重链可变区样结构，且其中多肽以小于100nM的KD结合IGF-IR。结合IGF-IR的10Fn3域优选地折叠成如下的结构，其中7条β链分布在彼此挤压形成稳定核心的两个β片层之间，且其中β链通过六个暴露于溶剂的环来连接。在例示性的实施方案中，10Fn3域的长度为80-150个氨基酸。
在例示性的实施方案中，A或C区是以小于100nM的KD结合IGF-IR的 10Fn3域，其具有下文所列的序列：
EVVAATXn1 SLLIXa1 Xa2 YYRITYGEXn2 QEFTVXa3 Xa4 ATIXn3 DYTITVYAVXa5 Xa6 ISINYRT(SEQ ID NO：86)。
在SEQ ID NO：86中，BC、DE和FG环具有如以粗体所显示的固定序列，或与以粗体显示的序列至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、或99％相同的序列，AB环以Xn1表示，CD环以Xn2表示，而EF环以Xn3表示，并且β链A-G是加下划线的。X表示任何氨基酸，而X后的下标表示氨基酸数目的整数。具体地，n1可以是1-15、2-15、1-10、2-10、1-8、2-8、1-5、2-5、1-4、2-4、1-3、2-3、或1-2个氨基酸；n2和n3可以各自独立是2-20、2-15、2-10、2-8、5-20、5-15、5-10、5-8、6-20、6-15、6-10、6-8、2-7、5-7、或6-7个氨基酸；而a1-a6可以各自独立包含0-10、0-5、1-10、1-5、或2-5个氨基酸。在优选的实施方案中，n1是2个氨基酸，n2是7个氨基酸，n3是7个氨基酸，而a1-a6是0个氨基酸。相对于SEQ ID NO：1中所显示的相应氨基酸，β链的序列在所有7个支架区中可以具有0至10、0至8、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2、或0至1处替代、缺失或添加。在一个例示性的实施方案中，相对于SEQ ID NO：1中所显示的相应氨基酸，β链的序列在所有7个支架区中可以具有0至10、0至8、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2、或0至1处保守替代。在某些实施方案中，核心氨基酸残基是固定的，而且任何替代、保守替代、缺失或添加均发生在与核心氨基酸残基不同的残基上。在某些实施方案中， IGF-IR结合物以下列氨基酸序列之一表示：
EVVAATPTSLLISW RYYRITYGETGGNSPVQEFTVP TATISGLKPGVDYTITVYAVT PISINYRT(SEQ ID NO：65)。
在SEQ ID NO：65中，BC、DE和FG环的序列具有如以粗体所显示的固定序列，或与以粗体显示的序列至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、或99％相同的序列，而加下划线的剩余序列(例如7个β链和AB、CD和EF环的序列)相对于SEQ ID NO：65中所显示的相应氨基酸具有0至20、0至15、0至10、0至8、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2、或0至1处替代、保守替代、缺失或添加。在某些实施方案中，核心氨基酸残基是固定的，而且任何替代、保守替代、缺失或添加均发生在与核心氨基酸残基不同的残基上。结合IGF-IR的10Fn3域可以任选地包含长度为1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-4、1-3、1-2、或1个氨基酸的N端延伸。例示性的N端延伸包括(以单字母氨基酸符号表示)M、MG、G、MGVSDVPRDL(SEQ ID NO：69)、GVSDVPRDL(SEQ ID NO：70)、和VSDVPRDL(SEQ ID NO：71)、或SEQ ID NO：69、70、或71中任一项的N端截短。其它合适的N端延伸包括例如，XnSDVPRDL(SEQ ID NO：72)、XnDVPRDL(SEQ ID NO：73)、XnVPRDL(SEQ ID NO：74)、XnPRDL(SEQ ID NO：75)、XnRDL(SEQ ID NO：76)、XnDL(SEQ ID NO：77)、或XnL，其中n＝0、1或2个氨基酸，其中在n＝1时，X是Met或Gly，而在n＝2时，X是Met-Gly。结合IGF-IR的10Fn3域可以任选地包含C端尾部。例示性的C端尾部包括长度为1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-4、1-3、1-2、或1个氨基酸的多肽。C端尾部的具体例子包括EIDKPSQ(SEQ ID NO：9)、EIDKPCQ(SEQ ID NO：10)、和EIDK(SEQ ID NO：78)。在其它实施方案中，合适的C端尾部可以是SEQ ID NO：9、10或78的C端截短片段，包括例如下列氨基酸序列之一(以单字母氨基酸密码表示)：E、EI、EID、EIDKP(SEQ ID NO：79)、EIDKPS(SEQ ID NO：80)、或EIDKPC(SEQ ID NO：81)。其它合适的C端尾部包括例如ES、EC、EGS、EGC、EGSGS(SEQ ID NO：96)、EGSGC(SEQ ID NO：97)、或EIEK(SEQ ID NO：217)。在某些实施方案中，结合IGF-IR的 10Fn3域包含N端延伸和C端尾部两者。在例示性的实施方案中，A区包含以Gly或Met-Gly开始的N端延伸和不含半胱氨酸残基的C端延伸，而B区包含不以Met开始的N端延伸和含有半胱氨酸残基的C端延伸。结合IGF-IR的10Fn3域的具体例子是如下的多肽，其包含(i)具有SEQ ID NO：3、4、65或86中任 一项中所示的氨基酸序列的多肽，或(ii)包含与SEQ ID NO：3、4、65或86中任一项中所示的氨基酸序列至少85％、90％、95％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列的多肽。
B区是如本文中进一步描述的接头。在例示性的实施方案中，B区是多肽接头。例示性的多肽接头包括具有1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-4、1-3、或1-2个氨基酸的多肽。合适多肽接头的具体例子在本文中进一步描述，包括例如，具有选自下组的序列的接头：SEQ ID NO：11-19、51、93-95和218。在某些实施方案中，接头可以是如本文中所描述的C端尾部多肽、如本文中所描述的N端延伸多肽、或其组合。
在一个实施方案中，抗体样蛋白质二聚体包含具有结构X1-A-X2-B-X3-C-X4的多肽，其中X1是任选的N端延伸，A是结合EGFR的10Fn3域，X2是任选的C端尾部，B是多肽接头，X3是任选的N端延伸，C是结合IGF-IR的10Fn3域，而X4是任选的C端尾部。在另一个实施方案中，抗体样蛋白质二聚体包含具有结构X1-A-X2-B-X3-C-X4的多肽，其中X1是任选的N端延伸，A是结合IGF-IR的10Fn3域，X2是任选的C端尾部，B是多肽接头，X3是任选的N端延伸，C是结合EGFR的10Fn3域，而X4是任选的C端尾部。上文描述了合适N端延伸和C端尾部的具体例子。在某些实施方案中，X1、X2、B、X3或X4中的一个或多个可以包含适合于PEG化的氨基酸残基，诸如半胱氨酸或赖氨酸残基。在例示性的实施方案中，X4包含至少一个适合于PEG化的氨基酸，诸如半胱氨酸或赖氨酸残基。下文进一步描述了合适的多肽接头的具体例子。具有结构X1-A-X2-B-X3-C-X4的抗体样蛋白质二聚体的具体例子是如下的多肽，其包含(i)具有SEQ ID NO：20-31、53-58、87-92、98-105、118-133、149-154、164-169、179-184、192-197、205-210和211-216中任一项中所示的氨基酸序列的多肽，或(ii)包含与SEQ ID NO：20-31、53-58、87-92、98-105、118-133、149-154、164-169、179-184、192-197、205-210和211-216中任一项中所示的氨基酸序列至少85％、90％、95％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列的多肽。
在某些实施方案中，可能期望调节本文中所描述的抗体样蛋白质二聚体中的一个10Fn3结合域相对于另一个10Fn3结合域的效力。例如，若第一10Fn3域的结合亲和力显著高于第二10Fn3域的结合亲和力，则第一10Fn3域的生物学效果可以压倒(overwhelm)第二10Fn3域的效果。因而，在某些实施方案中， 可能期望抗体样蛋白质二聚体的第一和第二10Fn3域的结合亲和力彼此相似，例如结合亲和力在彼此的100倍、30倍、10倍、3倍、1倍、0.3倍或0.1倍以内，或结合亲和力在彼此的0.1倍至10倍内、0.3倍至10倍内、0.1倍至3倍内、0.3倍至3倍内。0.1倍至1倍内、0.3倍至1倍内、1倍至10倍内、3倍至10倍内、3倍至30倍内、或1倍至3倍以内。
偶联
抗体样蛋白质的多聚体可以共价或非共价连接。在一些实施方案中，EGFR结合性10Fn3可以经由多肽接头与IGFIR结合性10Fn3直接或间接连接。适合于连接Fn3的接头是容许不同的域彼此独立地折叠，形成容许对靶分子的高亲和力结合的三维结构的接头。
公开内容提供了许多满足这些要求的合适的接头，包括基于甘氨酸-丝氨酸的接头、基于甘氨酸-脯氨酸的接头、及具有氨基酸序列PSTSTST(SEQ ID NO：12)的接头。本文中所描述的实施例表明经由多肽接头连接的Fn3域保留其靶物结合功能。在一些实施方案中，接头是基于甘氨酸-丝氨酸的接头。这些接头包含甘氨酸和丝氨酸残基，而且长度可以是8-50、10-30、和10-20个氨基酸。例子包括具有氨基酸序列GSGSGSGSGSGSGSGSGSGS(SEQ ID NO：11)、GSGSGSGSGS(SEQ ID NO：13)、GGGGS GGGGS GGGGS(SEQ ID NO：14)、GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS(SEQ ID NO：15)、GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS (SEQ ID NO：16)、或GGGGSGGGGSGGGSG(SEQ ID NO：17)的接头。在一些实施方案中，接头是基于甘氨酸-脯氨酸的接头。这些接头包含甘氨酸和脯氨酸残基，而且长度可以是3-30、10-30、和3-20个氨基酸。例子包括具有氨基酸序列GPGPGPG(SEQ ID NO：18)、GPGPGPGPGPG(SEQ ID NO：19)、和GPG(SEQ ID NO：51)的接头。在一些实施方案中，接头是基于脯氨酸-丙氨酸的接头。这些接头包含脯氨酸和丙氨酸残基，而且长度可以是3-30、10-30、3-20和6-18个氨基酸。此类接头的例子包括SEQ ID NO：93、94和95。预期可以通过本领域中公知的方法凭借常规实验来确定最佳的接头长度和氨基酸组成。
在一些实施方案中，经由多肽接头连接抗体样蛋白质的多聚体，所述多肽接头具有血液或靶组织中的蛋白酶可切割的蛋白酶位点。可以使用此类实施方案来释放两种或更多种治疗性蛋白质，以便实现与分别生产此类蛋白质相比更好的投递或治疗特性或更有效的生产。
可以在Fn3域的C端在Fn3域与多肽接头之间引入额外的接头或间隔物，例如SEQ ID NO：9和10。可以在Fn3域的N端在Fn3域与多肽接头之间引入额外的接头或间隔物。
在一些实施方案中，抗体样蛋白质的多聚体可以经由聚合物接头来直接或间接连接。可以使用聚合物接头来最佳地改变每个蛋白质模块之间的距离以创建具有下列一项或多项特征的蛋白质：1)在结合感兴趣的蛋白质时一个或多个蛋白质域的结合的空间阻碍降低或升高，2)蛋白质稳定性或溶解度升高，3)蛋白质聚集降低，和4)蛋白质的总体亲合力或亲和力升高。
在一些实施方案中，抗体样蛋白质的多聚体经由生物相容性聚合物诸如聚合糖连接。聚合糖可以包括血液或靶组织中的酶可切割的酶切割位点。可以使用此类实施方案来释放两种或更多种治疗性蛋白质，以实现与分别生成此类蛋白质相比更好的投递或治疗特性或更有效的产生。
在一些实施方案中，抗体样蛋白质的多聚体可以经由聚氧化烯，特别是聚乙二醇(PEG)模块来连接。抗体样蛋白质可以包含含有半胱氨酸的接头，诸如SEQ ID NO：10、81、97或218中所列的接头。PEG可以偶联于接头序列中的半胱氨酸模块，而且可以将两个域可操作连接。
药动学模块
在一个方面，公开内容提供了进一步包含药动学(PK)模块的E结合物和E/I结合物。在一些实施方案中，E/I结合物是抗体样蛋白质的多聚体，特别是EGFR结合性10Fn3和IGFIR结合性10Fn3的二聚体。可以根据发现的治疗需要来评估改善的药动学。经常期望提高生物利用度和/或延长给药间的时间，这可能通过延长蛋白质在给药后在血清中保持可用的时间来实现。在一些情况中，想要改善蛋白质的血清浓度随时间的连续性(例如降低蛋白质在施用后不久的血清浓度与下一次施用前不久的血清浓度的差异)。E结合物和E/I结合物可以附接于这样的模块，相对于未修饰的多肽，所述模块使多肽在哺乳动物(例如小鼠、大鼠、或人)中的清除率降低大于3倍。改善的药动学的其它量度可以包括血清半衰期，其常常分成α期和β期。通过添加合适的模块可以显著地改善这两个阶段或其中的任一个。
具有减缓蛋白质从血液中清除的趋向的模块包括聚氧化烯模块(例如聚乙二醇)；糖(例如唾液酸)；和耐受良好的蛋白质模块(例如Fc、Fc片段、运铁蛋白、或血清白蛋白)。
在一些实施方案中，PK模块是血清白蛋白结合蛋白诸如那些记载于美国公开文本号2007/0178082和2007/0269422的。
在一些实施方案中，PK模块是血清免疫球蛋白结合蛋白诸如那些记载于美国公开文本号2007/0178082的。
在一些实施方案中，PK模块是聚乙二醇(PEG)。
相对于未修饰的E/I结合物的清除率，PK修饰的抗体样蛋白质多聚体的血清清除率可以降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或甚至90％。相对于未修饰的多聚体的半衰期，PK修饰的多聚体可以具有延长的半衰期(t1/2)。相对于未修饰的多聚体的半衰期，PK结合多肽的半衰期可以延长至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、400％或500％，或甚至1000％。在一些实施方案中，在体外，诸如在缓冲盐水溶液中或在血清中测定多聚体半衰期。在其它实施方案中，多聚体半衰期是体内半衰期，诸如多聚体在动物的血清或其它体液中的半衰期。
在一些实施方案中，PK模块经由至少一个二硫键、肽键、多肽、聚合糖、或聚乙二醇模块来与抗体样蛋白质多聚体连接。例示性多肽接头包括PSTSTST(SEQ ID NO：12)、EIDKPSQ(SEQ ID NO：9)、和GS接头，诸如GSGSGSGSGS(SEQ ID NO：13)及其多聚体。
结合/筛选
本公开内容提供了E结合物和E/I结合物，尤其是抗体样蛋白质多聚体，诸如EGFR结合性10Fn3和IGFIR结合性10Fn3的二聚体。可以基于平衡常数(例如解离，KD)及基于动力学常数(例如开启常数kon和关闭常数koff)来评估对EGFR或IGFIR的结合。在一些实施方案中，抗体样蛋白质单体或多聚体会以小于500nM、100nM、50nM、5nM或更小的KD结合EGFR。在一些实施方案中，抗体样蛋白质多聚体会小于500nM、100nM、50nM、5nM或更小的KD结合IGFIR。在koff足够低或kon足够高的场合，可以容忍较高的KD值。
E结合物和E/I结合物可以结合EGFR的任何部分，包括EGFR的胞外域，特别是EGFR的配体结合域。E结合物和E/I结合物对EGFR的结合可以破坏EGFR与一种或多种配体(包括TGF-α和EGF)的相互作用，和/或破坏受体二聚化。在一些实施方案中，E结合物和E/I结合物与抗EGFR抗体竞争对EGFR的结合。抗EGFR抗体可以选自任何已知的抗EGFR抗体，包括帕尼单抗 (Amgen)、尼妥珠单抗(YM Biosciences)、扎鲁单抗(zalutumumab)(Genmab)、EMD72000(Merck KGaA)、和西妥昔单抗(ImClone Systems)。
在一些实施方案中，E结合物和E/I结合物抑制EGFR的下游信号传导。EGFR配体结合导致与EGFR或另一种HER家族成员的同或异二聚体受体二聚化。二聚体化促进受体自身磷酸化，这继而导致数种信号传导途径的活化。
E/I结合物可以结合IGFIR的任何部分，包括IGFIR的胞外域，特别是IGFIR的配体结合域。E/I结合物对IGFIR的结合可以破坏IGFIR与一种或多种配体(例如IGF-I和IGF-II)的相互作用；和/或破坏受体异四聚体的装配。在一些实施方案中，E/I结合物与抗IGFIR抗体竞争对IGFIR的结合。抗IGFIR抗体可以选自任何已知的抗IGFIR抗体。
在一些实施方案中，E/I结合物抑制IGFIR的下游信号传导。IGF-I受体由两类亚基组成：α亚基(130-135kDa的蛋白质，完全在胞外，在配体结合中发挥功能)和β亚基(95-kDa的跨膜蛋白，具有跨膜和胞质域)。IGFIR最初作为单链前受体多肽被合成，通过糖基化、蛋白水解切割、和共价键合被加工，装配成包含两个α亚基和两个β亚基的成熟的460-kDa异四聚体。β亚基拥有配体活化的酪氨酸激酶活性。
EGFR和IGFIR受体信号传导独立活化MAPK途径，包括MEK的磷酸化。另一种活化途径是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)途径，包括AKT的磷酸化。受体信号传导被转导到细胞核，导致多种转录因子的活化。
可以设计筛选测定法来鉴定并表征E结合物和E/I结合物。结合测定法，诸如表面等离振子共振和ELISA，和检测活化的信号传导途径的测定法，是本领域中公知的，参见例如实施例5。已经生成了多种抗体，包括许多商品化的，它们特异性结合EGFR和IGFIR的磷酸化的、活化的同等型，参见例如实施例6和7。也可以使用下游信号传导事件作为受体抑制的指标，诸如通过测量AKT磷酸化的水平来进行，参见例如实施例8。细胞增殖测定法也是一种对于表征候选E/I结合物结合并抑制EGFR和IGFIR信号传导的能力有用的方法，参见例如实施例9。
聚合物偶联
可以使用与生物相容性聚合物的偶联来连接抗体样蛋白质多聚体和/或改善蛋白质的药动学。选择聚合物的身份、大小和结构以改善多聚体的循环半衰期或降低多聚体的抗原性而不导致活性发生不可接受的降低。
可用于本发明的聚合物的例子包括但不限于聚亚烷基二醇诸如聚乙二醇(PEG)。聚合物不限于具体的结构，并且可以是线性的(例如烷氧基PEG或双功能PEG)，或非线性诸如分枝、叉状的、多臂的(例如附接于多元醇核心的PEG)、和树枝状的。
通常，PEG和其它水溶性聚合物(即聚合物试剂)用适合于与多肽上的期望位点偶联的合适的活化基团活化。如此，聚合物试剂会拥有与多肽进行反应的反应基团。代表性的聚合物试剂和用于偶联这些聚合物与活性模块的方法是本领域中公知的，并且进一步记载于Zalipsky，S.等，“Use of Functionalized Poly(Ethylene Glycols)for Modification of Polypeptides”in Polyethylene Glycol Chemistry：Biotechnical and Biomedical Applications，J.M.Harris，Plenus Press，New York(1992)，及Zalipsky(1995)Advanced Drug Reviews 16：157-182。
通常，聚合物的重量平均分子量是约100道尔顿至约150,000道尔顿。生物相容性聚合物的例示性重均分子量包括约20,000道尔顿、约40,000道尔顿、约60,000道尔顿和约80,000道尔顿。也可以使用具有任何前述的总分子量的分枝型式的生物相容性聚合物。
在一些实施方案中，聚合物是PEG。PEG是众所周知的水溶性聚合物，其可通过商业途径获得或者可依照本领域众所周知的方法通过乙二醇的开环聚合来制备(Sandler和Karo，Polymer Synthesis，Academic Press，New York，卷3，页138-161)。术语“PEG”广泛用于涵盖任何聚乙二醇分子，无论大小或PEG末端的修饰，而且可以由下式来表示：X-O(CH2CH2O)n-1CH2CH2OH(1)，其中n为20-2300，X为H或末端修饰，例如C1-4烃基。PEG可以含有结合反应所必需的别的化学基团，其源自分子的化学合成；或者其充当间隔物以获得分子各部分间的最佳距离。另外，此类PEG可以由一个或多个连接在一起的PEG侧链组成。具有超过一条PEG链的PEG称作多臂的或分枝的PEG。分枝PEG记载于例如欧洲公开的申请号473084A和美国专利No.5,932,462。
为了实现聚合物分子与多肽的共价附接，必须以活化形式(即具有反应性官能团)提供聚合物分子的羟基末端基团。适当活化的聚合物分子是商品化的，例如来自Nektar Therapeutics，Inc.，Huntsville，Ala.，USA；PolyMASC Pharmaceuticals plc，UK；或SunBio Corporation，Anyang City，South Korea。或者，可以通过本领域中已知的常规方法来活化聚合物分子，例如如披露于 WO 90/13540的。活化的PEG聚合物的具体例子包括下列线性PEG：NHS-PEG、SPA-PEG、SSPA-PEG、SBA-PEG、SS-PEG、SSA-PEG、SC-PEG、SG-PEG、SCM-PEG、NOR-PEG、BTC-PEG、EPOX-PEG、NCO-PEG、NPC-PEG、CDI-PEG、ALD-PEG、TRES-PEG、VS-PEG、OPS S-PEG、IODO-PEG、和MAL-PEG，及分枝的PEG，诸如PEG2-NHS、PEG2-MAL、和那些披露于美国专利号5,932,462和美国专利号5,643,575的，通过提及而将这两篇专利收入本文。
在PEG分子与抗体样蛋白质多聚体上的半胱氨酸残基偶联的一些实施方案中，半胱氨酸残基对于蛋白质而言是天然的，而在其它实施方案中，一个或多个半胱氨酸残基是通过工程改造引入蛋白质的。可以在蛋白质编码序列中引入突变以产生半胱氨酸残基。这可以通过，例如，将一个或多个氨基酸残基突变成半胱氨酸来实现。用于突变成半胱氨酸残基的优选氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸和其它亲水性残基。优选的是，要突变成半胱氨酸的残基是表面暴露的残基。根据蛋白质一级序列预测残基的表面可及性的算法在本领域是众所周知的。或者，由于作为结合多肽的设计和改进的基础的框架的晶体结构已经得以解析(参见Himanen等，Nature.(2001)20-27；414(6866)：933-8)并且由此鉴定了表面暴露的残基，可以通过比较结合多肽的氨基酸序列来预测表面残基。在一些实施方案中，将半胱氨酸残基引入抗体样蛋白质多聚体中的N和/或C末端或其附近，或者环区内。半胱氨酸残基的PEG化可以使用例如PEG-马来酰亚胺、PEG-乙烯基砜、PEG-碘乙酰胺、或PEG-邻吡啶基二硫化物来实施。
在一些实施方案中，PEG化的抗体样蛋白质多聚体包含共价附接于N末端氨基酸的α氨基的PEG分子。位点特异性N末端还原性氨化记载于Pepinsky等(2001)JPET，297，1059和美国专利No.5,824,784。利用其它可用的亲核氨基用PEG-醛进行蛋白质还原性氨化的用途记载于美国专利号4,002,531；Wieder等(1979)J.Biol.Chem.254,12579；及Chamow等(1994)Bioconjugate Chem.5，133。
在另一个实施方案中，PEG化的抗体样蛋白质多聚体包含一个或多个共价附接于接头的PEG分子，所述接头则附接于结合多肽N末端处氨基酸残基的α氨基。此类方法披露于美国公开文本号2002/0044921和PCT公开号WO94/01451。
在一些实施方案中，抗体样蛋白质多聚体在C末端被PEG化。可以通过引入C末端叠氮-甲硫氨酸，随后经由Staudinger反应来偶联甲基-PEG-三芳基膦化合物，从而将蛋白质在C末端PEG化。此C末端偶联方法记载于Cazalis等，C-Terminal Site-Specific PEGylation of a Truncated Thrombomodulin Mutant with Retention of Full Bioactivity，Bioconjug Chem.2004；15(5)：1005-1009。
可以使用本领域已知的常规分离和纯化技术来纯化PEG化的抗体样蛋白质多聚体，诸如大小排阻(例如凝胶过滤)和离子交换层析。也可以使用SDS-PAGE来分离产物。可以分离的产物包括单PEG化、二PEG化、三PEG化、多PEG化和未PEG化的结合多肽，以及游离PEG。可以通过合并洗脱峰周围的更宽级分(broader fractions)，提高组合物中单PEG的百分比，来控制单PEG偶联物的比例。约90％的单PEG偶联物代表产量和活性的良好平衡。
在一些实施方案中，PEG化的抗体样蛋白质多聚体会优选地保留与未修饰蛋白质相关的生物学活性的至少约25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，生物学活性指其结合EGFR和IGFIR的能力，如通过KD、kon或koff来评估的。在一些实施方案中，相对于未PEG化的蛋白质，PEG化的抗体样蛋白质多聚体显示出对EGFR和/或IGFIR的结合的增加。
结合多肽的去免疫(deimmunization)
可以改变E结合物和E/I结合物，具体地抗体样蛋白质多聚体诸如EGFR结合性10Fn3和IGFIR结合性10Fn3的二聚体的氨基酸序列以消除一个或多个B或T细胞表位。蛋白质或蛋白质的多聚体可以被去免疫，以使得它对于给定物种无免疫原性或免疫原性降低。去免疫可以藉由对多肽的结构改变来实现。可采用本领域技术人员知道的任何去免疫技术，参见例如WO 00/34317，将其公开内容完整收入本文。
在一个实施方案中，可以分析E结合物和E/I结合物的序列以确定MHC II类结合基序的存在。例如，可以与MHC结合基序的数据库进行比较，诸如例如通过搜索万维网上sitewehil.wehi.edu.au的“基序”数据库。或者，可以使用计算穿线法(computational threading method)来鉴定MHC II类结合肽，诸如由Altuvia等(J.Mol.Biol.249244-250(1995))设计的穿线法，测试来自多肽的连续的重叠肽对MHC II类蛋白的结合能。预测结合的计算机算法 (computational binding prediction algorithms)包括iTopeTM、Tepitope、SYFPEITHI、EpiMatrix(EpiVax)、和MHCpred。为了帮助鉴定MHC II类结合肽，可搜索涉及被成功呈递的肽的有关序列特征，诸如两亲性和Rothbard基序，及组织蛋白酶B和其它加工酶的切割位点。
鉴定出潜在的(例如人)T细胞表位后，通过改变一个或多个氨基酸(视消除T细胞表位的需要)来消除这些表位。通常，这会涉及T细胞表位自身内的一个或多个氨基酸的改变。这可能涉及改变这样的氨基酸：在蛋白质的一级结构上其邻近于所述表位，或者在分子的一级结构上不邻近但在二级结构中邻近。所考虑的通常的改变是氨基酸替代，但是在某些情况下有可能氨基酸添加或删除会是合适的。所有改变均可通过重组DNA技术来实现，这样最终的分子可通过重组宿主表达来制备，例如借助已确立的方法，但是也可使用蛋白质化学或任何其它改变分子的手段。
一旦消除了鉴定出的T细胞表位，可再次分析去免疫序列以确保没有产生新的T细胞表位，并且，如果产生了新的T细胞表位，那么可删除该表位。
并非所有通过计算鉴定出的T细胞表位都需要消除。本领域技术人员会理解特定表位的“强度”(或者更恰当的说是潜在免疫原性)的重要性。各种计算方法为潜在表位生成得分。本领域技术人员会认可，只有得分高的表位可能需要消除。技术人员还会认可，消除蛋白质的潜在表位与维持结合亲和力之间有一种权衡。因此，一种策略是依次地将替代引入蛋白质，然后测试抗原结合和免疫原性。
在一个方面，去免疫的蛋白质在人受试者中的免疫原性比原始蛋白质要低(或者更恰当的说，引发更低的HAMA应答)。用于测定免疫原性的测定法完全在熟练技术人员的知识范围内。可实施本领域公认的测定免疫应答的方法来监测特定受试者中的或临床试验中的HAMA应答。对施用了去免疫的蛋白质的受试者可在施用所述疗法开始时和整个期间给予免疫原性评估。HAMA应答例如使用本领域技术人员知道的方法通过测定来自受试者的血清样品中针对去免疫多肽的抗体来测量，包括表面等离振子共振技术(BIACORE)和/或固相ELISA分析。或者，设计用于测量T细胞活化事件的体外测定法也能指示免疫原性。
其它修饰
在某些实施方案中，E结合物和E/I结合物，尤其是抗体样蛋白质多聚体 诸如EGFR结合性10Fn3和IGFIR结合性10Fn3的二聚体，可以进一步包含翻译后修饰。例示性的翻译后蛋白质修饰包括磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖基化、遍在蛋白化、糖基化、羰基化、苏素化(sumoylation)、生物素化或添加多肽侧链或疏水基。结果，经修饰的E结合物和E/I结合物可以含有非氨基酸元件，诸如脂质、多糖或单糖、和磷酸酯。优选的糖基化形式是唾液酸化，其将一个或多个唾液酸模块与多肽偶联。唾液酸模块改善溶解度和血清半衰期，同时还降低蛋白质可能的免疫原性。参见例如Raju等Biochemistry.2001年7月31日；40(30)：8868-76。可以测试此类非氨基酸元件对E结合物或E/I结合物功能性的影响以确定其在EGFR和IGFIR信号传导功能中的拮抗作用。
在一些实施方案中，修饰E结合物和E/I结合物以增强抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。在一些实施方案中，E/I结合物是进一步包含Fc区的EGFR结合性10Fn3和IGFIR结合性10Fn3的二聚体。在一些实施方案中，Fc区是增强ADCC或CDC的变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如替代)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)，所述氨基酸位置包括第256位、第290位、第298位、第312位、第326位、第330位、第333位、第334位、第360位、第378位或第430位，其中Fc区中残基的编号方式是如在Kabat中的EU索引的编号方式。
载体和多核苷酸实施方案
本公开内容中还包括编码本文中所描述的任何蛋白质的核酸序列。如本领域技术人员理解的，由于第三碱基简并性，几乎每个氨基酸都可以由编码核苷酸序列中的超过一个三联体密码子表示。另外，次要的碱基对变化可以导致编码氨基酸序列的保守替代，但预期不实质上改变基因产物的生物学活性。因此，编码本文中所描述的蛋白质的核酸序列可以在序列上略微修饰，而仍编码其各自的基因产物。
编码本文中所描述的E/I结合物的例示性核酸包括具有SEQ ID NO：442-465的核酸或与SEQ ID NO：442-465中任一项具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的序列的核酸。因遗传密码的简并性而与如SEQ ID NO：442-465中所列的核酸不同的分离的核酸也在本发明的范围内。还提供了包含由与SEQ ID NO：328至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列编码的I单体的E/I结合物和/或包含由与 SEQ ID NO：329-441或495中任一项80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列编码的E单体的E/I结合物。还提供了由与SEQ ID NO：329-441或495中任一项80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列编码的E结合物。在某些实施方案中，编码E/I结合物、E单体、或I单体的核苷酸序列不含编码6XHis标签的序列(SEQ ID NO：487)。
可以化学合成编码本文中所公开的各种蛋白质或多肽之任一种的核酸。可以选择密码子用法以改善细胞中的表达。此类密码子用法会取决于所选择的细胞类型。已经开发了用于大肠杆菌和其它细菌以及哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞和昆虫细胞的专门的密码子用法模式。参见例如：Mayfield等，Proc Natl Acad Sci U S A.2003100(2)：438-42；Sinclair等Protein Expr Purif.2002(1)：96-105；Connell ND.Curr Opin Biotechnol.2001(5)：446-9；Makrides等Microbiol Rev.199660(3)：512-38；及Sharp等Yeast.19917(7)：657-78。
通用核酸操作技术在本领域技术人员的范围内，而且也记载于例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，卷1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版，1989或F.Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology(Green Publishing and Wiley-Interscience：New York，1987)和定期更新，通过提及而将上述文献收入本文。编码蛋白质的DNA与源自哺乳动物、病毒、或昆虫基因的合适的转录或翻译调节元件可操作连接。此类调节元件包括转录启动子、任选的操纵基因序列(用以控制转录)、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列、和控制转录和翻译终止的序列。另外，掺入在宿主中复制的能力(通常由复制起点赋予)和选择基因(用以帮助转化子的识别)。合适的调节元件是本领域中公知的。
本文中所描述的蛋白质可以作为与异源多肽的融合蛋白生成，所述异源多肽优选是信号序列或其它位于成熟蛋白质或多肽的N末端、具有特异性切割位点的多肽。所选择的异源信号序列优选是受到宿主细胞识别和加工(即被信号肽酶切割)的异源信号序列。对于不识别和加工天然信号序列的原核宿主细胞，用原核信号序列替换信号序列，原核信号序列选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp、或热稳定肠毒素II前导序列。对于酵母分泌，可以用例如下述序列替换天然信号序列：酵母转化酶前导序列、α因子前导序列(包括酵母属(Saccharomyces)和克鲁维酵母属(Kluyveromyces)α-因子前导序列)、 或酸性磷酸酶前导序列、白色假丝酵母(C.albicans)葡糖淀粉酶前导序列、或PCT公开文本号WO90/13646中记载的信号。在哺乳动物细胞表达中，有哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列(例如单纯疱疹gD信号)可供使用。可以将此类前体区域的DNA与编码蛋白质的DNA以符合读码框的方式相连接。
用于真核宿主细胞(例如酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其它多细胞生物体的有核细胞)的表达载体还会含有终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可以从真核或病毒DNA或cDNA的5’端(偶尔为3’端)的非翻译区获得。这些区域含有这样的核苷酸区段，它们被转录为编码多价抗体的mRNA的非翻译部分中的聚腺苷酸化片段。一种有用的转录终止构件是牛生长激素多聚腺苷酸化区。参见PCT公开号WO 94/11026及其中披露的表达载体。
重组DNA还可包含任何类型的可能对蛋白质纯化有用的蛋白质标签序列。蛋白质标签的例子包括但不限于组氨酸标签、FLAG标签、myc标签、HA标签、或GST标签。与细菌、真菌、酵母、和哺乳动物细胞宿主一起使用的适宜的克隆和表达载体可见于Cloning Vectors：A Laboratory Manual，(Elsevier，New York，1985)，以此通过提及收入其相关公开内容。
使用对宿主细胞适宜的方法将表达构建物导入宿主细胞中，这对本领域技术人员而言会是容易想到的。本领域已知多种用于将核酸导入宿主细胞中的方法，包括但不限于电穿孔；采用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-右旋糖酐、或其它物质的转染；微粒轰击；脂质体转染；和感染(其中载体是感染原)。
合适的宿主细胞包括原核生物、酵母、哺乳动物细胞、或细菌细胞。合适的细菌包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠埃希氏菌或大肠杆菌(E.coli)或芽孢杆菌属(Bacilli spp)。酵母(优选来自酵母属物种，诸如酿酒酵母(S.cerevisiae))也可用于生产多肽。也可采用各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统来表达重组蛋白。关于在昆虫细胞中生产异源蛋白质的杆状病毒系统的综述见Luckow和Summers，(Bio/Technology，6：47，1988)。在一些情况下，会想要在脊椎动物细胞中生成蛋白质，诸如为了糖基化，培养(组织培养)中扩增脊椎动物细胞已经变为常规的规程。合适的哺乳动物宿主细胞系的例子包括内皮细胞、COS-7猴肾细胞、CV-1、L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、人胚肾细胞、HeLa、293、293T、和BHK细胞系。对于许多应用， 本文中所描述的蛋白质多聚体的小尺寸会使大肠杆菌成为优选的表达方法。
蛋白质生产
用本文所述用于生产蛋白质的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在酌情更改用于诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因的的常规营养培养基中进行培养。
可以在多种培养基中培养用于生产本发明蛋白质的宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏F10(Sigma)、极限必需培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM，Sigma)适于培养宿主细胞。另外，可以使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基：Ham等，Meth.Enz.58：44(1979)；Barnes等，Anal.Biochem.102：255(1980)；美国专利No.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO90/03430；WO 87/00195；或美国专利号Re.30,985。任何这些培养基可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCINTM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等效能源。还可以包含本领域技术人员知道的适宜浓度的任何其它必需补充物。培养条件(诸如温度、pH等)为先前表达选用的宿主细胞所用的培养条件，这对于普通技术人员而言会是显而易见的。
本文中所公开的蛋白质也可以使用细胞翻译系统来生产。为了该目的，必须修饰编码蛋白质的核酸以容许体外转录生成mRNA，并容许mRNA在所利用的特定无细胞系统中进行无细胞翻译。例示性的真核无细胞翻译系统包括例如哺乳动物或酵母无细胞翻译系统，而例示性的原核无细胞翻译系统包括例如细菌无细胞翻译系统。
本文中所公开的蛋白质也可以通过化学合成来生产(例如使用Solid Phase Peptide Synthesis，第2版，1984，The Pierce Chemical Co.，Rockford，IL中记载的方法)。对蛋白质的修饰也可以通过化学合成来产生。
本文中所公开的蛋白质可以通过蛋白质化学领域普遍知道的蛋白质分离/纯化方法来纯化。非限制性的例子包括提取、再结晶、盐析(例如用硫酸铵或硫酸钠)、离心、透析、超滤、吸附层析、离子交换层析、疏水层析、正相层析、反相层析、凝胶过滤、凝胶渗透层析、亲和层析、电泳、逆流分 配或这些的任意组合。纯化后，可以通过本领域已知的多种技术(包括但不限于过滤和透析)将蛋白质更换到不同缓冲液中和/或浓缩。
纯化的蛋白质优选是至少85％纯、更优选至少95％纯、且最优选至少98％纯。无论纯度的确切数值如何，蛋白质对于用作药品是足够纯的。
成像、诊断和其它应用
本文中所描述的E结合物可以被可检测地标记，并用于接触表达EGFR的细胞以进行成像或诊断应用。本文中所描述的E/I结合物可以被可检测地标记，并用于接触表达EGFR和/或IGFIR的细胞以进行成像或诊断应用。本领域中已知的用于偶联蛋白质与可检测模块的任何方法均可以采用，包括Hunter等，Nature 144：945(1962)；David等，Biochemistry 13：1014(1974)；Pain等，J.Immunol.Meth.40：219(1981)；及Nygren，J.Histochem.and Cytochem.30：407(1982)所记载的方法。
在某些实施方案中，本文中所描述的E结合物和E/I结合物进一步附接于能够检测的标记物(例如标记物可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)。标记物可以是放射性试剂，诸如：放射性重金属诸如铁螯合物、钆或锰的放射性螯合物，氧、氮、铁、碳、或镓的正电子发射体、43K、52Fe、 57Co、67Cu、67Ga、68Ga、123I、125I、131I、132I、或99Tc。固定于此类模块的E结合物或E/I结合物可以作为成像剂使用，以对于在哺乳动物诸如人中的诊断用途有效的量施用，然后检测成像剂的定位和积累。可以通过放射性闪烁照相法、核磁共振成像、计算机断层摄影术或正电子成像术来检测成像剂的定位和积累。如熟练技术人员会显而易见的，要施用的放射性同位素的量取决于放射性同位素。本领域普通技术人员可以基于用作活性模块的给定放射性核酸的比活和能量，容易地配制要施用的成像剂的量。
E结合物和E/I结合物作为亲和纯化试剂也是有用的。在此过程中，使用本领域众所周知的方法将蛋白质固定化在合适的支持物上，诸如Sephadex树脂或滤纸。蛋白质可用于任何已知的测定法，诸如竞争性结合测定法、直接和间接夹心式测定法、和免疫沉淀测定法(Zola，Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques，页147-158(CRC Press，Inc.，1987))。
E结合物在用于检测样品中的EGFR的方法中是有用的。E/I结合物在用于检测样品中的EGFR和/或IGFIR的方法中也是有用的。样品常常会是生物学样品，诸如活检，特别是肿瘤、疑似肿瘤的活检。样品可以来自人或其它 哺乳动物。E结合物或E/I结合物可以用标记模块标记，诸如放射性模块、荧光模块、生色模块、化学发光模块、或半抗原模块，并可以固定化在固体支持物上。检测可使用本领域已知的任何技术来进行，如放射线照相术、免疫学测定法、荧光检测、质谱术、或表面等离子共振。
治疗/体内用途
本文中所描述的E结合物在针对可应答于对EGFR生物学活性的抑制的症候的治疗方法中也是有用的。本文中所描述的E/I结合物在用于治疗可应答于对EGFR和/或IGFIR生物学活性的抑制的症候的方法中也是有用的。EGFR和IGFIR直接地或间接地参与多种细胞活动(包括增殖、粘附和迁移，以及分化)的信号转导途径。
在一个方面，本申请提供了用治疗有效量的E结合物或E/I结合物治疗罹患过度增殖性病症的受试者的方法。具体地，E结合物和E/I结合物可用于治疗和/或预防肿瘤和/或肿瘤转移。在例示性的实施方案中，E/I结合物是抗体样蛋白质多聚体诸如EGFR结合性10Fn3和IGFIR结合性10Fn3的二聚体。
在一些实施方案中，对罹患肿瘤的受试者施用包含E结合物或E/I结合物的药物组合物，所述肿瘤包括但不限于脑肿瘤、泌尿生殖道肿瘤、淋巴系统肿瘤、胃肿瘤、喉肿瘤、单核细胞白血病、肺腺癌、小细胞肺癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤和乳腺癌，或癌性疾病，包括但不限于鳞状细胞癌、膀胱癌、胃癌、肝癌、肾癌、结肠直肠癌、乳腺癌、头癌、颈癌、食管癌、妇科癌症、甲状腺癌、淋巴瘤、慢性白血病和急性白血病。
E结合物或E/I结合物可以单独地施用或与一种或多种其它疗法诸如化学疗法、放射疗法、免疫疗法、手术干预、或这些的任意组合联合地。和在其它治疗策略的背景中的辅助疗法一样，长期疗法同样是可能的，如本文中所描述的。施用的技术和剂量随具体多肽的类型和所治疗的具体状况而有所变化，但熟练技术人员可以容易地确定。
可以与E/I结合物一起使用的其它药剂
本申请的一个方面提供了E结合物或E/I结合物和其它治疗剂诸如细胞毒剂的组合。在一些实施方案中，E结合物或E/I结合物与细胞毒剂连接。此类实施方案可以视情况通过体外或体内方法来制备。体外方法包括本领域众所周知的偶联化学，诸如与半胱氨酸和赖氨酸残基的偶联。为了将细胞毒剂与多肽相连，使用连接基团或反应性基团。合适的连接基团是本领域众所周 知的，包括二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团和酯酶不稳定基团。细胞毒剂也可以经由中间载体分子诸如血清白蛋白与E结合物或E/I结合物连接。
可以与E结合物或E/I结合物连接的例示性细胞毒剂包括美登木素生物碱、紫杉烷、CC-1065类似物、细菌毒素、植物毒素、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、蛋白酶、葡萄球菌肠毒素-A、商陆(pokeweed)抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素、假单胞菌内毒素、Ranpimase(Rap)、Rap(N69Q)、甲氨蝶呤、柔红霉素(daunorubicin)、多柔比星、长春新碱、长春碱、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、和加利车霉素(calicheamicin)。
在其它治疗性处理或组合物中，将E结合物或E/I结合物与一种或多种其它治疗剂共施用或顺序施用。合适的治疗剂包括但不限于细胞毒性或细胞抑制性药剂，诸如癌症治疗剂。
癌症治疗剂指那些旨在杀死癌细胞或限制癌细胞生长同时对患者具有最低限度影响的药剂。因此，此类药剂可利用癌细胞特性(例如代谢、血管化或细胞表面抗原呈递)与健康宿主细胞相比的任何差异。可以为了改善的抗癌效果而与E/I结合物组合的治疗剂包括肿瘤学实践中所使用的多种药剂(参考文献：Cancer，Principles&Practice of Oncology，DeVita，V.T.，Hellman，S.，Rosenberg，S.A.，第6版，Lippincott-Raven，Philadelphia，2001)，诸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、曲妥单抗(trastuzumab)、卡培他滨(capecitabine)、他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、来曲唑(letrozole)、阿那曲唑(anastrozole)、氟维司群(fulvestrant)、依西美坦(exemestane)、戈舍瑞林(goserelin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、卡铂(carboplatin)、顺铂(cisplatin)、地塞米松(dexamethasone)、安肽(antide)、贝伐单抗(bevacizumab)、5-氟尿嘧啶、亚叶酸(leucovorin)、左旋咪唑(levamisole)、伊立替康(irinotecan)、依托泊苷(etoposide)、托泊替康(topotecan)、吉西他滨(gemcitabine)、长春瑞滨(vinorelbine)、雌莫司汀(estramustine)、米托蒽醌(mitoxantrone)、阿巴瑞克(abarelix)、唑来膦酸盐(zoledronate)、链佐星(streptozocin)、利妥昔单抗(rituximab)、伊达比星(idarubicin)、白消安(busulfan)、苯丁酸氮芥、氟达拉滨(fludarabine)、伊马替尼(imatinib)、阿糖胞苷(cytarabine)、替伊莫单抗(ibritumomab)、托西莫单抗(tositumomab)、干 扰素α-2b、美法仑、硼替佐米(bortezomib)、六甲蜜胺(altretamine)、天冬酰胺酶(asparaginase)、吉非替尼(gefitinib)、埃罗替尼(erlonitib)、抗EGF受体抗体(例如西妥昔单抗或帕尼单抗(panitumab))、伊沙匹隆(ixabepilone)、埃博霉素(epothilone)或其衍生物、和铂剂(诸如卡铂、奥沙利铂、顺铂)、紫杉烷(诸如帕利他塞、多西他塞)、和喜树碱(camptothecin)。
治疗性配制剂和施用模式
本申请提供了用于治疗可应大于EGFR和/或IGFIR生物学活性的抑制的症候的方法。施用的技术和剂量随具体多肽的类型和所治疗的具体状况而有所变化，但熟练技术人员可以容易地确定。一般地，管理机构要求配制要作为治疗剂使用的蛋白质药剂以具有可接受的低水平的热原。因而，治疗性配制剂一般会在下面的方面与其它配制剂区别：它们基本上没有热原，或者至少含有不超过如适当的管理机构(例如FDA)所决定的可接受水平的热原。
在一些实施方案中，E结合物和E/I结合物对于哺乳动物，特别是人而言是药学可接受的。“药学可接受”的多肽指这样的多肽，其被施用给动物而没有药学上显著不利的后果。药学可接受的E结合物和E/I结合物的例子包括缺乏整联蛋白结合域(RGD)的10Fn3域和基本上没有内毒素或具有非常低的内毒素水平的10Fn3域。
治疗性组合物可以以单位剂量形式与药学可接受稀释剂、载体、或赋形剂一起施用。作为非限制性例子，施用可以是胃肠外(例如静脉内、皮下)、口服、或表面的。另外，可以采用任何使用编码E结合物或E/I结合物的核酸的基因治疗技术，诸如裸DNA投递、重组基因和载体、基于细胞的投递，包括离体操作患者的细胞等。
组合物可以为供口服的丸剂、片剂、胶囊、流体、或持续释放片剂；供静脉内、皮下或胃肠外施用的液体；或供局部施用的凝胶、洗剂、软膏剂、乳膏、或聚合物或其它持续释放媒介物的形式。
本领域中公知的用于生成配制剂的方法可参见例如“Remington：TheScience and Practice of Pharmacy”(第20版，A.R.Gennaro AR.编，2000，Lippincott Williams&Wilkins，Philadelphia，PA)。供胃肠外施用的配制剂可以例如含有赋形剂、无菌水、盐水、聚亚烷基二醇诸如聚乙二醇、植物源的油、或氢化萘。可以使用生物相容性、生物可降解性交酯聚合物、交酯/乙交酯共聚物、或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物来控制化合物的释放。可以使用纳米颗 粒制剂(例如生物可降解性纳米颗粒、固体脂质纳米颗粒、脂质体)来控制化合物的生物分布。其它潜在有用的胃肠外投递系统包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵(osmotic pump)、可植入输注系统、和脂质体。配制剂中的化合物浓度随多种因素而变化，所述因素包括要施用的药物剂量、和施用路径。
任选地，多肽可以作为药学可接受盐，诸如医药工业中通常使用的无毒性酸加成盐或金属复合物施用。酸加成盐的例子包括有机酸诸如乙酸、乳酸、扑酸(pamoic)、马来酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、琥珀酸、苯甲酸、棕榈酸、辛二酸、水杨酸、酒石酸、甲磺酸、甲苯磺酸、或三氟乙酸等；聚合酸诸如鞣酸、羧甲基纤维素等；和无机酸诸如氢氯酸、氢溴酸、硫酸、磷酸等。金属复合物包括锌、铁等。在一个例子中，在乙酸钠的存在下配制多肽以提高热稳定性。
口服使用的配制剂包括含有与无毒性药学可接受赋形剂混合的活性成分的片剂。这些赋形剂可以是例如，惰性稀释剂或填充剂(例如蔗糖和山梨糖醇)、润滑剂、助流剂、和防粘剂(anti-adhesive)(例如硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸、硅石、氢化植物油、或滑石)。
供口服使用的配制剂还可以作为可咀嚼的片剂提供，或作为硬明胶胶囊(其中活性成分与惰性固体稀释剂混合)，或作为软明胶胶囊(其中活性成分与水或油介质混合)提供。
治疗有效剂量，指产生其施用的目的治疗效果的剂量。确切的剂量将取决于要治疗的病症，并且本领域技术人员可以使用已知的技术确定。一般地，E结合物或E/I结合物以每天约0.01μg/kg至约50mg/kg、优选地每天0.01mg/kg至约30mg/kg、最优选地每天0.1mg/kg至约20mg/kg施用。多肽可以每天(例如每天一次、两次、三次、或四次)或更小的频率(例如每隔一天一次、每周一次或两次、或每月一次)给予。另外，如本领域中已知的，可能有必要针对年龄及体重、一般健康状况、性别、饮食、施用次数、药物相互作用、和疾病的严重性进行调整，本领域技术人员凭借常规的实验可以确定。
实施例
现在一般性描述的发明通过参照以下实施例会更容易理解，所述实施例仅为了例示本发明的某些方面和实施方案而包括在内，而并不意图以任何方 式限制本发明。
序列汇总
在下表中汇总了本申请中提及的许多序列。除非另有规定，N端延伸用单下划线标示，C端尾部用双下划线标示，而接头序列以粗体标示。
实施例1：用于筛选-+EGFR活性的细胞中Western测定法
开发出细胞中Western测定法(In Cell Western assay)以筛选各种10Fn3单克隆抑制EGFR活性的能力，从而鉴定能与IGF1R10Fn3结合物连接以构建E/I结合物的。还使用细胞中Western测定法来筛选并测定特定E/I10Fn3结合物的相对效力。开发出两种细胞中Western测定法以测量1)对EGF刺激的EGFR磷酸化的抑制或2)对EGF刺激的ERK磷酸化的抑制。对于A431表皮样癌或FaDu头颈癌(head&neck carcinoma)细胞，以24,000个细胞/孔将细胞接种入经多聚D-赖氨酸包被的96孔微量滴定板(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)中，并容许它们贴壁过夜。将细胞清洗一次，然后在无血清培养基中温育24小时。接着，将基于10Fn3的结合物的连续稀释物施加给细胞，并温育2-3小时，之后用100ng/ml EGF刺激10分钟。刺激后，将细胞在含有3.7％甲醛的PBS中固定20分钟，然后在含有0.1％triton-X-100的PBS中透化处理15分钟。将细胞在Odyssey封闭剂(Li-Cor Biosciences，Lincoln，Nebraska)中封闭1小时，并与用于检测酪氨酸1068磷酸化的EGFR的抗体(Cell Signaling，Beverly，MA)和检测β-肌动蛋白的抗体(Sigma，St.Louis，MO)或检测pERK的抗体(酪氨酸202/苏氨酸204磷酸化的MAP激酶)及检测总ERK的抗体(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)一起温育。在含有0.1％tween-20的PBS中清洗三次后，添加二抗(Invitrogen，Carlsbad，CA或Rockland，Gilbertsville，PA)。将细胞在含有0.1％tween-20的PBS中清洗三次，并在Li-Cor Odyssey红外线成像系统(Li-Cor Biosciences，Lincoln，Nebraska)上成像。一式二份或一式三份测定每个克隆，并将数值相对于β-肌动蛋白(对于pEGFR测定法)和总ERK(对于pERK测定法)标准化。从对最大信号减去背景的百分比抑制的线性回归分析计算IC50值。
结果产生具有抑制EGFR活性的能力的多个10Fn3克隆，而且显示了某些特异性E/I10Fn3结合物拥有与图9中所显示的例子相似的活性。
实施例2：基于10Fn3的结合物的表达
使用甘氨酸-丝氨酸接头来共价连接EGFR结合性10Fn3与IGFIR结合性 10Fn3，由此生成10Fn3二聚体，其中每个10Fn3域结合不同靶物，从而生成E/I结合物。IGFIR结合性10Fn3(I1)先前在PCT公开号WO 2008/066752中描述为SEQ ID NO：226。通过如PCT公开号WO 2008/06675中所描述的那样对RNA-蛋白质融合物文库筛选EGFR-Fc(R&D Systems，Minneapolis，MN)的结合物来鉴定两种新的EGFR结合性10Fn3(E2和E1)。以下实施例描述了使用多种加 有His标签的基于10Fn3的E/I结合物(未PEG化的)：E2-GS10-I1(SEQ ID NO：25)、E1-GS10-I1(SEQ ID NO：31)、I1-GS10-E1(SEQ ID NO：28)、和I1-GS10-E2(SEQ ID NO：22)得到的结果。
以下实施例还描述了用下列PEG化的、加有His标签的基于10Fn3的E/I结合物得到的结果：E1-GS10-I1(SEQ ID NO：55)、E2-GS10-I1(SEQ ID NO：56)、E3-GS10-I1(SEQ ID NO：53)、I1-GS10-E1(SEQ ID NO：57)、I1-GS10-E2(SEQ ID NO：58)、I1-GS10-E3(SEQ ID NO：54)、E4-GS10-I1(SEQ ID NO：120)、I1-GS10-E4(SEQ ID NO：124)、E5-GS10-I1(SEQ ID NO：128)、I1-GS10-E5(SEQ ID NO：132)、E85-GS10-I1(SEQ ID NO：149)、I1-GS10-E85(SEQ ID NO：152)、E90-GS10-I1(SEQ ID NO：164)、E96-GS10-I1(SEQ ID NO：179)、E105-GS10-I1(SEQ ID NO：192)、I1-GS10-E105(SEQ ID NO：195)、E112-GS10-I1(SEQ ID NO：205)、I1-GS10-E112(SEQ ID NO：208)、I1-GSGCGS8-E5(SEQ ID NO：211)、I1-GS10-E5-GSGC(SEQ ID NO：212)、I1(S62C)-GS10-E5(SEQ ID NO：213)、I1-GS10-E5(S62C)(SEQ ID NO：214)、I1(S91C)-GS10-E5(SEQ ID NO：215)、和I1-GS10-E5(S91C)(SEQ ID NO：216)。
实施例还描述了使用加有His标签的基于10Fn3的IGFRIR结合物I1(SEQ ID NO：4)、和10种加有His标签的基于10Fn3的EGFR结合物，即E2(SEQ ID NO：6)、E1(SEQ ID NO：8)、E3(SEQ ID NO：52)、E4(SEQ ID NO：107)、E5(SEQ ID NO：113，其中X＝Ser，且在C端具有His标签)、PEG化的E5(SEQ ID NO：113，其中X＝Cys，且在C端具有His标签)、E85(SEQ ID NO：140)、E90(SEQ ID NO：155)、E96(SEQ ID NO：170)、E105(SEQ ID NO：185)、和E112(SEQ ID NO：198)得到的结果。实施例32还描述了多种E单体，其具有图45中所列的序列，而且包括在C端的His标签。
使用高通量蛋白质制备法(high throughput protein production process，HTPP)来纯化各种基于10Fn3的结合物。将选定的结合物克隆入pET9d载体中，以生成His6标签(SEQ ID NO：487)融合物。将DNA转化入大肠杆菌HMS174(DE3)中，并以24孔格式将细胞接种在5ml含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37℃培养过夜。自过夜培养物吸出200μl，并将其分配入合适的孔中，来制备新鲜的5ml LB培养基(50μg/mL卡那霉素)培养物用于诱导表达。将培养物于37℃培养，直至A6000.6-0.9。在用1mM异丙基-β-硫代半乳 糖苷(IPTG)诱导后，将培养物于30℃再培养6小时，并通过于4℃以3220xg离心10分钟来收获。将细胞沉淀物于-80℃冷冻。
通过在450μl裂解缓冲液(50mM NaH2PO4、0.5M NaCl、1x CompleteTM蛋白酶抑制剂混合物-无EDTA(Roche)、1mM PMSF、10mM CHAPS、40mM咪唑、1mg/ml溶菌酶、30ug/ml DNA酶、2μg/ml抑肽酶(aprotonin)，pH 8.0)中重悬，并于室温摇动1小时来裂解细胞沉淀物(以24孔格式)。将溶胞物转移入配有96孔650μl捕捉板的96孔Whatman GF/D Unifilter并以200g离心5分钟，以澄清溶胞物并将其重设成96孔格式。将澄清后的溶胞物转移至经平衡缓冲液(50mM NaH2PO4，0.5M NaCl，10mM CHAPS，40mM咪唑，pH 8.0)平衡的96孔Ni螯合板并温育5分钟。用真空除去未结合的物质。将树脂用1号清洗缓冲液(50mM NaH2PO4，0.5M NaCl，5mM CHAPS，40mM咪唑，pH 8.0)2x 0.3ml/孔清洗，用真空除去每次的清洗液。接着，将树脂用PBS 3x 0.3ml/孔清洗，用真空除去每步的清洗液。在洗脱前，将每个孔用50μl洗脱缓冲液(PBS+20mM EDTA)清洗，温育5分钟，并通过真空弃去该清洗液。向每个孔中另加100ul洗脱缓冲液来洗脱蛋白质。于室温温育30分钟后，将板以200g离心5分钟，将所洗脱的蛋白质收集在固定至Ni板底部的含有5μl 0.5M MgCl2的96孔捕捉板中。使用BCA蛋白测定法定量所洗脱的蛋白质，以SEQ ID NO：2作为蛋白质标准品。
HTPP产生了具有活性的基于10Fn3的结合物，其以可溶性形式表达，将其从细菌胞质溶胶的可溶性级分纯化出来。图1描绘了来自对一种基于10Fn3的E/I结合物进行的例示性的SDS-PAGE分析。在Superdex 2005/150GL(GEHealthcare)上以流动相100mM NaPO4、100mM NaSO4、150mM NaCl，pH 6.8进行SEC分析，主要呈现单体蛋白质(参见实施例4)。
另外，对选定的基于10Fn3的结合物进行了中等规模表达和纯化。将与His6标签(SEQ ID NO：487)融合的选定结合物克隆入pET9d或pET29载体中，并在大肠杆菌HMS174(DE3)或BL212(DE3)(EMD Biosciences，San Diego，CA)细胞中表达。使用20ml接种培养物(自单个铺板的菌落生成)来接种1升含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基。将培养物于37℃培养，直至A6000.6-1.0。在用1mM异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后，将培养物于30℃再培养6小时。或者，于37℃使用自身诱导培养基(“ONE”培养基，EMD Biosciences，San Diego，CA)初始培养后于18℃进行表达。于4℃以≥10,000x g离心30分钟来 收获细胞沉淀物，并于-80℃冷冻。使用Ultra-turraxy匀浆仪，在冰上将细胞沉淀物在25mL裂解缓冲液(20mM NaH2PO4，0.5M NaCl，1x CompleteTM蛋白酶抑制剂混合物-无EDTA(Roche)，pH 7.4)中重悬。使用M-110S型微流化仪(Microfluidics)通过高压(≥18,000psi)匀浆来实现细胞裂解。通过于4℃以23,300g离心30分钟来分离可溶性级分。经0.45μm滤器将上清液澄清。将澄清后的溶胞物加载到用20mM NaH2PO4，0.5M NaCl，pH 7.4预平衡的HisTrap柱(GE)上。然后用25个柱体积的20mM NaH2PO4，0.5M NaCl，pH 7.4洗柱，接着用20个柱体积的20mM NaH2PO4，0.5M NaCl，25mM咪唑，pH 7.4洗柱，然后用35个柱体积的20mM NaH2PO4，0.5M NaCl，40mM咪唑，pH 7.4洗柱。用15个柱体积的20mM NaH2PO4，0.5M NaCl，500mM咪唑，pH 7.4洗脱蛋白质，根据A280吸光度合并级分，并针对1x PBS，50mM Tris，150mM NaCl，pH8.5或50mM NaOAc；150mM NaCl；pH4.5透析。通过0.22μm过滤除去任何沉淀物。
中等规模表达和纯化产生高纯度且活性的蛋白质，其以可溶性形式表达，并自细菌胞质溶胶的可溶性级分将其纯化。用Superdex 20010/30GL(GEHealthcare)以流动相100mM NaPO4、100mM NaSO4、150mM NaCl，pH 6.8进行SEC分析，主要呈单体蛋白质(参见实施例4)。
 实施例3：基于10Fn3的E/I结合物的PEG化
可以用各种大小和类型的PEG来使基于纤连蛋白的多价支架蛋白质(诸如基于10Fn3的E/I结合物)PEG化。为了容许PEG化，通常在蛋白质的C端附近进行修饰，将氨基酸(通常为丝氨酸)单点突变为半胱氨酸。通过将衍生化的PEG试剂与蛋白质溶液混合并温育，与各种马来酰亚胺衍生化的PEG形式进行偶联，从而实现蛋白质单个半胱氨酸残基处的PEG化。可以通过将未PEG化的蛋白质与PEG化的蛋白质分离开来的SDS-PAGE和/或SE-HPLC法来确认PEG化偶联反应的进行和确定。
例如，通过用半胱氨酸替换第221位的丝氨酸来使构建体E2-GS10-I1(SEQ ID NO：25)PEG化。然后偶联所得的构建体SEQ ID NO：56与马来酰亚胺衍生化的40kDa分枝PEG(NOF America Corporation，White Plains，NY)。将衍生化的PEG试剂与溶液中的蛋白质构建体混合，并在pH 7.40于室温温育，直至反应完成，通常为30分钟或于4℃过夜。通过透析或使用大小排阻柱层析快速脱盐入50NaOAc，150mM NaCl缓冲液中来将pH降低至pH 4.5或pH 5.0。然后，在降低的pH下，将来自PEG化反应的产物和过量的反应物的混合物加载到阳离子交换层析柱上，用150mM至1M NaCl的梯度洗脱。还进行了确认PEG化的研究，如上段中所描述的。可以用有His标签的或无His标签型的蛋白质来进行偶联。
有时需要在样品中消除大肠杆菌内毒素污染，有两种方法可以单独地或彼此结合使用。第一种是用通常5个柱体积的补充有0.5％Triton X-100的NaOAc缓冲液，接着用20个柱体积(或更多)的没有Triton X-100的相同缓冲液清洗阳离子交换柱。作为该方法的补充或者替代，使蛋白质非常缓慢地通过Sartorius Q滤器(Sartorius Stedim Biotech Bohemia，New York)。
使用另一种程序来使两种基于10Fn3的E/I结合物，即E2-GS10-I1-cys(具有his)(SEQ ID NO：56)和E3-GS10-I1-Cys(具有his)(SEQ ID NO：53)PEG化。对于含有T7聚合酶驱动的编码E2-GS10-I1-cys(具有his)或E3-GS10-I1-Cys(具有his)的pET29质粒的BL21(DE3)大肠杆菌细胞，自铺板的单菌落生成5ml的接种培养物，并用它来接种1升含有50μg/mL卡那霉素的自身诱导培养基(“ONE”培养基，EMD Biosciences，San Diego，CA)。37℃初始培养后于18℃进行表达，并4℃以约10,000x g离心10分钟来收获。将细胞离心沉淀物于-80℃冷冻。将细胞离心沉淀物重悬在10mL裂解缓冲液(20mM NaH2PO4，0.5M NaCl，5mM咪唑，pH 7.4)中，并使用Avestin匀浆仪以机械方式裂解。4℃、23,300x g离心15分钟来分离可溶性级分。倾出上清液，并将沉淀物在补充有4M至6M盐酸胍(GdnHCl)的裂解缓冲液(上述)中溶解。然后，将溶解的蛋白质在用补充GdnHCL的裂解缓冲液预平衡的合适大小的NiNTA柱(Qiagen，Inc.)上纯化。然后，用5至10个柱体积的相同缓冲液洗柱，接着用补充有300mM咪唑的相同缓冲液洗脱。将柱洗下的含有感兴趣蛋白质的级分稀释至2-3mg/mL蛋白质，然后与1.2-1.5摩尔过量的固体NEM-PEG(40kDa分枝的或其它)组合。让混合物于室温反应30分钟或者直至反应完成。然后，将整个反应体积放入透析袋(5,000Da分子量截留)中，并将混合物进行透析再折叠过程。例如，此过程可以是针对50mM NaOAc、150mm NaCl，pH 4.5的两次10-16小时500∶1(缓冲液∶透析液)透析交换。来自此过程的透析液含有正确折叠的、PEG化的材料及过量的反应物。通过离心或过滤来使来自PEG化反应的产物和过量反应物的混合物澄清，之后将它们加载到阳离子交换层析柱(SP Sepharose或Resource S，GE Healthcare)上。柱子用NaOAc背景缓冲液中 的150mM至1M NaCl梯度展开。如上文所描述地进行确认PEG化的研究。实施例4：基于10Fn3的结合物的生物物理表征
对自HTPP和中等规模方法纯化的蛋白质(对于HTPP为0.1至1μg蛋白质，而对于中等规模为10-50ug)进行标准的大小排阻层析(SEC)。HTPP来源材料的SEC使用Superdex 2005/150柱(GE Healthcare)或者对于中等规模方法得到的材料在Superdex 20010/30柱(GE Healthcare)上，在Agilent 1100或1200HPLC系统上以A214nm和A280nm的UV检测及以荧光检测(激发＝280nm，发射＝ 350nm)进行。采用缓冲液100mM硫酸钠、100mM磷酸钠、150mM氯化钠，pH6.8，和适合SEC柱的流速。使用凝胶过滤标准品(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)来进行分子量校准。
对HTPP纯化的基于10Fn3的结合物的SEC的结果主要显示单体蛋白质，洗脱的大致范围为25kDa(相对于球状凝胶过滤标准品(Biorad))。
对中等规模纯化的基于10Fn3的结合物的SEC结果主要显示单体蛋白质，洗脱的大致范围为25kDa(相对于球状凝胶过滤标准品(Biorad))。图2描绘了基于10Fn3的E/I结合物(图2A中的I1-GS10-E2和图2B中的E2-GS10-I1)的例示性SEC谱。
通过LC-MS(偶联有Waters Q-TOF API质谱仪的Water’s 2695液相层析HPLC系统，Waters Corporation，Milford，MA)进一步分析选定的中等规模基于10Fn3的结合物。用HPLC级水将样品稀释至约0.5mg/ml。将约5μl稀释样品注射到Jupiter C18柱(产品目录编号00G-4053-80，Phenomenex)上。缓冲液A：HPLC级水中的0.02％TFA+0.08％甲酸。缓冲液B：HPLC级乙腈中的0.02％TFA+0.08％甲酸。以流速0.2ml/分钟用梯度(表1)洗脱样品。
表1
  时间   ％A  B％
  0   95  5
  5.00   75  25
  25.00   55  45
  30.00   5  95
  32.00   95  5
  45.00   95  5
将HPLC洗脱物以近似1∶1的比率分开，将一半送到UC检测仪，另一半送到质谱仪。质谱仪的仪器设置如下：毛细管电压3.5KV、锥孔电压(cone voltage)40、源温度80℃、去溶剂化温度250℃、去溶剂化气流450、多通道 光检测仪电压2200。用MaxEn1(Waters Corporation)将原始光谱解卷积。
如通过LC-MS所测量的I1-GS10-E2(SEQ ID NO：22)的分子量是24,445道尔顿，其与从氨基酸组成计算的分子量相差1道尔顿内。这表明蛋白质具有正确的氨基酸组成，而且N端甲硫氨酸被加工。蛋白质上没有其它翻译后修饰。
对中等规模方法得到的I1-GS10-E2实施差示扫描量热法(DSC)分析以测定Tm。在N-DSC II量热计(Calorimetry Sciences Corp)中在3个大气压下对1mg/ml溶液以每分钟1度的速率将温度自5℃上升至95℃进行扫描。使用Orgin软件(OrginLab Corp)使用最佳拟合分析数据，与合适缓冲液的对照运行进行比较。此测定的结果表明E/I结合物具有50.69℃的Tm(参见图3A)。使用相同的方法，E2-GS10-I1(具有PEG)的Tm测定为50.72℃，而E2-GS10-Il(没有PEG)的Tm测定为56.82℃(参见图3B)。
实施例5：结合亲和力的测定
对溶液相基于10Fn3的结合物进行表面等离振子共振(BIAcore)分析以测定解离速率和/或结合亲和力，使用捕获的EGFR-Fc和IGF1R-Fc。将人IGF1R的胞外域(aa 1-932)克隆入含有人IgG1的铰链和恒定区的哺乳动物表达载体中。瞬时转染质粒生成融合蛋白IGF1R-Fc，随后通过蛋白A层析将其纯化。重组人EGFR-Fc(人EGFR的胞外域的aa 1-645与人Fc的融合)购自R&Dsystems(Minneapolis，MN)。IGF1R-Fc被捕获在固定化的蛋白A上，而EGFR-Fc被捕获在固定化的抗人抗体。
在典型的实验中，遵循制造商的推荐(GE Healthcare，Piscataway，NJ)将抗人IgG固定化在CM5芯片的流动池1和2上。用2分钟在流动池2(Fc2)上注射5uL EGFR-Fc(50nM)。使用3M MgCl2的两次30秒注射来从抗人IgG表面再生结合的EGFR-Fc。将蛋白A在乙酸盐pH 4.5中稀释至80ug/mL，并在CM5芯片表面的流动池3和4上以约3000个RU固定化。在Fc 4上捕获了约1300RU的IGF1R-Fc。样品之间使用50mM甘氨酸pH 1.5的两次30秒注射来再生表面。
对100nM至1nM浓度系列的HTPP纯化的蛋白质(收集三个数据点)或300nM至0.05nM浓度系列的中等规模纯化的蛋白质(收集11个数据点)评估对EGFR-Fc或IGF 1R-Fc的结合。在每个浓度获得传感图，并使用Biacore T100评估软件，第1.1.1版(GE healthcare/Biacore)来评估以测定速率常数ka(kon)和kd(koff)。对于HTPP评估，自3点曲线拟合解离速率。自速率常数比率koff/kon 计算亲和力KD。
以相似的格式，使用抗人-IgG捕捉HER2-Fc，对基于10Fn3的EGFR结合物评估特异性。基于10Fn3的结合物在对EGFR-Fc观察到强烈结合的条件下，对捕获的HER2-Fc没有显示任何可辨别的结合。
如表2中所显示的，基于10Fn3的E/I结合物的这两个域都是有功能性的，保留它们对各自靶物的结合特性。表2中所显示的解离速率来自中等规模方法的材料，而且与用HTTP材料获得的定性结果相似。
表2：基于10Fn3的结合物的结合常数的汇总
实施例6：对H292细胞中的IGFR活性的抑制
使用H292细胞体外测定法来测定基于10Fn3的E/I结合物抑制酪氨酸1131上的IGF1R磷酸化的能力。简言之，将65X 103个H292细胞在含有10mMHepes pH 7.4和10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中分配在96孔微板(经Biocoat多聚D-赖氨酸包被的96孔板，产品目录编号356640，Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)中。让细胞于37℃，5％CO2贴壁24小时。次日，用每孔200微升无血清RPMI-1640将细胞清洗一次，并在每孔100μL无血清RPMI-1640中温育过夜。添加HTPP材料的连续稀释物，并将细胞再温育3小时。于37℃用100ng/ml IGF-1(产品目录编号500-P11，PeproTech，Rocky Hill，NJ)刺激细胞10分钟。自平板倾出培养基，并向每孔中加入100μL细胞裂解缓冲液(Cell Signaling产品目录编号9803，Beverly，MA)。于室温将细胞温育15分钟以容许裂解，并将溶胞物转移到磷酸IGFR ELISA系统中(产品目录编号7302，Cell Signaling，Beverly，MA)。遵循制造商的规程来实施ELISA。
如图4中所显示的，加有His标签的E1-GS10-I1以与分离的IGF1R结合物I1(IC50＝0.018uM)相当的效力抑制IGF1刺激的IGF1R磷酸化(IC50＝0.004uM)。单独的EGFR结合物E1对IGF1R磷酸化具有非常小的影响(IC50＞3.5uM)。如图9中所显示的，其它E/I结合物表现出以范围为0.1nM至19nM的IC50抑制IGF1R刺激的磷酸化的能力，包括所测试的数种PEG化的E/I结合物。尤其是，对于PEG化的E/I结合物E1-GS10-I1和I1-GS10-E1，分别在0.9nM和4nM显示出对pIGFR的抑制。对于PEG化的E/I结合物E2-GS10-I1和I1-GS10-E2，分别在0.3nM和0.8nM显示出对pIGFR的抑制。
实施例7：对H292细胞中的EGFR活性的抑制
使用H292细胞体外测定法来测定基于10Fn3的E/I结合物抑制EGFR在酪氨酸1068上的磷酸化的能力。如实施例6中所描述的那样实施测定法，只是用100ng/ml EGF(产品目录编号236-EG-200，R&D Systems，Minneapolis，MN)刺激细胞，并进行磷酸EGFR ELISA(产品目录编号7240，Cell Signaling，Beverly，MA)。遵循制造商的规程来实施ELISA。
如图5中所显示的，加有His标签的E1-GS10-I1以与分离的EGFR结合物E1(IC50＝0.007uM)相当的效力抑制EGF刺激的EGFR磷酸化(IC50＝ 0.020uM)。IGF1R结合物，单独的I1，对EGFR磷酸化具有非常小的影响(IC50＞6.21uM)。如图9中所显示的，其它E/I结合物表现以范围为7nM至127nM的IC50抑制EGF刺激的磷酸化的能力，包括所测试的数种PEG化的E/I结合物。尤其是，对于PEG化的E2-GS10-I1和I1-GS10-E2，分别在32nM和47nM显示对pEGFR的抑制。对于PEG化的E/I结合物E2-GS10-I1和I1-GS10-E2，图11中显示了相似的数据。
实施例8：对H292细胞中EGF+IGF1诱导的pAKT的抑制
使用H292细胞体外测定法来测定基于10Fn3的E/I结合物抑制AKT在丝氨酸473上的磷酸化的能力。如实施例6中所描述的那样实施测定法，只是如上文所描述的那样用EGF和IGF1两者同时刺激细胞，并用磷酸AKT ELISA(产品目录编号7160，Cell Signaling，Beverly，MA)分析溶胞物。遵循制造商的规程来实施ELISA。
EGFR和IGF1R的信号转导流入PI3K-AKT信号传导途径中，并刺激AKT的磷酸化。如图6中所表明的，E1-GS10-I1抑制H292细胞中EGF和IGF1刺激的AKT磷酸化。基于10Fn3的E/I结合物的阻断AKT活化的能力(IC50＝0.004uM)比单独的IGF1R结合物I1(IC50＝0.031uM)略强。EGFR结合物E1在其阻断这两种配体的AKT活化的能力方面仅展现出适度的活性(IC50＝1.28uM)。如图9中所显示的，其它E/I结合物表明以范围为0.1nM至26nM的IC50抑制EGF和IGF1刺激的AKT磷酸化的能力，包括所测试的数种PEG化的E/I结合物。
实施例9：对RH41和H292细胞的细胞增殖的抑制
评估基于10Fn3的E/I结合物在H292非小细胞肺癌细胞(其生长依赖于EGFR信号传导)或RH41尤因肉瘤细胞系(其生长依赖于IGF1R信号传导)中的抗增殖活性。通过用CyQuantNF荧光染料(产品目录编号C35006，Invitrogen，Carlsbad，CA)对细胞DNA染色评估结合物在单层培养物中的抗增殖活性。简言之，将2X 103个H292或5X 103个RH41细胞在含有10mM Hepes pH 7.4和10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中分配入96孔微板(View Plates 96F产品目录编号6005225，Perkin-Elmer，Waltham，MA)中，并让其于37℃、5％CO2贴壁24小时。使细胞维持以指数生长的单层，并在测定期间保持于对数生长期，而在测定过程中不达到汇合。铺板后24小时，添加中等规模材料的连续稀释物，并将细胞再温育72小时。在此温育后，用CyQuantNF试剂处理细胞，并让它们于37℃将染料掺入细胞DNA中，历时1小时。通过在CytoFluor 4000仪 (Applied Biosystems，Framingham，MA)上以485nm激发和530nm发射读取荧光来定量总DNA。将细胞暴露于药物的总时间是72小时。每个实验中都包含了标准化合物以证实测定的性能和再现性。使用对测试化合物抑制百分比的线性回归分析来测定IC50值。
如图7中所显示的，在RH41细胞中，加有His标签的E1-GS10-I1以与IGFR结合物I1(IC50＝0.028uM)相当的效力(IC50＝0.009uM)抑制增殖。EGFR结合物E1单独对此细胞系中的增殖的影响非常小(IC50＞12.5uM)。
如图8中所显示的，在H292细胞中，加有His标签的E2-GS10-I1以比IGFR结合物I1(IC50＝0.699uM)或EGFR结合物E2(IC50＝0.553uM)更大的效力(IC50＝0.329uM)抑制增殖。对于E和I单体的IC50值，参见下文表4。
实施例10：竞争EGF配体结合测定法
在A431细胞中用基于细胞的EGF配体结合竞争测定法测试E/I结合物E1-GS10-I1、I1-GS10-E1、E2-GS10-I1和I1-GS10-E2(HTPP材料)，并与基于 10Fn3的EGFR结合物E1和E2(中等规模材料)比较。将A431细胞以15000个细胞/孔在DMEM+10％FBS中分配在96孔板中，并温育48小时。用饥饿培养基(DMEM+0.1％BSA)清洗细胞，并在饥饿培养基中培养1小时。将饥饿培养基除去，并更换为在饥饿培养基中稀释的基于10Fn3的结合物，并将细胞于37℃预温育30分钟以容许蛋白质结合细胞表面上的EGF受体。将饥饿培养基中稀释的10nM终浓度的经铕(Eu)标记的EGF(Perkin Elmer，Boston，MA)添加到预温育的细胞，并将平板于4℃在黑暗中温育3小时。用冷PBS将平板清洗两次，并向平板加入50ul/孔增强溶液(Perkin Elmer，Boston，MA)，于37℃温育1小时。在Flexstation II(Molecular Devices)上读取平板。用Softmax plus软件对数据绘图，并计算IC50值，即抑制50％的Eu-EGF配体结合细胞表面上的EGF受体所需要的基于10Fn3的结合物的浓度。
表3中汇总了与E2-GS10-I1、I1-GS10-E2、E1-GS10-I1和I1-GS10-E1比较的E2和E1的结果。此数据表明基于10Fn3的E/I结合物竞争并抑制EGF对A431细胞上的EGFR受体的结合，其效力与基于10Fn3的EGFR结合物相似。对于E和I单体的IC50值，参见下文表4。
表3：抑制EGF结合A431细胞表面上的EGFR的IC50值的汇总
实施例11：基于细胞的测定法中的活化和信号传导活性
通过免疫印迹在DiFi结肠癌细胞中评估各种基于10Fn3的E/I结合物的靶标效果。将细胞以4x 105个细胞接种在每个25cm2烧瓶中，并于37℃在5％CO2中温育过夜。次日，开始处理，并将细胞再温育1.5至120小时不等的时间。然后，将细胞在HNTG(50mM Hepes，150mM NaCl，0.5％Triton-X-100，8％甘油，2mM Na3VO4，1.5mM MgCl2，1mM EDTA，含有蛋白酶抑制剂AEBSF、抑肽酶、亮肽素(leupeptin)、苯丁抑制素、胃蛋白酶抑制剂-A和E64)中裂解，并用BCA蛋白测定系统(Pierce，Waltham，MA)来定量总蛋白质。通过对20微克总蛋白质的SDS-PAGE分析，接着将蛋白质转移到硝酸纤维素，并用特异性抗体进行免疫印迹来检测总EGFR、总IGF1R和磷酸化状态的EGFR、MAP激酶蛋白ERK1/2同等型的水平。还用β-肌动蛋白来探查印迹以证明每个样品的相等上样量。
PEG化的基于10Fn3的E/I结合物E1-GS10-I1(SEQ ID NO：55)、E2-GS10-I1(SEQ ID NO：56)、和E3-GS10-I1(SEQ ID NO：53)在此测定法中表现降解EGFR的能力。另外，对于E3-GS10-I1(SEQ ID NO：53)，还观察到IGF1R的降解。PEG化结合物E2-GS10-I1对EGFR降解的影响显示于图10，对信号传导分子的其它影响亦然。另外，未PEG化型结合物E2-GS10-I1表现相似的EGFR降解(数据未显示)。图10显示了，对于PEG化结合物I1-GS10-E2，没有EGFR降解。下文表4汇总了E单体的各种特性。
表4.E单体特性的汇总。
实施例12：用裸鼠中培养的H292肿瘤异种移植物评估某些基于10Fn3的E/I结合物
在H292肿瘤异种移植物模型中评估PEG化的E/I结合物E2-GS10-I1和E3-GS10-I1及单克隆抗体帕尼单抗。对于体内模型，帕尼单抗作为市售药物获得，而E/I结合物如上文所描述的那样纯化。在动物中施用前，通过EGF刺激的pEGFR和IGF1刺激的pIGFR测定法测试每个末端在H292细胞中的功能性来验证所有E/I结合物的体外活性。在实验开始时，将E/I结合物在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释，并每项研究的持续时间内于2-4℃贮存。两种化合物均以500μl/inj/小鼠的总体积i.p.施用，并在施用前平衡至室温。
小鼠和肿瘤增殖。5-6周龄的雌性无胸腺(裸)小鼠获自Harlan Sprague-Dawley Co.(Indianapolis，IN).，隔离约3周后用于肿瘤增殖或药物功效测试。给动物提供无限制的水和食物。依照AAALAC和Bristol-Myers Squibb准则进行动物护理。通过在裸鼠中皮下(s.c)植入来增殖肿瘤。约每两周至四周发生肿瘤传代。
体内抗肿瘤测试。使用下式计算估计的肿瘤重量：肿瘤重量(mg)＝(W2*l)/2；其中w＝宽度，l＝长度(按mm计)。以％肿瘤生长抑制(TGI)评估抗肿瘤活性，其中认为大于50％的％TGI是有活性的。相对％肿瘤生长抑制以％TGI＝[(Ct-Tt)/(Ct-C0)]x 100计算，其中Ct＝对照小鼠在肿瘤植入后第t天时间的中值肿瘤重量，Tt＝经处理小鼠在时间t时的中值肿瘤重量，C0＝对照小鼠在时间0时的中值肿瘤重量。计算在1.5个肿瘤体积倍增时间后开始的多个时间点处的％TGI值，并且在可能的情况下，维持3个肿瘤体积倍增时间(TVDT)。其中，TVDT＝对照肿瘤达到目标大小的中值时间(天)-对照肿瘤达到目标大小一半的中值时间(天)。治愈小鼠的定义是在处理后超过10个TVDT评估时检不出肿瘤或肿瘤小于35mg的小鼠。产生最大治疗效果的化合物剂量称作最佳剂量(OD)。处理组(通常为8只小鼠)若具有超过一例可归因于药物毒性的死亡，则认为其接受了过量的毒性处理，其数据不在抗肿瘤活性的评估中使用。最大耐受剂量(MTD)定义为刚好在发生过量毒性(即超过一例死亡)的剂量水平之下的剂量水平。经处理的小鼠在其肿瘤达到目标大小前死亡的，认为其死于药物毒性。使用Gehan氏广义Wilcoxon检验(Gehan，EA，A Generalized Wilcoxon Test for Comparing Arbitrarily Slightly-Censored Samples，Biometrika 52：203-223，1965)来进行数据的统计学评估。
在肿瘤中测量药效学终点。从未处理的或经药物处理的小鼠收获肿瘤，并在液氮中速冻。将样品称重，并且将每mg组织用10μl裂解缓冲液(50mM  Hepes，150mM NaCl，0.5％triton-X-100，8％甘油，2mM Na3VO4，1.5mM MgCl2，1mM EDTA，其含有每15ml缓冲液一片完全迷你蛋白酶抑制剂片剂(complete mini protease inhibitor tablet)Sigma#S8820和磷酸酶抑制剂混合物#P5726)匀浆化。用两把手术刀将组织在100mm培养皿中切碎，转移到Falcon#2059聚丙烯圆底管，并用手持式匀浆器浸渍30秒。将匀浆转移到1.5ml eppendorf管，并在微量离心机中以15000x g离心2分钟。将澄清后的上清液转移到新管，并用Pierce BCA蛋白测定系统(Pierce Biotechnology)测定总蛋白质浓度。通过免疫印迹或在中尺度MSD Sector成像仪6000多点测定系统上按照制造商(Meso Scale Discovery，Gaithersburg，MD)的推荐方法分析样品。
在无胸腺小鼠中在H292NSCLC中测试PEG化的E/I结合物E2-GS10-I1和E3-GS10-I1。用1mm3H292肿瘤碎片在后体侧中皮下植入肿瘤，让其长到大小50-150mg，之后在肿瘤植入后第6天时启动处理。以100mg/kg的剂量按TIWX3日程表(TIWX3schedule)i.p.施用PEG化的E/I结合物以评估抗肿瘤活性。帕尼单抗作为市售药物获得，并以其最佳剂量1mg/小鼠及以更低的剂量0.1mg/小鼠按Q3DX5日程表(Q3DX5schedule)i.p.施用。图12A中显示了自8只小鼠的组计算的均值肿瘤大小。1mg/小鼠和0.1mg/小鼠剂量的帕尼单抗均有活性，％TGI值分别为101％和100％，而且这些数值与对照动物显著不同(p＝0.0002，表5)。PEG化的E2-GS10-I1也是显著有活性的，％TGI值为96％(p＝0.0005)。PEG化的E3-GS10-I1在此研究中没有活性，％TGI值为31％，与对照组没有显著差异(p＝0.416)。剂量给药后的分析指明，约三分之二的PEG化E3GS10-I1是聚集的(一个批次为66.64％聚集/33.36％单体，而对于另一个批次为72.53％聚集/27.47％单体)，这可以解释PEG化的E3-GS10-I1在此测定中的较差活性。比较而言，PEG化的E2-GS10-I1在剂量给药后研究中仅显示小百分比的聚集(1.79％聚集/98.21％单体)。
所有处理得到良好耐受，其中在研究过程里没有处理相关的死亡或过度重量减轻。临床观察结果揭示无毒性证据，而且治疗过程里的平均重量变化在可接受限度内(图12B)。
表5.H292人肿瘤异种移植物研究的结果
a媒介物是磷酸盐缓冲盐水。所使用的缩写如下：ip，腹膜内路径；％TGI，以％TGI＝[(Ct-Tt)/(Ct-C0)]x 100计算的相对％肿瘤生长抑制，其中Ct＝对照小鼠在肿瘤植入后第t日时的中值肿瘤重量，Tt＝经处理小鼠在时间t时的中值肿瘤重量，C0＝对照小鼠在时间0时的中值肿瘤重量。在第12天和第20天两个点计算％TGI值作为平均抑制。结果，若处理方案产生统计学显著的大于50％的％TGI值，则认为其是有活性的；q3dx5；6，在肿瘤植入后第6天时开始，每三天一次施用化合物共施用五剂；TIWx3；6，在肿瘤植入后第6天时开始，一周三次施用化合物共施用三周。第20天时，用两尾配对分析相对于对照组计算p值，每组8个测量值。结果以％TGI计，A＝活性，I＝无活性。
来自H292肿瘤研究的药效学终点。对来自未处理对照、经帕尼单抗和E/I结合物处理的组的肿瘤样品，分析磷酸化EGFR、ErbB2和IGFR的水平，这些水平可表明靶物阻抑的情况。还对肿瘤分析总EGFR水平以测定是否发生了EGF受体降解。在第20天时，给予最终处理，并在剂量给药后1小时自2只动物、剂量给药后4小时自3只动物和剂量给药后24小时自3只动物取出肿瘤。所有处理均显示对磷酸化EGFR和ErbB2的显著阻抑，而磷酸化IGFR的基础水平太低以致不能辨别此项研究中的差别(图13)。所有处理均显示EGFR总量的降低，指明已经发生了受体的降解。
实施例13：对IGF1R抑制剂有抗性的MCF7细胞的选择和表征
将MCF7细胞(美国典型培养物保藏中心，目录编号HTB-22，Manassas，VA)在含有10mM hepes和10％FBS的RPMI培养基中于37℃在存在5％CO2的情况中培养。将小分子IGF1R抑制剂BMS-754807添加至培养基，并在10个月的时段里逐步提高浓度，直至细胞在200mM BMS-754807的存在下展现出持续的增殖。将抗性细胞称作MCF7r，如前人描述(Carboni等，Cancer Res.69：161-170(2009))实施的增殖测定法测得的对于BMS-754807的IC50是1239nM，与之相比亲本MCF7细胞为120nM。然后，自培养基除去药物，并将MCF7r细胞在完全培养基中再传代20或60天以除去残留BMS-754807的所有痕迹。通过免疫印迹对MCF7r细胞的分析揭示，与亲本MCF7细胞相比， EGFR在抗性细胞中显著过表达(图14)。另外，在让MCF7和MCF7r细胞血清饥饿，然后用EGF刺激7分钟时，磷酸化EGFR在亲本MCF7细胞中检测不到(可能是由于EGFR的低水平)，但是在MCF7r细胞中强烈可见。在用IGF配体刺激的经血清饥饿的细胞中，在亲本MCF7细胞中看到磷酸化IGFR，但是尽管MCF7r细胞中存在的总IGFR的水平略高，几乎没有观察到pIGFR。这显示了，抗性MCF7r细胞中的IGFR丧失了响应IGF1刺激而活化IGFR的能力(图14)。如通过pERK活化所量度的，MAP激酶途径响应EGF刺激的活化在MCF7r细胞中更强。
实施例14：MCF7和MCF7r异种移植物中的抗肿瘤研究
将MCF7r细胞在T75烧瓶中扩增，并离心分离。通过用Vi-CELL XR(Beckman Coulter，Fullerton，CA)进行锥虫蓝排斥来测量活细胞数目，在PBS中重悬到5x 106个活细胞/ml，并以0.2ml体积在无胸腺小鼠的后体侧中皮下植入。对于MCF7和MCF7r肿瘤生长，给所有小鼠补充0.25mg 17-β-雌二醇的90天缓释丸(Innovative Research of America，Sarasota，FL，产品目录编号NE-121)。使肿瘤增殖，直至它们的中值大小达到500-1000mg，此时将它们切除，并将1mm3碎片再植入新的无胸腺小鼠的后体侧中。通过在小鼠中连续套针传代进行至少四轮生长来使肿瘤适应实体瘤生长，期间对每次传代监测肿瘤体积倍增时间和成活率(take rate))。观察生长特征以确定异种移植物是否表现出可接受的特性，用以充当可靠的、可再现的模型。MCF7r肿瘤类型表明可接受的成活率和倍增时间，因此满足用作异种移植物模型的标准。先前已经使用相同的技术建立了MCF7亲本肿瘤模型。对于MCF7亲本异种移植物，在后体侧中皮下植入1mm3肿瘤碎片，并容许生长至50-150mg的大小，之后在肿瘤植入后第13天时启动处理。西妥昔单抗作为市售药物获得，并按Q3DX5日程表(在第13天、第16天、第19天、第22天、第25天施用剂量)以其最佳剂量1mg/小鼠及以更低剂量0.1mg/小鼠i.p.施用。图15A中显示了自8只小鼠的组计算的均值肿瘤大小。在MCF7异种移植物模型中，1mg/小鼠或0.1mg/小鼠剂量的西妥昔单抗都是没有活性的，％TGI值分别为-9％和3.2％，而且肿瘤大小与对照组没有统计学差异(表6)。
对于MCF7r抗性异种移植物，在后体侧中皮下植入1mm3肿瘤碎片，并容许建立至50-150mg的大小，之后在肿瘤植入后第6天时启动处理。西妥昔单抗作为市售药物获得，并按Q3DX5日程表(在第6天、第9天、第12天、第 15天、第18天施用剂量)以其最佳剂量1mg/小鼠及以更低剂量0.1mg/小鼠i.p.施用。图15B中显示了自8只小鼠的组计算的均值肿瘤大小。在MCF7r异种移植物模型中，各剂量的西妥昔单抗是有活性的，％TGI值分别是105％和75％。高剂量的西妥昔单抗具有高于100％的TGI值，这表明其导致肿瘤消退到启动处理时的起始大小以下。与对照组相比这两种剂量都导致肿瘤大小的统计学显著差异(表7)。
表6.MCF7人乳腺癌肿瘤异种移植物的结果。
a媒介物是磷酸盐缓冲盐水。所使用的缩写如下：ip，腹膜内路径；％TGI，以％TGI＝[(Ct-Tt)/(Ct-C0)]x 100计算的相对％肿瘤生长抑制，其中Ct＝对照小鼠在肿瘤植入后第t天时间的中值肿瘤重量，Tt＝经处理小鼠在时间t时的中值肿瘤重量，C0＝对照小鼠在时间0时的中值肿瘤重量。在第20天、第24天和第27天三个点计算％TGI值作为平均抑制。结果，若处理方案产生统计学显著的大于50％的％TGI值，则认为其是有活性的；q3dx5；13，在肿瘤植入后第13天时开始，每三天一次施用化合物，共6剂。在第24天时通过双尾配对分析相对于对照组计算p值，每组8个测量值。根据％TGI的结果，A＝活性，而I＝无活性。
表7.MCF7r人乳腺癌肿瘤异种移植物研究的结果。
参见表6的脚注。在两尾配对分析中相对于对照组在第19天时计算p值，每组8个测量值。
实施例15：GEO异种移植物中的抗肿瘤研究
如下建立GEO肿瘤，：在无胸腺小鼠的后体侧中皮下植入1mm3肿瘤碎片，并容许它们达到50-150mg的大小，之后在肿瘤植入后第18天时启动处理。以0.25mg/小鼠按Q3DX5日程表(在第18天、第21天、第24天、第27天、第30天施用剂量)ip施用西妥昔单抗。以25mg/kg按QDX21日程表施用IGFR激酶抑制剂BMS-754807。图16中显示了自8只小鼠的组计算的均值肿瘤大小。西 妥昔单抗在0.25mg/小鼠是有活性的，％TGI值为67％。BMS-754807是有活性的，％TGI为80％，而二者的组合比任一者单独的活性大得多，％TGI为94％(表8)。所有处理组在第26天时均与对照组有统计学差异(表8)。
表8.GEO人结肠癌肿瘤异种移植物研究的结果。
a西妥昔单抗的媒介物是磷酸盐缓冲盐水。BMS-754807的媒介物是50％聚乙二醇400，50％水。所使用的缩写如表6中所描述的，协同性定义为比组合中任一药剂单独表现的活性更好的统计学显著活性。根据％TGI的结果，A＝活性，而I＝无活性。
实施例16：H292异种移植物中的抗肿瘤研究
将H292细胞以1mm3碎片的形式在无胸腺小鼠的后体侧中皮下植入，并容许其建立至50-150mg的大小，之后在肿瘤植入后第12天时启动处理。以0.1mg/小鼠按Q3DX5日程表ip施用西妥昔单抗。MAB391是一种针对IGF1R的抗体(R&D Systems，Minneapolis，MN，产品目录编号MAB391)，并以40mg/kg的剂量按BIWX3日程表施用。图17中显示了自8只小鼠的组计算的均值肿瘤大小。西妥昔单抗在0.1mg/小鼠是有活性的，％TGI值为95.1％，而MAB391在40mg/kg是无活性的，％TGI值为10.5％(表9)。给予西妥昔单抗和MAB391的组合的小鼠展现出109.2％的％TGI值，指明组合组中的肿瘤消退(表9)。剂量给药停止后，肿瘤在经西妥昔单抗处理的组中比在用西妥昔单抗和MAB391的组合处理的组中更快速地再生长(图17)。
表9.H292人NSCLC肿瘤异种移植物研究的结果。
a西妥昔单抗和MAB391的媒介物是磷酸盐缓冲盐水。所使用的缩写如表6和表8中所描述的。
实施例17：集落形成测定
为了测定测试化合物对抑制H292细胞集落形成的能力的影响，将400个细胞在完全培养基中接种入24孔板(Becton-Dickinson，Franklin Lakes，NJ，产品目录编号351143)中，并容许它们贴壁过夜。次日，除去培养基，并更换为含有2％FBS的培养基。将测试化合物稀释入含有2％FBS的培养基中，并以连续稀释物的形式加到细胞中。将细胞于37℃温育14天。14天后，弃去培养基，并用2ml PBS将孔漂洗一次。用0.5ml考马斯染料溶液(Bio-Rad，Hercules，CA，产品目录编号161-0436)将细胞染色20分钟。吸出染料，并用1X脱色溶液考马斯R-250(Bio-Rad，产品目录编号161-0438)将孔快速清洗。用每孔1ml水实施最终漂洗，将平板颠转，让其干燥。在低倍放大率(10X-20X)下用肉眼计数由(至少)50个或更多个细胞组成的集落。所有样品一式三份测试，并基于对照的百分比抑制的线性回归计算IC50值。在图18中显示PEG化E/I结合物的代表性结果，而在表10中显示了各种基于10Fn3的E/I结合物、基于10Fn3的IGF1R单特异性结合物、和EGFR抗体的IC50值。
表10.各种基于10Fn3的E/I结合物、基于IGF1R10Fn3的单特异性结合物、和EGFR抗体在集落形成测定法中的IC50值。
  样品   IC50(nM)
  E4-GS10-I1(具有Peg)   5
  I1-GS10-E5(具有Peg)   1
  I1-GS10-E4   6
  E2-GS10-I1(具有Peg)   560
  I1单体(具有Peg)   15,510
  帕尼单抗   140
实施例18：表位定位测定法
在依照多份文献报告大致了解了EGFR胞外域上的结合位点的情况下，开发了一种利用商品化抗体的表位定位测定法。表11中列出了此测定法中所使用的抗体，而图19A描绘了抗体如何定位于EGFR上的近似结合域。该测定法是先前所描述的细胞中Western测定法的变型，评估与A431或其它表达 EGFR的细胞一起预温育过的基于10Fn3的EGFR结合物阻断来自表11中所列的组的检测抗体的结合的能力。该测定法如下实施：通过胰蛋白酶处理收获对数期生长的A431细胞，并将其以24,000个细胞/孔、总体积100μl/孔接种在96孔板中。次日，倒出培养基，并将在冷的DMEM基础培养基中稀释过的基于10Fn3的EGFR结合物添加至平板，并容许于4℃结合1小时以阻止EGFR的内化。结合后，将细胞用0.2ml PBS+0.1％Tween-20清洗，并在PBS+3.7％甲醛中于室温固定20分钟。将细胞在0.2ml Odyssey封闭缓冲液中于室温封闭1小时。接着，将一抗稀释在每孔50μl Odyssey封闭剂中，并于室温温育1-2小时。通过倒转平板倒出一抗，并用200μl PBS+0.1％Tween-20将每孔清洗3X。二抗是细胞中Western测定法中所使用的相同抗体，而且适合于所检测的抗体的物种。将这些二抗在Odyssey封闭剂+0.2％Tween-20中稀释(1∶800)，并以每孔50μl的体积与以(1∶3000)稀释的TOPRO3(Invitrogen，Carlsbad，CA，产品目录编号T3605)一起添加，以复染细胞，用于标准化。将细胞在台上于室温温育1小时。倒出二抗，并用200μl PBS+0.1％Tween-20于室温将每孔清洗4X，持续5分钟。在Licor仪上以160μm分辨率、中等质量、3mm的焦距偏移、强度5对平板成像。还用市售药物抗体西妥昔单抗、帕尼单抗和尼妥珠单抗实施此测定法，以确定基于10Fn3的EGFR结合物是否干扰它们结合A431细胞上的EGFR。图19B中显示了代表性结果。
表11.针对EGFR胞外域的商品化抗体。
缩写：表位：表位构象特异性；线性：不依赖于构象的表位。aJBC 264(1989)17469 Ala351-Asp364， bJ Immunological Methods 287(2004)147，cMol Biol Medl(1983)511，d针对小鼠EGFR的一种肽激发产生的[FKGDSFTRTPPLDPRELEI(SEQ ID NO：491)]，eInt J Oncol 4(1994)277. f[EEKKVCQGTSNKLTQLGTFEDHFLSLQRMFNNCEVVLGNLEITYVQRNYDLSFLKTIQEVAGYVLIALNTVERIPLENLQIIRGNMYYENSYALAVLSNY(SEQ ID NO：492)]， gIle-Gln-Cys-Ala-His-Tyr-Ile-Asp-Gly-Pro-His-Cys(SEQ ID NO：493)(氨基酸580-591)。hCancer Cell7(2005)301。
我们已经使用多种方法确认了EGFR单体E3结合EGFR的域I。因为其它E单体在多个实验中具有相似的特性，认为其它E单体也结合EGFR的域I。
实施例19：I单体的特性
对可溶性基于纤连蛋白的支架蛋白的BIAcore分析
使用BIAcore 2000或3000生物传感器(Pharmacia Biosensor)来测量I单体结合靶物的动力学。利用IGF-IR-Fc融合物来开发捕捉测定法。Forbes等(Forbes等2002，European J.Biochemistry，269，961-968)已经描述了相似的试剂。将人IGF-IR的胞外域(aa 1-932)克隆入含有人IgG1的铰链和恒定区的哺乳动物表达载体中。质粒的瞬时转染生成融合蛋白IGF-IR-Fc，随后将其通过蛋白A层析来纯化，并通过胺偶联在Biasensor CM5芯片上固定化的蛋白A上捕获。动力学分析牵涉在蛋白A上捕获IGF-IR-Fc，接着注射溶液中的基于纤连蛋白的支架蛋白，并用甘氨酸pH 2.0再生蛋白A表面。在每个浓度获得传感图，并使用程序Biaevaluation，BIA Evaluation 2.0(BIAcore)来评估，以确定 速率常数ka(kon)和kd(koff)。自速率常数速率koff/kon计算解离常数KD。通常，对一系列浓度(2uM至0uM)的纯化的基于纤连蛋白的支架蛋白评估对蛋白A捕获的人IGF-IR-Fc融合蛋白的结合。
对于测定结合人胰岛素受体的实验，遵循Biacore(Uppsala，Sweden)推荐的标准规程通过胺基联接将重组人胰岛素受体(IR)和重组人VEGF-R2-Fc与CM5Biasensor芯片直接偶联。简言之，以8300个RU的水平将乙酸盐4.5中稀释的60ug/mL IR偶联/固定化，并以9700个RU的水平将乙酸5.0中稀释的11.9ug/mL VEGF-R2-Fc固定化于流动池2和3。在FC1上准备好空白参照表面。通过减去对空白参照流动池1观察到的结合来计算对IR或VEGF-R2-Fc的特异性结合。将基于纤连蛋白的支架蛋白在HBS-EP(10mM Hepes、150mMNaCl、3mM EDTA、0.05％表面活性剂P20)中稀释至10uM，并以20uL/分钟于25℃注射在流动池上历时3分钟，并观察10分钟时间内的解离。
基于细胞的受体阻断测定法
将人乳腺腺癌MCF-7(ATCC，Manassas，VA)以每孔50,000个细胞的浓度在含有10％胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)的RPMI 1640(Invitrogen，Carlsbad，CA)中在24孔板中分配。次日，在由含有0.1％BSA(Sigma，St.Louis，MO)的RPMI 1640组成的结合缓冲液中清洗细胞，然后在冰上在200μL含有IGF-IR竞争剂的结合缓冲液中预温育30分钟。预温育期后，将40pM[125I]-IGF-I(Perkin Elmer，Wellesley，MA)(等于每分钟约60000次计数)添加至每孔，并让其在温和搅动下在冰上再温育3小时。然后，用冰冷的含有0.1％BSA的PBS清洗孔。用500μk由0.1％SDS+0.5N NaOH组成的缓冲液将细胞裂解。使用Wallac 1470Gamma计数器(Perkin Elmer，Wellesley，MA)来测量溶胞物的放射性，并使用SigmaPlot(Systat Software，Point Richmond，CA)来分析数据。
pIGFR测定法
对与Fc融合的基于纤连蛋白的支架蛋白评估其在Rh41人横纹肌肉瘤细胞中抑制IGF-1R磷酸化的能力。采用Western印迹来评估I单体在Rh41人横纹肌肉瘤细胞中抑制IGF-1R磷酸化的能力。用IGF-I、IGF-II、胰岛素配体(50ng/ml)刺激细胞，或无刺激(NS)，然后用不同浓度的I单体处理。用磷酸特异性抗体探查膜。
Rh41(人横纹肌肉瘤和H929人多发性骨髓瘤)的细胞增殖 
依据暴露于试剂72小时后DNA中[3H]-胸苷的掺入来评估增殖。将Rh41 细胞以3500个细胞/孔的密度分配在96孔微量滴定板中，并在24小时后，将它们暴露于一定浓度范围的I单体。于37℃温育72小时后，将细胞用4μCi/ml[3H]胸苷(Amersham Pharmacia Biotech，UK)冲激3小时，胰蛋白酶处理、收获至UniFilter-96，GF/B plates(PerkinElmer，Boston，MA)上，并在TopCount NXT(Packard，CT)上测量闪烁。结果以IC50表示，所述IC50是与未处理对照细胞的细胞增殖相比将细胞增殖抑制50％所需要的药物浓度。数据表示一式三份孔的平均值，其中显示了标准偏差。
下文表12中显示了I单体的表征结果。
实施例20：单特异性和双特异性EGFR及基于10Fn3的IGF-IR结合物的其它特征
使用mRNA展示的生物化学选择技术(其中将蛋白质共价连接于其编码核酸序列)来鉴定结合EGFR或IGF-IR的基于10Fn3的结合物。将基于10Fn3的蛋白质-mRNA融合物群体克隆入大肠杆菌中，并以基于10Fn3的蛋白质表达，所述基于10Fn3的蛋白质-mRNA融合物群体可结合IGF-IR或EGFR(当这些受体以1-10nM的浓度提供时)。鉴定出阻断EGFR或IGF-IR信号传导，而且具有合适的生物物理特性的靶物结合物亚组(表13)。针对初始的各克隆，通过额外以越来越低的靶物浓度进行mRNA选择，及选择更低的解离速率常数，来在靶物结合亲和力和细胞效力方面加以优化。选择过程中获得的IC50值范围为9至304nM，这表明有机会可以从一大批效力数值中选择分子以构建基于 10Fn3的双特异性结合物。对基于10Fn3的EGFR结合物，通过细胞中Western筛选测定法来测试EGFR和ERK(即EGFR活化的一种下游信号传导分子)的磷酸化阻断(与实施例1相似的方法)。对经优化的IGF-IR结合物实施类似的研究。优化的EGFR结合克隆(E3、E1、和E2)在体外以范围为9至40nM的IC50值(比亲本EGFR克隆高超过100倍的效力)抑制Y1068上的EGFR磷酸化和p42/p44的Y204上的ERK下游磷酸化(表13，与实施例1相似的方法)。
I1以0.11nM的KD值结合IGF-IR，而且以0.2nM的IC50抑制IGF-I刺激的IGF-IR磷酸化(表13，与实施例6相似的方法)。基于大小排阻层析，优化的基 于10Fn3的IGF-IR和EGFR单域结合物大于95％为单体，具有大于56℃的熔解温度(表13，与实施例4相似的方法)，而且通过EpiMatrix预测表现出最小的免疫原性潜力(六个环中的五个为小于7)，所述EpiMatrix是一种基于矩阵用于T细胞表位定位算法(De Groot AS，Moise L(2007)Prediction of immunogenicity for therapeutic proteins：state of the art.Curr Opin Drug Discovery Devel10：332-340)。选择基于10Fn3的结合物E1、E2、和E3以进行进一步开发，它们通过Biacore测定法测定具有范围为0.7至10nM的EGFR结合常数(表13，与实施例5相似的方法)。这些基于10Fn3的结合物的EGFR结合竞争EGF对EGFR的结合(表13)，如通过使用铕标记的EGF进行的置换测定法所测量的(与实施例10相似的方法)。类似地，IGF-I对IGF-IR的结合被I1抑制(表13，与实施例19相似的方法)。
基于10Fn3的双特异性结合物的生物物理表征。选定的基于10Fn3的E/I结合物的Tm值范围为49-58℃，而其SEC谱指明蛋白质大于90％为单体(表14，与实施例4相似的方法)。单特异性的基于10Fn3的结合物和基于10Fn3的E/I结合物显示相当的结合亲和力，尽管当将所述基于10Fn3的单域结合物连接在一起时Tm值略微降低(表13和表14)。为了延长血清半衰期以进行体内应用，用40kDa分枝PEG对基于10Fn3的E/I结合物进行PEG化(与实施例3相似的方法)。基于10Fn3的E/I结合物的PEG化由于结合速率常数降低而导致相对于未PEG化的构建体结合亲和力降低10至20倍，但不降低Tm。此外，PEG化未显著降低对细胞中EGFR/IGF-IR磷酸化的抑制。根据ELISA，与I-E取向相比，PEG化的E-I取向(其中EGFR结合物在N端，而IGF1R在C端)在抑制EGFR和IGF-IR磷酸化方面展现出略低的IC50值。虽然发现PEG化的E-I取向对I-E取向之间在KD值和生物学活性存在微小的差异，但是没有与之一致的趋势。
表13.与基于10Fn3的E/I结合物的构建有关的基于10Fn3的单特异性结合物的特性。
ND，未进行；NA，不适用；SEC，大小排阻层析。*通过细胞中Western测定法(ICW)来测定A431细胞中的EGFR和ERK磷酸化水平的IC50值。通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)来测定H292细胞中的EGFR和IGF-IR磷酸化水平。
**竞争IGF-IR结合。标准偏差来自3-6次实验。
表14.基于10Fn3的E/I结合物的特性。
Tm测量来自热扫描荧光测定法。KD值来自Biacore结合测定法，其使用吸附于芯片上的重组EGFR或IGF-IR域进行。进行细胞中Western测定法(ICW)以测定EI-串联物在A431细胞中抑制EGFR或ERK磷酸化的能力。使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)来测定EGFR或IGF-IR在H292细胞中的磷酸化。
实施例21：基于10Fn3的E/I结合物的物种交叉反应性
使用表面等离振子共振(BIAcore)分析(与实施例5相同的方法)分析PEG化的基于10Fn3的E/I结合物对来自小鼠、大鼠和猴的EGFR的结合亲和力。小鼠EGFR购自R&D Systems(Minneapolis，MN)，大鼠EGFR内部生成，而猴EGFR购自KEMP(Frederick，MD)。
如表15中所显示的，所有PEG化的基于10Fn3的E/I结合物以低纳摩尔亲和力(low nanomolar affinity)结合小鼠、大鼠和猴EGFR，表明所有PEG化的E/I结合物均与人、小鼠、大鼠和猴EGFR有交叉反应性。
表15
实施例22：其它基于10Fn3的E/I结合物的表征
图43汇总了其它基于10Fn3的E/I结合物的各种特征。
使用如先前实施例1中所描述的方法来测试PEG化的基于10Fn3的E/I结合物，以测定它们对A431中EGF诱导的EGFR和ERK磷酸化的抑制。结果表明，PEG化的基于10Fn3的E/I结合物以范围为12nM-297nM的IC50抑制EGF诱导的EGFR磷酸化，而以范围为12nM-295nM的IC50抑制ERK的磷酸化(图43，栏a和b)。
还使用先前在实施例6和7中所描述的方法来检查PEG化的基于10Fn3的E/I结合物在H292细胞中抑制IGFR和EGFR活性的能力。结果表明PEG化的基于10Fn3的E/I结合物以范围为0.2nM-6nM的IC50抑制IGFR活性(图43，栏d)，而以范围为1.3nM-123nM的IC50抑制EGFR活性(图43，栏c)。
测试PEG化的基于10Fn3的E/I结合物以确定它们是否能诱导Difi细胞中的EGFR和IGFR降解，如表16的栏e和f中所显示的。用1uM PEG化的基于 10Fn3的E/I结合物处理细胞，并在从7小时起到120小时止的多个时间点收获细胞，通过Western印迹分析来测定EGFR和IGF 1R的水平。降解的强度评分为(+)(其表明串联物降解了所述受体，但是降解没有得到维持，受体表达在时间过程期间再次出现)或(++)(其表明串联物降解受体，而且在整个时间过程中维持了所述降解)。结果(图43，栏e和f)表明PEG化的基于10Fn3的E/I结合物展示多种样式的EGFR和IGF1R降解；仅降解IGFR、降解EGFR和IGFR两者、或不降解任一受体。所测试的串联物没有展现仅降解EGFR的能力。
如先前在实施例5中所描述地通过表面等离振子共振(BIAcore)分析来评 估PEG化的基于10Fn3的E/I结合物对EGFR和IGF1R的结合亲和力。结果表明PEG化的基于10Fn3的E/I结合物以范围为3.35nM-57.9nM的亲和力结合EGFR，并以范围为0.37nM-2.43nM的亲和力结合IGF1R(图43，栏g和h)。
使用先前在实施例10中所描述的方法来测试PEG化的基于10Fn3的E/I结合物以测定其阻断EGF结合A431细胞表面上的EGFR的效力。PEG化的基于 10Fn3的E/I结合物以范围为19.5nM至238nM的IC50阻断EGF结合A431细胞(图43，栏i)。
使用实施例17中所描述的方法来对PEG化的基于10Fn3的E/I结合物评估其抑制H292细胞的集落形成的能力。如图43，栏j中所显示的，PEG化的基于10Fn3的E/I结合物以范围为1nM-560nM的IC50值抑制集落形成，并且所测试的四种PEG化的基于10Fn3的E/I结合物中有三种比抗EGFR单克隆抗体帕尼单抗的效力高23-140倍。第四种PEG化的基于10Fn3的E/I结合物比帕尼单抗的效力低4倍。PEG化的I1单体仅稍有抑制H292集落的活性，其IC50大于15uM；这是预料之中的，因为H292细胞生长主要是由EGFR信号传导而非IGF1R信号传导驱动的。
通过DSC(如先前在实施例4中所描述的)或热染料熔解法评估PEG化的基于10Fn3的E/I结合物的熔解温度。对于热染料熔解评估，将PEG化的基于 10Fn3的E/I结合物在50mM NaAc缓冲液pH 4.5中稀释至0.2mg/mL。向每个样品中掺入用1uL 200x Sypro Orange(DMSO缓冲液中)，使终浓度为0.5％染料。将每个样品加载到96孔盘中，并用5uL硅油包被。将盘以1,000RPM离心沉降，并加载到Bio-Rad CFX96系统上，并选择以下方法：25℃10分钟+读板25℃至95℃，0.5℃增量，15分钟+读板。用CFX软件进行数据分析以确定拐点。如图43，k栏中所显示的，所有PEG化的基于10Fn3的E/I结合物具有相似的Tm测量值，范围为49-62.5摄氏度。PEG化的基于10Fn3的E/I结合物的Tm测量值不依赖于浓度，而且在所测试的所有浓度保持一致。对例示性结合物PEG化的I1-GS10-E5，DSC分析以在PBS中的1mg/ml蛋白质浓度扫描范围15-95℃进行测量，结果测得Tm为55.2℃，如图20中所显示的。
对PEG化的基于10Fn3的E/I结合物进行大小排阻层析(SEC)，如先前在实施例4中所描述的。SEC分析揭示了，所有PEG化的基于10Fn3的E/I结合物都是大于95％单体的，如图43(表的栏l)中所显示的。
实施例23：具有选定的氨基酸变化的基于10Fn3的E/I结合物PEG化的 I1-GS10-E5的生物化学和生物物理特性
构建PEG化的I1-GS10-E5，其没有6HIS标签(SEQ ID NO：487)，并且还具有接头区的多处变化。另外，对所有构建体进行了一处全局性的改变，其中第一单体的C端尾部具有天冬氨酸变为谷氨酸的单点变化(D变化为E)。生成数种克隆，其中选定的丝氨酸残基突变为半胱氨酸(S突变为C)以提供备选的PEG化位点。比较这些变化对分子的生物化学和生物物理特性的影响，并在表17中汇总。用于测量对pEGFR的抑制的方法记载于实施例7，用于测量对pIGFR的抑制的方法记载于实施例6，用于测量对pERK的抑制的方法记载于实施例1，用于测量Tm的方法记载于实施例4，用于测量EGFR和IGFR KD的方法记载于实施例5。还对这些克隆实施了详细的结合动力学分析，并在表18和表19中给出(使用与实施例5中所描述的方法类似的方法进行)。
表17.
(1)没有对此构建体使用His标签。(2)对所有备选的PEG化的I1-GS10-E5的构建体进行一个全局变化，其中第一单体的C端尾部具有天冬氨酸变为谷氨酸(D变化为E)的单点变化。(3)用GSGC(SEQ ID NO：489)和GS8(SEQ ID NO：494)与E5连接的I1单体。(4)用GS10与E5连接的I1，GSGC(SEQ ID NO：489)在E5尾部。(5)用GS10与E5连接的I1，其中I1在第62位具有丝氨酸变为半胱氨酸的单点变化。(6)用GS10与E5连接的I1，其中E5在第62位具有丝氨酸变为半胱氨酸的单点变化。(7)用GS10与E5连接的I1，其中I1在第91位具有丝氨酸变为半胱氨酸的单点变化。(8)用GS10与E5连接的I1，其中E5在第91位具有丝氨酸变为半胱氨酸的单点变化。(9)此构建体表现对流动池的非特异性结合，因此亲和力的准确测定在此实验中是不可能的。
表18.经改变的PEG化I1-GS10-E5克隆对EGFR645-Fc的Biacore结合。
(1)没有对此构建体使用His标签。(2)对PEG化的I1-GS10-E5的所有备选构建体进行了一处全局变化，其中第一单体的C端尾部具有天冬氨酸变为谷氨酸的单点变化(D变化为E)。(3)用GSGC(SEQ ID NO：489)和GS8(SEQ ID NO：494)与E5连接的I1单体。(4)用GS10与E5连接的I1，GSGC(SEQ ID NO：489)在E5尾部。(5)用GS10与E5连接的I1，其中I1在第62位具有丝氨酸变为半胱氨酸的单点变化。(6)用GS10与E5连接的I1，其中E5在第62位具有丝氨酸变为半胱氨酸的单点变化。(7)用GS10与E5连接的I1，其中I1在第91位具有丝氨酸变为半胱氨酸的单点变化。(8)用GS10与E5连接的I1，其中E5在第91位具有丝氨酸变为半胱氨酸的单点变化。
表19.经改变的PEG化I1-GS10-E5克隆对IGF1R-Fc的Biacore结合。
(1)没有对此构建体使用His标签。(2)对PEG化的I1-GS10-E5的所有备选构建体进行一个全局性变化，其中第一单体的C端尾部具有天冬氨酸变为谷氨酸的单点变化(D变化为E)。(3)用GSGC(SEQ ID NO：489)和GS8(SEQ ID NO：494)与E5连接的I1单体。(4)用GS10与E5连接的I1，GSGC(SEQ ID NO：489)在E5的尾部。(5)用GS10与E5连接的I1，其中I1在第62位具有丝氨酸变为半胱氨酸的单点变化。(6)用GS10与E5连接的I1，其中E5在第62位具有丝氨酸变为半胱氨酸的单点变化。(7)用GS10与E5连接的I1，其中I1在第91位具有丝氨酸变为半胱氨酸的单点变化。(8)用GS10与E5连接的I1，其中E5在第91位具有丝氨酸变为半胱氨酸的单点变化。
实施例24：对EGFR和IGFR的共享下游信号传导途径的抑制
用与先前在实施例8中所描述的ELISA相同的pAKT ELISA来分析对下游信号传导途径的抑制。此研究的结果表明PEG化的I1-GS10-E5比单独的PEG化的I1在阻断H292细胞中IGF1刺激的AKT活化方面更有力。单独的PEG化的E5，即EGFR单特异性结合物未能高效地阻止IGF1刺激对AKT的活化(图21)。
实施例25：基于10Fn3的结合物和比较抗体对细胞增殖的抑制
进行H292和RH41细胞增殖实验，如实施例9中所描述的。基于10Fn3的 EGFR单特异性结合物，即PEG化的E5，以0.016μM的IC50值抑制H292细胞增殖。基于10Fn3的IGFR单特异性结合物，即PEG化的I1，具有大于8.4μM的IC50值，而基于10Fn3的E/I结合物，即PEG化的I1-GS10-E5，稍微更强，具有0.006μM的IC50值(图22)。H292细胞系是肺癌来源的，而且对IGFR和EGFR的抑制敏感((Akashi Y等(2008)Enhancement of the antitumor activity of ionising radiation by nimotuzumab，a humanised monoclonal antibody to the epidermal growth factor receptor，in non-small cell lung cancer cell lines of differing epidermal growth factor receptor status.Br.J.Cancer 98：749-755；及Buck E等(2008)Feedback mechanisms promote cooperativity for small molecule inhibitors of epidermal and insulin-like growth factor receptors.Cancer Res.68：8322-8332.))。比较而言，仅PEG化的I1-GS10-E5结合物和PEG化的I1结合物抑制了RH41细胞增殖(IC50值分别是0.0002和0.0004μM，图23)。这是预料之中的，因为RH41是一种小儿横纹肌肉瘤细胞系，已知其主要由IGFR信号传导驱动((Huang F等(2009).The mechanisms of differential sensitivity to an insulin-like growth factor-1receptor inhibitor(BMS-536924)and rationale for combining with EGFR/HER2 inhibitors.Cancer Res.69：161-170))，因此对EGFR阻断是不敏感的。
实施例26：通过PEG化的和未PEG化的基于10Fn3的结合物在体外抑制受体活化和下游信号传导
为了了解EGFR/IGFR信号传导的动力学及其受PEG化的I1-GS10-E5的抑制，让DiFi、H292或BxPC3细胞血清饥饿，暴露于1μM或0.1μM PEG化的E5、PEG化的I1、或PEG化的I1-GS10-E5，或者媒介物对照达2小时，然后用EGF、IGF-I、或EGF+IGF-I刺激10分钟。
将细胞在体外培养，血清饥饿过夜，然后暴露于基于10Fn3的结合物达2小时，之后用100ng/ml EGF或IGF刺激。将细胞溶胞物在裂解缓冲液(1％Triton X-100、5％甘油、0.15M NaCl、20mM Tris-HCl pH 7.6，完全蛋白酶抑制剂混合物片剂[Roche，Indianapolis，IN]和磷酸酶抑制剂混合物2[Sigma-Aldrich Corp.])中制备。将溶胞物(30μg)通过SDS-PAGE解析，转移至膜，并用针对磷酸-EGFR和总EGFR(Santa Cruz Biotechnology，Carlsbad，CA)、磷酸-AKT(Ser 473)、磷酸-p44/42MAPK(Thr202/Tyr204)(Cell Signaling Technology，Beverly，MA)、或总肌动蛋白(Chemicon International，Temecula， CA)的抗体来进行免疫印迹，印迹在含0.1％Tween 20的Odyssey封闭缓冲液(LI-COR Biosciences，Lincoln，NE)中进行。将膜与合适的二抗一起温育。使用LI-COR Biosciences Odyssey红外线成像系统来进行蛋白质显现。
如图24中所显示的，在血清剥夺后几乎检测不到磷酸化的EGFR、IGF-IR、和AKT的基础水平。在DiFi细胞中，PEG化的I1-GS10-E5或PEG化的E5(单特异性EGFR结合物)都不能完全阻抑EGF刺激的EGFR磷酸化。在H292和BxPC3细胞中，PEG化的I1-GS10-E5和PEG化的E5两者都强烈抑制EGFR磷酸化。在DiFi和BxPC3细胞中，PEG化的I1-GS10-E5对IGF刺激的IGFR磷酸化的阻断作用大于单独的PEG化的I1(单特异性IGFR结合物)。在H292细胞中，仅在EGFR被阻断时，IGF刺激才可交叉活化EGFR。PEG化的I1-GS10-E5在DiFi中抑制EGF刺激的pAKT；在EGF刺激的H292中增加pAKT，而在BxPC3EGF中不活化pAKT。在DiFi、H292和BxPC3细胞中，PEG化的I1-GS10-E5抑制IGF刺激的pIGFR的程度大于单独的PEG化的E5或PEG化的I1。PEG化的I1-GS10-E5在DiFi、H292或BxPC3中对EGF刺激的pERK具有非常少(若有的话)的影响。IGF刺激在所检查的任何细胞系中均不诱导pERK。
在另一项用未PEG化的基于10Fn3的结合物进行的实验中，让H292细胞血清饥饿，暴露于1μM未PEG化的单特异性EGFR结合物E2、IGFR结合物I1、或E2-GS10-I1、或媒介物对照达1小时，然后用EGF、IGF-I、或EGF+IGF-I刺激10分钟。在血清剥夺后磷酸化的EGFR、IGFR、和AKT的基础水平几乎检测不到(图25)。用EGF刺激诱导了EGFR磷酸化，但是未反式激活IGFR。EGFR磷酸化被E2和E2-GS10-I1，但不被I1所阻断。类似地，用IGF-I刺激诱导了强烈的IGFR磷酸化，其被I1和E2-GS10-I1，但不被E2阻断。EGF刺激仅略提高了AKT磷酸化，但是IGF-I或EGF+IGF-I强烈诱导了AKT磷酸化，其被I1和E2-GS 10-I1两者阻抑到基础水平。IGF-I和EGF的组合诱导AKT磷酸化的程度大于单独的任一生长因子。E2部分地降低了由EGF和IGF-I的组合诱导的pAKT。然而，I1显示了pAKT的最显著降低，提示了用EGF+IGF-I的刺激导致经由IGFR途径的强烈AKT磷酸化。令人惊讶地，利用E2阻断EGFR途径，接着用EGF配体刺激后，实际上提高了AKT的磷酸化，这可能是不依赖EGFR的AKT活化的结果((Dobashi Y等(2009)EGFR-dependent and independent activation of Akt/mTOR cascade in bone and soft tissue tumors.Mod Pathol (印 刷前电子公布))。这些结果例示了EGFR和IGFR途径之间的复杂串扰和反馈机制。
实施例27：用基于10Fn3的E/I结合物进行的竞争结合研究
对于Biacore竞争实验，使用标准的EDC/NHS酰胺偶联化学，将EGFR-Fc(乙酸钠pH 5.0中的3μg/mL)固定化于Biacore CM5芯片表面上至300个Ru的表面密度。作为市售药物获得EGFR抗体，并评估单特异性EGFR结合物E2与抗体之间对EGFR-Fc的结合的竞争，方法是结合450nM E2(30μL/分钟，200s接触时间)，然后马上结合450nM单独的E2，或450nM E2和450nM西妥昔单抗、帕尼单抗、或尼妥珠单抗的混合物(30μL/分钟，200秒接触时间)。在各循环之间用50mM NaOH以30μL/分钟的流速两次10秒脉冲来成功地再生表面。初始注射E2显示出对芯片表面上EGFR的结合。第二次注射与等量西妥昔单抗、帕尼单抗、或尼妥珠单抗混合的E2，没有显示出E2竞争抗体对EGFR的结合(图26A)。
利用表面等离振子共振(BIAcore)分析来显示基于10Fn3的E/I结合物同时接合(engagement)被捕获的EGFR-Fc和溶液相IGF 1R。重组人EGFR-Fc(与人Fc融合的人EGFR的胞外域的aa 1-645)购自R&D Systems(Minneapolis，MN)。重组IGF1R(蛋白水解切割并进行二硫化物连接的人IGF1R前肽的aa 1-932)购自R&D Systems(Minneapolis，MN)。为了证明同时接合，遵循制造商的推荐(GE Healthcare，Piscataway，NJ)将抗人IgG固定化于CM5芯片的流动池1和2上。在流动池2上以10uL/分钟2分钟捕捉EGFR-Fc(50nM)。通过以10uL/分钟在这两个流动池上注射基于10Fn3的蛋白质样品(100nM)2分钟来实现基于 10Fn3的E/I结合物对EGFR-Fc的结合。通过随后以30uL/分钟在这两个流动池上注射IGF 1R(0，100nM)2分钟来探查EGFR-Fc和IGF 1R的同时接合。监测复合物的解离，历时300秒。使用3M MgCl2的两次30秒注射来从抗人IgG表面再生结合的复合物。利用Biacore T100评估软件，第2.0.1版(GEhealthcare/Biacore)来重叠各传感图，并除去空气峰刺(airspikes)。如图26B中所显示的，基于10Fn3的E/I结合物的这两个域都是功能性的，而且能够同时结合EGFR-Fc和IGF1R。
通过Biacore来评估PEG化的E2-GS10-I1对HER家族受体的结合特异性，如实施例5中所描述的。在CM5芯片表面上用抗人IgG捕捉HER-2-Fc、HER-3-Fc和HER-4-Fc(R&D Systems)。PEG化的E2-GS10-I1在对EGFR-Fc (HER-1)出现强烈结合的条件下，没有显示对其它HER家族成员的任何可辨别的结合(表20)。
表20.PEG化的E2-GS10-I1对HER家族受体的胞外域的结合亲和力。
名称               EGFR-Fc       HER-2-Fc      HER-3-Fc      HER-4-Fc 
                    KD，nM*      KD，nM        KD，nM        KD，nM
PEG化的E2-GS10-I1   10.1         ＞1000        ＞1000        ＞1000
实施例28：血浆生物标志的测量
测量在异种移植物研究结束时的小鼠血浆中、或不荷瘤小鼠中在处理后的不同时间的可溶性生物标志TGF α和mIGF1的水平。通过末端心脏穿刺将血液取入含有抗凝血剂EDTA的管中。于4℃以1300xg将血液离心10分钟，并将澄清后的上清液取到另外的管中，来制备血浆。用ELISA测定系统按照制造商的推荐(R&D Systems，Minneapolis，MN)在0.1ml血浆中测量TGF α水平，在0.02ml血浆中测量mIGF1水平。在用PEG化的I1-GS10-E5或单特异性EGFR结合物PEG化的E5处理的小鼠中TGF α的血浆水平升高，而用西妥昔单抗处理的小鼠则不然(图27A-C)。TGF α可能是自人肿瘤分泌的，或者可能是内源小鼠TGF α。由于人与小鼠TGF α之间的高同源性(93％氨基酸同一性)，ELISA可能与小鼠TGFα起交叉反应。此外，由植入的肿瘤分泌的人TGF α可能结合小鼠EGFR。由于PEG化的I1-GS10-E5和PEG化的E5能结合人和小鼠EGFR两者，所有宿主和肿瘤EGFR结合位点均被这些基于10Fn3的结合物封闭，而西妥昔单抗不结合小鼠EGFR。为了测定这些基于10Fn3的结合物是否引起内源小鼠TGF α的升高及ELISA是否与小鼠TGF α起交叉反应，以100mg/kg用PEG化的I1-GS10-E5对不荷瘤的裸鼠给药，并在给药后4、24、48、74小时采集血浆样品。实际上观察到小鼠TGF α的增加，持续到72小时后(图28A)。还用小鼠特异性ELISA对来自不含肿瘤的小鼠的血浆样品测试mIGF1，也观察到此配体的增加(图28B)。
实施例29：各种基于10Fn3的E/I结合物的体内人肿瘤异种移植物研究的结果
在一项头对头(head to head)H292NSCLC研究(实施例12中所描述的方法)中，以比先前所使用的剂量更低的剂量评估数种基于10Fn3的E/I结合物，以便确定相对活性的差异。将单个0.625mg/小鼠剂量的基于10Fn3的E/I结合物PEG化的E2-GS10-I1、PEG化的E4-GS10-I1、PEG化的I1-GS10-E5、PEG化的I1-GS10-E85、PEG化的I1-GS10-E4、PEG化的I1-GS10-E105与两个剂量的 (1mg/小鼠和0.1mg/小鼠)帕尼单抗进行比较。
按照肿瘤生长抑制(TGI)终点，此研究中评估的这两剂帕尼单抗和所有基于10Fn3的E/I结合物都是有活性的。在给药期中，PEG化的E4-GS10-I1、PEG化的I1-GS10-E5、PEG化的I1-GS10-E4和帕尼单抗均引起肿瘤消退(表21，TGI值大于100％)，而PEG化的E2-GS10-I1、PEG化的I1-GS10-E85和PEG化的I1-GS10-E105引起肿瘤生长抑制(表21，TGI值最高达100％)。与对照组相比，活性的差异是统计学显著的。所有处理耐受良好，在整个研究过程里没有与处理相关的死亡或过度体重减轻。基于10Fn3的E/I结合物和帕尼单抗的功效比较呈现于下文表21及图29中。在图29A中，到第43天的测量值显示了给药停止后肿瘤再生的样式。图29B显示了到第27天的测量值，并且放大y-轴以显示处理组间的相对活性差异。
表21.H292NSCLC研究中的体内抗肿瘤活性
a媒介物是磷酸盐缓冲盐水。所使用的缩写如下：ip，腹膜内路径；％TGI，以％TGI＝[(Ct-Tt)/(Ct-C0)]x 100计算的相对％肿瘤生长抑制，其中Ct＝对照小鼠在肿瘤植入后第t天时间的中值肿瘤重量，Tt＝经处理小鼠在时间t时的中值肿瘤重量，C0＝对照小鼠在时间0时的中值肿瘤重量。在第20天、第24天和第27天的两个点计算％TGI值作为平均抑制。结果，若处理方案产生统计学显著的大于50％的％TGI值，则认为其是有活性的；q3dx5；6，在肿瘤植入后第6天时开始，每三天一次施用化合物共六剂；6开启/1关闭；6，一天一次施用化合物6天，然后不处理1天，并且此方案在肿瘤植入后第6天时开始。在两尾配对分析中相对于对照组在第20天时计算p值，每组8个测量值。
使用实施例12中所描述的方法在多个异种移植物模型中用下述选定的 基于10Fn3的E/I结合物实施进一步的体内研究。多个异种移植物模型的描述如下：H292是一种非小细胞肺癌(NSCLC)，并且更为详细地记载于实施例12；MCF7r乳腺癌记载于实施例14；而GEO结肠癌记载于实施例15。DiFi人结肠癌表达高水平的活化的EGFR，而且还表达IGFR；RH41是一种小儿横纹肌肉瘤细胞系，已知其主要由IGFR信号传导驱动((Huang F等(2009).The mechanisms of differential sensitivity to an insulin-like growth factor-1 receptor inhibitor(BMS-536924)and rationale for combining with EGFR/HER2inhibitors.Cancer Res.69：161-170))，并且因此对EGFR阻断是不敏感的；Cal27是一种人头颈癌，其表达高水平的EGFR和中等水平的IGFR；BxPC3是一种人胰腺癌；H441是一种NSCLC。
表22中呈现了选定的基于10Fn3的E/I结合物的功效比较。在这些功效研究中，所有基于10Fn3的E/I结合物均显示与帕尼单抗相等的活性，而且所有处理都能够使H292肿瘤消退到其起始大小以下，其表现为高于100％的％TGI值。在DiFi研究中，帕尼单抗在1mg/小鼠的剂量使肿瘤消退，而且在0.1mg/小鼠的剂量是有活性的，而所有基于10Fn3的E/I结合物均无活性，尽管PEG化的I1-GS10-E5显示了对肿瘤生长的一些抑制(TGI＝43.8％)。在RH41研究中，帕尼单抗在任一剂量都没有活性，PEG化的E2构建体没有活性，而基于 10Fn3的E/I结合物和PEG化的I1构建体都是有活性的。图32显示了代表性构建体PEG化的E2-GS10-I1在RH41模型中的抗肿瘤功效(数据也显示于表23中)。在Cal27研究中，帕尼单抗在1mg/小鼠的剂量使肿瘤消退，而且在0.1mg/小鼠剂量有活性，但是在基于10Fn3的E/I结合物中，仅PEG化的I1-GS10-E5E/I 10Fn3构建体有活性。
表23中呈现了设计用于评估协同性的用PEG化的I1-GS10-E5和单独的I1和E5构件进行的人肿瘤异种移植物研究的结果。这些组合(协同性)研究的设计使得基于10Fn3的E/I结合物的个别部分(即IGFR和EGFR单特异性PEG化型)被包含在内，以便能够辨别出除分离末端的贡献之外的抗肿瘤效果。在MCF7r研究中，PEG化的I1没有活性，而PEG化的E5(PEG化的E5+PEG化的I1)和PEG化的I1-GS10-E5克隆均有活性，而且展现出相似的活性，这意味着所有抗肿瘤活性很可能都来自对EGFR的抑制；而且阻断IGFR途径没有提供任何增强作用。西妥昔单抗在1mg/小鼠剂量使肿瘤消退，在0.1mg/小鼠剂量没有活性。BMS-754807也没有活性，表明用小分子抑制剂阻断IGFR途径在 此模型中不产生功效。
在BxPC3研究中，PEG化的I1没有活性，而PEG化的E5和(PEG化的E5+PEG化的I1)克隆有活性(TGI分别等于61.2％和68.8％)。PEG化的I1-GS10-E5克隆比构成它的各个部分更有活性(TGI＝78％)，而且根据两尾配对t检验该差异是统计学显著的，显示了它在此模型中具有协同活性。西妥昔单抗在所研究的所有剂量都有活性，但是通过将其与PEG化的I1组合来添加IGFR抑制没有产生协同性。
在GEO研究中，PEG化的I1没有活性，而PEG化的E5和(PEG化的E5+PEG化的I1)和PEG化的I1-GS10-E5克隆有活性(TGI分别等于83.5％、92.1和92.1％)。虽然通过在此模型中将EGFR和IGFR抑制组合在一起可能提供了一些增强作用，但是该差异并不显著好于单独的PEG化的E5。西妥昔单抗在所研究的这两种剂量都是有活性的，但是通过将其与PEG化的I1组合来添加IGFR抑制没有产生协同性。
在H441研究中，PEG化的I1和PEG化的E5单独没有活性，但是(PEG化的E5+PEG化的I1)有活性(TGI＝54.5％)。PEG化的I1-GS10-E5克隆比构成它的各个个别部分更有活性(TGI＝69.2％)，但是差异并不统计学显著，显示了它在此模型中提供了增强的活性，但非协同性。西妥昔单抗在1mg/小鼠剂量有活性，而在0.1mg/小鼠剂量没有活性。通过将其与PEG化的I1组合来添加IGFR抑制在此模型中没有产生任何增强。
实施例30：各种基于10Fn3的E/I结合物在小鼠中的药动学谱
经由腹膜内注射在小鼠中评估PEG化的基于10Fn3的E/I结合物E2-GS10-I1的药动学谱。每个剂量组的三只裸鼠以10和100mg/kg ip给药PBS中配制的E2-GS10-I1，并在给药前、给药后0.5、2、4、8、12、24、48、72、96、144、和168小时将血浆样品收集于柠檬酸盐磷酸盐右旋糖溶液中。使用一种定量电化学发光(ECL)测定法来评估血浆样品的PEG化的E2-GS10-I1基于Fn3的结合物水平，所述ECL测定法是被开发用于检测并定量血浆样品中的PEG化的基于10Fn3的E/I结合物的。在此测定法中，将对EGFR结合区具有特异性的小鼠单克隆抗体4℃吸附于Meso Scale Discovery板过夜，以容许捕获血浆样品中的PEG化的基于10Fn3的E/I结合物。将血浆样品添加至平板，并于22℃温育1小时。通过对基于10Fn3的E/I结合物的支架区特异性的兔多克隆抗体来检测捕获的PEG化的基于10Fn3的E/I结合物，所述兔多克隆抗体与连接有SULFO-TAG的山羊抗兔抗体混合在一起。清洗以除去未结合的SULFO-TAG试剂后，添加读取缓冲液，并使用ECL检测。根据与PEG化的E2-GS10-I1基于Fn3的结合物的标准曲线的4参数拟合的比较来计算血浆样品中的PEG化的E2-GS10-I1的水平。
腹膜间(ip)施用10或100mg/kg PEG化的E2-GS10-I1的小鼠分别产生约200和1700μg/mL的峰水平，这表现出剂量比例的药动学(图30)。以与下段中所描述的方式相似的方式计算图30的药动学参数(注意“T 1/2”与“HL_lambda_z”可互换，而AUC与“AUCINF_obs”可互换)。PEG化的E2-GS10-I1在小鼠中的半衰期是15.75±1.52小时(图30)。基于这些药动学参数，在人肿瘤异种移植物研究中每周三次(TIW)施用100mg/kg能够维持比体外IC50值高10至100倍的药物水平。
对数种PEG化的基于10Fn3的E/I结合物进行其它药动学实验，其中对小鼠腹膜间(ip)施用10或100mg/kg，对于PEG化的I1-GS10-E5则皮下(sc)施用10或64mg/kg，如上文所描述地那样收集血浆并分析以测量PEG化的基于10Fn3的E/I结合物的水平。通过对血浆(血清)浓度对时间数据的非隔室分析来获得这多种基于10Fn3的E/I结合物的药动学参数。使用WinNonlin软件(第5.1版，Pharsight Corp.Mountain View CA)来计算终末半衰期(HL_lambda_z)、最大观察浓度(Cmax)、从时间0外推到无穷大的曲线下面积(AUCINF_obs)、清除 (CL_F_obs)、基于末期的分布体积(Vz_F_obs)和外推到无穷大的均值停留时间(MRTINF_obs)。结果显示了PEG化的基于10Fn3的E/I结合物的半衰期在12.1-20.9小时之间，如图44和图31中所显示的。
实施例31：药效学
在研究结束时自表22中所描述的H292和DiFi异种移植物模型采集样品，并如实施例12中的“在肿瘤中测量药效学终点”下所概述的那样进行处理以分析EGFR和IGFR蛋白质的总体水平及磷酸化EGFR和IGFR。通过免疫印迹来评估PEG化的I1-GS10-E5和帕尼单抗的目标效果，如实施例11中所描述的。在图33A中，在DiFi异种移植物模型结束时，总EGFR、pEGFR和总IGFR的水平在经PEG化的I1-GS10-E5处理的肿瘤中比在未处理的肿瘤中低。在图33B中，pEGFR的水平在用帕尼单抗和PEG化的I1-GS10-E5处理的肿瘤中更低。总EGFR水平仅在经PEG化的I1-GS10-E5处理的肿瘤中、而非在经帕尼单抗处理的肿瘤中更低。总IGFR水平在这两个经PEG化的I1-GS10-E5处理的肿瘤中均更低，在一个经帕尼单抗处理的肿瘤更低，但在另一个中则不然。这些模型中的pIGFR量太低以致于不能检测处理后的差异。用GAPDH探查免疫印迹以证明蛋白质的相等加载量。
实施例32：基于10Fn3的EGFR结合物优化和共有序列分析
基于10Fn3的结合物679F09(如记载于PCT WO 2009/102421的)(图34)鉴定为对EGFR胞外域-Fc融合蛋白(R&D Systems)的结合物。使用经EGFR-Fc包被的珠子以及与其核酸编码序列偶联的基于10Fn3的结合物来选择结合活性(参见例如Xu等，Directed Evolution of High-Affinity Antibody Mimics Using MRNA Display，Chem.Biol.9：933-942(2002))。还鉴定了亲本EGFR结合物679F09的更有力的变体，它们在BC、DE和FG环中具有氨基酸序列的变化。
序列分析I：对所有基于10Fn3的结合物选择对EGFR的高亲和力结合
为了揭示限定对EGFR的强亲和力的序列样式，使用数种方法来分析所有独特的EGFR结合序列(1044)。首先，通过环中每个位置的氨基酸的频率来分析序列(图35-38)。仅分析对于每个环而言独特的序列。
通过上述序列分析，确定了下列广义的序列基序：
序列基序#1
(a)BC环：第7位-第8位(即与SEQ ID NO：1的第29位和第30位对应)中的 “YQ”
(b)DE环：第3位(即与SEQ ID NO：1的第54位对应)中的脂肪族残基(“V/I/L/M/A”)
(c)FG环：第1位(即与SEQ ID NO：1的第77位对应)中的“D/N”
除了一个外，所分析的所有1044个序列的FG环均遵循序列样式(c)。所分析的所有独特的序列中，90％的BC环遵循样式(a)，而95％的DE环遵循样式(b)。除了四个外，所分析的所有序列遵循上述三种样式中的至少两种。另外，15个氨基酸的FG环长度是一个值得注意的序列特征。
除了上文限定的广义序列基序#1外，使用图35-38中的数据基于每个位置上占优势的残基来限定第二序列基序。若前3个最频繁出现的氨基酸的总和具有大于50％的频率，则将残基包含在此基序中。
序列基序#2
(a)BC环：XXXXXXYQ(与基序#1相同)，其中X是任何氨基酸 
(b)DE环：(G/Y/H)(D/M/G)(V/L/I)X，其中X是任何氨基酸
(c)FG环，10个氨基酸的长度：(D/N)(Y/M)(Y/A/M)(Y/H/F)(K/Q/V)(E/P/R)(Y/T/K)X(E/Y/Q)(Y/G/H)，其中X是任何氨基酸
(d)FG环，15个氨基酸的长度：D(Y/F/W)(Y/F/K)(N/D/P)(P/H/L)(A/T/V)(T/D/S)(H/Y/G)(E/P/V)(Y/H)(T/K/I)(Y/F)(H/N/Q)(T/Q/E)(T/S/I) 
用于限定序列基序#1和#2的分析方法分别评估环内的每个残基位置。为了揭示跨越环内的多个残基的任何序列基序，将基于10Fn3的结合物进行进一步分析。在此分析中，使用ClustalW(Thompson JD等CLUSTAL W：improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting，position-specific gap penalties and weight matrix choice.Nucleic Acids Research 22：4673-4680，1994)来比对环序列。通过此比对，使用手工检查来将序列家族分组。对于BC和DE环，观察到与序列基序#1和#2相似的序列样式。然而，对于长10和15个氨基酸的FG环，可以确定出其它序列基序。
序列基序#3
(a)FG环，10个氨基酸的长度
(1)DY(A/Y)GKPYXEY(SEQ ID NO：473)，其中X是任何氨基酸
(2)DY(A/Y)Y(K/R/Q/T)PYXEY(SEQ ID NO：474)，其中X是任何氨基酸
(3)(D/N)Y(A/Y)(Y/F)(K/R/Q/T)EYXE(Y/H)(SEQ ID NO：475)，其中X是任何氨基酸
(4)DYY(H/Y)X(R/K)X(E/T)YX(SEQ ID NO：476)，其中X是任何氨基酸
(5)DYY(H/Y)(K/H/Q)(R/K)T(E/T)Y(G/P)(SEQ ID NO：477)
(6)(D/N)MMHV(E/D)YXEY(SEQ ID NO：478)，其中X是任何氨基酸
(7)DYMHXXYXEY(SEQ ID NO：479)(如679F09的FG环)，其中X是任何氨基酸
(8)D(M/Y)YHX(K/R)X(V/I/L/M)YG  (SEQ ID NO：480)，其中X是任何氨基酸
(b)FG环，15个氨基酸的长度
(1)D(Y/F)(Y/F)NPXTHEYXYXXX(SEQ ID NO：481)，其中X是任何氨基酸
(2)D(Y/F)(Y/F)D(P/L)X(T/S)HXYXYXXX(SEQ ID NO：482)，其中X是任何氨基酸
(3)D(Y/F)(K/R)PHXDGPH(T/I)YXE(S/Y)(SEQ ID NO：483)，其中X是任何氨基酸
序列分析II：显示对EGFR磷酸化的更有力抑制的基于10Fn3的结合物
另一项全面序列分析针对基于10Fn3的结合物的在基于细胞的测定法中显示最强活性的亚组进行(这与序列分析I形成对比，序列分析I是针对所有经Profusion选择的对EGFR有高亲和力结合的结合物进行的)。因为许多结合物仅进行了基于细胞的单点测定(single-point cell-based assays)，所以此分析中包括了在固定浓度100nM显示对EGFR磷酸化的大于75％抑制的结合物。给定浓度的百分比抑制与IC50根据下式关联：％抑制＝100x浓度/(浓度+IC50)，。
通常，通过拟合在多个浓度的％抑制数据来计算IC50。然而，考虑到每个结合物仅单个数据点可用，使用此单个数据点来计算IC50是不适当的。因此，使用在单个浓度点的EGFR信号传导的百分比抑制作为结合物功效的近似值。虽然结合物在100nM的浓度可以显示75％抑制，但是提高浓度会容许克隆在更高的浓度显示100％抑制。％抑制与IC50呈负相关；即％抑制越高，IC50越低且结合物越强。若结合物在100nM的浓度显示75％抑制，则我们认为它是为序列分析II的目的的“强的”结合物。然而，在100nM浓度显示小 于75％抑制的结合物大体上仍结合EGFR，而且对EGFR信号传导仍具有影响。例如，抗EGFR单克隆抗体尼妥珠单抗(Friedlander E等，ErbB-directed immunotherapy：antibodies in current practice and promising new agents.Immunol Lett 116：126-140，2008)目前正开发为治疗剂，但是它在EGFR磷酸化测定法中在100nM浓度显示小于5％抑制(数据未显示)。图45中显示了测定的所有“强的”结合物的序列及其在100nM浓度对EGFR磷酸化的％抑制。
在100nM浓度显示大于75％抑制的独特的基于10Fn3的结合物的总数是111个。如前述，首先通过环中每个位置上的氨基酸的频率来分析这些序列(图39-42)。因为这些结合物是Profusion中根据对EGFR的高亲和力结合所选择的所有结合物中的一个亚组，它们也遵循序列基序#1(参见上文)。分析的所有“强”序列均遵循FG环序列样式(第1位中的“D/N”)。分析的所有独特的“有力的”序列中，93％遵循BC环的样式(第7位-第8位中的“YQ”)，而98％遵循DE环的样式(第3位的脂肪族残基(“V/I/L/M/A”))。分析的所有“强”序列遵循序列基序#1的三种样式中的至少两种。
值得注意的是，15个氨基酸的FG环长度在最“强”结合物中似乎也被高度呈现。虽然长15个氨基酸的FG环仅占根据对EGFR的高亲和力结合选择的所有结合物(序列分析I)的55％，但是15个氨基酸的FG环占在100nM浓度对EGFR磷酸化具有大于50％抑制的结合物的86％，且占具有大于75％抑制的结合物(序列分析II中的“强”结合物)的91％。因此，较长的15个氨基酸的FG环似乎是与较高的功效相关的序列样式。
在分析的111种“强”序列中，仅10种含有长10个氨基酸的FG环，而其中的6种是独特的。因此，一个序列基序可以涵盖每个“强”的10个氨基酸的FG环序列。基于这6个序列限定序列基序#4。
序列基序#4
FG环，10个氨基酸的长度，“强”结合物
(D/N)(M/Y)(M/A/W)(H/F/Y)(V/K)EY(A/Q/R/S/T)E(Y/H/D)
对具有15个氨基酸的FG环的“强”结合物的序列分析还进一步阐明了哪些残基位置是最保守的，由此得以确定了序列基序#5。在此序列基序中的“X”表示没有三个占优势的氨基酸的位置。
序列基序#5
FG环，15个氨基酸的长度，“强”结合物
D(Y/F/W)(Y/F/K)(N/P/D)(P/H/L)X(T/D/S)(H/G/Y)(E/P/Y)(Y/H)XYXXX，其中X是任何氨基酸
分析的所有EGFR结合物是亲本679F09的后代，而且构成一个序列“家族”，即它们在序列上都是相关性，符合前述的序列基序。679F09结合物家族的各个成员可以耐受T51I支架突变，并保留结合活性。因此，T51I支架突变可以与任何前述序列基序组合，以也产生对EGFR具有高亲和力结合的结合物。
最后，应当注意到，经常可以将具有相似特性的氨基酸替代入蛋白质序列中，而对结构或功能影响很小或没有影响。实际上，基于10Fn3的结合物也是如此，其中环或支架区中的保守氨基酸替代仍可以产生结合EGFR的结合物。例如，在结合物E98的FG环的第二位中用“Y”替换“H”产生结合物E99，而且这两种结合物在抑制EGFR磷酸化方面都显示相似的效力(图45)。

Claims (16)

1.一种抗体样蛋白质二聚体，其组成为：以小于500nM的KD结合IGF-IR的10Fn3，其经由接头与以小于500nM的KD结合EGFR的10Fn3连接；其中：
IGF-IR结合性10Fn3包含由SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列组成的BC环、由SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列组成的DE环、和由SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列组成的FG环；
EGFR结合性10Fn3包含由SEQ ID NO:115所示的氨基酸序列组成的BC环、由SEQ ID NO:116所示的氨基酸序列组成的DE环、和由SEQ ID NO:117所示的氨基酸序列组成的FG环。
2.权利要求1的抗体样蛋白质二聚体，其中：
所述IGF-IR结合性10Fn3由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成，而所述EGFR结合性10Fn3由SEQ ID NO:112所示的氨基酸序列组成。
3.权利要求1的抗体样蛋白质二聚体，其中所述IGF-IR结合性10Fn3经由多肽接头或聚乙二醇模块与所述EGFR结合性10Fn3共价连接。
4.权利要求2的抗体样蛋白质二聚体，其中所述IGF-IR结合性10Fn3经由多肽接头或聚乙二醇模块与所述EGFR结合性10Fn3共价连接。
5.权利要求3的抗体样蛋白质二聚体，其中所述多肽接头由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成。
6.权利要求4的抗体样蛋白质二聚体，其中所述多肽接头由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成。
7.抗体样蛋白质二聚体，其由SEQ ID NO:126-128、130-132和211-216中任一项的氨基酸序列组成。
8.一种抗体样蛋白质，其由以小于500nM的KD结合EGFR的10Fn3组成，其中该EGFR结合性10Fn3包含由SEQ ID NO:115所示的氨基酸序列组成的BC环、由SEQ ID NO:116所示的氨基酸序列组成的DE环、和由SEQ ID NO:117所示的氨基酸序列组成的FG环。
9.权利要求8的抗体样蛋白质，其中所述EGFR结合性10Fn3由选自SEQID NO:112-114中的任一个所示的氨基酸序列组成。
10.权利要求1-6中任一项的抗体样蛋白质二聚体，其中所述IGF-IR结合性10Fn3还包含C端尾部，所述C端尾部由SEQ ID NO:217的氨基酸序列组成；且所述EGFR结合性10Fn3还包含C端尾部，所述C端尾部由SEQ ID NO:217的氨基酸序列组成。
11.权利要求1-6中任一项的抗体样蛋白质二聚体，其中所述IGF-IR结合性10Fn3还包含N端延伸，所述N端延伸由SEQ ID NO:69的氨基酸序列组成；且所述EGFR结合性10Fn3还包含N端延伸，所述N端延伸由SEQ ID NO:71的氨基酸序列组成。
12.权利要求10的抗体样蛋白质二聚体，其中所述IGF-IR结合性10Fn3还包含N端延伸，所述N端延伸由SEQ ID NO:69的氨基酸序列组成；且所述EGFR结合性10Fn3还包含N端延伸，所述N端延伸由SEQ ID NO:71的氨基酸序列组成。
13.权利要求7的抗体样蛋白质二聚体，其由SEQ ID NO:130所示的氨基酸序列组成。
14.权利要求13的抗体样蛋白质二聚体，其还包含C端尾部，所述C端尾部由SEQ ID NO:217的氨基酸序列组成。
15.一种药学可接受组合物，其包含权利要求1-7和10-14中任一项的抗体样蛋白质二聚体或权利要求8或9的抗体样蛋白质，其中所述组合物基本上没有热原。
16.权利要求15的组合物在制备用于在有需要的受试者中治疗可应答于对EGFR活性的抑制的过度增殖性病症的药物的用途。
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