JP2013230093A - ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータートランスジェニックマウス - Google Patents
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Abstract
【解決手段】以下の工程:(i)肝特異的プロモーター/エンハンサーおよびそれらの制御下に作動可能に連結されたウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターをコードするcDNAを含むDNA断片によりマウスES細胞を形質転換する工程;(ii)工程(i)で得られた形質転換されたマウスES細胞を宿主胚へ注入する工程;(iii)工程(ii)で得られたES細胞が注入された宿主胚を代理母マウスの子宮に移植してキメラマウスを得る工程;ならびに(iv)工程(iii)で得られたキメラマウスを交配し、該DNA断片がヘテロ接合型に導入されているトランスジェニックマウスを得る工程、を含む、uPA遺伝子をヘテロ接合型で有する肝障害マウスの作製方法。
【選択図】なし
Description
本発明はこれらの知見に基づく。
[1] 以下の工程:
(i)肝特異的プロモーター/エンハンサーおよびそれらの制御下に作動可能に連結されたウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターをコードするcDNAを含むDNA断片によりマウスES細胞を形質転換する工程;
(ii)工程(i)で得られた形質転換されたマウスES細胞を宿主胚へ注入する工程;
(iii)工程(ii)で得られたES細胞が注入された宿主胚を代理母マウスの子宮に移植してキメラマウスを得る工程;ならびに
(iv)工程(iii)で得られたキメラマウスを交配し、該DNA断片がヘテロ接合型に導入されているトランスジェニックマウスを得る工程、
を含む、uPA遺伝子をヘテロ接合型で有する肝障害マウスの作製方法。
[2] さらに(v)2〜3週齢の血清ALT値が30(Karmen単位)以上であるトランスジェニックマウスを得る工程を含む、[1]の方法。
[3] 肝特異的プロモーターがアルブミンプロモーターである、[1]または[2]の方法。
[4] [1]〜[3]の方法により作製された肝障害マウスおよびその一部。
[5] [4]の肝障害マウスとSCIDマウスとを交配することによって得られる、免疫不全肝障害マウス。
[6] [5]の免疫不全肝障害マウスに、ヒト肝細胞を移植することを含む、ヒト肝細胞を含むキメラ肝を有することを特徴とするキメラマウスの作製方法。
[7] [6]の方法により作製された、ヒト肝細胞を含むキメラ肝を有することを特徴とするキメラマウス。
[8] 免疫不全であり、肝特異的プロモーター/エンハンサーおよびそれらの制御下に作動可能に連結されたウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターをコードするcDNAを含むDNA断片をヘテロ接合型で有し、かつヒト肝細胞を含むキメラ肝を有することを特徴とするキメラマウス。
[9] ヒト肝細胞がキメラ肝の肝細胞の少なくとも10%を占めている、[7]または[8]のキメラマウス。
[10] ヒト肝細胞が少なくとも2週間以上、キメラ肝においてその機能および特性を保持している、[7]または[8]のキメラマウス。
[11] 以下の(a)〜(c)の工程を含む、ヒト肝機能に影響を与える物質のスクリーニング方法であって、
(a)被検物質を[7]〜[10]のいずれかのキメラマウスに投与する工程;
(b)(a)において該被検物質が投与された該キメラマウスのヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、および総ビリルビン値からなる群から選択される一以上を測定する工程;ならびに
(c)該被検物質が投与されていない該キメラマウスのヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、および総ビリルビン値と比較して、(b)にて測定されたヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、および総ビリルビン値のいずれか一つ以上の増減を生じる被検物質を選択する工程。
[12] 以下の(a)〜(c)の工程を含む、被検物質のヒト肝細胞に対する毒性を評価する方法であって、
(a)被検物質を[7]〜[10]のいずれかのキメラマウスに投与する工程;
(b)(a)において該被検物質が投与された該キメラマウスのヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、および総ビリルビン値からなる群から選択される一以上を測定する工程;ならびに
(c)該被検物質が投与されていない該キメラマウスのヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、および総ビリルビン値と比較して、(b)にて測定されたヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、および総ビリルビン値のいずれか一つ以上の増減を指標にして、該被検物質のヒト肝細胞に対する影響を評価する工程。
[13] 以下の(a)〜(d)の工程を含む、ウイルス性肝炎の治療に有効な物質をスクリーニングする方法であって、
(a)[7]〜[10]のいずれかのキメラマウスに肝炎ウイルスを接種する工程;
(b)(a)において肝炎ウイルスが接種された該キメラマウスに被検物質を投与する工程;
(c)(b)において被検物質が投与された該キメラマウスのヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、総ビリルビン値、ウイルス量、およびウイルス由来タンパク質量からなる群から選択される一以上を測定する工程;ならびに
(d)該被検物質が投与されていない該キメラマウスのヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、総ビリルビン値、ウイルス量、およびウイルス由来タンパク質量と比較して、(c)にて測定されたヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、総ビリルビン値、ウイルス量、およびウイルス由来タンパク質量のいずれか一つ以上の変化を生じる被検物質を選択する工程。
[14] 肝炎ウイルスが、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルスまたはE型肝炎ウイルスである、[13]の方法。
本発明の肝障害マウスは、肝特異的プロモーター/エンハンサーおよびそれらの制御下に作動可能に連結されたウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターをコードするcDNAを含むDNA断片をヘテロ接合型に有し、これによってuPAが肝臓特的に発現されており、マウス本来の肝臓の細胞(特に、肝細胞)の少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%またはそれ以上が障害を受けている、増殖が抑制されている、ならびに/あるいは壊死を生じている。
移植に用いるヒト肝細胞は、正常なヒト肝組織から、コラゲナーゼ灌流法のような常法によって単離したものを用いることができる。また、分離した肝細胞を一旦凍結保存した後解凍して用いることもできる。あるいは、ヒト肝細胞で置換されたキメラマウス肝臓からコラゲナーゼ灌流法のような手法を用いて分離したヒト肝細胞(キメラマウス肝細胞)を新鮮な状態で、または凍結保存したキメラマウス肝細胞を融解して用いることもできる。
本方法は例えば、以下の工程を含む評価方法を挙げることができる。
(a)被検物質を上記キメラマウスに投与する工程;
(b)(a)において被検物質が投与されたキメラマウスのヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、および総ビリルビン値からなる群から選択される一以上を測定する工程;ならびに(c)被検物質が投与されていないキメラマウスのヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、および総ビリルビン値と比較して、(b)において測定されたヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、および総ビリルビン値のいずれか一つ以上の増減を生じる被検物質を選択する工程。
本方法は例えば、以下の工程を含む評価方法を挙げることができる。
(a)被検物質を上記キメラマウスに投与する工程;
(b)(a)において被検物質が投与されたキメラマウスのヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、および総ビリルビン値からなる群から選択される一以上を測定する工程;ならびに
(c)被検物質が投与されていない該キメラマウスのヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、および総ビリルビン値と比較して、(b)において測定されたヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、および総ビリルビン値のいずれか一つ以上の増減を指標にして、被検物質のヒト肝細胞に対する影響を評価する工程。
「被験物質」およびその「投与方法」としては、上に定義したものが挙げられる。
本方法は例えば、以下の工程を含む評価方法を挙げることができる。
(a)上記キメラマウスに肝炎ウイルスを接種する工程;
(b)(a)において肝炎ウイルスが接種されたキメラマウスに被検物質を投与する工程;
(c)(b)において被検物質が投与された該キメラマウスのヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、総ビリルビン値、ウイルス量、およびウイルス由来タンパク質量からなる群から選択される一以上を測定する工程;ならびに
(d)被検物質が投与されていない上記キメラマウスのヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、総ビリルビン値、ウイルス量、およびウイルス由来タンパク質量と比較して、(c)において測定されたヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、総ビリルビン値、ウイルス量、およびウイルス由来タンパク質量のいずれか一つ以上の変化を生じる被検物質を選択する工程。
「被験物質」およびその「投与方法」としては、上に定義したものが挙げられる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
実施例1.DNAマイクロインジェクション法を用いたuPAトランスジェニックマウスの作製
(1)uPA遺伝子とアルブミンプロモーターを含むベクターの作製
uPA遺伝子は、マウス肝臓からAGPC法(acid-guanidinium-isothiocyanate-phenol-chloroform)で全RNAを抽出し、RNase-free水に溶解した。前記で得た全RNAを用いて、公開されたデータベースに登録されるuPA遺伝子の配列(アクセッション番号:NM008873(配列番号11))より作成したuPA遺伝子特異的プライマー(1341番塩基から1360塩基長のアンチセンス配列)及びLongRange Reverse Transcriptase(Qiagen社製)による逆転写反応を、25℃にて10分間、次いで、42℃にて90分間行い、逆転写酵素不活化処理を85℃にて5分間行った後、RNaseH(Invitrogen社製)を添加して37℃にて20分間処理してmRNAを消化し、cDNAのみを残存させた。合成されたcDNAをPCR反応の鋳型としてPCRを行った。上記反応液を全量の1/10添加し、酵素はPhusion DNA polymerase(Fynnzymes社製)を用いた。PCRプライマー(39番塩基から61塩基長のセンス配列)は、uPA遺伝子配列(アクセッション番号:NM008873)より作製した。増幅される断片は、PCR反応では塩基番号39-1360の長さである。えられたDNA断片を後述のマウスアルブミンプロモーター/エンハンサーを持った発現プラスミドに導入し「mAlb uPAInt2」を構築した。「mAlb uPAInt2」遺伝子の構成を図1に示す。マウスアルブミンのエンハンサー/プロモーターの下流にラビットβグロビンの第2エキソン、イントロン、第3エキソン・マウスuPAのORF部分・ラビットβグロビンの第3エキソン中のpolyAシグナルを結合したものである。
DNA断片の濃度を3ng/μLになるように調製した後、CB-17/IcrとScid-beige交雑系マウスから採取した前核期受精卵に注入した。受精卵へのDNAの注入はマイクロインジェクション法によって行った。DNAを注入した受精卵748個中635個が生存し、このうち469個が2細胞期胚にまで分化した。この2細胞期胚を、予め偽妊娠させたレシピエントマウスICR系統の卵管内に移植した。産仔は108匹得られた。得られた産仔がuPA遺伝子を含むかどうか、PCR法によって解析した(臨床研)。PCRの結果、1個体に目的のDNAが含まれていることを確認した。この1匹から1ラインのuPAトランスジェニックマウス系統を確立した。
得られたuPA遺伝子を保有するマウスから採血し、血清を得た。その後、ALT値を測定することで、肝臓でのuPA遺伝子発現による影響、すなわち肝細胞の損傷を解析した。ALT値の測定方法は、和光純薬工業 『トランスアミナーゼ CII‐テストワコー』cat# 431-30901を用いて行った。サンプル血清は採取後測定時まで−80℃にて保存した。
ALT測定方法は『トランスアミナーゼ C II‐テストワコー』の添付の標準操作法1の1/20スケールで実施した。まず、ALT用基質酵素液:ALT用酵素剤1びんにALT用基質緩衝液10mLを加え、溶解した。さらに発色試液:発色剤1びんに発色剤溶解液を40mL加え、溶解した。
(1)uPA遺伝子を挿入したES 細胞の樹立
本実施例では、uPA遺伝子挿入用ベクター「mAlb uPAInt2ES」(図2)を構築して用いた。これはES細胞での薬剤選択性を付与するために「mAlb uPAInt2」プラスミドにさらにSV40プロモーターで発現するネオマイシン耐性遺伝子を導入したものである。エレクトロポレーション法により129SvEvマウスより得られたES細胞に導入し、次いでG418により選択培養を行った。得られたG418耐性コロニーについて、PCRにより遺伝子が導入されたES細胞の検定を行った。以下、具体的に説明する。
遺伝子導入後5日目から、以下のようにして、出現したG418耐性コロニーを24穴のプレートに継代した。即ち、ピペットマン(ギルソン)を用いてG418耐性コロニーを150μLのトリプシン/EDTA溶液を含む96穴のマイクロプレートに移し換え、20分間37℃のインキュベーター内で処理した後、ピペットマンでピペッティングすることによって単一細胞にした。この細胞懸濁液を24穴のプレートに移し換え培養を継続した。2日後、24穴のプレート上の細胞を凍結保存用とDNA抽出用の2つに分割した。即ち、細胞にトリプシン/EDTAを500μL加えて20分間37℃のインキュベーター内で処理し、ES培地を500μL加えてピペットマンで静かにピペッティングすることによって単一細胞にした。その後、1mLのES培地の入った24穴プレートに細胞懸濁液の半分を移し、元の24穴プレートにもES培地を1mL加えた。さらに2日後、片方の24穴プレートの培地を抜いてから、ES培地に終濃度が10%の牛胎児血清と終濃度が10%のジメチルスルホキシド(DMSO)(Sigma社 D-5879)を添加した凍結用培地を1mL入れて、シールした後-70℃で凍結保存した。
使用したPCRプライマーはラビットβグロビン中に設定した。配列は、センスプライマー:GGGCGGCGGTACCGATCCTGAGAACTTCAGGGTGAG(配列番号1)、アンチセンスプライマー:GGGCGGCGGTACCAATTCTTTGCCAAAATGATGAGA(配列番号2)である。反応はAmpiTaqGold(ABI社)の添付方法に従って行った。95℃で9分間かけて酵素を活性化した後に94℃にて30秒間(変性)、63℃にて30秒間(アニーリング)、72℃にて1分間(伸長)の反応を40回繰り返した。終了後反応液を2%アガロースゲルで泳動してPCRプロダクトの確認を行った。
遺伝子導入が確認されたES細胞クローンについて、C57BL/6J系マウスの胚盤胞をホスト胚としてキメラ胚を作製し、それを偽妊娠マウスの子宮角に移植して産仔を得た。ホスト胚の採取は、妊娠3日目に、100μMトリプシン/EDTAを添加したWhitten’s培地で、卵管と子宮を灌流することによって行った。8細胞期胚または桑実胚を24時間Whitten’s培地で培養し、得られた胚盤胞を注入に用いた。注入に用いたES細胞は、継代してから2あるいは3日目にTE処理により分散させ、顕微操作に供するまで4℃で静置した。ES細胞の注入用ピペットとしては、Sutter社製のglass capillary tubing(内径約20μm)を用いた。胚保定用ピペットとしては、外径1mmの微小ガラス管(NARISHIGE)を微小電極作製器(Sutter社P-97/IVF)を用いて細く引き延ばした後、マイクロフォージ(De Fonburun)を用いて外径50〜100μmの部分で切断し、さらに口径を10〜20μmに加工したものを用いた。注入用ピペットと保定用ピペットは、ピエゾシステム(プライムテックPAMS-CT150)を接続したマイクロマニピュレーター(Lica)に接続した。顕微操作に用いたチャンバーとしては、穴あきスライドグラスにカバーグラスを蜜蝋で接着したものを用い、その上に約10μLの0.3%BSAを加えたHepes-buffered Whitten’s培地のドロップを2個置き、上面をミネラルオイル(シグマ)で覆った。一方のドロップには、約100個のES細胞を入れ、他方には拡張胚盤胞を20個程度入れ、胚1個あたり約15個のES 細胞を注入した。顕微操作はすべて、倒立顕微鏡下で行った。操作胚は、偽妊娠2日目のICR系受容雌の子宮角に移植した。分娩予定日に至っても産仔を娩出しなかった受容雌については、帝王切開を施し、里親に哺育させた。C57BL/6J系マウスの胚盤胞に、45クローンのES細胞を注入した結果、39クローンにおいて雄キメラマウスが得られた。
キメラマウスをC57BL/6J系マウスと交配させ、ES細胞由来の産仔が得られるか否かを検定した。キメラマウスの生殖細胞がES細胞に由来していれば、娩出される産仔の毛色は野生色を呈し、C57BL/6J系マウスの胚盤胞に由来していれば黒色を呈することとなる。交配により25ラインにおいて野生色のマウスが誕生し、ES細胞の生殖系列への伝達が確認された。
得られたuPA遺伝子を保有するマウスから採血し、血清を得る。その後、ALT値を測定することで、肝臓でのuPA遺伝子発現による影響、すなわち肝細胞の損傷を解析した。ALT値の測定方法は、和光純薬工業 『トランスアミナーゼ CII‐テストワコー』cat# 431-30901を用いて行った。サンプル血清は採取後測定時まで−80℃保存した。
ALT測定方法は『トランスアミナーゼ CII‐テストワコー』の添付の標準操作法1の1/20スケールで実施した。まず、ALT用基質酵素液:ALT用酵素剤1びんにALT用基質緩衝液10mLを加え、溶解した。さらに発色試液:発色剤1びんに発色剤溶解液を40mL加え、溶解した。
得られた3ラインのうち、ALT値が高値の2ライン(#1C2および#2C7)を用いて、以下のヒト肝細胞の移植実験を行なった。
(1)免疫不全肝障害マウス
上記実施例2で作製したuPA-Tgマウス(hemizygote, +/-)をSCID-bgマウスに2回バッククロスさせ、uPA-Tg(+/-)SCID(+/+)の遺伝子型を持つマウスを得た。そのマウスの雄より精子を採取し、SCIDマウス(homozygote, +/+)の未受精卵と体外受精後、仮腹に戻した。生まれた子マウスの内、Tg遺伝子の入ったマウスを選択肢、自然交配にて、両方の形質を持つマウスuPA-Tg(+/-)/SCID (+/+)を得た。uPA-Tg(+/-)とuPA-Tg(-/-)の識別は、導入遺伝子に特異的な配列をプライマーに用い、ゲノムPCR法により行った。
フォワードプライマー
5’-GGGCGGCGGTACCGATCCTGAGAACTTCAGGGTGAG-3’(配列番号3)
リバースプライマー
5’-GGGCGGCGGTACCAATTCTTTGCCAAAATGATGAGA-3’(配列番号4)
また、SCID (+/+)、SCID (+/-)とSCID(-/-)の識別は、PCR-RFLP法により行った。
uPA-Tg(+/-)/SCID(+/+)を得た。uPA-Tg(+/+)とuPA-Tg(+/-)の識別はサザンブロット法により実施した。生後8〜10日目のマウスの尾を約5 mm切断し、3 SDS, proteinase K溶液により可溶化し、フェノールおよびクロロホルム抽出により混在するタンパク質成分を除去した。 DNase-free RNase Aを用いて混在するRNAを分解した後、イソプロパノール沈澱により高分子ゲノムDNAを析出させた。上記のゲノムDNAを70%エタノールで洗浄して風乾させた後、TEに再溶解させた。検体から抽出したゲノムDNA、陽性および陰性コントロールのゲノムDNA、それぞれ5μgをEcoR1で完全消化させ、生成するDNA断片をアガロース電気泳動により分離し、ナイロンメンブレンにトランスファーした。制限酵素EcoR1を用いて、uPA cDNAプローブ/TAからサザンハイブリダイゼーションのプローブに適したDNAフラグメントを精製した(379 bp)。ランダムプライム法により、上記のDNAフラグメントを[32P]ラベルした。ナイロンメンブレンにトランスファーされたDNAフラグメントを、RIラベルしたuPA cDNAプローブとハイブリダイズさせた。洗浄により非特異的に結合したプローブを取り除き、mAlb-uPA-Int2 Tgマウスの候補の個体に導入されている外来遺伝子に由来する放射活性シグナルを、X線フィルムに感光して検出した。野生型遺伝子座由来の1.5 kbの特異的なシグナル、および変異型遺伝子座由来の0.4 kb(wt:1.5kb)の特異的なシグナルを検出して、mAlb-uPA-Int2 Tgマウス個体のジェノタイプを判定した。
ヒト肝細胞としては、BD Gentest社より購入した肝細胞(Lot No.BD85、男児、5才)を使用した。この凍結肝細胞は従来公知の方法(Chise Tateno et al, Near-completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs. Am J Pathol 165:901-912, 2004)に従って融解して用いた。
フォワードプライマー:5’-CGGGAGAGCCATAGTGG-3’(配列番号5)
リバースプライマー:5’-AGTACCACAAGGCCTTTCG-3’(配列番号6)
プローブ:5’-CTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3’(配列番号7)
(5末端:FAM 、3末端:TAMRA)
フォワードプライマー:5-CACATCAGGATTCCTAGGACC-3(配列番号8)
リバースプライマー:5-AGGTTGGTGAGTGATTGGAG-3(配列番号9)
プローブ:5-CAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTC-3(配列番号10)
(5末端:FAM 、3末端:TAMRA)
Claims (14)
- 以下の工程:
(i)肝特異的プロモーター/エンハンサーおよびそれらの制御下に作動可能に連結されたウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターをコードするcDNAを含むDNA断片によりマウスES細胞を形質転換する工程;
(ii)工程(i)で得られた形質転換されたマウスES細胞を宿主胚へ注入する工程;
(iii)工程(ii)で得られたES細胞が注入された宿主胚を代理母マウスの子宮に移植してキメラマウスを得る工程;ならびに
(iv)工程(iii)で得られたキメラマウスを交配し、該DNA断片がヘテロ接合型に導入されているトランスジェニックマウスを得る工程、
を含む、uPA遺伝子をヘテロ接合型で有する肝障害マウスの作製方法。 - さらに(v)2〜3週齢の血清ALT値が30(Karmen単位)以上であるトランスジェニックマウスを得る工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 肝特異的プロモーターがアルブミンプロモーターである、請求項1または2に記載の方法。
- 請求項1〜3の方法により作製された肝障害マウスおよびその一部。
- 請求項4に記載の肝障害マウスとSCIDマウスとを交配することによって得られる、免疫不全肝障害マウス。
- 請求項5に記載の免疫不全肝障害マウスに、ヒト肝細胞を移植することを含む、ヒト肝細胞を含むキメラ肝を有することを特徴とするキメラマウスの作製方法。
- 請求項6に記載の方法により作製された、ヒト肝細胞を含むキメラ肝を有することを特徴とするキメラマウス。
- 免疫不全であり、肝特異的プロモーター/エンハンサーおよびそれらの制御下に作動可能に連結されたウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターをコードするcDNAを含むDNA断片をヘテロ接合型で有し、かつヒト肝細胞を含むキメラ肝を有することを特徴とするキメラマウス。
- ヒト肝細胞がキメラ肝の肝細胞の少なくとも10%を占めている、請求項7または8に記載のキメラマウス。
- ヒト肝細胞が少なくとも2週間以上、キメラ肝においてその機能および特性を保持している、請求項7または8に記載のキメラマウス。
- 以下の(a)〜(c)の工程を含む、ヒト肝機能に影響を与える物質のスクリーニング方法であって、
(a)被検物質を請求項7〜10のいずれか1項に記載のキメラマウスに投与する工程;
(b)(a)において該被検物質が投与された該キメラマウスのヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、および総ビリルビン値からなる群から選択される一以上を測定する工程;ならびに
(c)該被検物質が投与されていない該キメラマウスのヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、および総ビリルビン値と比較して、(b)にて測定されたヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、および総ビリルビン値のいずれか一つ以上の増減を生じる被検物質を選択する工程。 - 以下の(a)〜(c)の工程を含む、被検物質のヒト肝細胞に対する毒性を評価する方法であって、
(a)被検物質を請求項7〜10のいずれか1項に記載のキメラマウスに投与する工程;
(b)(a)において該被検物質が投与された該キメラマウスのヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、および総ビリルビン値からなる群から選択される一以上を測定する工程;ならびに
(c)該被検物質が投与されていない該キメラマウスのヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、および総ビリルビン値と比較して、(b)にて測定されたヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、および総ビリルビン値のいずれか一つ以上の増減を指標にして、該被検物質のヒト肝細胞に対する影響を評価する工程。 - 以下の(a)〜(d)の工程を含む、ウイルス性肝炎の治療に有効な物質をスクリーニングする方法であって、
(a)請求項7〜10のいずれか1項に記載のキメラマウスに肝炎ウイルスを接種する工程;
(b)(a)において肝炎ウイルスが接種された該キメラマウスに被検物質を投与する工程;
(c)(b)において被検物質が投与された該キメラマウスのヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、総ビリルビン値、ウイルス量、およびウイルス由来タンパク質量からなる群から選択される一以上を測定する工程;ならびに
(d)該被検物質が投与されていない該キメラマウスのヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、総ビリルビン値、ウイルス量、およびウイルス由来タンパク質量と比較して、(c)にて測定されたヒトアルブミン濃度、体重曲線、肝重量体重比、総アルブミン値、総タンパク値、ALT値、AST値、総ビリルビン値、ウイルス量、およびウイルス由来タンパク質量のいずれか一つ以上の変化を生じる被検物質を選択する工程。 - 肝炎ウイルスが、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルスまたはE型肝炎ウイルスである、請求項13に記載の方法。
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