KR20180033719A

KR20180033719A - 기미 또는 검버섯 구별용 마커로서의 호메오박스a9의 용도

Info

Publication number: KR20180033719A
Application number: KR1020160123015A
Authority: KR
Inventors: 이애영; 정경아
Original assignee: 동국대학교 산학협력단
Priority date: 2016-09-26
Filing date: 2016-09-26
Publication date: 2018-04-04

Abstract

본 발명은 기미 또는 검버섯을 조기에 효과적으로 구별 진단 및 예측할 수 있는 기미 또는 검버섯 구별 마커용 조성물, 기미 또는 검버섯 구별용 조성물 및/또는 키트, 상기 조성물을 이용한 기미 또는 검버섯 구별 진단 방법에 관한 것으로, 본 발명으로 기미 또는 검버섯의 구별이 가능할 것으로 기대되며, 본 발명의 마커인 호메오박스A9의 발현 및 활성을 조절하여 기미 또는 검버섯 치료제 개발에 유용하게 사용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

기미 또는 검버섯 구별용 마커로서의 호메오박스A9의 용도 {Use of homeoboxA9 as a melasma or seborrheic keratosis distinguishing marker}

본 발명은 기미 또는 검버섯 구별 마커용 조성물, 기미 또는 검버섯 구별용 조성물, 상기 구별 마커용 조성물을 이용한 기미 또는 검버섯 구별 진단 방법 및 기미 또는 검버섯의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

신체 피부의 멜라닌 세포에서 생성되는 멜라닌 색소는 검은 색소와 단백질의 복합체 형태를 갖는 페놀계 고분자 물질로서, 태양으로부터 조사되는 자외선에 의한 피부손상 저해에 중요한 역할을 담당한다. 멜라닌의 과잉 합성 및 축적은 피부에 기미, 주근깨 및 노인성 흑자 (senile lentigo) 등 심각한 미적 (美的) 문제를 일으킬 뿐만 아니라, 피부노화를 촉진하며 피부암을 유발하기도 한다 (Hearing V.J. et al., FASEB J., 5: 2902-2909, 1991).

기미는 주로 태양에 노출된 피부에 일어나는 과색소 침착 증상으로, 일반적으로는 좌우 대칭 형태로 나타나는 특징을 갖고, 햇볕을 비교적 덜 받는 눈두덩이나 턱밑 같은 곳에는 거의 생기지 않는다. 따라서 햇볕이 강한 여름에 한층 더 증세가 심해지는 반면 겨울에는 옅어진다. 성별이나 인종, 나이에 큰 영향을 받지는 않지만 주로 동양인이나 라틴계 여성에게서 많이 발견된다. 그 원인에 대해서는 아직도 불명확한 부분이 많지만 주로 태양광에의 노출, 임신에 의한 호르몬 변화, 영양 부족, 내분기계 질환 등으로 인해 유발된다고 알려져 있다.

한번 생긴 기미는 완전한 제거하기가 어렵기 때문에 예방이 중요한데 기미가 생기기 쉬운 피부를 미리 확인하여 집중적인 예방 처치를 할 수 있다면 기미 발생을 좀더 효율적으로 방지할 수 있을 것이다. 그러나 상기 기술한 바와 같이 아직 기미의 원인에 대해 명확하게 밝혀진 바가 없기 때문에, 미리 기미 형성을 예지하는 것은 어려운 실정이다.

한편, 검버섯은 햇빛에 노출되는 부위에 발생하는 원형 또는 타원형의 갈색 또는 검은색 반점 또는 융기된 형태로서, 얼굴, 등, 손등, 팔, 다리 등의 자외선 노출 부위에 많이 나타나지만 다른 부위에도 발생할 수 있다.

그러나 피부의 검버섯 발생 과정에서 외부 자극 (UV, ROS 등)과 검버섯 발생 사이의 인과 관계가 명확하지 않기 때문에 효과적인 검버섯 발생 조절 방법이 개발되지 못하고 있다. 또한, 검버섯의 특성을 총체적으로 이해하기 위해 다양한 단백질들의 특성을 이해하려는 시도 또한 효능 물질 (코지산, 하이드로퀴논 등) 이나 자극원 (UV, ROS)을 세포에 처리한 배양 시스템 내 연구에 국한되어 그 한계를 가지고 있다.

특히, 검버섯은 초기에는 크기도 작고 옅은 갈색을 띄며, 일반적으로 노인질환으로 인식하거나, 기미 또는 점으로만 생각하고 방치하는 경우가 많다. 하지만, 그냥 두면 둘수록 점점 넓어지고 개수도 늘어나기 때문에 검버섯 치료는 최대한 초기에 하는 것이 바람직하다. 한편, 미용적인 문제 외 피부에 별다른 영향을 주지는 않지만 갑자기 검버섯이 많아 보이고 가려움증 등이 동반된다면 신체 내부 장기의 암 증상을 의심해볼 수 있고, 피부암 초기증상도 검버섯과 비슷하기 때문에, 초기에 기미 또는 검버섯을 구별하여 진단하는 것이 더욱 중요하다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 정상피부 부위와 비교하여 기미 또는 검버섯 병변 부위에서 발현이 증가 또는 감소하는 유전자를 찾아내고, 이에 대하여 기미 또는 검버섯 부위에서 발현 정도를 재확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 목적은 호메오박스A9 (homeoboxA9) 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 호메오박스A9 단백질을 포함하는 기미와 검버섯 구별용 바이오마커 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 호메오박스A9 (homeoboxA9) 유전자의 수준 또는 호메오박스A9 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 기미 또는 검버섯 구별 진단용 조성물 및/또는 키트를 포함한 관련 제품 및/또는 적용 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 생물학적 시료에 존재하는 호메오박스A9 (homeoboxA9) 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하여 정상대조군 시료의 발현량과 비교하는 단계를 포함하는 기미 또는 검버섯의 예측 및 진단 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 호메오박스A9 (homeoboxA9) 또는 호메오박스A9 억제제를 유효성분으로 포함하는 기미 또는 검버섯의 예방 또는 치료용 조성물 및 이를 이용한 기미 또는 검버섯 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 호메오박스A9 (homeoboxA9) 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 호메오박스A9 단백질을 포함하는 기미와 검버섯 구별용 바이오마커 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 호메오박스A9 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 가질 수 있다.

또한, 본 발명은 호메오박스A9 (homeoboxA9) 유전자의 수준 또는 호메오박스A9 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 기미 또는 검버섯 구별 진단용 조성물 및/또는 키트를 포함한 관련 제품 및/또는 적용 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 호메오박스A9 유전자의 수준을 측정하는 물질은 호메오박스A9 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 호메오박스A9 단백질의 수준을 측정하는 물질은 호메오박스A9 단백질을 특이적으로 인식하는 항체일 수 있다.

또한, 본 발명은 생물학적 시료에 존재하는 호메오박스A9 (homeoboxA9) 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하여 정상대조군 시료의 발현량과 비교하는 단계를 포함하는 기미 또는 검버섯의 예측 및 진단 방법을 제공한다. 이때, 상기 생물학적 시료에서 존재하는 호메오박스A9 유전자의 발현량 또는 단백질의 양이 대조군에 비해 증가된 경우, 검버섯 형성이 쉬운 피부인 것으로 판정하거나 검버섯이 진행된 것으로 판정할 수 있으며, 반대로 호메오박스A9 유전자의 발현량 또는 단백질의 양이 대조군에 비해 감소된 경우, 기미 형성이 쉬운 피부인 것으로 판정하거나 기미가 진행된 것으로 판정할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 유전자 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNaseprotection assay), 노던 블롯팅(Northern blotting) 및 DNA 칩으로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 방법일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하기 위한 방법은 웨스턴 블롯, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직 면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 방법일 수 있다.

또한, 본 발명은 호메오박스A9 (homeoboxA9) 또는 호메오박스A9 억제제를 유효성분으로 포함하는 기미 또는 검버섯의 예방 또는 치료용 조성물 및 이를 이용한 기미 또는 검버섯 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

도 1은 검버섯 및 기미 피부 조직에서의 마이크로어레이 분석 결과를 나타내는 도이다.
도 2는 Real-tiem PCR을 이용하여 정상부 (N)에 비하여 검버섯 병변부 (L)에서 발현되는 호메오박스A9 (homeoboxA9) mRNA 양의 비를 비교한 도이다.
도 3은 Real-tiem PCR을 이용하여 정상부 (N)에 비하여 기미 병변부 (L)에서 발현되는 호메오박스A9 (homeoboxA9) mRNA 양의 비를 비교한 도이다.
도 4는 Real-tiem PCR을 이용하여 일차 배양한 피부세포 (각질형성세포 (KC), 섬유아세포 (FB), 및 멜라닌세포 (MC))에서 발현되는 호메오박스A9 (homeoboxA9) mRNA 양을 확인한 도이다.
도 5는 검버섯 환자 (#1)의 정상부 (N) 및 병변부 (L) 조직을 호메오박스A9 (homeoboxA9) 항체 및 Hoechst로 염색하여 GDA 발현을 확인한 도이다.
도 6은 검버섯 환자 (#2)의 정상부 (N) 및 병변부 (L) 조직을 호메오박스A9 (homeoboxA9) 항체 및 Hoechst로 염색하여 GDA 발현을 확인한 도이다.
도 7은 기미 환자 (#1)의 정상부 (N) 및 병변부 (L) 조직을 호메오박스A9 (homeoboxA9) 항체 및 Hoechst로 염색하여 GDA 발현을 확인한 도이다.
도 8은 기미 환자 (#2)의 정상부 (N) 및 병변부 (L) 조직을 호메오박스A9 (homeoboxA9) 항체 및 Hoechst로 염색하여 GDA 발현을 확인한 도이다.
도 9는 호메오박스A9 (homeoboxA9)의 클로닝 및 트렌스펙션 과정을 개략적으로 나타내는 도이다.

본 발명자들은, 실시예에서 검버섯 또는 기미 병변부에서 호메오박스A9 (homeoboxA9) 단백질 발현이 증가 또는 감소한다는 점에 기반하여 검버섯 또는 기미 환자 병변부에서 호메오박스A9 단백질 발현 등을 구체적으로 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 호메오박스A9 (homeoboxA9) 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 호메오박스A9 단백질을 포함하는 기미와 검버섯 구별용 바이오마커 조성물을 제공함에 특징이 있다.

본 발명자들은, 검버섯 환자에서 호메오박스A9 (homeoboxA9) 유전자가 정상부에 비해 병변부 조직에서 높게 발현되는 것을 확인할 수 있었으며, 반대로 기미 환자에서 호메오박스A9 (homeoboxA9) 유전자가 정상부에 비해 병변부 조직에서 낮게 발현되는 것을 확인하고, 상기 호메오박스A9 유전자의 염기서열을 서열번호 1에 나타내었다.

본 발명의 일실시예에서는, 검버섯 또는 기미 병변부 조직에서 특이적으로 호메오박스A9의 발현이 증가 또는 감소한다는 것을 확인하였는 바(실시예 2 참조), 본 발명에 따른 호메오박스A9 유전자를 이용하여 기미 또는 검버섯의 구별 진단이 요구되는 다양한 목적 및 용도로 사용될 수 있다.

이에, 본 발명은 호메오박스A9 (homeoboxA9) 유전자의 수준 또는 호메오박스A9 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 기미 또는 검버섯 구별 진단용 조성물 및/또는 키트를 포함한 관련 제품 및/또는 적용 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 호메오박스A9 (homeoboxA9) 유전자의 수준 또는 호메오박스A9 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 기미 또는 검버섯 진단용 조성물 및/또는 키트를 포함한 관련 제품 및/또는 적용 방법을 제공한다.

본 발명에서, "진단"이란 병리 상태를 확인하는 것을 의미하는 것으로서, 본 발명의 목적상 상기 진단은 기미 또는 검버섯 진단 마커의 발현 유무를 확인하여 기미 또는 검버섯의 진행 여부를 확인하는 것을 의미하며, 또한, 본 발명에서의 진단은 기미 또는 검버섯 진단 마커의 발현 유무 및 발현 정도를 확인하여 기미 또는 검버섯의 발병여부, 발전 및 경감 등을 판단하는 것도 포함한다.

본 발명에서, "구별 진단"이란 본 발명의 목적상 기미 또는 검버섯 진단 마커의 발현 유무를 확인하여 기미 또는 검버섯의 진행 여부를 확인하여, 마커의 발현 증가 또는 감소에 따라 어느 한 쪽의 질병이 발병, 발전 및 경감됨을 판단하는 것을 의미한다.

또한, "진단 마커 (diagnosis marker)"각질형성세포 (KC), 섬유아세포 (FB), 또는 멜라닌세포 (MC) 등 병변부 피부세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질을 의미하며, 정상 세포에 비하여 병변부 피부세포에서 증가를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산 (예컨대, mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당 (단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다.

본 발명에서 상기 호메오박스A9 유전자의 수준을 측정하는 물질은 호메오박스A9 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있고, 상기 호메오박스A9 단백질의 수준을 측정하는 물질은 호메오박스A9 단백질을 특이적으로 인식하는 항체일 수 있다.

본 발명에서 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형 (template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응 (즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.

본 발명에서 "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 표지 (Labelling)되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브, 단쇄 DNA (single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA (double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명에서, "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.

본 발명의 유전자는 핵산 서열이 유전자 은행에 등록되어 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브를 디자인할 수 있다.

본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브는 포스포르 아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미 데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

또한, 본 발명은 생물학적 시료에 존재하는 호메오박스A9 (homeoboxA9) 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하여 정상대조군 시료의 발현량과 비교하는 단계를 포함하는 기미 또는 검버섯의 예측 및 진단 방법을 제공한다.

본 발명에서 "생물학적 시료"는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 생물학적 시료에서 존재하는 호메오박스A9 유전자의 발현량 또는 단백질의 양이 대조군에 비해 증가된 경우, 검버섯 형성이 쉬운 피부인 것으로 판정하거나 검버섯이 진행된 것으로 판정할 수 있으며, 반대로 호메오박스A9 유전자의 발현량 또는 단백질의 양이 대조군에 비해 감소된 경우, 기미 형성이 쉬운 피부인 것으로 판정하거나 기미가 진행된 것으로 판정할 수 있다.

본 발명에서 "유전자 발현량 측정"이란 기미 또는 검버섯의 진행 여부를 확인하기 위하여 각질형성세포 (KC), 섬유아세포 (FB), 또는 멜라닌세포 (MC) 등 피부세포에서 상기 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA의 양을 측정하여 이루어진다. 이를 위한 분석 방법으로는 예를 들어, 역전사 중합효소반응 (RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응 (Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응 (Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅 (Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 유전자의 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브이다. 본 발명에서 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서, 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드염기의 서열 및 서브 유닛간 백본을 갖는 올리고머를 지칭한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다. 이 안티센스 올리고머는 mRNA의 번역을 차단 또는 저해하고 mRNA의 스플라이스 변이체를 생산하는 mRNA의 프로세싱 과정을 변화시킬 수 있다.

본 발명에서 "단백질 발현량 측정"이란 기미 또는 검버섯의 진행 여부를 확인하기 위하여 각질형성세포 (KC), 섬유아세포 (FB), 또는 멜라닌세포 (MC) 등 피부세포에서 본 발명의 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 단백질의 양을 측정하여 이루어진다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석 (RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법 (Complement Fixation Assay), 유세포분석 (Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩 (protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 단백질 발현 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 항체이다.

또한, 본 발명은 호메오박스A9 (homeoboxA9) 유전자의 수준 또는 호메오박스A9 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는, 기미 또는 검버섯 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 호메오박스A9 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 확인함으로써 기미 또는 검버섯을 진단할 수 있다. 본 발명의 키트에는 프라이머, 프로브, 항체 등 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액, 또는 장치가 더 포함될 수 있으며, 바람직하게는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트, DNA 칩 키트, 단백질 칩 키트의 형태일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

구체적인 일례로서, 본 발명에서 상기 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드 (dNTPs), Taq-중합 효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물 (DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 마이크로어레이를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 마이크로어레이 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있으며, 본 발명의 유전자를 이용하여 당업계에서 통상적으로 사용되는 제조 방법에 의하여 용이하게 제조될 수 있다. 마이크로어레이를 제작하기 위해서, 상기 탐색된 마커를 탐침 DNA 분자로 이용하여 DNA 칩의 기판상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭 (piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅 (micropipetting)법 또는 핀 (pin) 형태의 스폿터 (spotter)를 이용한 방법 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 제한되지 않는다. 상기 마이크로어레이 칩의 기판은 아미노-실란 (amino-silane), 폴리-L-라이신 (poly-Llysine) 및 알데히드 (aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막 및 니트로셀룰로스 막 (nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하나 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드 (oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예로서, 대상체 유래 생물학적 시료로부터 호메오박스A9 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하고, 이에 상기 기미 치료용 후보물질 투여시, 호메오박스A9 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 기존 대비 증가되는 경우 상기 후보물질은 기미 치료제로 이용될 수 있으며, 검버섯 치료용 후보물질 투여시, 호메오박스A9 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 기존 대비 감소되는 경우 상기 후보물질은 검버섯 치료제로 이용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험 준비 및 실험 방법

1-1. 조직 샘플

기미 또는 검버섯 환자 각각 2 사람의 정상부와 병변부 피부 조직을 생검하여 샘플을 얻었다. 본 실시예에서 사용된 상기 조직 샘플들은 일산동국대병원 IRB 승인을 받은 것이며, 헬싱키 선언의 요구에 부합되도록 사전에 참가자들로부터 동의를 받았다. 각 환자의 특성치는 도 1에 나타내었다.

1-2. 마이크로어레이 분석 (microarray analysis)

피부 시료의 전체 RNA는 제조자의 지시에 따라 PureLink RNA 미니 키트 (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA)로 동정하였다. 총 RNA의 품질 및 정량은 Agilent bioanalyzer 2100 분석으로 평가하였다. 유전자 발현은 약 20,000 개의 잘 특성화된 인간 유전자를 나타내는 530,000 이상의 프로브로 구성되는 GeneChip® Prime view Arrays (Affymetrix, Santa Clara, CA)로 분석하였다. 바이오틴화된 cRNA는 500ng 전체 RNA (Expression Analysis Technical Manual, 2001, Affymetrix)의 표준 아피매트릭스 프로토콜에 따라 제조하였다. 분할 후, aRNA 12 μg을 Affymetrix Primeview array에서 45 ℃, 16 시간 동안 하이브리드하였다. GeneChip probe array는 세척 후 Affymetrix Fluidics Station 450에서 염색하였다. 염색된 GeneChip probe array는 Affymetrix GeneChip Scanner 3000+7G로 스캔하였다. 데이터는 표준화된 방법으로 아피매트릭스 기본 분석 설정 및 글로벌 스케일링을 사용하여 Robust Multichip Analysis (RMA)로 분석하였다. 정규화 후, 로그-변환된 강도 값은 GeneSpring GX 13.1.1 (Agilent technologies, CA)을 사용하여 분석하였다. Fold change 필터는 유전자가 업레귤레이트된 유전자 제어의 적어도 200 % 및 다운레귤레이트된 유전자 제어의 50 % 미만으로 존재하는 것이 필요조건으로 포함되었다.

1-3. Real-tiem PCR

RT-PCR을 위하여, cDNA 합성용 키트 (Promega, Fichburg, WI, USA)를 사용하여 총 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 표적 mRNA의 양은 Light Cycler real-time PCR machine (Roche, Penzberg, Germany)을 사용하여 RT-PCR에 의해 정량화하였다. mRNA의 상대적인 양은 글리세르알데히드-3-인산수소이탈효소 (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)에 대하여 각각의 타겟의 비율로 계산하였다. 본 실험에 사용된 프라이머 서열은 하기 표 1과 같다.

	5’-3’
HOXA9	forward	CCCCATCGATCCCAATAA
HOXA9	reverse	CACCGCTTTTTCCGAGTG
GAPDH	forward	TCCACTGGCGTCTTCACC
GAPDH	reverse	GGCAGAGATGATGACCCTTT

1-4. 면역조직화학적 염색

인간 피부 생검 표본의 5 μm 단편을 파라핀에 임베딩하였다. 탈파라핀 및 재수화 후, 3 % 소 혈청 알부민으로 전배양하였다. 상기 단편은 항-HOXA9 항체 및 1:200 Alexa Fluor-labeled donkey anti-goat IgG (488; Molecular Probes, Eugene, OR)를 순차적으로 반응시켰으며, 핵은 Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich)로 대조염색하였다. 형광 이미지는 이미지 분석 시스템 (Dp Manager 2.1; Olympus Optical Co., Tokyo, Japan)을 사용하여 평가하였다.

실시예 2. 기미 또는 검버섯 피부 조직의 마이크로어레이 분석 (microarray analysis)

검버섯 및 기미 피부 조직에서 특이적으로 발현되는 유전자를 확인하기 위하여 실시예 1-2의 방법으로 실험하였으며, 그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 검버섯 피부 조직에서는 증가되면서, 기미 피부 조직에서는 감소되는 호메오박스A9 (homeoboxA9, HOXA9) 유전자를 확인하였다.

실시예 3. 기미 또는 검버섯 환자에서 homeoboxA9 (HOXA9) 발현 확인

상기 실시예 2의 결과에 기초하여, 기미 또는 검버섯 부위에서 GDA의 mRNA 발현 정도를 재확인하기 위하여 상기 실시예 1-3과 같이 실험하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 검버섯 환자의 경우 9명 중 8명의 병변부에서 HOXA9 mRNA 발현이 증가됨을 확인한 반면, 기미 환자의 경우 9명 중 9명의 병변부에서 HOXA9 mRNA 발현이 감소됨을 확인하였다. 나아가, 도 3에 나타낸 바와 같이, 일차 배양한 각질형성세포 (KC)에서 HOXA9 mRNA 발현이 뚜렷하게 나타남을 확인하였으나, 섬유아세포 (FB) 및 멜라닌세포 (MC)에서는 mRNA 발현이 나타나지 않았다.

또한, 기미 또는 검버섯 환자의 정상부 (N) 및 병변부 (L) 조직에서 HOXA9의 mRNA 발현 정도를 재확인하기 위하여 상기 실시예 1-4와 같이 실험하였으며, 그 결과, 도 4 내지 7에 나타낸 바와 같이, 검버섯 환자 병변부에서 HOXA9의 mRNA 발현이 증가됨을 확인하였으나(도 4 및 5), 기미 환자 병변부에서는 HOXA9의 mRNA 발현이 감소됨을 확인하였다(도 6 및 7).

상기 내용을 종합한 결과, HOXA9 단백질 발현 정도가 증가 또는 감소하는지 여부에 따라, 기미 환자와 검버섯 환자를 구별하여 진단할 수 있으며, 각 질병에 맞는 예방, 초기진단 및 치료분야에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Dongguk University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Use of homeoboxA9 as a melasma or seborrheic keratosis distinguishing marker <130> MP16-405 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 819 <212> DNA <213> homeoboxA9 <400> 1 atggccacca ctggggccct gggcaactac tacgtggact cgttcctgct gggcgccgac 60 gccgcggatg agctgagcgt tggccgctat gcgccgggga ccctgggcca gcctccccgg 120 caggcggcga cgctggccga gcaccccgac ttcagcccgt gcagcttcca gtccaaggcg 180 acggtgtttg gcgcctcgtg gaacccagtg cacgcggcgg gcgccaacgc tgtacccgct 240 gcggtgtacc accaccatca ccaccacccc tacgtgcacc cccaggcgcc cgtggcggcg 300 gcggcgccgg acggcaggta catgcgctcc tggctggagc ccacgcccgg tgcgctctcc 360 ttcgcgggct tgccctccag ccggccttat ggcattaaac ctgaaccgct gtcggccaga 420 aggggtgact gtcccacgct tgacactcac actttgtccc tgactgacta tgcttgtggt 480 tctcctccag ttgatagaga aaaacaaccc agcgaaggcg ccttctctga aaacaatgct 540 gagaatgaga gcggcggaga caagcccccc atcgatccca ataacccagc agccaactgg 600 cttcatgcgc gctccactcg gaaaaagcgg tgcccctata caaaacacca gaccctggaa 660 ctggagaaag agtttctgtt caacatgtac ctcaccaggg accgcaggta cgaggtggct 720 cgactgctca acctcaccga gaggcaggtc aagatctggt tccagaaccg caggatgaaa 780 atgaagaaaa tcaacaaaga ccgagcaaaa gacgagtga 819

Claims

호메오박스A9 (homeoboxA9) 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 호메오박스A9 단백질을 포함하는 기미와 검버섯 구별용 바이오마커 조성물.
제1항에 있어서,
상기 호메오박스A9 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 조성물.
호메오박스A9 (homeoboxA9) 유전자의 수준 또는 호메오박스A9 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는, 기미 또는 검버섯 구별 진단용 조성물.
제3항에 있어서,
상기 호메오박스A9 유전자의 수준을 측정하는 물질은 호메오박스A9 유전자를 증폭시킬 수 있는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 조성물.
제3항에 있어서,
상기 호메오박스A9 단백질의 수준을 측정하는 물질은 호메오박스A9 단백질을 특이적으로 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는, 조성물.
호메오박스A9 (homeoboxA9) 유전자의 수준 또는 호메오박스A9 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는, 기미 또는 검버섯 구별 진단용 키트.
제6항에 있어서,
상기 호메오박스A9 유전자의 수준을 측정하는 물질은 호메오박스A9 유전자를 증폭시킬 수 있는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 키트.
제6항에 있어서,
상기 호메오박스A9 단백질의 수준을 측정하는 물질은 호메오박스A9 단백질을 특이적으로 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는, 키트.
a) 생물학적 시료에 존재하는 호메오박스A9 (homeoboxA9) 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하는 단계; 및
b) 상기 a) 단계의 측정결과를 정상대조군 시료의 호메오박스A9 유전자의 발현량 또는 단백질의 양과 비교하는 단계를 포함하는, 기미 또는 검버섯의 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법.
제9항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제9항에 있어서,
상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNaseprotection assay), 노던 블롯팅(Northern blotting) 및 DNA 칩으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 방법인 것을 특징으로 하는, 방법.
제9항에 있어서,
상기 단백질의 발현 수준을 측정하기 위한 방법은 웨스턴 블롯, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직 면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 방법인 것을 특징으로 하는, 방법.
제9항에 있어서,
상기 방법은, 상기 생물학적 시료에 존재하는 호메오박스A9 유전자의 발현량 또는 단백질의 양이 대조군에 비해 증가된 경우 검버섯 형성이 쉬운 피부인 것으로 판정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제9항에 있어서,
상기 방법은, 상기 생물학적 시료에 존재하는 호메오박스A9 유전자의 발현량 또는 단백질의 양이 대조군에 비해 감소된 경우 기미 형성이 쉬운 피부인 것으로 판정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
호메오박스A9 (homeoboxA9)를 유효성분으로 포함하는 검버섯 예방 또는 치료용 조성물.
호메오박스A9 (homeoboxA9) 억제제를 유효성분으로 포함하는 기미 예방 또는 치료용 조성물.
a) 기미 또는 검버섯 환자 유래 생물학적 시료에 존재하는 호메오박스A9 (homeoboxA9) 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하고, 이에 기미 또는 검버섯 치료용 후보물질을 투여하는 단계; 및
b) 호메오박스A9 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 상기 a) 단계에 비해 감소 또는 증가되는 것을 확인하는 단계를 포함하는 기미 또는 검버섯 치료제의 스크리닝 방법.
제17항에 있어서,
상기 방법은, c) 상기 b) 단계에서 호메오박스A9 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 상기 a) 단계에 비해 감소되는 경우, 검버섯 치료제로 판정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제17항에 있어서,
상기 방법은, c) 상기 b) 단계에서 호메오박스A9 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 상기 a) 단계에 비해 증가되는 경우, 기미 치료제로 판정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.