JP2013230093A

JP2013230093A - ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータートランスジェニックマウス

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Publication number: JP2013230093A
Application number: JP2012102814A
Authority: JP
Inventors: Michinori Obara; 道法小原; Koichi Terakososhita; 浩一寺社下; Yosuke Kawase; 洋介川瀬; Tomoyo Mukoya; 知世向谷; Hiroki Oshita; 浩樹大下; Riko Hamamura; 理子浜村
Original assignee: PHOENIX BIO KK; Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science; Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: PHOENIX BIO KK; Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science; Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2012-04-27
Filing date: 2012-04-27
Publication date: 2013-11-14
Anticipated expiration: 2032-04-27
Also published as: US20150128298A1; CA2871586C; EP2842417A1; JP5976380B2; CN104334017A; EP2842417B1; CA2871586A1; US11051496B2; US20190335724A1; US9955675B2; CN104334017B; WO2013162064A1; EP2842417A4

Abstract

【課題】uPA遺伝子をヘテロ接合型に有しながらも、マウス本来の肝細胞に対する障害度が高い、肝障害マウスおよびその効率的な作製方法を提供する。
【解決手段】以下の工程：（ｉ）肝特異的プロモーター／エンハンサーおよびそれらの制御下に作動可能に連結されたウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターをコードするcDNAを含むDNA断片によりマウスES細胞を形質転換する工程；（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた形質転換されたマウスES細胞を宿主胚へ注入する工程；（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られたES細胞が注入された宿主胚を代理母マウスの子宮に移植してキメラマウスを得る工程；ならびに（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で得られたキメラマウスを交配し、該DNA断片がヘテロ接合型に導入されているトランスジェニックマウスを得る工程、を含む、uPA遺伝子をヘテロ接合型で有する肝障害マウスの作製方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、肝特異的プロモーター／エンハンサーおよびそれらの制御下に作動可能に連結されたウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターをコードするcDNAを含むDNA断片をＥＳ細胞に導入し、当該ＥＳ細胞を用いて作製された、当該DNA断片がヘテロ接合型に導入されている、肝障害マウスに関する。

一般的に、ヒト疾患の研究にはヒトの細胞で実験を行なうことが望まれている。特に、種特異性が認められる多くの薬物代謝酵素や宿主がヒトに限られているウイルスなどが関与する疾患の研究には、ヒト細胞、特にヒト肝細胞を用いることが必要である。しかしながら、ヒト肝細胞の供給は限られており、ヒト肝細胞の分化状態を維持したままin vitroで増殖させることは非常に難しい。ヒト肝細胞の増殖には生体内の環境を利用することが比較的効率的である。つまり、免疫不全化したマウスを遺伝的背景としたマウスにマウス肝細胞死を促進させる遺伝子を導入したトランスジェニックマウスにヒト肝細胞を移植し、ヒト肝細胞を増殖させることでマウス肝細胞からヒト肝細胞に多くを置換することが試みられている。

ヒトの肝臓にウイルスが感染することで引き起こされる肝疾患は、ここ数年で医療現場が直面する治療困難な疾患のひとつである。これらヒト肝細胞に感染するウイルスに感受性がある動物種は、ヒトやチンパンジーに限られている。これらのウイルス感染に対する治療薬を開発するためには、ヒトの肝細胞を用いた試験が必要である。また、肝細胞は薬物代謝に対し、重要な役割を果たしており、個々の薬物のヒトにおける代謝経路の解明が新たな医薬品の開発につながると考えられている。しかしながら、多くの薬物代謝酵素には種特異性が存在し、ヒトにおける薬物代謝経路を解明するためには、ヒト肝細胞を用いて試験を行なう必要がある。

Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、日本ではＣ型肝炎ウイルスの持続感染者（ＨＣＶキャリア）は約１５０万人、これ以外に約４０−５０万人が治療を受けていると推測され、インターフェロンの投与を受けているＣ型慢性肝炎の患者は年間３−４万人といわれている。昨今、ウイルスゲノムの様々な部位を標的とする新たな抗ウイルス薬が開発中であるが、信頼性、再現性が高いＨＣＶ用の動物モデルがないため、その進展は大きく阻害されている。これは、ＨＣＶに限られたことではなく、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）などの他のウイルス性肝炎にも言えることである。これらのウイルスは、ヒトおよびチンパンジーのみが宿主となるため、動物を用いた大規模な抗ウイルス薬の開発検討には、ヒト肝細胞が宿主の肝細胞と置換された小型モデル動物の開発が望まれている。

脂肪肝は肝臓への中性脂肪の蓄積が原因で発症するが、近年肝臓に脂肪が蓄積することで起こる肝炎である非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ：Non-alcoholic steatohepatitis）が増加しており、この疾患は慢性肝炎、肝硬変や肝細胞がんなど予後不良な疾患へ進展するおそれがある疾患である。一方で、そのような肝疾患に有効な治療薬が存在しないことが指摘されている（非特許文献１）。この治療薬開発にも最適な動物モデルの存在が必要である。

以上の疾患研究に対し、ヒト肝細胞に置換されたモデル動物が利用可能となれば、多くの薬物開発研究に寄与する。しかしながら、このモデル動物が作製されるには、宿主となる動物にヒト肝細胞を移植した後、効率的にヒト肝細胞が増殖し、宿主の肝細胞と置換されることが必要である。

これまでウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（以下、「uPA」と記載）遺伝子を肝臓特異的に発現させることによりマウス肝細胞に障害を与えるトランスジェニックマウスがいくつか作製され、そのマウスにヒト肝細胞が移植された例がいくつか報告されている。uPAのゲノム配列を用いて作製されたuPAトランスジェニックマウス（非特許文献２）、uPAのcDNAを用いて作製されたuPAトランスジェニックマウス（非特許文献３）が報告されている。これらのuPAトランスジェニックマウスはいずれも、uPA遺伝子をヘテロ接合型で有する場合には、移植されたヒト肝細胞が生着することは困難であることから、uPA遺伝子をホモ接合型で有する必要があった。しかし、uPA遺伝子をホモ接合型で有するトランスジェニックマウスを作製するためには、少なくとも2世代、最短でも6カ月を要し、また得られたマウスの総数に対して、ホモ接合型のマウスはおよそ２５％の割合でしか得られず、短期間に大量のuPA遺伝子をホモ接合型で有するトランスジェニックマウスを作製することは困難であった。また、他のトランスジェニックマウスとの交雑系を作製することも同様の理由で困難であった。さらに、従来のuPAゲノム配列を用いたトランスジェニックマウスでは時間の経過とともに肝臓において導入したuPA遺伝子の組み換えが起こり、uPA遺伝子の脱落が観察され、uPA遺伝子が脱落したマウス細胞は再度肝細胞を再生してしまうため、ヘテロ接合型マウスにヒト肝細胞を移植しても、生着させることは困難であった。また、ホモ接合型においても、uPA遺伝子の脱落によるマウス肝細胞の再生により、生着したヒト肝細胞が徐々に減少するマウスも頻繁にみられた。当該分野においては、効率的に大量生産可能な、および他のトランスジェニックマウスとの交雑系を容易に作製可能なuPAトランスジェニックマウスが切望されていた。

N Engl J Med. 346:1221-31 (2002) Cell 66: 245-256（1991） BBRC 377: 248-252 (2008)

本発明は、uPA遺伝子をヘテロ接合型に有しながらも、マウス本来の肝細胞に対する障害度が高い、肝障害マウスおよびその効率的な作製方法を提供する。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、肝特異的プロモーター／エンハンサーおよびそれらの制御下にuPAをコードするcDNAが作動可能に連結されたDNA断片をマウスＥＳ細胞導入し、当該ＥＳ細胞を利用することによって、uPA遺伝子をヘテロ接合型に有しながらも、マウス本来の肝細胞に対する障害度が高いトランスジェニックマウスを効率的に作製できることを見出した。また、当該トランスジェニックマウスにおいては、時間が経過しても、導入したuPA遺伝子の脱落が生じないか、ほとんど生じないことを見出した。

さらに、当該トランスジェニックマウスを用いて作製した免疫不全肝障害マウスは、移植したヒト肝細胞が生着可能であることを見出した。
本発明はこれらの知見に基づく。

すなわち、本発明は以下を包含する。
［１］以下の工程：
（ｉ）肝特異的プロモーター／エンハンサーおよびそれらの制御下に作動可能に連結されたウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターをコードするcDNAを含むDNA断片によりマウスES細胞を形質転換する工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた形質転換されたマウスES細胞を宿主胚へ注入する工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られたES細胞が注入された宿主胚を代理母マウスの子宮に移植してキメラマウスを得る工程；ならびに
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で得られたキメラマウスを交配し、該DNA断片がヘテロ接合型に導入されているトランスジェニックマウスを得る工程、
を含む、uPA遺伝子をヘテロ接合型で有する肝障害マウスの作製方法。
［２］さらに（ｖ）２〜３週齢の血清ALT値が30（Karmen単位）以上であるトランスジェニックマウスを得る工程を含む、［１］の方法。
［３］肝特異的プロモーターがアルブミンプロモーターである、［１］または［２］の方法。
［４］［１］〜［３］の方法により作製された肝障害マウスおよびその一部。
［５］［４］の肝障害マウスとＳＣＩＤマウスとを交配することによって得られる、免疫不全肝障害マウス。
［６］［５］の免疫不全肝障害マウスに、ヒト肝細胞を移植することを含む、ヒト肝細胞を含むキメラ肝を有することを特徴とするキメラマウスの作製方法。
［７］［６］の方法により作製された、ヒト肝細胞を含むキメラ肝を有することを特徴とするキメラマウス。
［８］免疫不全であり、肝特異的プロモーター／エンハンサーおよびそれらの制御下に作動可能に連結されたウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターをコードするcDNAを含むDNA断片をヘテロ接合型で有し、かつヒト肝細胞を含むキメラ肝を有することを特徴とするキメラマウス。
［９］ヒト肝細胞がキメラ肝の肝細胞の少なくとも１０％を占めている、［７］または［８］のキメラマウス。
［１０］ヒト肝細胞が少なくとも２週間以上、キメラ肝においてその機能および特性を保持している、［７］または［８］のキメラマウス。
［１１］以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、ヒト肝機能に影響を与える物質のスクリーニング方法であって、
（ａ）被検物質を［７］〜［１０］のいずれかのキメラマウスに投与する工程；
（ｂ）（ａ）において該被検物質が投与された該キメラマウスのヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、および総ビリルビン値からなる群から選択される一以上を測定する工程；ならびに
（ｃ）該被検物質が投与されていない該キメラマウスのヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、および総ビリルビン値と比較して、（ｂ）にて測定されたヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、および総ビリルビン値のいずれか一つ以上の増減を生じる被検物質を選択する工程。
［１２］以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、被検物質のヒト肝細胞に対する毒性を評価する方法であって、
（ａ）被検物質を［７］〜［１０］のいずれかのキメラマウスに投与する工程；
（ｂ）（ａ）において該被検物質が投与された該キメラマウスのヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、および総ビリルビン値からなる群から選択される一以上を測定する工程；ならびに
（ｃ）該被検物質が投与されていない該キメラマウスのヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、および総ビリルビン値と比較して、（ｂ）にて測定されたヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、および総ビリルビン値のいずれか一つ以上の増減を指標にして、該被検物質のヒト肝細胞に対する影響を評価する工程。
［１３］以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、ウイルス性肝炎の治療に有効な物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）［７］〜［１０］のいずれかのキメラマウスに肝炎ウイルスを接種する工程；
（ｂ）（ａ）において肝炎ウイルスが接種された該キメラマウスに被検物質を投与する工程；
（ｃ）（ｂ）において被検物質が投与された該キメラマウスのヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、総ビリルビン値、ウイルス量、およびウイルス由来タンパク質量からなる群から選択される一以上を測定する工程；ならびに
（ｄ）該被検物質が投与されていない該キメラマウスのヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、総ビリルビン値、ウイルス量、およびウイルス由来タンパク質量と比較して、（ｃ）にて測定されたヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、総ビリルビン値、ウイルス量、およびウイルス由来タンパク質量のいずれか一つ以上の変化を生じる被検物質を選択する工程。
［１４］肝炎ウイルスが、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルスまたはE型肝炎ウイルスである、［１３］の方法。

本発明によれば、uPA遺伝子をヘテロ接合型に有しながらも、マウス本来の肝細胞に対する障害度が高い、肝障害マウスおよびその効率的な作製方法を提供することができる。

図１は受精卵用のuPA遺伝子挿入用ベクター「mAlb uPAInt2」の模式図を示す。SV40pA:SV40polyAシグナル； mAlbPro/En:マウスアルブミンのエンハンサー/プロモーター； uPAcDNA:マウスuPAのORF部分；exon-intron-exon:ラビットβグロビンの第２エキソン、イントロン、第３エキソン；polyA+約50bp：ラビットβグロビンの第３エキソン中のpolyAシグナル。図２はES細胞用のuPA遺伝子挿入用ベクター「mAlb uPAInt2ES」の模式図を示す。SV40pA:SV40polyAシグナル；mAlbPro/En:マウスアルブミンのエンハンサー/プロモーター；uPAcDNA:マウスuPAのORF部分；exon-intron-exon:ラビットβグロビンの第２エキソン、イントロン、第３エキソン；polyA+約50bp：ラビットβグロビンの第３エキソン中のpolyAシグナル。図３はES細胞を介して作製したuPAトランスジェニックマウスにおけるALT値等の測定結果を示す。図４は#1C2マウスへのヒト肝細胞移植後14週齢までのマウス血中ヒトアルブミン濃度(上)、および体重（下）の測定結果を示す。実線はホモ、点線はヘテロマウスを示す。図５は#2C7マウスへのヒト肝細胞移植後14週齢までのマウス血中ヒトアルブミン濃度（上）、および体重（下）の測定結果を示す。実線はホモ、点線はヘテロマウスを示す。図６は#1C2ホモ、ヘテロ、#2C7ホモを用いて作製したキメラマウス肝臓切片のヒトサイトケラチン8／18抗体による免疫染色像を示す。図７は14週齢（上）と30週齢（下）の#1C2ホモ、ヘテロ、#2C7ホモマウスを用いて作製したキメラマウス肝臓の置換率とマウス血中ヒトアルブミン濃度の測定結果を示す。図８−１は#1C2ホモ、ヘテロマウスを用いて作製したキメラマウスにおける、HCVを接種するまでのマウス血中ヒトアルブミン濃度（左）と接種後のマウス血清中各ウイルスのコピー数（右）を示す。実線はホモ、点線はヘテロマウスを示す。図８−２は#1C2ホモ、ヘテロマウスを用いて作製したキメラマウスにおける、HBVを接種するまでのマウス血中ヒトアルブミン濃度（左）と接種後のマウス血清中各ウイルスのコピー数（右）を示す。実線はホモ、点線はヘテロマウスを示す。図９−１は#2C7ホモマウスを用いて作製したキメラマウスにおける、HCVの接種までのマウス血中ヒトアルブミン濃度（左）と接種後のマウス血清中HCVコピー数（右）を示す。図９−２は#2C7ホモマウスを用いて作製したキメラマウスにおける、HBVの接種までのマウス血中ヒトアルブミン濃度（左）と接種後のマウス血清中HBVコピー数（右）を示す。図１０は#1C2マウスへのヒト肝細胞移植後30週齢までのマウス血中ヒトアルブミン濃度（上）、および体重（下）の測定結果を示す。実線はホモ、点線はヘテロマウスを示す。図１１は#2C7マウスへのヒト肝細胞移植後30週齢までのマウス血中ヒトアルブミン濃度（上）、および体重（下）の測定結果を示す。実線はホモ、点線はヘテロマウスを示す。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の肝障害マウスは、肝特異的プロモーター／エンハンサーおよびそれらの制御下に作動可能に連結されたウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターをコードするcDNAを含むDNA断片をヘテロ接合型に有し、これによってuPAが肝臓特的に発現されており、マウス本来の肝臓の細胞（特に、肝細胞）の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれ以上が障害を受けている、増殖が抑制されている、ならびに／あるいは壊死を生じている。

本発明の肝障害マウスはuPA遺伝子をヘテロ接合型に有しながらも、マウス本来の肝細胞に対する障害度が高く、従来公知のuPAトランスジェニックマウスと異なり、uPA遺伝子をホモ接合型に有していなくても良い。

本発明の肝障害マウスは、従来公知のトランスジェニック動物の作製方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:7380-7384(1980)）に基づいて、肝特異的プロモーター／エンハンサーおよびそれらの制御下に作動可能に連結されたuPAをコードするcDNAを含むDNA断片をマウスＥＳ細胞に導入し、得られたＥＳ細胞を用いて作製することができる。

「プロモーター／エンハンサー」とは、プロモーターおよびエンハンサーの両機能を提供可能な配列を有するDNAを意味する。

「肝特異的プロモーター」としては、その３’側に連結された遺伝子の発現を肝臓特異的に誘導可能なものであれば特に制限されず、例えば、アルブミンプロモーター、α−フェトプロテインプロモーター、α_１−抗トリプシンプロモーター、トランスフェリントランスサイレチンプロモーター、血清アミロイドＡプロモーター、トランスチレチンプロモーター、肝細胞核因子６（ＨＮＦ−６）プロモーターなどが挙げられる。好ましくはアルブミンプロモーターである。

「肝特異的プロモーター／エンハンサー」は、目的の遺伝子を肝臓特異的に発現できる限り、内因性、外因性、同種、異種、人工のいずれのプロモーターであってもよいが、好ましくはマウス由来のものを使用する。マウス由来の肝特異的プロモーター／エンハンサーは当該分野において公知であり、例えばアルブミンプロモーター／エンハンサーを利用することができる。マウス由来のアルブミンプロモーター／エンハンサーは、公知であり（Herbst RS et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 1989 Mar;86(5):1553-7; Heckel JL et al., Cell 1990 Aug 10;62(3):447-56）、当該アルブミンプロモーター／エンハンサーに特異的なプライマーを使用して、マウスゲノムライブラリーを鋳型とするPCRを行うことにより得ることができる。

uPAをコードするcDNAは、内因性、外因性、同種、異種のいずれであってもよいが、好ましくはマウス由来のものを使用する。uPAをコードするcDNAは、当業者に公知である一般的な手法により得ることができ、すなわち、肝臓より抽出したRNAを鋳型とし、uPAをコードする遺伝子に特異的なプライマーを使用する逆転写PCRを行うことによって得ることができる。uPAをコードする遺伝子は、上記公開されたデータベースにアクセッション番号：NM008873として登録されており、本発明においてはこの遺伝子情報を利用することができる（本明細書中、配列番号１１としてuPAをコードする遺伝子を記載する）。なお、本明細書において、本発明について記載されるuPA遺伝子とは、uPAをコードするcDNAを意味し、これらの用語は相互互換的に用いることができる。

「肝特異的プロモーター／エンハンサーおよびそれらの制御下に作動可能に連結されたuPAをコードするcDNA」とは、肝特異的プロモーター／エンハンサーおよびそれらの制御下に、uPAが発現されるようにuPAをコードするcDNAが配置されていることを意味する。

肝特異的プロモーター／エンハンサーおよびそれらの制御下に作動可能に連結されたuPAをコードするcDNAを含むDNA断片を、ES細胞（胚性幹細胞）に導入する。

DNA断片のES細胞への導入方法は、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、DEAE−デキストラン法等（これらに限定されない）により行うことができる。

DNA断片を導入したES細胞は体外で培養することができ、これによって導入に成功したおよび／または導入したDNA断片が脱落しない細胞をスクリーニングすることができる。次いで、得られたES細胞を宿主胚、好ましくはマウス胚盤胞、に注入した後、代理母マウスの子宮角に移植して、これを発生させることでトランスジェニックマウス（キメラマウス）が誕生する。代理母には、通常、精管を切断したオスと交配させて偽妊娠状態としたメスが利用される。

生まれたトランスジェニックマウス（キメラマウス）は、上記DNA断片が組み込まれていることを確認した上で、F1マウスの誕生のために野生型マウスと交配させる。この交配の結果誕生するF1マウスの中で、体細胞に上記DNA断片を有するもの（ヘテロ接合体）は、生殖細胞に上記DNA断片を伝えることができるトランスジェニックマウスである。

本発明の肝障害マウスは、導入された上記DNA断片がヘテロ接合体であれば、上記のトランスジェニックマウスのいずれの世代のマウスであってもよい。ヘテロ接合体の選択は、例えば、F1マウスの尾部より分離抽出した染色体DNAをサザンハイブリダイゼーションまたはPCR法によりスクリーニングすることにより検定できる。

さらに、得られたトランスジェニックマウスについて、血清ALT(アラニンアミノトランスフェラーゼ)値が2〜3週齢において、30（Karmen単位）以上であるものを選択する。好ましくは、3週齢または４週齢において血清ALT値が30（Karmen単位）以上であるもの、さらに好ましくは６週齢において血清ALT値が45、50または55（Karmen単位）以上であるもの、特に好ましくは８週齢において血清ALT値が60、65、または70（Karmen単位）以上であるものを選択する。血清ALT値は肝障害の程度の指標となり、当該値が高いほど肝障害の程度が高いことを示す。

本発明の肝障害マウス作製において用いられる上記ES細胞、胚盤胞は、特に限定されることなく、様々なマウス系統に由来するものを利用することができ、例えば、129SvEvマウス、C57BL/6Jマウスなどに由来する細胞を利用することができる。

本発明の肝障害マウスの作製方法によれば、導入遺伝子をヘテロ接合型に有することが可能であるために、当該トランスジェニックマウスを効率的に大量に作製することができ、得られたトランスジェニックマウスよりuPA遺伝子をヘテロ接合型で有しながらも、肝障害度が高いマウスをスクリーニングすることによって、所望されるトランスジェニックマウスを効率的に選択・作製することができる。

また、本発明の肝障害マウスはuPA遺伝子をヘテロ接合型で有することが可能であるために、uPA遺伝子をホモ接合型で有する従来のトランスジェニックマウスと比較してマウスの生産性が高い。つまり、多数のホモ接合型マウスを得るためには、まず一旦、ヘテロ接合型雌マウスを多数生産する必要がある。その後、そのヘテロ接合型マウス同士の体外受精や自然交配により、ホモ接合型マウスを得る必要があり、この過程に2世代、最短でも計６ヵ月必要である。さらに、得られたマウスの総数に対し、およそ２５％の割合でしかホモ接合型マウスが得られない。これに対してヘテロ接合型マウスは、ブリーダーから多数購入できる野生型マウスと体外受精または自然交配を行い、次世代（1世代）にて多数のヘテロ接合型マウスが得られる。この過程に必要な期間は、最短で３ヶ月である。さらに、ここで得られたマウスの総数のおよそ５０％がヘテロ接合型マウスであり、短期間で高率に必要なマウスを多数生産することが可能である。また、他の遺伝子変異マウス（遺伝子欠損や導入した遺伝子等）との交雑系を実験に使用する場合にも、ヘテロ接合型uPAトランスジェニックマウスが使用可能であった場合、効率的に実験に使用可能なマウスを得ることができる。例えば、導入したuPA遺伝子がヘテロ接合型でかつ、もう1種類の遺伝子変異もヘテロ接合型であるマウス同士を使ってこのuPA遺伝子ともう1種類の遺伝子変異がダブルでホモ接合型であるマウスを生産する場合、両遺伝子がホモ接合型であるマウスが得られる割合は、得られたマウスのうちのおよそ６％に過ぎず、さらに、実験に使用するためにまとまった数のマウスを得るためには雌雄のホモ接合型マウスを得た上で、繁殖、生産を行なう必要がある。一方、uPA遺伝子がヘテロ接合型でかつ、もう1種類の遺伝子変異がホモ接合型のマウスが得られる割合はおよそ１２．５％であり、両遺伝子がホモ接合型であるマウスを作出するよりも高い作出効率で実験に必要なマウスがこの時点で得られる。これは、両遺伝子がホモ接合型であるマウスを作出するよりも1世代早く、実験に使用するだけのまとまった数のマウスが得られることになる。以上のように、ヘテロ接合型マウスを使用できることは、高い作出効率を可能とし、その結果として実験に必要なマウスを得るために飼育する動物室の省スペース化に貢献し、作出までの期間の短縮、使用するマウス数の大幅な削減、実験者の労力軽減につながる。

本発明において、「肝障害マウス」には当該マウスの一部も含まれる。「マウスの一部」とは、例えば、マウス由来の組織、体液、細胞、ならびに、これらの破砕物または抽出物など（特にこれらに限定されない）を意味する。組織としては、心臓、肺、腎臓、肝臓、胆嚢、膵臓、脾臓、腸、筋肉、血管、脳、精巣（睾丸）、卵巣、子宮、胎盤、髄、甲状腺、胸腺、乳腺等が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。体液としては、血液、リンパ液、尿が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。細胞としては、上記組織または体液に含まれる細胞を意味し、これらより単離および培養して得られる培養細胞、精子、卵子、受精卵も含まれる。培養細胞としては、初代培養細胞およびその株化細胞の双方を含む。発生段階（胎生期）における組織、体液、細胞、ならびに、これらの破砕物または抽出物なども、当該マウスの一部に含まれる。なお、本発明の肝障害マウス由来の株化細胞は、公知の方法を利用して樹立することができる（胎仔細胞の初代培養の方法（新生化学実験講座、18巻、125頁〜129頁東京化学同人、およびマウス胚の操作マニュアル、262頁〜264頁、近代出版））。

また、本発明は免疫不全肝障害マウスを提供する。本発明の免疫不全肝障害マウスは、ヒト肝細胞を移植するためのホストマウスとして利用することができる。本発明の免疫不全肝障害マウスは、上記肝障害マウスと免疫不全マウスとを交配させることによって得ることができる。

「免疫不全マウス」としては、異種動物由来の肝細胞（特にヒト肝細胞）に対して拒絶反応を示さないマウスであれば良く、例えば、Ｔ細胞およびＢ細胞系不全を示す重症複合免疫不全症（SCID：severe combined immunodeficiency）マウス、遺伝的な胸腺の欠損によりT細胞機能を失ったマウス（NUDEマウス）、RAG2遺伝子を公知のジーンターゲッティング法（Science,244:1288-1292,1989)によりノックアウトしたマウス（RAG2ノックアウトマウス）などが挙げられるが、これらには限定されない。好ましくはSCIDマウスである。

本発明の免疫不全肝障害マウスは、免疫不全の形質を規定する遺伝子をホモ接合型に有する。また、上記肝障害マウスに由来する上記uPA遺伝子を含むDNA断片をヘテロ接合型に有していても良いし、ホモ接合型に有していても良い。本発明の免疫不全肝障害マウスは、uPA遺伝子をヘテロ接合型に有していたとしても、移植したヒト肝細胞が長期にわたって生着可能である。本発明の免疫不全肝障害マウスの遺伝子型としては、例えば、uPA (+/-)/SCID (+/+)、uPA (+/+)/SCID (+/+)などが挙げられるが。これらに限定はされない。

ヘテロ接合型およびホモ接合型の選択は、上記したように、得られた仔の尾部より分離抽出した染色体DNAをサザンハイブリダイゼーションまたはPCR法によりスクリーニングすることにより行うことができる。

本発明において、「免疫不全肝障害マウス」には当該マウスの一部も含まれる。「マウスの一部」とは、上に定義したとおりである。

さらに、本発明はヒト肝細胞を有するキメラマウスを提供する。本発明のキメラマウスは、免疫不全であり、肝特異的プロモーターおよびエンハンサー領域の制御下に操作可能に連結されたウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターをコードするcDNAを含むDNA断片がヘテロ接合型に導入されており、かつヒト肝細胞を含むキメラ肝を有する。

本発明のキメラマウスは、上記本発明の免疫不全肝障害マウスに、ヒト肝細胞を移植することによって作製することができる。
移植に用いるヒト肝細胞は、正常なヒト肝組織から、コラゲナーゼ灌流法のような常法によって単離したものを用いることができる。また、分離した肝細胞を一旦凍結保存した後解凍して用いることもできる。あるいは、ヒト肝細胞で置換されたキメラマウス肝臓からコラゲナーゼ灌流法のような手法を用いて分離したヒト肝細胞（キメラマウス肝細胞）を新鮮な状態で、または凍結保存したキメラマウス肝細胞を融解して用いることもできる。

このようなヒト肝細胞は、上記免疫不全肝障害マウスの脾臓を経由して肝臓へ移植することができる。また、直接門脈から移植することもできる。移植するヒト肝細胞の数は、1〜200万個程度、好ましくは20万〜100万個程度とすることができる。免疫不全肝障害マウスの性別は特に限定されない。また、移植時の免疫不全肝障害マウスの日齢は、特に限定されないが、マウスが低週齢のときにヒト肝細胞を移植すると、マウスの成長とともにヒト肝細胞がより活発に増殖することができる点で、生後0〜40日程度、中でも生後8〜40日程度のマウスを使用するのが好ましい。

移植後のマウスは、常法により、飼育することができる。移植後定期的にマウス尾より血液を採取し、マウス血中ヒトアルブミン濃度を測定する。ヒトアルブミン濃度は、マウス肝臓におけるヒト肝細胞の置換率と相関しているため、ヒト肝細胞の生着、増殖の程度を推測することができる。マウス血中ヒトアルブミン濃度より、置換率が70%以上と推測されたマウスは高置換キメラマウスとして、薬物動態試験、肝炎ウイルス感染実験などに利用する事ができる。マウスの場合は、ヒト肝細胞を1〜10×10⁵個程度移植した場合、40〜100日間程度飼育することにより、10万〜3000万ng/mLの血中ヒトアルブミン濃度が得られる。

移植されたヒト肝細胞は、当該キメラマウスの肝臓における肝細胞の少なくとも１０％、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、またはそれ以上を占める。

移植されたヒト肝細胞は、該キメラマウスの肝臓において少なくとも２週間以上、３週間以上、４週間以上、５週間以上、１０週間、２０週間、３０週間、４０週間であり、最も好ましくはマウスが生存している期間、正常ヒト肝細胞の機能および特性を保持する。

「ヒト肝細胞の機能および特性」としては、薬物代謝機能、蛋白質合成、糖新生、尿素合成、胆汁合成、脂質合成、糖代謝、解毒、肝炎ウイルスへの感染などが挙げられるが、これらに限定はされない。

移植されたヒト肝細胞は、上記の機能および特性をヒト正常肝臓内における機能および特性の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、またはそれ以上を保持している。

また本発明は上記キメラマウスを用いたヒト肝機能に影響を与える物質のスクリーニング方法を提供する。
本方法は例えば、以下の工程を含む評価方法を挙げることができる。
（ａ）被検物質を上記キメラマウスに投与する工程；
（ｂ）（ａ）において被検物質が投与されたキメラマウスのヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、および総ビリルビン値からなる群から選択される一以上を測定する工程；ならびに（ｃ）被検物質が投与されていないキメラマウスのヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、および総ビリルビン値と比較して、（ｂ）において測定されたヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、および総ビリルビン値のいずれか一つ以上の増減を生じる被検物質を選択する工程。

本発明の方法における「被験物質」としては、特に制限はなく、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、抗体、ペプチド、アミノ酸等の単一化合物、核酸、ならびに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物若しくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。これらは精製物であっても、また植物、動物又は微生物等の抽出物等のように粗精製物であってもよい。また被験物質の製造方法も特に制限されず、天然物から単離されたものであっても、化学的又は生化学的に合成されたものであっても、また遺伝子工学的に調製されたものであってもよい。

上記被験物質は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。また、上記被験試料に加えて、これらの被験試料を複数種混合した混合物も含まれる。

本方法において、マウスに対する被験物質の投与方法も特に制限されない。投与する被験物質の種類に応じて、経口投与又は皮下、静脈、局所、経皮若しくは経腸（直腸）などの非経口投与を適宜選択することができる。

マウス血中のヒトアルブミン濃度をELISAや免疫比濁法などにより測定することにより、マウス肝臓におけるヒト肝細胞による置換率を予測することができる。予測するためには、予め、次の様にヒトアルブミン濃度と置換率の相関曲線を作成する必要がある。キメラマウスの剖検前に血液を採取し、ヒトアルブミン濃度を求める。剖検に於いて採取した肝臓のすべてまたは1部の葉の凍結切片やパラフィン切片を作製し、ヒト特異的サイトケラチン8/18 (hCK8/18) 抗体などヒト肝細胞に特異的な抗体を用いて、免疫染色を行う。切片を顕微鏡下で写真撮影し、肝臓切片あたりのhCK8/18陽性面積の割合を求め、置換率とする。ヒトアルブミンの濃度と置換率をグラフにプロットし相関式を求める。相関式にマウス血中ヒトアルブミン濃度を入力することにより、おおよその置換率を算出することができる。また、体重を経時的に測定することにより、マウスの健康状態を予測することができる。剖検時に採取した血液の生化学検査、たとえば総アルブミン値、総蛋白値などの測定を行うことにより、マウスの健康状態を知る事ができる。肝重量体重、ALT、AST、総ビリルビン値などを測定することにより、キメラマウスの肝臓の障害の程度を知ることができる。すなわち、これら数値の増減を指標にして、被験物質のヒト肝細胞に対する影響を判定することができる。

また本発明は上記キメラマウスを用いた被検物質のヒト肝細胞に対する肝毒性を評価する方法を提供する。
本方法は例えば、以下の工程を含む評価方法を挙げることができる。
（ａ）被検物質を上記キメラマウスに投与する工程；
（ｂ）（ａ）において被検物質が投与されたキメラマウスのヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、および総ビリルビン値からなる群から選択される一以上を測定する工程；ならびに
（ｃ）被検物質が投与されていない該キメラマウスのヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、および総ビリルビン値と比較して、（ｂ）において測定されたヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、および総ビリルビン値のいずれか一つ以上の増減を指標にして、被検物質のヒト肝細胞に対する影響を評価する工程。
「被験物質」およびその「投与方法」としては、上に定義したものが挙げられる。

上記したように、ヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、および総ビリルビン値より、キメラマウスの肝臓の障害の程度を知ることができ、これら数値の増減を指標にして、被験物質のヒト肝細胞に対する毒性を判定・評価することができる。

さらに本発明は上記キメラマウスを用いたウイルス性肝炎の治療に有効な物質をスクリーニングする方法を提供する。
本方法は例えば、以下の工程を含む評価方法を挙げることができる。
（ａ）上記キメラマウスに肝炎ウイルスを接種する工程；
（ｂ）（ａ）において肝炎ウイルスが接種されたキメラマウスに被検物質を投与する工程；
（ｃ）（ｂ）において被検物質が投与された該キメラマウスのヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、総ビリルビン値、ウイルス量、およびウイルス由来タンパク質量からなる群から選択される一以上を測定する工程；ならびに
（ｄ）被検物質が投与されていない上記キメラマウスのヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、総ビリルビン値、ウイルス量、およびウイルス由来タンパク質量と比較して、（ｃ）において測定されたヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、総ビリルビン値、ウイルス量、およびウイルス由来タンパク質量のいずれか一つ以上の変化を生じる被検物質を選択する工程。

接種する肝炎ウイルスとしては、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルスまたはE型肝炎ウイルスが挙げられる。ウイルスは脈や腹腔内投与により接種することができる。

本方法において用いられる上記キメラマウスは、以下のいずれか１つ以上を満たすマウスが好ましい：ヒト肝細胞移植後3週間以上経過している、血中ヒトアルブミン濃度が1mg/mL以上である、肝細胞全体の10％以上がヒト肝細胞である。
「被験物質」およびその「投与方法」としては、上に定義したものが挙げられる。

ヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、総ビリルビン値、ウイルス量、およびウイルス由来タンパク質量より、肝炎ウイルスによる肝臓の障害の程度を知ることができ、これら数値の変化を指標にして、被験物質のウイルス性肝炎の治療における有効性を判定・評価することができる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。

本発明を以下の実施例によってさらに具体的に説明する。
実施例１．DNAマイクロインジェクション法を用いたuPAトランスジェニックマウスの作製
（１）uPA遺伝子とアルブミンプロモーターを含むベクターの作製
uPA遺伝子は、マウス肝臓からAGPC法（acid-guanidinium-isothiocyanate-phenol-chloroform）で全RNAを抽出し、RNase-free水に溶解した。前記で得た全RNAを用いて、公開されたデータベースに登録されるuPA遺伝子の配列（アクセッション番号：NM008873（配列番号１１））より作成したuPA遺伝子特異的プライマー（1341番塩基から1360塩基長のアンチセンス配列）及びLongRange Reverse Transcriptase（Qiagen社製）による逆転写反応を、25℃にて10分間、次いで、42℃にて90分間行い、逆転写酵素不活化処理を85℃にて5分間行った後、RNaseH（Invitrogen社製）を添加して37℃にて20分間処理してmRNAを消化し、cDNAのみを残存させた。合成されたcDNAをPCR反応の鋳型としてPCRを行った。上記反応液を全量の1/10添加し、酵素はPhusion DNA polymerase（Fynnzymes社製）を用いた。PCRプライマー（39番塩基から61塩基長のセンス配列）は、uPA遺伝子配列（アクセッション番号：NM008873）より作製した。増幅される断片は、PCR反応では塩基番号39-1360の長さである。えられたDNA断片を後述のマウスアルブミンプロモーター/エンハンサーを持った発現プラスミドに導入し「mAlb uPAInt2」を構築した。「mAlb uPAInt2」遺伝子の構成を図１に示す。マウスアルブミンのエンハンサー/プロモーターの下流にラビットβグロビンの第２エキソン、イントロン、第３エキソン・マウスuPAのORF部分・ラビットβグロビンの第３エキソン中のpolyAシグナルを結合したものである。

（２）DNAの受精卵前核へのマイクロインジェクション
DNA断片の濃度を3ng/μLになるように調製した後、CB-17/IcrとScid-beige交雑系マウスから採取した前核期受精卵に注入した。受精卵へのDNAの注入はマイクロインジェクション法によって行った。DNAを注入した受精卵748個中635個が生存し、このうち469個が２細胞期胚にまで分化した。この２細胞期胚を、予め偽妊娠させたレシピエントマウスICR系統の卵管内に移植した。産仔は108匹得られた。得られた産仔がuPA遺伝子を含むかどうか、PCR法によって解析した（臨床研）。PCRの結果、1個体に目的のDNAが含まれていることを確認した。この1匹から1ラインのuPAトランスジェニックマウス系統を確立した。

（３）uPAトランスジェニックマウスにおける血清中のALT値の測定解析
得られたuPA遺伝子を保有するマウスから採血し、血清を得た。その後、ALT値を測定することで、肝臓でのuPA遺伝子発現による影響、すなわち肝細胞の損傷を解析した。ALT値の測定方法は、和光純薬工業『トランスアミナーゼ CII‐テストワコー』cat# 431-30901を用いて行った。サンプル血清は採取後測定時まで−80℃にて保存した。
ALT測定方法は『トランスアミナーゼ C II‐テストワコー』の添付の標準操作法１の1/20スケールで実施した。まず、ALT用基質酵素液：ALT用酵素剤１びんにALT用基質緩衝液10mLを加え、溶解した。さらに発色試液：発色剤１びんに発色剤溶解液を40mL加え、溶解した。

次に、CORNING 25850 96well U底プレートを氷上に準備した。サンプル血清 1μLをプレートに入れた。プレートを氷上から降ろし、基質酵素液25μLを加え、37℃にて5分間加温した。STND (×1/2希釈：1μL，×1：1 ,2μL ) を空いたwellに入れ、発色試液25μLを各wellに加えた。STNDのwellに基質酵素液25μLを加え、37℃にて，20分間加温した。反応停止液100μLを各wellに加え、プレートミキサーでよく攪拌した後、60分以内に570nmで吸光度を測定した。STNDの測定値で検量線を作成し、サンプルの活性値を算出した。

測定したマウスにおいてALT値が高値であるマウスは確認できなかった。目的とするuPAトランスジェニックマウスは、uPA遺伝子の発現量がその後の肝細胞移植に最適な条件を示すようなものではなくてはならず、多くのuPAトランスジェニックマウスを作製した上で、最適な発現量を示すマウスを選別する必要があり、本法では、トランスジェニックマウスの作製効率の限界から、今回のような最適なマウスを確率論的に作製する方法には適していないことが明らかとなった。

実施例２．ES細胞を介したuPAトランスジェニックマウスの作製
（１）uPA遺伝子を挿入したES 細胞の樹立
本実施例では、uPA遺伝子挿入用ベクター「mAlb uPAInt2ES」（図２）を構築して用いた。これはES細胞での薬剤選択性を付与するために「mAlb uPAInt2」プラスミドにさらにSV40プロモーターで発現するネオマイシン耐性遺伝子を導入したものである。エレクトロポレーション法により129SvEvマウスより得られたES細胞に導入し、次いでG418により選択培養を行った。得られたG418耐性コロニーについて、PCRにより遺伝子が導入されたES細胞の検定を行った。以下、具体的に説明する。

相同組み換え用ベクター（uPA）DNA 25-30μｇを制限酵素で切断することにより線状化し、精製した。このDNAをマウスES細胞3×10⁶個を含むエレクトロポレーション用緩衝液（20mM HEPES pH7.0、137mM NaCl、5mM KCl、6mM D-glucose、0.7mM Na₂HPO₄）に懸濁し、Field Strength 185V/cm、Capacitance 500μＦの条件で、遺伝子導入を行った。導入から24時間経過後、終濃度200μg/mLのG418(Geniticin)(SIGMA社 G-9516)で選択培養を行った。ES細胞の培養には、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)(Gibco/BRL社 11965-084)培養液に終濃度15％の牛胎児血清(Hyclone社 SH30071)、終濃度2mMのL-グルタミン(Gibco/BRL社 25030-081)、終濃度がそれぞれ100μＭの非必須アミノ酸(Gibco/BRL社 11140-050)、終濃度10mMのHEPES(Gibco/BRL社 15630-080)、終濃度がそれぞれ100U/mLのペニシリン／ストレプトマイシン(Gibco/BRL社 15140-122)、終濃度100μＭのβ−メルカプトエタノール(SIGMA社 M-7522)、そして終濃度1000U/mLのESGRO(LIF)(Gibco/BRL社 13275-029)を添加したものを用いた(以下ES培地と記す)。

また、ES細胞用のフィーダー細胞としては、E14.5の胚から単離したMEF（Mouse Embryonic Fibroblast）細胞を用い、培養液はDMEM(Gibco/BRL社 11965-084)培養液に終濃度10%の牛胎児血清(Hyclone社 SH30071)、終濃度2mMのL-グルタミン(Gibco/BRL社 25030-081)、終濃度がそれぞれ100μＭの非必須アミノ酸(Gibco/BRL社 11140-050)、終濃度がそれぞれ100U/mLのペニシリン／ストレプトマイシン(Gibco/BRL社 15140-122)を添加したものを用いた(以下MEF培地と記す）。150cm²のフラスコでコンフルエントにまで培養させたMEF細胞をトリプシン／EDTA(0.05%/1mM、Gibco/BRL社 25300-047)ではがし、4枚の10cmディッシュ、2枚の24穴プレート、2枚の6穴プレート、6個の25cm²フラスコ、2個の75cm²フラスコにそれぞれ至適な濃度で撒きなおした。

（２）遺伝子型解析用ES細胞の調整
遺伝子導入後5日目から、以下のようにして、出現したG418耐性コロニーを24穴のプレートに継代した。即ち、ピペットマン（ギルソン）を用いてG418耐性コロニーを150μLのトリプシン／EDTA溶液を含む96穴のマイクロプレートに移し換え、20分間37℃のインキュベーター内で処理した後、ピペットマンでピペッティングすることによって単一細胞にした。この細胞懸濁液を24穴のプレートに移し換え培養を継続した。2日後、24穴のプレート上の細胞を凍結保存用とDNA抽出用の2つに分割した。即ち、細胞にトリプシン／EDTAを500μL加えて20分間37℃のインキュベーター内で処理し、ES培地を500μL加えてピペットマンで静かにピペッティングすることによって単一細胞にした。その後、1mLのES培地の入った24穴プレートに細胞懸濁液の半分を移し、元の24穴プレートにもES培地を1mL加えた。さらに2日後、片方の24穴プレートの培地を抜いてから、ES培地に終濃度が10％の牛胎児血清と終濃度が10％のジメチルスルホキシド(DMSO)(Sigma社 D-5879)を添加した凍結用培地を1mL入れて、シールした後-70℃で凍結保存した。

遺伝子導入ES細胞の検定は、PCRによって以下の通りに行った。即ち、コンフルエントの状態まで細胞が増殖した24穴プレートの各ウェルから培地を取り除き、PBSで洗浄した後溶解バッファー(1% SDS、20mM EDTA、20mM Tris pH7.5)を250μLとプロテイナーゼ K（20mg／mL）5μLを加えてよく振り、52℃で加温して溶解した。溶解したサンプルからフェノール／クロロホルム抽出によりDNAを抽出し、PCR用の鋳型DNAとして用いた。

（３）ES細胞の遺伝子型解析方法：uPA遺伝子導入ES細胞の選択配下の手順で行った。
使用したPCRプライマーはラビットβグロビン中に設定した。配列は、センスプライマー：GGGCGGCGGTACCGATCCTGAGAACTTCAGGGTGAG（配列番号１）、アンチセンスプライマー：GGGCGGCGGTACCAATTCTTTGCCAAAATGATGAGA（配列番号２）である。反応はAmpiTaqGold(ABI社)の添付方法に従って行った。95℃で9分間かけて酵素を活性化した後に94℃にて30秒間（変性）、63℃にて30秒間（アニーリング）、72℃にて1分間（伸長）の反応を40回繰り返した。終了後反応液を2%アガロースゲルで泳動してPCRプロダクトの確認を行った。

PCR解析で遺伝子導入が確認されたクローンは、凍結保存してあった96穴プレートを37℃に温めることにより融解し、24穴プレートに継代した。この24穴プレートを24時間、37℃で培養後、DMSOと流動パラフィンを除くために培地を交換した。それぞれのクローンが75〜90％コンフルエントに達した時点で24穴から6穴プレートに継代した。さらに、６穴プレートに75〜90％コンフルエントまで増殖したものが2穴分得られたところで、１穴分は凍結保存し、残りの１穴分は胚盤胞への注入及びDNA抽出に使用した。

凍結保存は以下の如く行った。即ち、細胞をPBSで2回リンスした後、0.5mLのTrypsinを加え、37℃で15〜20分間保温しトリプシン処理を行った後、さらに0.5mLのES細胞培地を加え、35〜40回ピペッティングを行いES細胞の塊を完全に解離させた。この細胞懸濁液を15mL遠心チューブに移し、さらに1mLのES細胞培地でウェルを洗ってチューブに回収した。チューブを1,000rpmで7分間遠心し、培地を取り除き0.25mL ES細胞培地に再懸濁し、0.25mLの2 ｘ凍結培地を加えた。クライオジェニックバイアルにウェルの中身を移し、−80℃で凍らせ、液体窒素中で保存した。

胚盤胞への注入及びDNA抽出用の細胞は、ES細胞の塊を完全に解離させた後、その四分の一を胚盤胞への注入に用い、残りの細胞の三分の一、及び三分の二をそれぞれゼラチンコートした60mmディッシュに継代した。前者は細胞がコンフルエントにまで増殖したところでPCR解析用のゲノムDNAを抽出し、後者の細胞はコンフルエントにまで増殖したところで３本に分けて凍結した。

（４）uPA遺伝子を持つES細胞によるキメラマウスの作製
遺伝子導入が確認されたES細胞クローンについて、C57BL/6J系マウスの胚盤胞をホスト胚としてキメラ胚を作製し、それを偽妊娠マウスの子宮角に移植して産仔を得た。ホスト胚の採取は、妊娠3日目に、100μＭトリプシン/EDTAを添加したWhitten’s培地で、卵管と子宮を灌流することによって行った。8細胞期胚または桑実胚を24時間Whitten’s培地で培養し、得られた胚盤胞を注入に用いた。注入に用いたES細胞は、継代してから2あるいは3日目にTE処理により分散させ、顕微操作に供するまで4℃で静置した。ES細胞の注入用ピペットとしては、Sutter社製のglass capillary tubing（内径約20μｍ）を用いた。胚保定用ピペットとしては、外径1mmの微小ガラス管（NARISHIGE）を微小電極作製器（Sutter社P-97/IVF）を用いて細く引き延ばした後、マイクロフォージ（De Fonburun）を用いて外径50〜100μｍの部分で切断し、さらに口径を10〜20μｍに加工したものを用いた。注入用ピペットと保定用ピペットは、ピエゾシステム（プライムテックPAMS-CT150）を接続したマイクロマニピュレーター（Lica）に接続した。顕微操作に用いたチャンバーとしては、穴あきスライドグラスにカバーグラスを蜜蝋で接着したものを用い、その上に約10μLの0.3%BSAを加えたHepes-buffered Whitten’s培地のドロップを2個置き、上面をミネラルオイル（シグマ）で覆った。一方のドロップには、約100個のES細胞を入れ、他方には拡張胚盤胞を20個程度入れ、胚1個あたり約１５個のES 細胞を注入した。顕微操作はすべて、倒立顕微鏡下で行った。操作胚は、偽妊娠2日目のICR系受容雌の子宮角に移植した。分娩予定日に至っても産仔を娩出しなかった受容雌については、帝王切開を施し、里親に哺育させた。C57BL/6J系マウスの胚盤胞に、45クローンのES細胞を注入した結果、39クローンにおいて雄キメラマウスが得られた。

（５）uPA遺伝子の生殖系列への伝達の検定
キメラマウスをC57BL/6J系マウスと交配させ、ES細胞由来の産仔が得られるか否かを検定した。キメラマウスの生殖細胞がES細胞に由来していれば、娩出される産仔の毛色は野生色を呈し、C57BL/6J系マウスの胚盤胞に由来していれば黒色を呈することとなる。交配により25ラインにおいて野生色のマウスが誕生し、ES細胞の生殖系列への伝達が確認された。

次に、これらの野生色マウスの尾の一部からDNAを抽出し、PCRにより、uPA遺伝子が伝達されているかを調べた。その結果、14ラインのES細胞由来の産仔においてuPA遺伝子が伝達されていることが確認された。

（６）uPAトランスジェニックマウスにおける血清中のALT値の測定解析
得られたuPA遺伝子を保有するマウスから採血し、血清を得る。その後、ALT値を測定することで、肝臓でのuPA遺伝子発現による影響、すなわち肝細胞の損傷を解析した。ALT値の測定方法は、和光純薬工業『トランスアミナーゼ CII‐テストワコー』cat# 431-30901を用いて行った。サンプル血清は採取後測定時まで−80℃保存した。
ALT測定方法は『トランスアミナーゼ CII‐テストワコー』の添付の標準操作法１の1/20スケールで実施した。まず、ALT用基質酵素液：ALT用酵素剤１びんにALT用基質緩衝液10mLを加え、溶解した。さらに発色試液：発色剤１びんに発色剤溶解液を40mL加え、溶解した。

次に、CORNING 25850 96well U底プレートを氷上に準備した。サンプル血清 1μLをプレートに入れた。プレートを氷上から降ろし、基質酵素液25μLを加え、37℃にて5分間加温した。STND (×1/2希釈：1μL，×1：1 ,2μL)を空いたwellに入れた。発色試液25μLを各wellに加えた。STNDのwellに基質酵素液25μLを加え、37℃にて20分間加温した。反応停止液100μLを各wellに加え、プレートミキサーでよく攪拌した後、60分以内に570nmで吸光度を測定した。STNDの測定値で検量線を作成し、サンプルの活性値を算出した。

測定した14ラインのマウスのうち、3ラインのヘテロマウスにおいてALT値が高値であるマウスが確認できた（図３）。
得られた3ラインのうち、ALT値が高値の2ライン（#1C2および#2C7）を用いて、以下のヒト肝細胞の移植実験を行なった。

実施例３．キメラマウスの作製
(１)免疫不全肝障害マウス
上記実施例２で作製したuPA-Tgマウス（hemizygote, +/-）をSCID-bgマウスに2回バッククロスさせ、uPA-Tg(+/-)SCID(+/+)の遺伝子型を持つマウスを得た。そのマウスの雄より精子を採取し、SCIDマウス（homozygote, +/+）の未受精卵と体外受精後、仮腹に戻した。生まれた子マウスの内、Tg遺伝子の入ったマウスを選択肢、自然交配にて、両方の形質を持つマウスuPA-Tg(+/-)/SCID (+/+)を得た。uPA-Tg(+/-)とuPA-Tg(-/-)の識別は、導入遺伝子に特異的な配列をプライマーに用い、ゲノムPCR法により行った。
フォワードプライマー
5’-GGGCGGCGGTACCGATCCTGAGAACTTCAGGGTGAG-3’（配列番号３）
リバースプライマー
5’-GGGCGGCGGTACCAATTCTTTGCCAAAATGATGAGA-3’（配列番号４）
また、SCID (+/+)、SCID (+/-)とSCID(-/-)の識別は、PCR-RFLP法により行った。

次に、得られたuPA-Tg(+/-)/SCID(+/+)同士を交配させ、uPA-Tg(+/+)/SCID(+/+)と
uPA-Tg(+/-)/SCID(+/+)を得た。uPA-Tg(+/+)とuPA-Tg(+/-)の識別はサザンブロット法により実施した。生後8〜10日目のマウスの尾を約5 mm切断し、3 SDS, proteinase K溶液により可溶化し、フェノールおよびクロロホルム抽出により混在するタンパク質成分を除去した。 DNase-free RNase Aを用いて混在するRNAを分解した後、イソプロパノール沈澱により高分子ゲノムDNAを析出させた。上記のゲノムDNAを70%エタノールで洗浄して風乾させた後、TEに再溶解させた。検体から抽出したゲノムDNA、陽性および陰性コントロールのゲノムDNA、それぞれ５μgをEcoR1で完全消化させ、生成するDNA断片をアガロース電気泳動により分離し、ナイロンメンブレンにトランスファーした。制限酵素EcoR1を用いて、uPA cDNAプローブ/TAからサザンハイブリダイゼーションのプローブに適したDNAフラグメントを精製した(379 bp)。ランダムプライム法により、上記のDNAフラグメントを[32P]ラベルした。ナイロンメンブレンにトランスファーされたDNAフラグメントを、RIラベルしたuPA cDNAプローブとハイブリダイズさせた。洗浄により非特異的に結合したプローブを取り除き、mAlb-uPA-Int2 Tgマウスの候補の個体に導入されている外来遺伝子に由来する放射活性シグナルを、X線フィルムに感光して検出した。野生型遺伝子座由来の1.5 kbの特異的なシグナル、および変異型遺伝子座由来の0.4 kb(wt:1.5kb)の特異的なシグナルを検出して、mAlb-uPA-Int2 Tgマウス個体のジェノタイプを判定した。

(２)ヒト肝細胞移植
ヒト肝細胞としては、BD Gentest社より購入した肝細胞（Lot No.BD85、男児、５才）を使用した。この凍結肝細胞は従来公知の方法（Chise Tateno et al, Near-completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs. Am J Pathol 165:901-912, 2004）に従って融解して用いた。

生後2〜4週齢の#1C2 ホモ7匹、ヘテロ4匹、#2C7ホモ 4匹、ヘテロ7匹のuPA-Tg/SCIDマウスをエーテルで麻酔し、わき腹を約5 mm切開し、脾頭より2.5x10⁵個のヒト肝細胞を注入した後、脾臓を腹腔に戻し縫合した。#1C2 ホモ1匹が移植後30日目に死亡した。

移植後3、6週、その後は毎週、マウス尾静脈より2 μLの血液を採取し、LX-Buffer 200 μLに添加した。免疫比濁法により自動分析装置JEOL BM6050（日本電子）を用いて、マウス血中のヒトアルブミン濃度を測定した。その結果、#1C2ホモ、ヘテロ、#2C7ホモのマウスではヒトアルブミンの増加が認められ、ヒトアルブミン＞7 mg/mLのものが認められた（図４、図５）。#2C7ヘテロマウスはヒトアルブミンの増加は見られなかった（図５）。いずれも順調な体重増加が観察されたが、#2C7ヘテロマウスにおいて総じて体重が高値であった（図５）。

移植後10-12週後（13-15週齢）にキメラマウスを解剖し、肝臓、血液を採取した。肝臓の7つの葉の凍結切片を作製し、ヒト特異的サイトケラチン8／18（hCK8/18）抗体を用いて免疫染色を行った（図６）。凍結切片の面積あたりのhCK8/18陽性面積を求め、置換率とした。その結果、#1C2ホモ、#2C7ホモのマウスで置換率70%以上のものが認められた（図７）。#1C2のヘテロは、60%以上の置換率が観察された（図７）。マウス血中ヒトアルブミン濃度と置換率は、従来公知のキメラマウス（Chise Tateno et al、上掲）におけるそれらと同様相関関係が認められた（図７）。また、相関関係において、#1C2と#2C7の間で、また、ヘテロとホモで明らかな違いは認められなかった（図７）。

生後2〜4週齢の#1C2 ホモ28匹、ヘテロ28匹、#2C7ホモ 18匹、ヘテロ15匹のuPA-Tg/SCIDマウスにヒト肝細胞を移植した。その結果、マウスヒトアルブミン濃度が7 mg/mL以上の高置換キメラマウスになったのは、#1C2 ホモ61%、ヘテロ36%、#2C7ホモ28%、ヘテロ0%であった（図８−１，２、図９−１，２、図１０、図１１）。

1部のマウス（#1C2 ホモ6匹、ヘテロ6匹、#2C7ホモ 4匹）は14または15週齢時にHBVまたはHCVを1x10⁴コピー／匹ずつ、眼窩静脈叢より接種した（図８−１，２、９−１，２）。接種後1週目より、毎週眼窩静脈叢より血液を採取し、HBVおよびHCVウィルスタイターをreal-time quantitative PCR法およびreal-time quantitative RT-PCR法により求めた。

HCVを接種したマウスから採取した血清5 μLからSepaGene RV-R（三光純薬株式会社、東京）を用いてRNA抽出を行い、RNAを1 mM DTT（プロメガ株式会社、東京）と0.4 U/μL ribonuclease inhibitor（タカラバイオ株式会社、滋賀）を含む10 μLのNuclease-free water（Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, USA）に溶解した。溶解したRNAは血清中HCV RNAを定量するまで-80℃で保存した。

PCR反応液は、溶解したRNA原液もしくは希釈したRNAを2.5 μL用いて TaqMan EZ RT-PCR Core Reagents（Life Technologies Corporation）で行う。PCR反応は、50℃にて2分間（Uracil-N-Glycosylase処理）→60℃にて30分間（逆転写反応）→95℃にて5分間（PCR初期活性化）→[95℃にて20秒間（変性）→62℃にて1分間（アニーリング・伸長反応）]×50サイクルで行い、ABI Prism 7500（Life Technologies Corporation）によって反応と解析を行った。使用プライマーおよびプローブは、以下の通りである。
フォワードプライマー：5’-CGGGAGAGCCATAGTGG-3’（配列番号５）
リバースプライマー：5’-AGTACCACAAGGCCTTTCG-3’（配列番号６）
プローブ：5’-CTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3’（配列番号７）
（5末端：FAM 、3末端：TAMRA）

HCV RNAスタンダードにはHCV感染キメラマウスから得られた血清を使用した。この血清は人工HCV RNAからHCV RNA量を決定したものであり、血清中HCV RNA定量するまで-80°Cで保存していた。血清中HCV RNA濃度測定時に、この血清からRNA抽出を行い10倍段階希釈したものをHCV RNAスタンダードとして使用した。このHCV RNAスタンダードを用いる血清中HCV RNA定量の定量範囲は血清中2.1×10⁴ copies/mLから2.1×10⁷ copies/mLである。

HBVを接種したマウスから採取した血清10 μLからスマイテスト EX-R&D（Code: R-35、株式会社医学生物学研究所、長野）を用いてDNA抽出を行い、DNAを20 μLのNuclease-free waterに溶解した。溶解したDNAは、HBV DNA定量するまで-20℃以下で保存した。

PCR反応液は、溶解したDNA 5 μL を用いてTaqMan PCR Core Reagents Kit with AmpliTaq Gold （アプライドバイオシステムズジャパン株式会社、東京）で行った。PCR反応は、50℃にて2分間（プライマーのアニーリング）→95℃にて10分間（PCR初期活性化）→[95℃にて20秒間（変性）→60℃にて1分間（アニーリング・伸長反応）]×53サイクルで行い、ABI Prism 7500（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社、東京）によって反応を行った。また、解析には2ウエルの平均でHBV DNA量を算出した。なお、算出値が0より大きくかつ4.0×10⁴copies / mL未満の場合をPCR陽性、算出値が0の場合をPCR陰性とし、測定対象の2ウエル中どちらともPCR陽性の場合：「＋」（HBV陽性）、2ウエル中どちらともPCR陰性の場合：「−」（HBV陰性）、2ウエル中どちらかが陽性の場合：「±」（HBV擬陽性）と表記した。

使用プライマーおよびプローブは、以下の配列で行った。
フォワードプライマー：5-CACATCAGGATTCCTAGGACC-3（配列番号８）
リバースプライマー：5-AGGTTGGTGAGTGATTGGAG-3（配列番号９）
プローブ：5-CAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTC-3（配列番号１０）
(5末端：FAM 、3末端：TAMRA)

HBVスタンダードは、HBV遺伝子(nucleotides 1〜2182) が挿入されたプラスミッドを用い、OD260 nmの濃度よりコピー数が換算されたものを用いた。血清中HBV DNA定量の測定限界は、4.0×10⁴ copies / mLから4.0×10⁹ copies / mLとした。また、4.0×10⁹ copies / mL以上を示した検体については、希釈を行い測定範囲で実施した。

その結果、感染させたすべてのマウスにおいて、HBV、HCVの感染が確認された（図８−１，２、図９−１，２）。HCVを接種したマウスでは、7/8例で接種後1週目よりHCVが認められ、4週目ころよりプラトーに達した（図８−１、図９−１）。1/8例では4週目よりHCVが検出された（図８−１、図９−１）。HBVでは7/8例で接種後3週においてマウス血清中にHBVが検出され、4週目ではすべてのマウスが感染した。接種後8週目にはプラトーに達した（図８−２、図９−２）。感染効率、ウィルスの増殖速度に関して、#1C2と#2C7の間で、また、#1C2のヘテロとホモで明らかな違いは認められなかった（図８−１，２、図９−１，２）。なお、#2C7のヘテロではマウスヒトアルブミン濃度が7 mg/mL以上の高置換キメラマウスが得られなかったので、感染実験に使用しなかった。

残りのマウス（#1C2 ホモ22匹、ヘテロ22匹、#2C7ホモ 14匹、ヘテロ15匹）は30週齢まで飼育し、ヒトアルブミン濃度の測定を1週間に1度行った。30週目に解剖し、同様に肝臓の置換率を求めた。ヒトアルブミン濃度は、14週齢を過ぎても増加し続けた（図１０、１１）。３０週まで、ほとんどの動物において、マウス血中ヒトアルブミン濃度の低下は見られなかった。解剖時のヒトアルブミン濃度と置換率には相関関係が観察された（図７）。

Claims

以下の工程：
（ｉ）肝特異的プロモーター／エンハンサーおよびそれらの制御下に作動可能に連結されたウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターをコードするcDNAを含むDNA断片によりマウスES細胞を形質転換する工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた形質転換されたマウスES細胞を宿主胚へ注入する工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られたES細胞が注入された宿主胚を代理母マウスの子宮に移植してキメラマウスを得る工程；ならびに
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で得られたキメラマウスを交配し、該DNA断片がヘテロ接合型に導入されているトランスジェニックマウスを得る工程、
を含む、uPA遺伝子をヘテロ接合型で有する肝障害マウスの作製方法。
さらに（ｖ）２〜３週齢の血清ALT値が30（Karmen単位）以上であるトランスジェニックマウスを得る工程を含む、請求項１に記載の方法。
肝特異的プロモーターがアルブミンプロモーターである、請求項１または２に記載の方法。
請求項１〜３の方法により作製された肝障害マウスおよびその一部。
請求項４に記載の肝障害マウスとＳＣＩＤマウスとを交配することによって得られる、免疫不全肝障害マウス。
請求項５に記載の免疫不全肝障害マウスに、ヒト肝細胞を移植することを含む、ヒト肝細胞を含むキメラ肝を有することを特徴とするキメラマウスの作製方法。
請求項６に記載の方法により作製された、ヒト肝細胞を含むキメラ肝を有することを特徴とするキメラマウス。
免疫不全であり、肝特異的プロモーター／エンハンサーおよびそれらの制御下に作動可能に連結されたウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターをコードするcDNAを含むDNA断片をヘテロ接合型で有し、かつヒト肝細胞を含むキメラ肝を有することを特徴とするキメラマウス。
ヒト肝細胞がキメラ肝の肝細胞の少なくとも１０％を占めている、請求項７または８に記載のキメラマウス。
ヒト肝細胞が少なくとも２週間以上、キメラ肝においてその機能および特性を保持している、請求項７または８に記載のキメラマウス。
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、ヒト肝機能に影響を与える物質のスクリーニング方法であって、
（ａ）被検物質を請求項７〜１０のいずれか１項に記載のキメラマウスに投与する工程；
（ｂ）（ａ）において該被検物質が投与された該キメラマウスのヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、および総ビリルビン値からなる群から選択される一以上を測定する工程；ならびに
（ｃ）該被検物質が投与されていない該キメラマウスのヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、および総ビリルビン値と比較して、（ｂ）にて測定されたヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、および総ビリルビン値のいずれか一つ以上の増減を生じる被検物質を選択する工程。
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、被検物質のヒト肝細胞に対する毒性を評価する方法であって、
（ａ）被検物質を請求項７〜１０のいずれか１項に記載のキメラマウスに投与する工程；
（ｂ）（ａ）において該被検物質が投与された該キメラマウスのヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、および総ビリルビン値からなる群から選択される一以上を測定する工程；ならびに
（ｃ）該被検物質が投与されていない該キメラマウスのヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、および総ビリルビン値と比較して、（ｂ）にて測定されたヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、および総ビリルビン値のいずれか一つ以上の増減を指標にして、該被検物質のヒト肝細胞に対する影響を評価する工程。
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、ウイルス性肝炎の治療に有効な物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項７〜１０のいずれか１項に記載のキメラマウスに肝炎ウイルスを接種する工程；
（ｂ）（ａ）において肝炎ウイルスが接種された該キメラマウスに被検物質を投与する工程；
（ｃ）（ｂ）において被検物質が投与された該キメラマウスのヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、総ビリルビン値、ウイルス量、およびウイルス由来タンパク質量からなる群から選択される一以上を測定する工程；ならびに
（ｄ）該被検物質が投与されていない該キメラマウスのヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、総ビリルビン値、ウイルス量、およびウイルス由来タンパク質量と比較して、（ｃ）にて測定されたヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、総ビリルビン値、ウイルス量、およびウイルス由来タンパク質量のいずれか一つ以上の変化を生じる被検物質を選択する工程。
肝炎ウイルスが、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルスまたはE型肝炎ウイルスである、請求項１３に記載の方法。