KR20230036561A - CRISPR/Cas9 매개 폴리시스트론성 종양유전자 발현 벡터 및 이를 이용한 동물 종양 모델 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 CRISPR/Cas9 매개 폴리시스트론성 종양유전자 발현 벡터 및 이를 이용한 동물 종양 모델에 관한 것으로, 본 발명의 종양 돼지 모델은 임상적으로 효용가치가 떨어지는 설치류 모델에 대한 새로운 대체 모델로 종양에 대한 기초 및 전임상연구의 활용에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

CRISPR/Cas9 매개 폴리시스트론성 종양유전자 발현 벡터 및 이를 이용한 동물 종양 모델 {CRISPR/Cas9-mediated polystronic oncogene expression vector and animal tumor model using same}
본 발명은 CRISPR/Cas9 매개 폴리시스트론성 종양유전자 발현 벡터 및 이를 이용한 동물 종양 모델에 관한 것이다.
암 질환은 우리 신체를 이루고 있는 세포 유전체에 유전학 및 후생유전학적 변이가 축적되어 나타나는 질환으로 보고되고 있다. 현재 인간의 암 질환에 관한 연구는 대체로 분자적인 관점에서 암의 메커니즘에 대한 다양한 가설 및 실험적 접근을 통해 이루어지고 있으며, 이를 바탕으로 효과적인 새로운 암 치료법 개발을 목표로 한다. 최근 약 10여 년 동안 암 연구 동향 보면, 변이된 암세포 자체적인 특징도 물론 중요하지만, 암 조직 내에서 관찰되는 다양한 기질 세포 및 면역세포와의 상호작용과 물리화학적으로 변화된 특수한 환경으로 정의되는 암미세환경 (tumor microenvironment)이 발달 촉진 및 항암제 저항성 기전 등에 많은 영향을 준다는 것을 알 수 있다. 암미세환경은 암이 발달하면서 체내 암조직에서 만들어지는 독특한 환경으로, 최근 암 연구에서는 실제로 인간의 암에서 관찰되는 암미세환경의 특징을 가장 잘 모방할 수 있는 최적화된 체내 (in vivo) 실험 모델이 필수적이다.
현재 암 연구 분야에서 가장 많이 사용하는 실험동물은 마우스와 렛드와 같은 설치류 동물이며, 지금까지 생명 연구 분야에 있어 활용된 주요 모델로 수많은 전임상학적 결과를 도출하는데 중요한 초석이되어 왔다. 그러나 최근 몇 년 동안 신체 활동, 면역 체계, 신진 대사 및 심지어 미생물 군집의 생물학적 차이로 인해 발생하는 이러한 설치류 모델의 한계로 인해, 설치류 종양 모델에서 유의미하게 관찰된 분자적인 기전, 약물에 대한 반응성, 약리학적/약동학적 특성 및 부작용 등이 실제 환자에서 전혀 다르게 나타날 수 있다는 것이 많은 임상시험에서 제시되었다. 이러한 설치류 동물 모델의 한계점에 대한 한 가지 대안은 인간과 더 해부학적, 유전적, 생리적으로 유사한 돼지와 같은 큰 동물을 사용하여 새로운 동물 종양 모델을 개발하는 것이다.
질병 관련 유전자의 제어되지 않은 발현이 관심 질병과 관련되지 않은 여러 경로를 방해할 수 있다. 따라서, 정교한 유전 공학 기술은 인간 질병의 형질전환 동물 모델을 개발하는 데 매우 중요하다. 3 세대 유전자 편집 기술인 CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9)의 개발로 간편하면서도 효과적으로 형질전환이 가능하게 되었다. 이 시스템에서 20-뉴클레오타이드 gRNA는 Watson-Crick 염기 쌍을 통해 외래 DNA에서 3'측면 NGG PAM (protospacer adjacent motif) 서열 바로 뒤의 표적 서열을 인식한 후 Cas9 엔도뉴클레아제가 두 개의 뉴클레아제 도메인인 HNH 및 RuvC를 통해 두 가닥을 절단한다. 이중 가닥 절단 (double strand break; DSB)이 생성 된 다음 두 가지 세포 복구 시스템인 NHEJ (Non-homologous end joining) 및 HDR (homology-directed repair) 경로 중 하나를 통해 복구된다. 전자는 DSB 부위 주변에 무작위 삽입 또는 결실 돌연변이를 생성하고, 후자는 설계된 기증자 템플릿에서 의도한 DNA 서열을 정확하게 삽입한다. 이와 함께, 체세포를 이용해 체세포의 유전정보와 동일한 개체를 복제할 수 있는 생식기술인 체세포 핵이식 (somatic cell nuclear transfer, SCNT)기법의 발달은 형질전환 돼지 모델 개발 연구를 가속화하였다.
종래의 선행기술로서 대한민국 등록특허 10-2159317에는 CRISPR/Cas9 시스템을 도입하여 TP53 유전자를 특이적으로 넉아웃 (knock-out)한 개를 개시하고 있다. 또한, J-T Kang et al (2016)에는 CRISPR/Cas9 벡터를 이용하여 종양 억제 유전자인 RUNX3 녹아웃한 돼지를 개시하고 있다. 또한, Martin Fogtmann Berthelsen et al (2021)에는 FlpO에 의해 매개되어 조절되는 Cas9의 조건부 발현/활성화 및 sgRNA의 바이러스 전달에 의해 TP53, STK11, KRAS 유전자 등의 돌연변이가 체세포에 도입될 수 있는 미니피그를 개시하고 있다.
이에 본 발명자들은 CRISPR/Cas9 시스템에 의해 제어되는 유도성 종양 유전자 발현 시스템인 CRI-CPC ( CRI SPR/Cas9-based C onditional P olycistronic gene expression C assette)를 시도하여 성공적으로 구축하였고, CRI-CPC 시스템 및 SCNT 기술을 사용하여 인간 암의 새로운 형질 전환 돼지 모델을 개발함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 종양 동물 모델 제작용 재조합 발현 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 발현 벡터가 도입된 종양 동물모델 제작용 형질전환 세포주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 체세포의 핵을, 탈핵된 난자에 이식하여 형성한 핵 이식란을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터가 도입된 핵 공여 세포의 핵을 탈핵된 난자에 이식하여 난자를 생산하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 종양 동물 모델의 제작 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 제작된 인간을 제외한 종양 동물 모델을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 동물 모델을 이용하여 항암제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 종양성 유전자 (oncogene); 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 gRNA를 암호화하는 유전자; Cas9 단백질을 암호화하는 유전자; 및 상기 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터; 를 포함하는 종양 동물 모델 제작용 재조합 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터가 도입된 종양 동물모델 제작용 형질전환 세포주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 체세포의 핵을, 탈핵된 난자에 이식하여 형성한 핵 이식란을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 재조합 벡터가 도입된 핵 공여 세포의 핵을 탈핵된 난자에 이식하여 난자를 생산하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 종양 동물 모델의 제작 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 방법으로 제작된 인간을 제외한 종양 동물 모델을 제공한다.
또한 본 발명은 1) 제12항의 종양 동물 모델에 항암제 후보물질을 투여하는 단계; 및 2) 상기 후보물질을 투여한 동물모델을 후보물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 후보물질에 의해 종양형성이 개선되거나 치료되는 경우 이를 항암제로 판단하는 단계; 를 포함하는 항암제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 CRISPR/Cas9 매개 폴리시스트론성 종양유전자 발현 벡터 및 이를 이용한 동물 종양 모델에 관한 것으로, 본 발명의 종양 돼지 모델은 임상적으로 효용가치가 떨어지는 설치류모델에 대한 새로운 대체 모델로 종양에 대한 기초 및 전임상연구의 활용에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a는 DsRed, SV40LT 항원 및 HRASG12V를 함유하는 2A 펩티드 매개 폴리시스트론 종양 유전자 발현 컨스트럭트 (DsRed-P2A-SV40LT-T2A-HRASG12V; DSH)를 나타낸 도이다.
도 1b는 각 SV40LT의 형질 도입 후 HRASG12V, SV40LT, 인산화된 AKT (pAKT), 전체 AKT (tAKT), pERK1/2 및 tERK1/2 단백질 수준을 보여주는 면역 블롯 결과를 나타낸 도이다.
도 1c는 대조군 및 DSH 형질 도입된 돼지 섬유아세포의 적색 형광을 보여주는 대표적인 형광 현미경 이미지이다.
도 1d는 대조군 및 DSH 형질 도입된 돼지 섬유아세포의 세포 형태를 보여주는 대표적인 이미지이다.
도 1e는 반고체 한천 배양 조건에서 성장한 대조군 및 DSH 형질 도입된 세포의 콜로니 형성을 보여주는 대표적인 이미지이다.
도 1f는 반고체 한천 배양에서 생성된 콜로니 수의 정량 데이터를 나타낸 도이다.
도 2a는 CRI-CPC 시스템 및 CMV-Cas9#1-EGFP-pA-Cas9#2-DsRed-2A-SV40LT-2A-HRASG12V-WPRE (CMV-GCas9-DSH) 벡터 구성을 나타낸 도이다.
도 2b는 CMV-GCas9-DSH 컨스트럭트의 형질 감염 후 EGFP 발현 돼지 섬유 아세포의 대표적인 형광 이미지를 나타낸 도이다.
도 2c는 CMV-GCas9-DSH 컨스트럭트의 형질 감염 2주 후 형광 활성화 세포 분류기 (FACS)를 사용하여 안정한 EGFP 발현 세포 분리를 보여주는 결과를 나타낸 도이다.
도 2d는 단일 세포 확장 후 7 개의 EGFP 발현 클론의 대표적인 형광 이미지를 나타낸 도 (스케일 바: 100μm)이다.
도 2e는 각 게놈에서 CMV-GCas9-DSH 컨스트럭트를 검출하기 위해 게놈 DNA를 사용한 PCR 증폭 분석을 보여주는 겔 전기 영동 이미지이다.
도 3a는 이식 전 CRI-CPC 기증자 유래 SCNT 배아의 난할 (cleavage) 및 배반포 형성 속도 평가를 나타낸 도이다 (p＜0.05, n=3, 평균 ± SEM, † 총 난모세포의 백분율; * 총 융합된 난모세포의 백분율).
도 3b는 이식 전 발달 과정에서 공여자 세포 및 SCNT 배아를 발현하는 EGFP의 대표적인 이미지이다.
도 4a는 CRI-CPC 새끼 돼지의 사진이다.
도 4b는 밝은 필드에서 촬영한 EGFP를 표현하는 새끼 돼지의 사진이다.
도 4c는 자외선 아래에서 EGFP 필터로 촬영한 새끼 돼지의 사진이다.
도 4d는 1차 탯줄 세포주의 EGFP 발현을 나타낸 도이다 (스케일 바: 250μm)
도 4e는 CRI-CPC 새끼 돼지의 탯줄 조직에서 분리된 게놈 DNA의 PCR 증폭을 보여주는 겔 전기 영동 이미지이다.
도 5a는 P#5 CRI-CPC 돼지에서 얻은 정자의 형태 및 공초점현미경을 통해 관찰된 EGFP 발현을 나타낸 도이다.
도 5b는 정상 및 P#5 CRI-CPC 새끼 돼지의 정자에서 분리된 게놈 DNA 및 cDNA를 사용한 PCR 분석 결과를 나타낸 도이다 (스케일 바: 30μm)
도 5c는 배양 2일 및 7일에 측정된 P#5 CRI-CPC 돼지 정자의 체외 수정 결과를 나타낸 도이다.
도 5d는 2일 배아 및 7일 배반포의 밝은 필드 및 녹색 형광 이미지이다.
도 6a는 자연 교배의 개략도를 나타낸 도이다.
도 6b는 각 CRI-CPC 새끼 돼지에서 추출한 게놈 DNA를 사용하여 성별을 식별한 결과를 나타낸 도이다.
도 6c는 게놈에서 CMV-GCas9-DSH 컨스트럭트를 검출하는 PCR 분석 결과를 나태낸 도이다.
도 7a는 각각 대조군 및 Cas9 벡터의 형질 도입 후 각 F1#5, F1#2, F1#3 및 F1#4 새끼 돼지로부터 분리된 섬유아세포의 세포 형태를 보여주는 대표적인 이미지이다 (스케일 바: 200μm).
도 7b는 CRI-CPC 활성화 후 각 P#5, F1#2, F1#3 및 F1#4 새끼 돼지의 세포에서 녹색 및 적색 형광 단백질을 보여주는 대표적인 이미지이다 (스케일 바: 100μm).
도 7c는 FACS 장비를 사용하여 표시된 각 세포에서 DsRed 양성 집단의 정량 데이터를 나타낸 도이다.
도 7d는 HRASG12V 및 SV40LT의 유도된 노출 및 Cas9 형질 도입 후 각 표시된 세포에서 ERK1/2의 증가된 인산화를 보여주는 면역 블롯 데이터 결과를 나타낸 도이다.
도 7e는 반고체 한천에서 성장한 각 표시된 세포에서 생성된 콜로니를 보여주는 대표적인 이미지이다 (스케일 바: 200μm)
도 7f는 반고체 한천 배양에서 콜로니 수의 정량 데이터를 나타낸 도이다(***, p값＜ 0.001).
도 8a는 F 및 R 프라이머 세트를 사용하여 증폭된 것으로 예상되는 게놈 DNA PCR 산물의 사전 재배열 및 재배열 후 크기를 보여주는 실험 계획을 나타낸 도이다.
도 8b는 CRI-CPC 활성화가 P#5 및 F1#3 유래 섬유아세포에서 Cas9 표적 부위를 재배열하였지만 F1#2 및 F1#4 유래 세포는 그렇지 않음을 보여주는 게놈 DNA PCR 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 8c는 P#5 게놈 DNA에서 얻은 예상 재배열된 크기의 PCR 산물을 사용한 시퀀싱 분석을 나타낸 도이다.
도 8d는 F1#3 게놈 DNA에서 얻은 예상 재배열된 크기의 PCR 산물을 사용한 시퀀싱 분석을 나타낸 도이다.
도 9는 Cas9 매개 유도성 CRI-CPC 시스템의 개략도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 종양성 유전자 (oncogene); 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 가이드 RNA (guide RNA; gRNA)를 암호화하는 유전자; Cas9 단백질을 암호화하는 유전자; 및 상기 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터; 를 포함하는, 종양 동물 모델 제작용 재조합 발현 벡터를 제공한다.
상기 종양성 유전자(oncogene)는 암세포를 만드는 유전물질, 즉 암을 유발시키는 능력을 가진 유전자를 의미하며, 발암유전자 또는 암유전자라고도 한다. 상기 종양성 유전자는 SV40 large T (SV40LT), ras패밀리(H-ras, K-ras, N-ras), mos, raf패밀리(raf, A-raf1, B-raf, rel, ski, sno), EGFR, FGF 패밀리 (bFGF, aFGF, int2/FGF3, hst1/K-fgf/FGF4, FGF5, hst2/FGF6, KGF, AIGF, erbB1, erbB2/neu (HER2, NGL), ros, met, trkA, trkB, trkC, ret, kit, PDGFRβ, flt1, flt3, flk1/kdr, flk2, FGFR패밀리 (FGFR2/K-sam/bek, KGFR, FGFR1/Nsam/flg/Cek1/bF, FGF3/Cek3, FGFR4), abl, src패밀리(src, yes, fyn, fgr, lyn, lck, hck, blk, csk, fps, fes, mas, gsp, gip, , myc패밀리(myc, N-myc, L-myc, max), myb패밀리(myb, A-myb, B-myb), fos패밀리 (fos, fosB, fra1, fra2), jun 패밀리(jun, junB, junD, jif1), ets패밀리 (ets1, ets2, erg, elk1, Spi1/PU.1, fli1, GABPa, elf1, SAP1), db1, ect2, bcl1, bcl2, bcl3, bcl6, bcr, pml, pbx1/prf, PIK3CA, all1/mll, aml1, dec, ews, tls/fus 및 tel 중에서 선택된 하나 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직한 실시예에서 상기 종양 유전자는 SV40 large T (SV40LT) 및 HRASG12V이다.
상기 가이드 RNA (gRNA)는 표적 DNA에 특이적인 RNA로, gRNA는 Cas9 단백질과 복합체를 형성할 수 있고, Cas9 단백질을 표적 DNA에 가져올 수 있다.
상기 gRNA는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 Cas9 단백질은 CRISPR/Cas9 시스템에서 필수적인 단백질 요소로써, CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA(trans-activating crRNA: tracrRNA)로 불리는 두 RNA와 복합체를 형성하여, 활성 엔도뉴클레아제 또는 니카아제(nickase)로 작용할 수 있다. 상기 Cas9 단백질은 스타필로코커스 (Staphylococcus) 속, 스트렙토코커스 (Streptococcus) 속, 네이세리아 (Neisseria) 속, 파스테우렐라 (Pasteurella) 속, 프란시셀라 (Francisella) 속, 캄필로박터 (Campylobacter) 속 유래인 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 sp. (Streptococcus sp.), 바람직하게는 스트렙토코커스 피요젠스 (Streptococcus pyogens)와 같은 유기체로부터 분리된 것 또는 재조합 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 스트렙토코커스 피요젠스로부터 유래한 Cas9 단백질은 NGG 트리뉴클레오타이드 (trinucleotide)를 인식할 수 있다.
상기 Cas9 단백질을 암호화하는 아미노산 서열은 서열번호 3의 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "CRISPR/Cas9 시스템"이란 미생물의 면역체계로 알려진 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 시스템을 이용해 원하는 유전자 염기서열을 절단하도록 고안된 것으로서, 고정적 구성요소로서 Cas9 단백질을 포함하고, 가변적 구성요소로서 타겟 유전자에 특이적인 가이드 RNA를 포함한다. 이때 타겟 유전자의 조건은 23bp 길이이고 두 개의 구아닌 염기 (GG)로 끝나기만 하면 된다. 가이드 RNA가 타겟 유전자를 인식하면 가이드 RNA에 Cas9 단백질이 결합하여 뉴클레아제로 작용하여 타겟 유전자의 하류 약 3bp에 위치한 두 개의 구아닌 염기 (GG)를 인식하여 절단함으로써 DNA 이중가닥 손상 (DSB)을 유발한다.
상기 프로모터는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며, 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. 상기 프로모터는 CMV 프로모터 (cytomegalovirus promoter), U6 프로모터, EF1-alpha (elongation factor 1-a) 프로모터, EF1-alpha short(EFS) 프로모터, SV40 프로모터, 아데노바이러스 프로모터 (major late promoter), pLλ 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, HSV의 사 프로모터, SV40E1 프로모터, 호흡기 세포융합 바이러스 (Respiratory syncytial virus; RSV) 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터 (metallothionin promoter), β-액틴 프로모터, 유비퀴틴 C 프로모터, 인간 IL-2(human interleukin-2) 유전자 프로모터, 인간 림포톡신 (human lymphotoxin) 유전자 프로모터 및 인간 GM-CSF (human granulocyte-macrophage colony stimulating factor) 유전자 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 실시예에서 상기 프로모터는 CMV 프로모터이다.
상기 벡터는 적합한 숙주 내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자의 염기서열을 포함하는 유전자 작제물을 의미하는 것으로, 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 벡터는 세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않고 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있으며, 예컨대 플라스미드, 코즈미드, 파지 입자, 바이러스 벡터일 수 있다.
상기 재조합 발현 벡터는, 발현시키고자 하는 목적 폴리펩타이드의 암호화 유전자가 작동 가능하게 연결될 경우, 적절한 숙주 세포에서 상기 목적 폴리펩타이드를 높은 효율로 발현시킬 수 있는 목적 폴리펩타이드의 발현 벡터로 사용될 수 있으며, 상기 재조합 벡터는 숙주 세포에서 발현 가능할 수 있다. 숙주 세포는 바람직하게는 진핵세포일 수 있으며, 숙주세포의 종류에 따라 프로모터 (promoter), 종결자 (terminator), 인핸서 (enhancer) 등과 같은 발현 조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.
상기 재조합 벡터는 형광 단백질을 코딩하는 유전자를 더 포함할 수 있다.
상기 형광 단백질은 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein; GFP), 변형된 녹색 형광 단백질 (modified green fluorescent protein), 증강된 녹색 형광 단백질 (enhanced green fluorescent protein; EGFP), 적색 형광 단백질 (red fluorescent protein; RFP), 증강된 적색 형광 단백질 (enhanced red fluorescent protein; ERFP), 청색 형광 단백질(BFP), 증강된 청색 형광 단백질(EBFP), 황색 형광 단백질(YFP), 증강된 황색 형광 단백질(EYFP), 남색 형광 단백질(CFP), 및 증강된 남색 형광 단백질(ECFP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 실시예에서 상기 형광 단백질은 EGFP, DsRed이다.
상기 유전자는 2A 펩타이드 (2A peptide) 서열로 연결될 수 있다.
상기 2A 펩타이드는 20개 내외의 아미노산 서열로, P2A, E2A, F2A 및 T2A로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 실시예에서 상기 2A 펩타이드는 P2A 및 T2A이다. 상기 P2A 펩타이드는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 것일 수 있고, 상기 T2A 펩타이드는 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 2A 펩타이드는 더불어 동시에 전사가 시작되어, 해당 부위의　Gly과 Pro 서열에서 라이보솜 스킵핑 (Ribosome skipping)이 일어나면서, 아미노산 서열이 절단 (Self-cleavage)되는 것을 이용하는 것이기 때문에　2가지 유전자의 단백이 거의 동등하게 발현된다.　 예를 들어, 상기 벡터는 2A 펩타이드 서열의 한 종류인 P2A 서열에 의해 SV40LT 유전자와 HRASG12V 유전자가 하나의 폴리시스트론 Mrna (polycistronic mRNA) 로 전사되어 두 개의 단백질을 동시에 생산할 수 있다.
본 발명의 일구체예에서 CMV-Cas9#1-EGFP-pA-Cas9#2-DsRed-P2A-SV40LT-T2A-HRASG12V인 종양 동물 모델 제작용 재조합 발현 벡터를 제작하였다. 상기 벡터는 처음에는 EGFP만 유비쿼터스 CMV 프로모터 서열에 의해 발현된다. Cas9 및 2 개의 가이드 RNA (gRNA)의 도입으로, 2개의 특정 Cas9 표적 서열이 측면에 있는 EGFP-폴리 A (pA) 단편은 Cas9 활성으로 인해 두 표적 부위에서 이중 가닥 절단 (DSB) 후 잘려나간다. 그런 다음 CMV 및 DSH 측 DSB는 NHEJ (non-homologous end joining) 매개 DSB 복구 메커니즘을 통해 연결된다. 마지막으로, 재배열된 CMV-DSH 컨스트럭트로부터 종양 유전자가 발현된다. 상기 재조합 발현 벡터는 Cas9 유전자와 표적 gRNA를 도입을 통해 암세포화 및 종양 발달을 선택적으로 유도할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터가 도입된 종양 동물모델 제작용 형질전환 세포주를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따른 재조합 발현벡터가 도입된 형질전환 세포주를 제조하기 위하여, 핵산 분자를 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 당 분야에서 공지된 방법을 사용할 수 있으며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 예를 들어, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 (CaPO4) 침전, 염화칼슘 (CaCl2) 침전, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌글리콜 (PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온성 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
형질전환 세포주로 사용될 세포의 종류는 동물세포 또는 동물세포 유래의 세포일 수 있고, 바람직하게는 포유류, 가장 바람직하게는 돼지 유래의 수정된 단일세포 단계 배아일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 체세포의 핵을, 탈핵된 난자에 이식하여 형성한 핵 이식란을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 재조합 벡터가 도입된 핵 공여 세포의 핵을 탈핵된 난자에 이식하여 난자를 생산하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 종양 동물 모델의 제작 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 방법으로 제작된 인간을 제외한 종양 동물 모델을 제공할 수 있다. 상기 동물은 인간을 제외한 포유동물로서, 돼지, 원숭이, 랫트, 마우스, 토끼, 개, 영장류 등일 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 동물은 돼지이다. 돼지 모델은 설치류 모델에 비해 해부학적, 유전적, 생리학적 관점 등에서 인간과 더욱 유사하므로, 돼지를 활용한 암 질환 관련 기초 기전 연구와 개발되는 치료법에 대한 적응점, 효과, 부작용 등에 대한 연구 결과는 인간에 실제 적용하는 임상 단계에 더욱 활용도가 높음을 예상할 수 있다.
또한 본 발명은 1) 상기 종양 동물 모델에 항암제 후보물질을 투여하는 단계; 및 2) 상기 후보물질을 투여한 동물모델을 후보물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 후보물질에 의해 종양형성이 개선되거나 치료되는 경우 이를 항암제로 판단하는 단계; 를 포함하는, 항암제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 스크리닝 방법에서, 항암제 후보물질은 통상적인 선정방식에 따라 종양형성 개선 또는 치료제로서의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 추출물 또는 천연물, 화합물 등을 예시할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 동물 실험은 충북 대학교 동물 실험 윤리위원회 (허가 번호: CBNUR-1415-20)의 승인을 받고 수행하였다.
본 발명에 사용된 장비와 시약은 하기 실시예 및 실험예에 표시되어 있으며, 달리 명시되지 않은 모든 화학 물질은 Sigma-Aldrich Chemical Company (St. Louis, MO, USA스)에서 구입하였다.
통계 분석은 SPSS 21.0 (Statistical Package for the Social Sciences, Inc., Chicago, IL, USA)을 사용하여 수행되었으며 데이터는 Student 's t-test를 사용하여 분석되었다. p값이 0.05 미만이면 유의성이 있는 것으로 간주되었다. 결과는 평균±SEM으로 표시된다.
본 발명은 사용 편의성과 높은 유전자 교정률을 보여주는 제3세대 유전자 편집기술인 CRISPR/Cas9 시스템을 활용하여, 선택적으로 표적 세포에 종양 유전자의 발현을 유도하여 암을 발병시킬 수 있는 돼지 종양 모델을 제작하였다. 이를 위해 돼지에서 종양을 효과적으로 유발할 수 있는 시스템을 구축하고자 하였다. 활용한 종양 유발 유전자는 종양 억제 신호 (tumor suppressive pathway)의 주요 인자인 TP53 (Tumor protein 53) 유전자와 RB1 (Retinoblastoma) 유전자를 교란할 수 있는시미안 바이러스 40 (simian virus 40) 유래 SV40 large T (SV40LT) 항원 유전자와 인간의 암에서 빈번하게 관찰되는 돌연변이 종양 유발 유전자인 HRASG12V 두 유전자이다. SV40LT와 HRASG12V 두 종양 유전자를 하나의 전사체 (transcript, mRNA)로부터 발현하고자 하는 인자가 한꺼번에 발현될 수 있도록, 2A 펩타이드 서열을 활용한 폴리시스트로닉 유전자 발현 시스템 (polycistronic gene expression system)으로 디자인하였다. 발현 여부를 효과적으로 확인하기 위해 빨간색 형광 표지 유전자인 DsRed를 추가로 도입하였고, 발현시킬 세 유전자를 P2A, T2A 두 개의 2A 펩타이드 서열로 연결하여 DsRed-P2A-SV40LT-T2A-HRASG12V (DSH) 종양 유전자 카세트 플라스미드 벡터를 구축하였다 (도 1a). DSH 종양 유전자 카세트를 도입한 돼지 유래 섬유아세포에서는 각 종양 유전자가 효과적으로 발현될 수 있으며, 발현된 돼지 유래 섬유아세포는 암세포화가 진행된다는 것을 확인하였다 (도 1b 내지 1f). CRISPR/Cas9 시스템에 의해 선택적으로 상기 DSH 종양 유전자 카세트가 발현될 수 있도록 유도하기 위해 Cas9이 특정 DNA 인식 서열을 양가닥절단 (double strand break, DSB)를 만드는 특성 및 세포의 내재 DNA 손상 복구 기전 중 하나인 비상동말단연결 (non-homologous end joining, NHEJ)을 활용하여, CMV-Cas9#1-EGFP-pA-Cas9#2-DsRed-P2A-SV40LT-T2A-HRASG12V (CMV-GCas9-DSH) 폴리시스트로닉 종양 유전자 발현 시스템을 구축하고 이를 CRI-CPC ( CRI SPR/Cas9-based C onditional P olycistronic gene expression Cassette)로 명명하였다 (도 2a). 상기 시스템은 Cas9 유전자와 표적 gRNA를 도입을 통해 암세포화 및 종양 발달을 선택적으로 유도할 수 있다. 구체적으로, 평상시 CRI-CPC 시스템에서는 유전자 발현을 담당하는 CMV (cytomegalovirus) 프로모터 서열에 의해 EGFP만 발현이 되도록 디자인 하였다. 특정 시기에 Cas9 유전자와 Cas9#1, Cas9#2에 대한 두 가이드 RNA (guide RNA, gRNA)를 도입하여 활성화를 유도하게 되면, EGFP-pA 양 쪽에 존재하는 Cas9 인식서열에 양가닥절단되어 제거되고, CMV 프로모터 뒤의 절단면과 DSH 카세트 앞 절단면이 비상동말단연결 기전을 통해 연결되어 DSH가 발현되도록 하는 시스템으로 개발하였다. 제작한 CMV-GCas9-DSH 카세트 벡터 시스템을 돼지 유래 섬유아세포에 도입하여 체세포 핵이식용 핵공여세포를 제작하였고 (도 2b 내지 2e), 이로부터 SCNT 배아를 제작하여 배아의 발달능을 검증하였다 (도 3a 및 3b). 또한 본 발명은 상기 배아를 암컷 돼지 대리모에 이식하여 CRI-CPC가 도입된 돼지 종양 모델을 생산하고 검증하였다 (도 4a 내지 4e). 또한, 본 발명은 선대 형질전환 모델에 도입된 유전자 카세트가 생식선 전달 가능함을 확인하였다 (도 5a 내지 5d). 또한, 본 발명은 자연교배를 통해 CRI-CPC 돼지 모델이 후대 생산 가능함을 확인하였다 (도 6a 내지 6c). 따라서 본 발명의 동물모델은 자연 교배가 가능해 정상적인 생식 능력을 가지고 있음을 확인하여 대량 생산이 가능한 돼지 종양 모델임을 제시하여 연구목적에 충분히 활용 가능함을 증명하였다. 또한, 생산된 형질전환 CRI-CPC 돼지 유래 세포를 활용하여 Cas9으로 암세포화를 유도할 수 있음을 검증하여(도 7a 내지 7f), 종양 모델로서의 의미성을 확보하였다. 마지막으로, 서열분석으로 통하여 CRI-CPC 시스템이 의도한대로 정상적으로 작동했음을 확인하였다 (도 8a 내지 8d).
제3세대 유전자 편집 기술인 CRISPR/Cas9 시스템은 사용의 편의성과 높은 유전자 표적 적중률을 보여 많은 연구진들이 연구에 활용하고 있다. 하지만 현재까지 CRISPR/Cas9 시스템을 활용하여, 선택적으로 유전자의 발현을 켜거나 끄도록 하는 연구에 대한 보고는 거의 없다. 본 발명은 CRISPR/Cas9 시스템을 활용해 도입 유전자의 발현을 조절할 수 있는 시스템을 개발하였고, 이를 종양 유발 유전자에 적용해 종양 모델 제작에 활용될 수 있음을 확인하였다. 본 발명을 통해 개발한 CRISPR/Cas9 매개 종양 유발시스템인 CRI-CPC 시스템을 적용한 형질전환 돼지 종양 모델은 Cas9 및 가이드 RNA를 도입하고 발현시키는 방법에 따라 상당히 다양한 연구 모델로 활용할 수 있다. 예를 들어, 특정 조직의 특정 세포에서 발현을 유도하는 프로모터 서열을 활용한다면, 뇌종양, 유방암, 폐암, 대장암 등을 다양한 종양 모델로 확장 개발될 가능성이 있어 그 활용 가치는 매우 높다. 이외에도 개발된 CRI-CPC 시스템은 종양 질환뿐만 아니라 다른 질환과 관련된 유전자의 발현을 선택적으로 조절할 수 있고, 또한 발생과 발달과정에 중요한 유전자의 발현을 선택적으로 조절할 수 있도록 디자인할 수 있어 다방면의 연구모델 제작 기반 기술로 유용하게 활용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실험예에 의해서 상세히 설명한다.
단, 하기 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실험예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> DsRed-P2A-SV40LT-T2A-HRAS G12V (DSH) 발현 벡터의 제작 및 검증
빨강 형광 단백질인 DsRed, 종양 유발 유전자인 SV40 Large T (SV40LT)와 HRASG12V 세 유전자가 한꺼번에 발현될 수 있도록 2A 펩타이드에 의해 조절되는 폴리시스트로닉 (polycistronic) 종양유전자 발현시스템인 DsRed-P2A-SV40LT-T2A-HRASG12V (DSH) 발현 벡터 시스템을 제작하였다 (도 1a).
구체적으로, CMV-Cas9#1-EGFP-pA-Cas9#2-DsRed-P2A-SV40LT-T2A-HRASG12V (CMV-GCas9-DSH) 컨스트럭트를 확립하기 위해 합성된 2A 펩티드 서열 (Bio basic Inc., Toronto, 캐나다)을 LCMV-EGFP (LoxP)-MCS 벡터 (플라스미드 #31306, Addgene, Watertown, MA, USA에서 변형됨)의 다중 클로닝 부위에 삽입하였다. 2개의 loxP 부위가 Cas9#1 및 #2 가이드 RNA의 표적 서열로 변형되었다. CMV 인핸서/프로모터 (약칭 CMV 프로모터), Dsred, SV40LT 및 HRASG12V 유전자의 서열은 pcDNA3.1 (+) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), pTRE-tight-BI-Dsred (Clontech Laboratories Inc. , Mountain View, CA, USA), pBabe-SV40LT 및 pBabe-puro-H-Ras V12 (플라스미드 # 71304; Addgene)로부터 PCR 증폭을 통해 클로닝되었다. Ex Taq 중합 효소 (Takara bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan) 및 하기 표1의 프라이머 세트를 사용하여 각 유전자를 증폭하였다. 각 생산물은 제조업체의 지침에 따라 pGEM T-easy 벡터 (Promega, Madison, WI, USA)에 연결되었다. 그런 다음 LCMV-EGFP (LoxP)-MCS의 CMV IE94 프로모터 서열을 CMV 프로모터로 변경하고 각 유전자를 변형된 LCMV-EGFP (LoxP)-2A 펩타이드-MCS 벡터에서 다중 클로닝 부위로 클로닝하였다.
타켓 서열 프라이머 서열 (5'-3') 서열번호
CMV 프로모터 F GCGGCCGCGGGCCAGATATACTCGTTGA 6
R GCCAGAGAGCTCTGCTTAT 7
DsRed F CCCGGGAGATTTCATGGCCTCCTCCGA 8
R GCTAGCAGACAACAGGAACAGGTGGTG 9
SV40LT F CTCGAGTCGACCAGCTTTGCAAAGA 10
R TCGCGATGATGTTTCAGGTTAGGGGA 11
HRAS G12V F GAATTCGCGATGACGGAATATAAGCTG 12
R AGGCCTCGTCAGGAGAGCACACACTT 13
DSH 발현 벡터를 돼지 유래 섬유아세포에 발현시켜 종양 유발유전자 SV40LT와 HRASG12V가 독립적으로 발현되는지 검증하고, HRASG12V의 대표적인 하부 신호 중개자로 알려진 AKT 및 ERK1/2가 인산화(phosphorylation)되어 활성화되는지 검증하기 위하여 웨스턴 블롯 (western blot) 실험을 수행하였다.
구체적으로, 돼지 섬유아세포는 완전 배지 [DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium), 10% (v/v) FBS (fetal bovine serum), 1% (v/v) Gluta-max, 1 % (v/v) 비필수 아미노산, 1% (v/v) 항생제-항균제 및 0.1% (v/v) 2-메르캅토 에탄올 (모두 미국 캘리포니아 주 라이프 테크놀로지스에서 입수)]에서 유지되었다. 1차 배양을 위한 배양 조건은 37도 및 5% CO2 조건 의 습한 배양기에서 이루어졌다.
DSH 발현 벡터를 돼지 유래 섬유아세포에 발현시켜 종양 유발유전자 SV40LT와 HRASG12V가 독립적으로 발현되는지 검증하고, HRASG12V의 대표적인 하부 신호 중개자로 알려진 AKT 및 ERK1/2가 인산화(phosphorylation)되어 활성화되는지 검증하기 위하여 웨스턴 블롯 (western blot) 실험을 수행하였다.
구체적으로, 돼지 섬유아세포는 완전 배지 [DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium), 10% (v/v) FBS (fetal bovine serum), 1% (v/v) Gluta-max, 1 % (v/v) 비필수 아미노산, 1% (v/v) 항생제-항균제 및 0.1% (v/v) 2-메르캅토 에탄올 (모두 미국 캘리포니아 주 라이프 테크놀로지스에서 입수)]에서 유지되었다. 1차 배양을 위한 배양 조건은 37도 및 5% CO2 조건 의 습한 배양기에서 이루어졌다.
세포 형질전환을 위해 구축한 CMV-GCas9-DSH를 포함하는 원형 플라스미드 벡터를 Pvu1 제한효소를 활용해 직선화한 다음, 미니돼지 피부조직 유래 섬유아세포에 Neon® Transfection System (Invitrogen)을 활용한 전기천공법 (elctroporation)으로 형질전환을 유도하였다.
웨스턴 블롯 분석을 위해, 1mM β-글리세로포스페이트 (β-glycerophosphate), 2.5mM 나트륨 피로포스페이트 (sodium pyrophosphate), 1mM NaF, 1mM Na3VO4 및 프로테아제 억제제 칵테일 (protease inhibitor cocktail, Roche, Basel, Switzerland)을 포함하는 방사 면역 침전 분석 용해 완충액 (radioimmunoprecipitation assay lysis buffer, 150mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS 및 50mM Tris, pH 7.4)에서 전체 세포 추출물을 준비하였다. 단백질의 정량 분석은 Bradford 분석 시약 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 수행하였다. 단백질은 SDS-PAGE로 분리되고 표준 프로토콜에 따라 폴리비닐 리덴 디플루오라이드 막 (polyvinylidene difluoride membrane, Pall Corporation, Port Washington, NY, USA)으로 옮겨졌다. 막은 0.05% Tween 20이 포함된 1% BSA (bovine serum albumin)가 들어있는 트리스 완충 식염수에서 HRAS (Calbiochem, Darmstadt, Germany), SV40T 항원 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), pAKT (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), 전체 AKT (Cell signaling), pERK1/2 (Cell signaling), 전체 ERK1/2 (Cell signaling) 및 β-액틴 (Santa Cruz Biotechnology)에 대한 1차 항체로 면역 블롯팅되었다. 1차 배양 후 염소 항-마우스 또는 항-토끼 IgG가 접합된 HRP (horseradish peroxidase) 2차 항체 (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)로 배양 및 세척하였다. β-액틴은 로딩 대조군으로 사용되었다.
그 결과, 도 1b에 나타난 바와 같이, DSH 컨스트럭트 (construct)의 각 유전자가 단일 유전자로 발현되었음을 확인하였다. 또한, HRAS 신호 전달의 하류 매개체로 잘 알려진 AKT와 EKR1/2는 모두 HRASG12V 과발현 세포 (도 1b)와 같이 DSH를 이소성으로 발현하는 돼지 세포에서 활성화됨을 확인하였다.
이어서, DSH를 발현하는 돼지 섬유아세포의 특성을 검증하였다. 형광현미경으로 관찰한 결과, 도 1c에 나타난 바와 같이, 적색 형광 마커 단백질인 DsRed가 잘 감지되는 것을 확인하였다. 또한, 도 1d에 나타난 바와 같이, DSH가 발현되는 돼지 섬유아세포 세포의 형태가 많이 변하고 세포 배양접시에서 여러 겹으로 층을 이루어 겹쳐 자라는 것을 관찰하였고, 이는 암세포의 특징을 획득한 것으로 보인다.
DSH 발현 돼지 세포가 암세포의 대표적 특징 중 하나인 부착-비의존성 성장 (anchorage-independent growth)을 하는지 확인하기하기 위하여 소프트 한천배지 실험 (soft-agar assay)을 수행하였다.
구체적으로, 10% FBS를 포함하는 DMEM에서 0.72% 한천의 1.5 mL 하부층을 6- 웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고 실온 (19-21℃)에서 고형화되도록 하였다. 각각의 5x103 세포를 10% FBS를 함유하는 DMEM에 0.28% 한천의 플레이팅 층 (plating layer, 1.2 mL)에 현탁시키고 웰에 첨가하였다. 아가로스를 실온에서 고형화시킨 후 37℃의 가습 CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 한천이 건조되는 것을 방지하기 위해, 20% FBS를 포함하는 500μL의 DMEM을 2 내지 3 일마다 각 웰에 추가하였다.
그 결과, 도 1e 및 도 1f에 나타난 바와 같이, DSH를 발현하는 돼지 섬유아세포는 부착-비의존성 성장을 할 수 있음을 확인하였다.
상기의 결과들은 2A 펩타이드 매개 삼중-시스트론성 (tri-cistronic) 종양 유전자 발현 카세트인 DSH가 효율적으로 돼지 세포를 형질 전환했음을 시사한다. 이를 바탕으로 DSH 카세트에 적절한 발현 조절장치를 적용한다면 형질전환 돼지 종양 모델 생산이 가능할 것으로 판단하였다.
<실시예 2> Cas9 매개 조건부 종양 유전자 발현 시스템 CRISPR/Cas9 기반 조건부 폴리시스트로닉 유전자 발현 카세트 (CRISPR/Cas9-based Conditional Polycistronic gene expression Cassette; CRI-CPC) 시스템 설계
Cas-OFFinder 도구 (http://www.rgenome.net/cas-offinder/)를 사용하여 무작위 gRNA 서열을 분석하였다. 프로그램 시작 후, 돼지 종의 게놈 내에서 일치하는 서열이 없는 후보 gRNA 서열인 Sus scrofa를 선택하였다. 그런 다음, 이러한 후보는 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)를 사용하여 돼지 게놈 영역, 특히 코딩 서열에 대한 가능한 결합 가능성을 확인하여 표적 외 변경을 방지하였다. 마지막으로, Cas9 gRNA#1 및 #2는 BLAST 알고리즘을 사용하여 결정된 Max 점수에 따라 가장 낮은 비특이적 결합 잠재력을 기반으로 선택되었다. 이러한 gRNA 서열은 합성되어 lentiCRISPRv2 (#52961; Addgene)의 스터퍼 (stuffer) 서열 옆에 있는 두 BsmB1 부위에 삽입되었다. 하기 표 2에 gRNA#1 및 gRNA#2의 서열을 나타내었다. 굵은 글씨의 서열은 PAM 염기서열을 나타낸다.
염기서열 (5'-3') 서열번호
gRNA#1 TACATTATACGAAGTTACCATGG 1
gRNA#2 TATACGAAGTTATAGGATCCCGG 2
렌티 바이러스를 생산하기 위해 HEK-293FT 세포를 10 % FBS 및 2mM L-글루타민 (Lonza, Basel, Switzer-land)을 포함하는 완전한 DMEM에서 100mm 플레이트에 플레이팅하고 12시간 동안 부착되도록 두었다. LipoJetTM In Vitro Transfection Kit (Ver. II; SignaGen Laboratories, Frederick, MD, USA)를 사용하여 gRNA#1 및 #2 서열을 포함하는 각 4μg lentiCRISPRv2, 4μg 3세대 패키징 플라스미드로 제조업체의 지침에 따라 무 혈청 DMEM 배지 (Invitrogen)에서 형질 감염을 수행하였다. 형질 감염 12시간 후, 세포를 PBS로 세척한 다음, L-글루타민 및 10% FBS를 함유하는 신선한 완전 DMEM과 혼합하고 42시간 동안 추가 배양하였다. 렌티 바이러스를 함유하는 상층액을 형질 감염 48시간 후 수집하고 0.45μm 주사기 필터를 통해 여과하였다. 각 렌티 바이러스는 제조업체의 지침에 따라 Lenti-X 농축기 (Clontech Laboratories Inc.)를 사용하여 농축되었다.
이 시스템에서 두 개의 설계된 가이드 RNA (gRNA) 표적 부위가 측면에 있는 강화된 녹색 형광 단백질 (Enhanced Green fluorescent Protein; EGFP) 유전자와 폴리 A (pA) 신호의 구조는 DSH 구조 앞에 위치하므로 EGFP는 Cas9 형질 도입 이전에 CMV (cytomegalovirus) 프로모터 서열에 의해 발현된다. Cas9 도입 후 CRI-CPC 시스템은 1) 2 개의 Cas9-표적 부위에서 이중 가닥 파손 (double strand break; DSB) 발생, 2) EGFP-pA 제거, 3) 비상동 말단 결합 (non-homologous end joining; NHEJ)-매개된 DSB 복구 및 4) DSH의 발현 단계에 따라 작동한다. 두 개의 gRNA 표적 서열은 돼지 게놈에서 더 적은 수의 유사한 서열을 가지도록 설계되었으며 표적을 벗어난 효과를 최소화하였다. 이 CRI-CPC 설계를 기반으로 CMV-Cas9 #1-EGFP-pA-Cas9 #2-DsRed-P2A-SV40LT -T2A-HRASG12V (CMV-GCas9-DSH)의 플라스미드 벡터 컨스트럭트를 구축하였다 (도 2a).
<실시예 3> 난자 수집 체외 성숙 ( in vitro maturation; IVM)), 시험관 수정 ( In vitro fertilization; IVF)
난자 수집 및 체외 성숙은 S.-U. Hwang et al (2015)에 따라 수행되었다. 도축장 (충주 동아 푸드)에서 돼지 난소를 채취하여 37도, 0.9% NaCl (w/v) 용액에 넣어 실험실로 옮겼다. 돼지 여포액 (Porcine follicular fluid; pFF) 및 적운 난모세포 복합체 (cumulus oocyte complexe; COC)는 18g 바늘과 주사기를 사용하여 3-6mm 여포에서 동시에 흡인되었다. COC는 실체 현미경으로 등급을 매기고 500μL IVM 배지 [0.6mM 시스테인, 0.91mM 나트륨피루베이트, 10ng/mL EGF, 75μg/mL 카나마이신, 1μg/mL 인슐린 및 10% (v/v) pFF를 함유한 TCM 199 (Gibco, Grand Island, NY, USA)]와 함께 Nunc 4웰 접시 (Nunc, Roskilde, Denmark)에서 배양하였다. IVM 동안 처음 22시간 동안, 10 IU/mL eCG (equine chronic gonadotropin) 및 10IU/mL hCG (human chorionic gonadotropin, Intervet, Boxmeer, Netherland)를 IVM 배지에 첨가했다. 22시간 후, COC를 eCG/hCG 없이 새로운 IVM 배지로 옮기고 20시간 동안 배양했다. IVM은 습한 인큐베이터 (Astec, Fukuoka, Japan)를 사용하여 39도의 5% CO2 조건에서 수행되었다. 42시간 동안 IVM 후, 성숙 COC는 0.1% 히알루로니다아제로 부드럽게 피펫팅하여 제거되었다. 성숙한 난모세포는 후속 실험에 사용되었다.
IVF는 중기 II (MII) 단계에서 성숙한 난모세포만 선택하여 S.-U. Hwang et al (2015)에 설명한대로 수행되었다. 성숙된 MII 난모세포를 0.05% (w/v) PVA (TLH-PVA)를 포함하는 HEPES 완충 Tyrode 배지를 사용하여 3회 세척하고 15개의 난모세포를 mTBM (modified tris-buffered medium) 방울로 옮겼다. 신선한 액체 정액 (Xperm-V, Darby Genetics, Inc., Anseong, South Korea)을 구입하여 수집 후 3일 이내에 사용했다. 방울당 최종 정자 농도를 5x105 정자/mL로 희석하고 난모세포와 함께 배양하고, 5% CO2 가습 조건에서 20분 동안 39도에서 배양하였다. 난모세포 표면의 정자를 부드러운 피펫팅으로 분리하고 새로운 mTBM 방울로 이동하였다. 수정된 배아를 배양하고, 39도의 5% CO2 가습 조건에서 5시간 동안 배양하고, 배아를 IVC용 돼지 접합자 배지 (PZM) 방울로 옮겼다.
<실시예 4> 체세포 핵 전달 (somatic cell nuclear transfer; SCNT) 및 체외 배양 ( in vitro culture ; IVC )
SCNT의 경우 MII 단계에서 성숙된 난모세포가 사용되었다. MII 난모세포는 0.2% FBS (TLH-BSA)를 함유하는 칼슘이 없는 TLH를 사용하여 세척되었다. 적출은 5μg/mL 사이토칼라신 B (CB)를 함유하는 TLH에서 마이크로 매니퓰레이터의 16μm 유리 피펫 (Humagen, Charlottesville, VA, USA)을 사용하여 수행되었다. 적출 후 트립신 처리된 CRI-CPC 단일 세포를 적출된 난모세포의 주변 공간으로 옮겼다. 다음으로 Electro Cell Fusion Generator (LF201; Nepa Gene, Japan)를 사용하여 0.1mM CaCl2 및 0.05mM MgCl2를 포함하는 260mM 만니톨 용액에서 60μs 동안 180V/mm 직류의 두 펄스로 융합되었다. 융합된 SCNT 배아를 6-DMAP (0.4 μg / mL Demecolcine 및 6-Dimethyl amino purine)와 함께 30μL PZM 방울에서 4시간 동안 (활성화 후) 배양한 다음 IVC를 위해 PZM 방울로 옮겼다. 융합 후 2일째에 배아 분열을 평가하고 (1개 세포, 2 ~ 3개 세포, 4 ~ 5개 세포, 6 ~ 8개 세포 단계 및 분열된 배아) 배아를 새로운 PZM 방울로 옮겼다. 4일째에 배아를 10% FBS (Gibco)가 포함된 PZM 방울로 옮겼다. 융합 후 7 일에 배반포 형성을 정량적으로 평가했다 (초기, 확장, 부화 배반포).
<실시예 5> CRI-CPC 시스템을 도입한 핵공여세포 (CRI-CPC transgenic donor cell) 제작 및 검증
체세포 핵 전달 (somatic cell nuclear transfer; SCNT)을 통해 CMV-GCas9-DSH 구조를 사용하여 CRI-CPC 트랜스제닉 돼지를 개발하기 위해 플라스미드 벡터를 전기 천공을 통해 돼지 섬유 아세포로 형질 감염시켰다.
구체적으로, 제조업체의 지침에 따라 전기천공 도구인 Neon® Transfection System (Invitrogen)을 사용하여 Yucatane 소형 돼지 섬유 아세포 세포를 CMV-GCas9-DSH로 형질 감염하였다. 3 내지 4주 동안 연속 계대 후, EGFP를 안정적으로 발현하는 돼지 섬유 아세포를 검출하고 유세포 분석법 (FACS Aria II, BD biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA)을 사용하여 분류하였다 (도 2b 및 도 2c). 마지막으로, 정상적인 형태를 나타내는 7 개의 EGFP 발현 클론을 얻었다 (도 2d).
그런 다음 각 클론에서 추출한 게놈 DNA를 사용하여 PCR 분석을 수행하여 전체 CMV-GCas9-DSH 트랜스진 컨스트럭트가 각각에 성공적으로 통합되었는지 테스트하였다.
구체적으로 Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega) 또는 G-spinTM Total DNA Extraction Kit (Intron Bio Technologies, Co., Ltd., Seongnam, Korea)를 사용하여 동결된 응집체와 표시된 세포에서 제조업체의 지침에 따라Genomic DNA를 분리하였다. TRIzol 시약 (Invitrogen)을 사용하여 전체 RNA를 추출했다. MMLV (Moloney murine leukemia virus) 역전사 효소 (Invitrogen) 및 랜덤 프라이머 (9-mer, TaKaRa Bio, Inc.)를 사용하여 cDNA (Complementary DNA)를 합성하였다.
PCR 분석을 위해, 하기 표 2의 올리고 뉴클레오티드 프라이머 서열을 사용하여 1U의 i-StarTaq DNA 중합 효소 (Intron Bio Technologies, Co., Ltd.), 1X PCR 버퍼 (30mM Tris-HCl [pH 9.0], 30mM K+ 및 NH4+, 2mM MgCl2 염)를 2mM 데옥시리보 뉴클레오시드 트리포스페이트 (dNTP) 믹스 및 각 유전자 특이적 프라이머 10pM을 포함하는 20μL PCR 반응에서 gDNA 또는 cDNA를 증폭하였다. PCR은 95도에서 5분 동안 사전 변성; 95도에서 30초 동안 변성, 58도에서 30초 동안 어닐링, 72도에서 30초 동안 연장, 30회 반복; 72도에서 5분 동안 변성;으로 수행되었다. 증폭된 PCR 산물은 RedSafe (Intron Bio Technologies)가 있는 1.25% 아가로스겔에서 20분 동안 100V에서 겔 전기 영동 (Mupid-exU; Takara Bio Inc.)을 통해 분석되었다. Bio-1000f 겔 이미저 (Microtek, Hsinchu, Taiwan)를 사용하여 겔 이미지를 얻었다.
타겟 서열 프라이머 서열 (5'-3') 서열번호
Whole construct of CMV-GCas9-DSH F CAAGTACGCCCCCTATTGAC 14
R GACGATGATTTCCCCGACAA 15
EGFP F AACGGCCACAAGTTCAGCGT 16
R TCACCTTGATGCCGTTCTTC 17
DsRed F ACGGCCACGAGTTCGAGAT 18
R TGCTTCACGTACACCTTGGAG 19
SV40LT F TGCTTGGCTACACTGTTTGT 20
R CTGTCCAAGGGCAAATTAAC 21
HRASG12V F CATTTTGTGGACGAATACGA 22
R TGTCCTCAAAAGACTTGGTG 23
Re-arranged target sequence F CAAGTACGCCCCCTATTGAC 24
R TGCTTCACGTACACCTTGGAG 25
RN18s F CGCGGTTCTATTTTGTTGGT 26
R AGTCGGCATCGTTTATGGTC 27
그 결과, CMV-GCas9-DSH #7 클론만이 전체 이식 유전자 컨스트럭트를 보유한 반면, 다른 클론은 EGFP 도입 유전자를 포함하는 부분 컨스트럭트만 가졌다는 것을 확인하였다 (도 2e). 따라서 우리는 SCNT에 대한 CRI-CPC 시스템의 전체 구조를 보유한 형질 전환 공여자 세포를 성공적으로 확립하였다.
<실시예 6> CRI-CPC 시스템이 도입된 핵공여세포로부터 제작된 SCNT 배아의 발달능 검증
변형된 유전자에 의한 세포 신호 체계의 변화는 발생 및 발달과정에 필수적인 유전자의 기능에 영향을 미칠 가능성이 있다. 특히, 배발생 (embryogenesis) 단계에서 정상적인 발달에 이르지 못하고 배아 치사 (embryonic lethality)되는 경우도 많이 발생하는데, 이는 형질전환 모델 개발에 큰 제한점이다. 특히, SV40LT 발현이 SCNT 배아 발달을 방해한다고 알려져 있어, 이러한 문제가 있는지 확인하고자 도입된 CRI-CPC 시스템이 배발생 단계에 영향을 주는지 검증하기 위한 실험을 진행하였다.
우선 CRI-CPC 시스템이 도입된 핵공여세포로 체세포 핵이식을 수행하여 얻은 형질전환 배아 (CMV-GCas9-DSH #7)가 배반포 (blastocyst)까지 정상적으로 발달되는지 확인하였다
그 결과, 도 3a에 나타난 바와 같이, 대조군 섬유 아세포와 배아 절단 및 배반포 형성 속도를 비교한 결과, 도입된 CRI-CPC 시스템이 배반포 단계까지 배아 발달에 부정적인 영향을 미치지 않음을 보여 주었다. 오히려 배반포 형성 속도는 CMV-GCas9-DSH #7 세포에서 유래된 SCNT 배아에서 정상 섬유아세포보다 더 높았다. 또한, 도 2b에 나타난 바와 같이, CRI-CPC 시스템에서 CMV 프로모터 서열에 의해 제어되는 EGFP는 CMV-GCas9-DSH #7 공여자 세포가 배아 및 배반포까지 발달하는 과정에서도 잘 발현되는 것을 확인하였다.
상기의 결과들을 종합해보면, CRI-CPC 시스템을 보유한 SCNT 배아가 EGFP 만 발현하고 종양 유전자는 발현하지 않음으로써 정상적으로 발달할 수 있음을 시사한다.
<실시예 7> SCNT 배아를 이용한 CRI-CPC 종양 돼지 생산
CRI-CPC 시스템이 도입된 핵공여세포로 제작한 SCNT 배아를 암컷 돼지 대리모에 이식하여 최종 5마리의 돼지 (P#1, P#2, P#3, P#4, P#5)가 임신되어 생산되었다 (도 4a).
구체적으로, S.U. Hwang (2018)에 따라 배아 이동을 수행하였다. Landrace Х Duroc 교배종 어미가 대리모로 사용되었다. 마취 전 케타민 (50mg/mL, 유한양행)과 자일라진 (100mg/mL, SF, 한국)을 1:3으로 혼합하여 귀 정맥에 주입 하였다. 이후 이소플루란액 (하나팜, 한국)을 이용한 호흡 마취를 유지하였다. 모든 수술기구는 수술 전에 멸균되었다. 생식 기관을 노출하기 위해 중복부 개복술을 수행하였다. SCNT 배아 (수혜자당 100 ~ 150 개의 배아)를 팽대부-협부 접합부 (ampullary-isthmic junction)에서 대리 난관으로 옮겼다. 30일 후 초음파 촬영을 통해 임신을 진단하였다.
태어난 5마리 중 3마리의 새끼 돼지 (P#1, P#2, P#4)는 태어난지 얼마되지 않아 죽었지만, P#3, P#5는 장애없이 성장하였다. P#3, P#5 새끼 돼지에서는 EGFP 초록 형광 단백질이 개체 수준에서 발현되었으며 특히 코와 발굽에서 강하게 발현되었는데, 이를 통해 CRI-CPC 시스템이 정상적으로 도입되었을 가능성을 확인하였다 (도 4b 및 4c).
태어난 다섯 마리의 돼지들이 형질전환 CRI-CPC 돼지 종양 모델인지 검증하기 위해 각 탯줄에서 세포를 추출하여 EGFP 발현 여부를 확인하였다.
그 결과, 다섯 마리 돼지 유래 세포 모두 세포수준에서 EGFP가 관찰되는 것을 형광 현미경을 통해 확인하였다 (도 4d).
또한, 이들 다섯 마리 돼지 유전체에 정상적으로 CRI-CPC 시스템이 도입되었는지 검증하기 위해, 각 탯줄에서 유전체 DNA를 추출하여 CMV-GCas9-DSH 카세트에 있는 유전자들을 PCR을 통해 증폭하였다.
그 결과, 다섯 마리 모두 CRI-CPC 시스템의 모든 유전자를 발현함을 확인하였다 (도 4e).
상기의 결과들은 CRI-CPC 시스템을 보유한 형질전환 돼지가 SCNT를 통해 성공적으로 생산되었으며, 두 개의 건강한 CRI-CPC 돼지 모델을 획득하였음을 나타낸다.
<실험예1> 생산된 P#5 CRI-CPC 돼지로부터 확보한 정자 분석과 이를 이용한 체외 시험관 수정 (in vitro fertilisation) 후 배아 발달 효율 평가
개발한 CRI-CPC 돼지 종양 모델을 연구목적으로 활용하기 위해서는 자연 교배 등을 통한 대량 생산이 가능해야 한다. 이를 위해서는 선대 형질전환 모델에 도입된 유전자 카세트가 생식선 전달 (germline transmission) 되는 것이 필수 요건이다. 이를 검증하기 위해 수컷인 P#5 CRI-CPC 돼지의 생식세포인 정자에서 도입한 CMV-GCas9-DSH 카세트의 EGFP가 발현되는지 형광 현미경을 통해 확인하였다.
그 결과, 도 5a에 나타난 바와 같이, P#5 CRI-CPC 돼지의 정자 샘플에서 EGFP 발현을 검출하였다. 또한, 도 5b에 나타난 바와 같이, PCR 분석은 정자의 게놈에서 CRI-CPC 시스템의 존재를 확인하였다. 상기의 결과들은 CRI-CPC 시스템이 생식 세포로 전달될 수 있음을 시사한다.
확보한 정자로 체외 시험관 수정 (in vitro fertilisation, IVF)을 수행하여 배반포 (blastocyst)까지 정상적으로 배아 발달이 가능한지 확인하는 실험을 수행하였다.
그 결과, 도 5c에 나타난 바와 같이, 정상적인 배아 발달이 관찰되었다. 또한, 도 5d에 나타난 바와 같이, 체외 시험관 수정 후 2일째 발달 중인 배아와 배반포에서 CMV-GCas9-DSH 카세트의 EGFP가 관찰되는 것으로 확인되어, 도입된 CMV-GCas9-DSH 카세트는 정상적으로 생식선 전달이 가능하며 생식세포가 수정되어 배아 발달이 되는 과정에서도 CRI-CPC 시스템이 유효함을 검증하였다.
<실험예2> 자연 교배를 통한 CRI-CPC 돼지 종양 모델 후대 생산
자연 교배를 통해 후대 생산이 가능한지 검증을 위해, CRI-CPC 돼지 종양 모델인 P#5 수컷과 제주 토종 암컷 돼지를 자연 교배하였고, F1#1, F1#2, F1#3, F1#4 총 4마리의 2세대 형질전환 새끼 돼지를 생산하였다 (도 6a).
Y 염색체에 있는 SRY 유전자 검증을 통해, 태어난 4마리의 새끼 돼지 중 F1#1은 암컷이고, F1#2, F1#3, F1#4 세 마리는 수컷으로 확인되었다 (도 6b).
태어난 새끼 돼지들이 형질전환 CRI-CPC 종양 돼지 모델인지 검증하기 위해 4마리의 새끼 돼지의 유전체를 PCR 분석하였다.
그 결과, 도 6c에 나타난 바와 같이, 암컷인 F1#1은 형질전환 돼지가 아닌 것으로 확인되었으며, 수컷인 F1#2, F1#3, F1#4 세 마리는 모두 CMV-GCas9-DSH 카세트가 정상적으로 도입된 CRI-CPC 돼지 종양 모델임을 PCR 검증을 통해 확인하였다.
<실험예3> 생산된 형질전환 CRI-CPC 돼지 유래 세포를 활용한 Cas9 유도 암세포화 검증
형질전환 CRI-CPC 돼지 종양 모델로 검증된 P#5, F1#2, F1#3, F1#4 네 마리의 돼지로부터 확보한 섬유아세포를 활용해 Cas9에 의해 CRI-CPC 시스템이 적절하게 작동하고, 그에 따라 종양유전자의 발현 및 암세포화가 진행되는지 검증하고자 하였다.
그 결과, 도 7a에 나타난 바와 같이, 각 세포에 Cas9과 두 gRNA를 도입한 세포 중 일부 P#5와 F1#3 돼지 유래 세포의 세포 모양이 많이 바뀌었고 암세포처럼 겹쳐 자라는 것으로 확인하였다. Cas9에 의해 의도한 CRI-CPC 시스템이 적절하게 작동이 된다면 DSH 카세트에 포함된 DsRed 형광 유전자가 발현되도록 설계되어있다. 형광현미경과 FACS 장비를 통해 DsRed 형광 단백질 발현 여부를 확인한 결과, 도 7b 및 7c에 나타난 바와 같이, 세포 모양이 변한 일부 P#5와 F1#3 돼지 유래 세포에서 빨강 형광이 관찰됨을 확인하였다. 반대로 Cas9 도입 후 F1#2 및 F1#4 유래 섬유 아세포에서는 형태학적 변화나 적색 형광이 검출되지 않았다.
또한, 두 가지 종양 유전자, SV40LT 및 HRASG12V의 발현과 MAPK 경로의 활성화 여부를 알아보기 위하여 웨스턴 블랏 (western blot) 실험을 수행하였다.
그 결과, 도 7d에 나타난 바와 같이, Cas9을 도입한 P#5와 F1#3 돼지 유래 세포에서 DSH 카세트에 포함된 SV40LT와 HRASG12V가 독립된 단백질로 발현하는 것을 확인하였으며, HRAS의 대표 하부 신호 중개인자인 ERK1/2의 인산화가 증가되어있는 것을 확인하였다.
암세포의 대표적 특징인 부착-비의존성 성장을 확인하기 위해 소프트 한천배지 실험 (soft-agar assay)을 수행하였다.
그 결과, 도 7e 및 7f에 나타난 바와 같이, Cas9을 도입한 P#5와 F1#3 돼지 유래 세포만이 부착-비의존성을 획득한 것을 확인하여, 암세포화된 것을 확인하였다.
<실험예4> Cas9에 의해 재정렬된 CRI-CPC 도입 유전자 자리의 서열 분석
디자인된 CRI-CPC 시스템은 의도된대로 Cas9에 의해 재정렬이 적절하게 되었는지에 대한 여부는 타겟 서열을 PCR하여 서열 분석을 통해 정확히 알 수 있다. CMV-GCas9-DSH 카세트 내에서 Cas9에 의한 표적 DNA　양가닥절단이 되는 부위의 바깥쪽인 CMV 프로모터 서열과 DsRed 유전자를 증폭하는 프라이머 (primer)를 디자인하여 표적 재정렬 이후 PCR 산물의 차이를 보고자 하였다. 재정렬 되지 않은 경우에는 1,995bp (base pair)의 PCR 산물이 증폭되며 재정렬된 경우에는 1,019bp의 EGFP-pA 카세트가 제거되고, 976bp의 산물이 증폭된다 (도 8a).
제작한 프라이머로 증폭한 결과, 앞선 결과와 마찬가지로 Cas9을 도입한 P#5와 F1#3 돼지 유래 세포 유전체에서만이 재정렬된 PCR 밴드를 확인하여 의도된 CRI-CPC 시스템 작동에 의해 종양 유전자 발현이 되었음을 확인하였다 (도 8b).
정확히 어떻게 재정렬이 되었는지 검증하기 위해 976 bp에 해당하는 PCR 산물을 시퀀싱 기법으로 정확한 서열을 분석하였다.
구체적으로, CRI-CPC 활성화 후 각 표시된 세포에서 추출한 게놈 DNA를 PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase (TaKaRa Bio, Inc.) 및 특정 프라이머 세트 (표 2)를 사용하여 증폭하여 다음 조건 하에서 표적 재배열 된 서열을 검출하였다. 98 도에서 2분; 98도에서 15초, 58도에서 15초, 35회 반복; 72도에서 5 분. 각 생산물을 pGEM T-easy 벡터 (Promega)에 연결한 다음 ABI BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 시퀀싱하였다.
그 결과, Cas9을 도입한 P#5, F1#3 돼지 유래 섬유아세포의 유전체 내에 도입된 CMV-GCas9-DSH 카세트에서 의도한 EGFP-pA 카세트 제거가 일어난 뒤 비상동말단연결 기전에 의해 CMV-DSH로 연결되었음을 확인하였다 (도 8c 및 도 8d). 알 수 없는 삽입된 서열과 치환된 서열의 뉴클레오타이드는 각각 적색과 청색으로 음영 처리하였다.
상기의 결과를 통해, 본 발명의 CRI-CPC 시스템이 Cas9 형질 도입을 통해 CRI-CPC 형질 전환 돼지 유래 세포를 암세포로 조건부로 유도할 수 있으며, 생식선을 통해 전달된 CRI-CPC 시스템이 자손 세대에서 성공적으로 작동함을 밝혔다.
<110> Chungbuk National University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> CRISPR/Cas9-mediated polystronic oncogene expression vector and animal tumor model using same <130> 2021p-07-002 <160> 27 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA#1 <400> 1 tacattatac gaagttacca tgg 23 <210> 2 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA#2 <400> 2 tatacgaagt tataggatcc cgg 23 <210> 3 <211> 4104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cas9 <400> 3 atggacaaga agtacagcat cggcctggac atcggcacca actctgtggg ctgggccgtg 60 atcaccgacg agtacaaggt gcccagcaag aaattcaagg tgctgggcaa caccgaccgg 120 cacagcatca agaagaacct gatcggagcc ctgctgttcg acagcggcga aacagccgag 180 gccacccggc tgaagagaac cgccagaaga agatacacca gacggaagaa ccggatctgc 240 tatctgcaag agatcttcag caacgagatg gccaaggtgg acgacagctt cttccacaga 300 ctggaagagt ccttcctggt ggaagaggat aagaagcacg agcggcaccc catcttcggc 360 aacatcgtgg acgaggtggc ctaccacgag aagtacccca ccatctacca 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gccattctgc ggcggcagga agatttttac ccattcctga aggacaaccg ggaaaagatc 1320 gagaagatcc tgaccttccg catcccctac tacgtgggcc ctctggccag gggaaacagc 1380 agattcgcct ggatgaccag aaagagcgag gaaaccatca ccccctggaa cttcgaggaa 1440 gtggtggaca agggcgcttc cgcccagagc ttcatcgagc ggatgaccaa cttcgataag 1500 aacctgccca acgagaaggt gctgcccaag cacagcctgc tgtacgagta cttcaccgtg 1560 tataacgagc tgaccaaagt gaaatacgtg accgagggaa tgagaaagcc cgccttcctg 1620 agcggcgagc agaaaaaggc catcgtggac ctgctgttca agaccaaccg gaaagtgacc 1680 gtgaagcagc tgaaagagga ctacttcaag aaaatcgagt gcttcgactc cgtggaaatc 1740 tccggcgtgg aagatcggtt caacgcctcc ctgggcacat accacgatct gctgaaaatt 1800 atcaaggaca aggacttcct ggacaatgag gaaaacgagg acattctgga agatatcgtg 1860 ctgaccctga cactgtttga ggacagagag atgatcgagg aacggctgaa aacctatgcc 1920 cacctgttcg acgacaaagt gatgaagcag ctgaagcggc ggagatacac cggctggggc 1980 aggctgagcc ggaagctgat caacggcatc cgggacaagc agtccggcaa gacaatcctg 2040 gatttcctga agtccgacgg cttcgccaac agaaacttca tgcagctgat ccacgacgac 2100 agcctgacct ttaaagagga catccagaaa gcccaggtgt ccggccaggg cgatagcctg 2160 cacgagcaca ttgccaatct ggccggcagc cccgccatta agaagggcat cctgcagaca 2220 gtgaaggtgg tggacgagct cgtgaaagtg atgggccggc acaagcccga gaacatcgtg 2280 atcgaaatgg ccagagagaa ccagaccacc cagaagggac agaagaacag ccgcgagaga 2340 atgaagcgga tcgaagaggg catcaaagag ctgggcagcc agatcctgaa agaacacccc 2400 gtggaaaaca cccagctgca gaacgagaag ctgtacctgt actacctgca gaatgggcgg 2460 gatatgtacg tggaccagga actggacatc aaccggctgt ccgactacga tgtggaccat 2520 atcgtgcctc agagctttct gaaggacgac tccatcgaca acaaggtgct gaccagaagc 2580 gacaagaacc ggggcaagag cgacaacgtg ccctccgaag aggtcgtgaa gaagatgaag 2640 aactactggc ggcagctgct gaacgccaag ctgattaccc agagaaagtt cgacaatctg 2700 accaaggccg agagaggcgg cctgagcgaa ctggataagg ccggcttcat caagagacag 2760 ctggtggaaa cccggcagat cacaaagcac gtggcacaga tcctggactc ccggatgaac 2820 actaagtacg acgagaatga caagctgatc cgggaagtga aagtgatcac cctgaagtcc 2880 aagctggtgt ccgatttccg gaaggatttc cagttttaca aagtgcgcga gatcaacaac 2940 taccaccacg cccacgacgc ctacctgaac gccgtcgtgg gaaccgccct gatcaaaaag 3000 taccctaagc tggaaagcga gttcgtgtac ggcgactaca aggtgtacga cgtgcggaag 3060 atgatcgcca agagcgagca ggaaatcggc aaggctaccg ccaagtactt cttctacagc 3120 aacatcatga actttttcaa gaccgagatt accctggcca acggcgagat ccggaagcgg 3180 cctctgatcg agacaaacgg cgaaaccggg gagatcgtgt gggataaggg ccgggatttt 3240 gccaccgtgc ggaaagtgct gagcatgccc caagtgaata tcgtgaaaaa gaccgaggtg 3300 cagacaggcg gcttcagcaa agagtctatc ctgcccaaga ggaacagcga taagctgatc 3360 gccagaaaga aggactggga ccctaagaag tacggcggct tcgacagccc caccgtggcc 3420 tattctgtgc tggtggtggc caaagtggaa aagggcaagt ccaagaaact gaagagtgtg 3480 aaagagctgc tggggatcac catcatggaa agaagcagct tcgagaagaa tcccatcgac 3540 tttctggaag ccaagggcta caaagaagtg aaaaaggacc tgatcatcaa gctgcctaag 3600 tactccctgt tcgagctgga aaacggccgg aagagaatgc tggcctctgc cggcgaactg 3660 cagaagggaa acgaactggc cctgccctcc aaatatgtga acttcctgta cctggccagc 3720 cactatgaga agctgaaggg ctcccccgag gataatgagc agaaacagct gtttgtggaa 3780 cagcacaagc actacctgga cgagatcatc gagcagatca gcgagttctc caagagagtg 3840 atcctggccg acgctaatct ggacaaagtg ctgtccgcct acaacaagca ccgggataag 3900 cccatcagag agcaggccga gaatatcatc cacctgttta ccctgaccaa tctgggagcc 3960 cctgccgcct tcaagtactt tgacaccacc atcgaccgga agaggtacac cagcaccaaa 4020 gaggtgctgg acgccaccct gatccaccag agcatcaccg gcctgtacga gacacggatc 4080 gacctgtctc agctgggagg cgac 4104 <210> 4 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P2A <400> 4 gctactaact tcagcctgct gaagcaggct ggagacgtgg aggagaaccc tggacct 57 <210> 5 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T2A <400> 5 gagggcaggg gaagtcttct aacatgcggg gacgtggagg aaaatcccgg ccca 54 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV PROMOTER (F) <400> 6 gcggccgcgg gccagatata ctcgttga 28 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV PROMOTER (R) <400> 7 gccagagagc tctgcttat 19 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DsRed (F) <400> 8 cccgggagat ttcatggcct cctccga 27 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DsRed (R) <400> 9 gctagcagac aacaggaaca ggtggtg 27 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SV40LT (F) <400> 10 ctcgagtcga ccagctttgc aaaga 25 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SV40LT (R) <400> 11 tcgcgatgat gtttcaggtt agggga 26 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRASG12V (F) <400> 12 gaattcgcga tgacggaata taagctg 27 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRASG12V (R) <400> 13 aggcctcgtc aggagagcac acactt 26 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Whole construct of CMV-GCas9-DSH PRIMER (F) <400> 14 caagtacgcc ccctattgac 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Whole construct of CMV-GCas9-DSH primer (R) <400> 15 gacgatgatt tccccgacaa 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP primer (F) <400> 16 aacggccaca agttcagcgt 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP primer (R) <400> 17 tcaccttgat gccgttcttc 20 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DsRed primer (F) <400> 18 acggccacga gttcgagat 19 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DsRed primer (R) <400> 19 tgcttcacgt acaccttgga g 21 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SV40LT primer (F) <400> 20 tgcttggcta cactgtttgt 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SV40LT primer (R) <400> 21 ctgtccaagg gcaaattaac 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRASG12V primer (F) <400> 22 cattttgtgg acgaatacga 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRASG12V primer (R) <400> 23 tgtcctcaaa agacttggtg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Re-arranged target sequence primer (F) <400> 24 caagtacgcc ccctattgac 20 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Re-arranged target sequence primer (R) <400> 25 tgcttcacgt acaccttgga g 21 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RN18s primer (F) <400> 26 cgcggttcta ttttgttggt 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RN18s primer (R) <400> 27 agtcggcatc gtttatggtc 20

Claims (14)

  1. 종양성 유전자 (oncogene);
    서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 가이드 RNA (gRNA)를 암호화하는 유전자;
    Cas9 단백질을 암호화하는 유전자; 및
    상기 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 종양 동물 모델 제작용 재조합 발현 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 종양성 유전자(oncogene)는, SV40 large T (SV40LT) 및 HRASG12V 에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 종양 동물 모델 제작용 재조합 발현 벡터.
  3. 제1항에 있어서, 상기 프로모터는 CMV 프로모터인 것을 특징으로 하는, 종양 동물 모델 제작용 재조합 발현 벡터.
  4. 제1항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 형광 단백질을 코딩하는 유전자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 종양 동물 모델 제작용 재조합 발현 벡터.
  5. 제4항에 있어서, 상기 형광 단백질은 EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), DsRed 또는 이들 모두를 포함하는 것을 특징으로 하는, 종양 동물 모델 제작용 재조합 발현 벡터.
  6. 제1항 내지 제5항에 있어서, 상기 유전자는 2A 펩타이드 서열로 연결된 것을 특징으로 하는, 종양 동물 모델 제작용 재조합 발현 벡터.
  7. 제1항에 있어서, 상기 벡터는 CMV-Cas9#1-EGFP-pA-Cas9#2-DsRed-P2A-SV40LT-T2A-HRASG12V인 것을 특징으로 하는, 종양 동물 모델 제작용 재조합 발현 벡터.
  8. 제1항에 있어서, 상기 재조합 발현 벡터는 Cas9 유전자와 표적 gRNA를 도입을 통해 암세포화 및 종양 발달을 선택적으로 유도하는 것을 특징으로 하는, 종양 동물 모델 제작용 재조합 발현 벡터.
  9. 제1항의 재조합 발현 벡터가 도입된 것을 특징으로 하는, 종양 동물모델 제작용 형질전환 세포주.
  10. 제1항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 체세포의 핵을, 탈핵된 난자에 이식하여 형성한 핵 이식란.
  11. 제1항의 재조합 벡터가 도입된 핵 공여 세포의 핵을 탈핵된 난자에 이식하여 난자를 생산하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간을 제외한 종양 동물 모델의 제작 방법.
  12. 제11항의 방법으로 제작된 것을 특징으로 하는, 인간을 제외한 종양 동물 모델.
  13. 제12항에 있어서, 상기 동물은 돼지인 것을 특징으로 하는, 종양 동물 모델.
  14. 1) 제12항의 종양 동물 모델에 항암제 후보물질을 투여하는 단계; 및
    2) 상기 후보물질을 투여한 동물모델을 후보물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 후보물질에 의해 종양형성이 개선되거나 치료되는 경우 이를 항암제로 판단하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 항암제의 스크리닝 방법.
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