KR102039174B1 - 피부노화 특이적 후성유전자 마커 탐지용 pcr 프라이머 세트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인볼루크린(Involucrin) 유전자의 메틸화된 5’-UTR을 포함하는, 피부노화 특이적 바이오마커 및 상기 바이오마커의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 피부노화 또는 피부노화 진행단계의 탐지용 조성물에 관한 것이다.

Description

피부노화 특이적 후성유전자 마커 탐지용 PCR 프라이머 세트{PCR primer set for detecting skin aging-specific Epigenetic gene markers}

본 발명은 피부노화 관련 후성 유전자 마커 및 이를 이용한 피부 노화의 탐지 용도에 관한 것으로서, 구체적으로 인볼루크린(Involucrin) 유전자의 메틸화된 5’-UTR을 포함하는, 피부노화 특이적인 바이오마커 및 상기 바이오마커의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 피부노화 또는 피부노화 진행단계의 탐지용 조성물에 관한 것이다.

후성유전자 DNA 메틸화는 유전자 프로모터 부위의 CpG 섬 (CpG island)의 시토신 (cytosine)에 메틸기가 결합하는 현상으로, 상기 유전자 DNA 메틸화로 인해서 전사 인자 (transcription factor)의 유전자 프로모터의 결합이 저해되어 해당 유전자의 발현이 저해되는 것으로 알려져있다.

최근, 후생유전자(Epigenetic), DNA 메틸화(DNA Methylation) 측정을 통해 암을 진단하는 방법들이 제시되고 있고. 유전자 프로모터 부위의 CpG 섬(CpG island)의 시토신(cytosine)에서 일어나는 DNA 메틸화에 의해서 해당 프로모터 염기서열에 결합하여 해당 유전자의 발현을 조절하는 전사 인자의 프로모터 염기서열에 대한 결합이 저해되어 특정 유전자의 발현이 억제됨이 보고 되고 있다.

특히, 종양 억제 유전자의 메틸화에 대한 연구는 암의 치료제 개발에 중요한 단초를 제공할 수 있고, 이러한 이유로 종양 관련 유전자의 메틸화를 조사하여 각종 암 진료에 사용하려는 시도가 활발하게 이루어지고 있으나 (Esteller, M. et al., Cancer Res., 59:67, 1999; Sanchez-Cespedez, M. et al., Cancer Res., 60:892, 2000; Ahlquist, D.A. et al., Gastroenterol., 119:1219, 2000), 현재까지는 피부노화와 관련된 유전자의 메틸화에 대한 연구는 초기단계에 머물러 있는 실정이다.

대한민국 공개특허공보 제2014-0122529호에는 방광암 바이오마커 유전자의 CpG 섬 부위의 메틸화를 검출하는 방법에 대해 개시되어 있고, 대한민국 등록특허공부 제10-1597812호에는 ZFP37 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하여 난소암 환자의 백금 기반의 항암제에 대한 반응성 예측 정보를 제공하는 조성물에 대해 개시되어 있다.

그러나, 피부노화와 관련된 유전자의 후성유전자 DNA 메틸화와의 상관관계 및 이를 이용한 피부노화 진단 방법에 대해서는 아직까지 알려진 바가 없다.

본 발명은 인볼루크린(Involucrin) 유전자의 메틸화된 5’-UTR 부위를 포함하는 피부노화 측적용 바이오 마커를 제공한다.

또한, 본 발명은 인볼루크린 유전자의 메틸화된 5’-UTR의 메틸화를 측정하는 제제를 포함하는, 피부노화 또는 피부노화 진행단계의 탐지, 검출, 평가 또는 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 인볼루크린 유전자의 메틸화된 5’-UTR의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는 피부노화 또는 피부노화 진행단계의 진단에 필요한 정보의 제공방법을 제공한다.

본 발명의 추가 목적은 피부노화 특이적 바이오마커인 인볼루크린 유전자의 메틸화된 5’-UTR을 이용한 피부노화 억제 약물의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 인볼루크린(Involucrin) 유전자의 메틸화된 5’-UTR을 포함하는, 피부노화 특이적 바이오마커와 상기 바이오마커의 메틸화를 측정하는 제제를 포함하는 피부노화 또는 피부노화 진행단계의 탐지용 조성물, 및 이를 이용한 피부노화 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

본 발명자들은 우선, 광노화를 유도한 쥐의 피부 조직으로부터 DNA를 추출하여 MeDIP(Methylated DNA immunoprecipitation) 분석법을 실시하여 후생유전학적으로 조절되는 유전자 후보군을 선별하였다.

일반적으로 후성유전자 DNA 메틸화가 일어날 경우, 전사 인자 (transcription factor)의 유전자 프로모터의 결합이 저해되어 해당 유전자의 발현이 저해되는 것으로 알려져 있다. 종래에는 피부 광노화에 의해서 Involucrin 유전자 및 단백질의 발현이 증가함이 밝혀졌으며, 따라서 Involucrin 유전자의 메틸화는 광노화에 의해서 감소될 것이라 예상되어 왔다.

그러나 본 발명자들은 기존에 추측된 것과 상반되는 결과로써, 광노화 유도에 의해 발현이 증가된 인볼루크린(Involucrin) 유전자의 5’-UTR부분, 특히 5’-UTR 의 CpG 섬의 메틸화가 증가됨을 새로이 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명은 인볼루크린(Involucrin) 유전자의 메틸화(Methylation)된 5’-UTR(Untranslated region) 부위를 포함하는, 피부노화 측정용 바이오마커를 제공한다.

상기 인볼루크린(Involucrin)은 포유류의 피부를 구성하는 단백질로 알려져 있으며, 광노화 유도에 의해서 Involucrin을 암호화하는 유전자 및 단백질의 발현이 증가하는 것으로 알려져 있다.

Involucrin 단백질은 인간 (Homo sapiens) 등을 포함하는 영장류, 마우스 (Mus musculus), 래트 (Rattus norvegicus) 등을 포함하는 설치류 등의 포유류, 개구리 (Xenopus laevis) 등의 양서류 등으로부터 유래한 것일 수 있으며, 예컨대, 인간 Involucrin (Accession no. NP_005538.2. (유전자: NM_005547.3.))일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 메틸화된 Involucrin 유전자는 표 1의 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

표 1의 서열번호 1은 Involucrin 유전자의 전체 염기서열을 나타낸 것이며, 굵은 글씨로 나타낸 CG는 UV조사시 메틸화가 일어나는 CpG 섬 부위를 나타나며, 굵은 글씨 ATG는 개시코돈이다. 밑줄로 표시한 부분은 Involucrin 유전자의 5'-UTR 부분을 표시한 것이다.

서열번호 2는 서열번호 1의 Involucrin 유전자의 전체 염기서열 중, Transcription site를 포함하는 Exon1 부위의 염기서열을 나타낸 것이다.

서열번호 3은 서열번호 1의 Involucrin 유전자의 전체 염기서열 중, 5'-UTR 부위를 나타낸 것이며, 굵은 글씨로 나타낸 CG는 UV조사시 메틸화가 일어나는 CpG 섬 부위를 나타나며, 굵은 글씨 ATG는 개시코돈이다.

서열번호 4는 서열번호 3의 5'-UTR 부위 중 메틸화가 일어날 가능성이 큰 CpG 섬 부위 의 염기서열을 나타낸것으로, 구체적으로 Meth primer tool을 통해 IVL 염기서열 중 CpG 섬 집약부위를 선별한 부분이다.

서열번호 5는 Involucrin 단백질을 코딩하는 Exon2 부위의 염기서열이며, 굵은글씨 ATG는 개시코돈을 나타낸다.

명명	서열	서열번호
Involucrin 유전자 full sequence	CTCCTAGAAGCCTTCTACTTGACTCTACTTGGCCTAAAGTCAAACTCCCTCCACCAAAGACAGAGTTTATTTCCACATAGGATGGAGTTAAAAAATATATTCTGAGAGAGGAAGGGCTTGTGGCCCAAGAGAACACCCCAGAAATACCACCCCTTCATGGGAAGTGACTCTATCTTCAAACATATAACCCAGCCTGGACATCCCCGAAAGACACATAACTTTCCATTTCATGCCCTTGAAAGTGAATCTTTTGGCCTAATAATGAGAACAAACTCATTTTGAAAGTGGAAAAATTGAGATTCAGAGCAGAAGTTTGACTAAGGTCACAAAACAGTAGGATGCCTCACTCAGCTCCCTGTGCCTAGGTCAGAAAAGCATCACAGGAATAGTTGAGCTACCAGAATCCTCTGGCCAGGCAGGAGCTGTGTGTCCCTGGGAAATGGGGCCCTAAAGGGTTTGCTGCTTAAGATGCCTGTGGTGAGTCAGGAAGGGGTTAGAGGAAGTTGACCAACTAGAGTGGTGAAACCTGTCCATCACCTTCAACCTGGAGGGAGGCCAGGCTGCAGAATGATATAAAGAGTGCCCTGACTCCTGCTCAGCTCAGCACTCCACCAAAGCCTCTGCCTCAGCCTTACTGTGAGTCTGGTAAGTGTCGGATGGTAGAACCAGGGTTGGGACT CG GGACCTCCAACAGCATA CG ATGTGGTGGGGGTGGGCAGCCTGGGTGGGGGTGGGCATTACTCTGGGGCTGGATTCAGCTGGACTTTCATTCTAGGGGGACT CG AGTCAGAGTACTGAGAGAAAAGTGCCTTGGCACAGAAGTGCAGAACAGAGAGTAATCATCCTATGTCCCATCTTTTCTTGTGACCATATTTTTGGATTTGTGTGTGAGAGAGAATTATGGAAGGGAGGAGGGGAATAGCATTCAACTTCTTTCCTAAACCTCTTGGGTTTTGACAGACCATCATTTTGCCTTCTTTATGGAGGGAGAGGTTCAGGGAAGAGCTTCTACCTTTTGGCTATGCTGCACAGAGGGATGGCAGAATGGGGAAACCTTTCTATTTGGAGAAACCTAGGCAGAGCTGGGACAGGAAAACTCAACTTAGAAGTATAAGACTTGGAAGAACAACCTCCAACTCTCAGCAACCTTCCAGCTCCCGCAGCCCCACCCCAGACACAAGGACTGCAGCTAAACCTCAGAAGGTCAGGAGAGAAAGCAGCCCTGGGGTTGAATAGGCCAACCTGCTGGCTTTACAGGGGGGAAAACCAAATCCCAGGAGACTAAGTGACATGCCCAGAAACACACAGCATTCCAATGGGAGATTCAGGCCTAGAGCATGTCCTGTGGCTCCAGTCTGGAGGTCACACCATGACCTCTTAGGTCCTCTCTGGCACGGCCTATTGGTTTTCTAGGACTTGGTGTTCTCCAAGAGACATTTCATTCCCTAAGGCCTTACTCCTCACTGTGACATAATCCCAGAACGCATCTCTGCTCCTTGGTCAGTGAAGCGATGAGGGTGGACACAAGGACTAGACAAGAGCAGACAGTGAGCTGGCACCTGACCCACCCTTGCAGAACAGCCCTGCAGACAGATCTCCTTGTTGGCTCTCACCTGGGAACAAGGAGGCTCCTAGGAGGACCTTTCTCTGCCCCTCCACATTTCCACCCTTCTCTCTCTGCTGCTTTTGGGAAATGATAGTCCAGAGGTGGTAGAACAGTACCCTGCCCAAGGGAAGAGGGGATGCTAAAAAACCAGATACTTCTGCAGATTCCCAAGGTTTCATCTATTTCCTTTGCCTTCAGCCTGTGCATCAGACCTCTTCTGTCTTTCAGGTTGACAGTAGCTTCTAAG ATGTCCCAGCAACACACACTGCCAGTGACCCTCTCCCCTGCCCTCAGTCAGGAGCTCCTCAAGACTGTTCCTCCTCCAGTCAATACCCATCAGGAGCAAATGAAACAGCCAACTCCACTGCCTCCCCCATGCCAGAAGGTGCCTGTCGAGCTCCCAGTGGAGGTCCCATCAAAGCAAGAGGAAAAGCACATGACTGCTGTAAAGGGACTGCCTGAGCAAGAATGTGAGCAACAGCAGAAGGAGCCACAGGAGCAGGAGCTGCAGCAACAGCACTGGGAACAGCATGAGGAATATCAGAAAGCAGAAAACCCAGAGCAGCAGCTTAAGCAGGAGAAAACACAAAGGGATCAGCAGCTAAACAAACAGCTGGAAGAAGAGAAGAAGCTCTTAGACCAGCAACTGGATCAAGAGCTAGTCAAGAGAGATGAGCAACTGGGAATGAAGAAAGAGCAACTGTTGGAGCTCCCAGAGCAGCAGGAGGGGCACCTGAAGCACCTAGAGCAGCAGGAGGGACAGCTGAAGCACCCGGAGCAGCAGGAGGGGCAGCTGGAGCTCCCAGAGCAGCAGGAGGGGCAGCTGGAGCTCCCAGAGCAGCAGGAGGGGCAGCTGGAGCTCCCAGAGCAGCAGGAGGGGCAGCTGGAGCTCCCAGAGCAGCAGGAGGGGCAGCTGGAGCTCCCAGAGCAGCAGGAGGGGCAGCTGGAGCTCCCACAGCAGCAGGAGGGGCAGCTGGAGCTCTCTGAGCAGCAGGAGGGGCAGCTGGAGCTCTCTGAGCAGCAGGAGGGACAGCTGAAGCACCTGGAGCACCAGGAGGGGCAGCTGGAGGTCCCAGAGGAGCAGATGGGGCAGCTGAAGTACCTGGAACAGCAGGAGGGGCAGCTGAAGCACCTGGATCAGCAGGAGAAGCAGCCAGAGCTCCCAGAGCAGCAGATGGGGCAGCTGAAGCACCTGGAGCAGCAGGAGGGGCAGCCTAAGCATCTGGAGCAGCAGGAGGGGCAACTGGAGCAGCTGGAGGAGCAGGAGGGGCAGCTGAAGCACCTGGAGCAGCAGGAGGGGCAGCTGGAGCACCTGGAGCACCAGGAAGGGCAGCTGGGGCTCCCAGAGCAGCAGGTGCTGCAGCTGAAGCAGCTAGAGAAGCAGCAGGGGCAGCCAAAGCACCTGGAGGAGGAGGAGGGGCAGCTGAAGCACCTGGTGCAGCAGGAGGGGCAGCTGAAGCATCTGGTGCAGCAGGAGGGGCAGCTGGAGCAGCAGGAGAGGCAGGTGGAGCACCTGGAGCAGCAGGTGGGGCAGCTGAAGCACCTAGAGGAGCAGGAGGGACAACTGAAGCATCTGGAGCAGCAGCAGGGGCAGTTGGAGGTCCCAGAGCAGCAGGTGGGGCAGCCAAAGAACCTGGAGCAGGAGGAGAAGCAACTGGAGCTCCCAGAGCAGCAAGAGGGCCAGGTGAAGCACCTGGAGAAGCAGGAGGCACAGCTGGAGCTCCCAGAGCAGCAGGTAGGACAGCCAAAGCACCTGGAACAGCAGGAAAAGCACCTAGAGCACCCAGAGCAGCAGGACGGACAACTAAAACATCTGGAGCAGCAGGAGGGGCAGCTGAAGGACCTGGAGCAGCAGAAGGGGCAGCTGGAGCAGCCTGTGTTTGCCCCAGCTCCAGGCCAGGTCCAAGACATTCAACCAGCCCTGCCCACAAAGGGAGAAGTATTGCTTCCTGTAGAGCACCAGCAGCAGAAGCAGGAGGTGCAGTGGCCACCCAAACATAAATAACCACCCGCAGTGTCCAGAGGCCCTCAGATCGTCTCATACAAGGGAAGAGAGAGCCACTGGCTCCACTTATTTCGGGTCCGCTAGGTGGCCCGTCTCATCTGTGAACTTGACTCTGTCCCTCTACATGTCTCTTTAATGGGGTGAGGGTGGGGGAGAGAGGGAATTATTGTCCAGTGCCAACCCCAATGACCCCAATCCCAACCTCAGGTGAGCAGAGCCTCTACTTGAGGGACTATTGTTACTATAGGAATCCTTACTTCCCCAGTATTGAAGCTGAATCAGTGAGTGTGTACAATGATACATAATAAATCCTGGAAGTCTTGGGATCCTATATTCTCTTTAGCATTTTCTTCTATCACACCACATAAAAACCTGTGTATGGGTCAATGGCTGCAAGAGACTCCCACGGCCCATTCTCAAAGGAGGACAGACTCTTTTTAAATTTTGGTCCTCAAACCACTCAATAGATCTAACAGTTCCTGAAAAAGAAACAAACCCCCCCCCAAAAAAAATCAGCTTCACTTGATGTACTTGAAAACAACACTTGCCAGCCATGAAAAGGGGATACGTTGTTCTGGTTGCATCTCAGTCCAACACTACCTTCCACCACAACACCACACTCAACCCCTGGCAGAGCCCACCCTACACTTCTGCTCCAGACTCAGCTCCTCTCAGGAGGGGGACTGGGAAGATGCTAGGAAAGCTTGGGGGCTCCATCTGGGTTCTAGTCCCTTCCCTGGAAACATTTCCTGGCTCTTCTTCTTGGGTTTTCTCTCTTAGAAAATCTCATGATTTCAAAAAGTCTTATGGTCTGCCTACTTGGCTGAGGAAGACTTTAGCAAAGCAATAGAAGTAGAATTGGGCAAGGTGGGAAGAGGAGGTGTTCCAGATTGTCTCTGAGGGAAAGTGACAGCGTTATTAAAGTAAGTAA		1
Exon 1including Transcription Start Site	TCAGCACTCCACCAAAGCCTCTGCCTCAGCCTTACTGTGAGTCTG			2
5'-UTR	ACCAGGGTTGGGACT CG GGACCTCCAACAGCATA CG ATGTGGTGGGGGTGGGCAGCCTGGGTGGGGGTGGGCATTACTCTGGGGCTGGATTCAGCTGGACTTTCATTCTAGGGGGACT CG AGTCAGAGTACTGAGAGAAAAGTGCCTTGGCACAGAAGTGCAGAACAGAGAGTAATCATCCTATGTCCCATCTTTTCTTGTGACCATATTTTTGGATTTGTGTGTGAGAGAGAATTATGGAAGGGAGGAGGGGAATAGCATTCAACTTCTTTCCTAAACCTCTTGGGTTTTGACAGACCATCATTTTGCCTTCTTTATGGAGGGAGAGGTTCAGGGAAGAGCTTCTACCTTTTGGCTATGCTGCACAGAGGGATGGCAGAATGGGGAAACCTTTCTATTTGGAGAAACCTAGGCAGAGCTGGGACAGGAAAACTCAACTTAGAAGTATAAGACTTGGAAGAACAACCTCCAACTCTCAGCAACCTTCCAGCTCCCGCAGCCCCACCCCAGACACAAGGACTGCAGCTAAACCTCAGAAGGTCAGGAGAGAAAGCAGCCCTGGGGTTGAATAGGCCAACCTGCTGGCTTTACAGGGGGGAAAACCAAATCCCAGGAGACTAAGTGACATGCCCAGAAACACACAGCATTCCAATGGGAGATTCAGGCCTAGAGCATGTCCTGTGGCTCCAGTCTGGAGGTCACACCATGACCTCTTAGGTCCTCTCTGGCACGGCCTATTGGTTTTCTAGGACTTGGTGTTCTCCAAGAGACATTTCATTCCCTAAGGCCTTACTCCTCACTGTGACATAATCCCAGAACGCATCTCTGCTCCTTGGTCAGTGAAGCGATGAGGGTGGACACAAGGACTAGACAAGAGCAGACAGTGAGCTGGCACCTGACCCACCCTTGCAGAACAGCCCTGCAGACAGATCTCCTTGTTGGCTCTCACCTGGGAACAAGGAGGCTCCTAGGAGGACCTTTCTCTGCCCCTCCACATTTCCACCCTTCTCTCTCTGCTGCTTTTGGGAAATGATAGTCCAGAGGTGGTAGAACAGTACCCTGCCCAAGGGAAGAGGGGATGCTAAAAAACCAGATACTTCTGCAGATTCCCAAGGTTTCATCTATTTCCTTTGCCTTCAGCCTGTGCATCAGACCTCTTCTGTCTTTCAGGTTGACAGTAGCTTCTAAG ATG			3
5'-UTR 중 메틸화 가능한 부분	TGGGACT CG GGACCTCCAACAGCATA CG ATGTGGTGGGGGTGGGCAGCCTGGGTGGGGGTGGGCATTACTCTGGGGCTGGATTCAGCTGGACTTTCATTCTAGGGGGACT CG AGTCAGAGTACTGAGAGAAAAGTGCCTT			4
Exon2Coding Involucrin	GTTGACAGTAGCTTCTAAG ATG TCCCAGCAACACACACTGCCAGTGACCCTCTCCCCTGCCCTCAGTCAGGAGCTCCTCAAGACTGTTCCTCCTCCAGTCAATACCCATCAGGAGCAAATGAAACAGCCAACTCCACTGCCTCCCCCATGCCAGAAGGTGCCTGTCGAGCTCCCAGTGGAGGTCCCATCAAAGCAAGAGGAAAAGCACATGACTGCTGTAAAGGGACTGCCTGAGCAAGAATGTGAGCAACAGCAGAAGGAGCCACAGGAGCAGGAGCTGCAGCAACAGCACTGGGAACAGCATGAGGAATATCAGAAAGCAGAAAACCCAGAGCAGCAGCTTAAGCAGGAGAAAACACAAAGGGATCAGCAGCTAAACAAACAGCTGGAAGAAGAGAAGAAGCTCTTAGACCAGCAACTGGATCAAGAGCTAGTCAAGAGAGATGAGCAACTGGGAATGAAGAAAGAGCAACTGTTGGAGCTCCCAGAGCAGCAGGAGGGGCACCTGAAGCACCTAGAGCAGCAGGAGGGACAGCTGAAGCACCCGGAGCAGCAGGAGGGGCAGCTGGAGCTCCCAGAGCAGCAGGAGGGGCAGCTGGAGCTCCCAGAGCAGCAGGAGGGGCAGCTGGAGCTCCCAGAGCAGCAGGAGGGGCAGCTGGAGCTCCCAGAGCAGCAGGAGGGGCAGCTGGAGCTCCCAGAGCAGCAGGAGGGGCAGCTGGAGCTCCCACAGCAGCAGGAGGGGCAGCTGGAGCTCTCTGAGCAGCAGGAGGGGCAGCTGGAGCTCTCTGAGCAGCAGGAGGGACAGCTGAAGCACCTGGAGCACCAGGAGGGGCAGCTGGAGGTCCCAGAGGAGCAGATGGGGCAGCTGAAGTACCTGGAACAGCAGGAGGGGCAGCTGAAGCACCTGGATCAGCAGGAGAAGCAGCCAGAGCTCCCAGAGCAGCAGATGGGGCAGCTGAAGCACCTGGAGCAGCAGGAGGGGCAGCCTAAGCATCTGGAGCAGCAGGAGGGGCAACTGGAGCAGCTGGAGGAGCAGGAGGGGCAGCTGAAGCACCTGGAGCAGCAGGAGGGGCAGCTGGAGCACCTGGAGCACCAGGAAGGGCAGCTGGGGCTCCCAGAGCAGCAGGTGCTGCAGCTGAAGCAGCTAGAGAAGCAGCAGGGGCAGCCAAAGCACCTGGAGGAGGAGGAGGGGCAGCTGAAGCACCTGGTGCAGCAGGAGGGGCAGCTGAAGCATCTGGTGCAGCAGGAGGGGCAGCTGGAGCAGCAGGAGAGGCAGGTGGAGCACCTGGAGCAGCAGGTGGGGCAGCTGAAGCACCTAGAGGAGCAGGAGGGACAACTGAAGCATCTGGAGCAGCAGCAGGGGCAGTTGGAGGTCCCAGAGCAGCAGGTGGGGCAGCCAAAGAACCTGGAGCAGGAGGAGAAGCAACTGGAGCTCCCAGAGCAGCAAGAGGGCCAGGTGAAGCACCTGGAGAAGCAGGAGGCACAGCTGGAGCTCCCAGAGCAGCAGGTAGGACAGCCAAAGCACCTGGAACAGCAGGAAAAGCACCTAGAGCACCCAGAGCAGCAGGACGGACAACTAAAACATCTGGAGCAGCAGGAGGGGCAGCTGAAGGACCTGGAGCAGCAGAAGGGGCAGCTGGAGCAGCCTGTGTTTGCCCCAGCTCCAGGCCAGGTCCAAGACATTCAACCAGCCCTGCCCACAAAGGGAGAAGTATTGCTTCCTGTAGAGCACCAGCAGCAGAAGCAGGAGGTGCAGTGGCCACCCAAACATAAATAACCACCCGCAGTGTCCAGAGGCCCTCAGATCGTCTCATACAAGGGAAGAGAGAGCCACTGGCTCCACTTATTTCGGGTCCGCTAGGTGGCCCGTCTCATCTGTGAACTTGACTCTGTCCCTCTACATGTCTCTTTAATGGGGTGAGGGTGGGGGAGAGAGGGAATTATTGTCCAGTGCCAACCCCAATGACCCCAATCCCAACCTCAGGTGAGCAGAGCCTCTACTTGAGGGACTATTGTTACTATAGGAATCCTTACTTCCCCAGTATTGAAGCTGAATCAGTGAGTGTGTACAATGATACATAATAAATCCTGGAAGTCTTGGGATCCTA			5

상기 Involucrin 유전자의 메틸화된 5’-UTR은 Involucrin 유전자의 발현을 조절하는 5’-UTR의 CpG 섬 (Island)에 메틸화가 일어난 것을 의미하며, 상기 5’-UTR은 Involucrin 유전자 프로모터 기준으로 다운스트림(downstream) 또는 업스트림(upstream)에 존재할 수 있으며, 바람직하게는 Involucrin 유전자 프로모터의 다운스트림에 존재한다. 구체적으로 상기 Involucrin 유전자는 (Promoter)-(Transcription start site)-(5’UTR)-(start codon, ATG)-(stop codon, TGA)-(3’UTR)-(Transcription Terminal) 구조를 가지며, 메틸화 부위는 프로모터의 다운스트림의 Transcription start site와 시작코돈(ATG) 서열 사이에 위치할 수 있다. 본 발명의 일 예에 따르면, 상기 메틸화되는 Involucrin 유전자(Accession no. NP_005538.2.)의 5’-UTR 부분은 서열번호 1의 Involucrin 유전자의 시작 코돈(ATG) 서열을 기준으로 -1189 번째에 해당하는 뉴클레오타이드 서열로부터 시작 코돈인 ATG 서열까지 포함한다(서열번호 3).

또 다른 본 발명의 일 예에 따르면, 상기 Involucrin 유전자의 메틸화된 5’-UTR 부위는 상기 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드 서열의 5’말단으로부터 673번째 내지 812번째 뉴클레오타이드로 이루어진 군(서열번호 4)에서 선택된 하나 이상의 염기가 메틸화된 것일 수 있다. 상기 범위는 하기 실시예에서 확인한 바와 같이, Meth primer tool을 통해 IVL 염기서열 중 CpG 부위를 선별한 것이다. 서열번호 4의 5’-UTR의 일부 폴리뉴클레오타이드에 CpG island가 집약되어 있으며, UV에 의한 피부노화가 발생할 경우, 상기 부위의 CpG island에서 Methylation이 일어날 수 있다.

상기 UV에 의해 Involucrin 유전자(Accession no. NP_005538.2.)의 5’-UTR 부분에서 메틸화된 염기는 서열번호 1의 시작코돈(ATG)로부터 -1174, -1155, -1071번째에 해당되는 뉴클레오타이드에 존재하는 CpG 섬 (CpG island)의 시토신 (cytosine)일 수 있다. 바람직하게는 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드의 5’-말단으로부터 680번째, 699번째, 783번째 뉴클레오타이드에 존재하는 CpG 섬으로 이루어진 군에서 선택된 하나이상의 CpG 섬이 메틸화된 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 680번째, 699번째, 783번째 뉴클레오타이드에 존재하는 CpG 섬 모두가 메틸화된 것일 수 있다.

하기 실시예에서 밝힌 바와 같이, 피부의 노화 또는 피부 노화가 진행된 경우, 세포내의 Involucrin 유전자의 5’-UTR 부위의 CpG 섬 (Island)의 메틸화가 증가하게 되며, 세포 내의 Involucrin 유전자 또는 Involucrin 단백질의 발현이 증가한다. 따라서, Involucrin 유전자의 메틸화된 5’-UTR 부위를 피부노화 측적용 바이오마커로 사용할 수 있다.

본 명세서에서 용어, “피부노화”는 흔히 주름, 처짐 및 늘어짐의 증가와 관련된 외적 및 내적 (자연적)인 과정에 의한 것으로서, 외적 노화는 반복되는 자외선 (ultraviolet rays, UV) 노출에 의해 주로 발생하기 때문에 이를 일반적으로 '광노화'라고 한다. 자연적으로 노화된 피부는 매끄럽고 창백하며 잔주름이 있으나, 광노화된 피부는 굵은 주름이 생기며 색소침착 및 모세혈관 확장증을 야기한다. 피부의 주요 구조적 구성요소인 콜라겐의 손상은 피부 노화의 주된 요인으로 여겨지고 있으며 자연적인 노화 및 광노화 피부 모두에서 확인된다. 콜라겐 손상은 부분적으로 메트릭스 메탈로프로테이나제 (matrix metalloproteinase; MMP)의 유도와 관련된다. MMP는 매트릭스-분해 효소와 구조적으로 연관된 패밀리로서, 염증, 종양 침습 및 피부 노화와 같은 다양한 분해 과정에 중요한 역할을 수행한다. MMP의 수준은 자외선 광, 산화적 스트레스 및 사이토카인 등과 같은 다양한 자극에 의해 증가하고, 자외선 조사는 활성 단백질(activator protein-1; AP-1)의 DNA 결합을 촉진시키고, 콜라게나제(MMP-1), 스트로멜리신(MMP-3), 및 젤라티나제(MMP-9)와 같은 MMP를 유도한다. 콜라겐이 MMP-1에 의해 일단 분해되면 MMP-3 및 MMP-9에 의해 추가로 분해된다.

본 발명에 있어서, 상기 피부노화는 광피부노화 또는 UV에 의한 피부노화를 의미할 수 있고, 상기 피부노화는 주름 형성이 증가하거나 피부 상피세포의 두께가 증가하는 특징을 갖는 것일 수 있으며, 바람직하게는 광피부노화를 의미할 수 있다.

상기 피부노화 단계는 외적 및 내적인 과정에 의한 피부노화가 일어나는 단계를 말하며, 구체적으로 하기와 같은 과정을 거쳐 일어난다. 표피의 경우 각질형성 세포의 케라틴 합성이 감소되며 필라그린, 케라토히알린 및 여러 효소의 감소로 탈수형상이 심해지고 죽은 각질세포들이 떨어져 나가지 못하고 정체되어 각질 세포층이 두터워 지며, 이 후 각질층의 수분 결핍 현상이 심화되고 기저층까지 수분 이동 현상이 둔화됨을 확인할 수 있다. 다음으로 피지 생산이 감소되며 멜라닌 색소의 분포가 불규칙해져 피부가 전체적으로 얼굴덜룩해 진다. 진피의 경우 콜라겐과 탄력섬유가 경화 및 불용성이 되며, 피부 탄성 관련 인자들의 가교화 과정을 거치게 된다. 다음으로 노화의 진행에 따라 기질 (ground substance)의 감소로 피부의 주름이 늘어나게 되며 히알루론산의 양이 점차로 감소하게 된다. 상기 피부노화 단계는 각질 세포층의 증가 및 피부 탄력의 저하 단계를 포함하는 모든 단계를 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 일 예는, Involucrin 유전자의 5’-UTR의 메틸화를 측정하는 제제를 포함하는 피부노화 또는 피부노화 진행단계의 탐지용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.

상기 Involucrin 유전자의 5’-UTR의 메틸화를 측정하는 제제는 Involucrin 유전자의 메틸화 5’-UTR의 메틸화된 CpG 섬을 포함하는 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드를 증폭하기 위한 PCR 프라이머 세트일 수 있다.

상기 PCR프라이머 세트는 프라이머 염기서열 내에 최소한 하나 이상의 CpG 서열을 포함하고, Bisulfite conversion 과정에서 비메틸화된 시토신이 우라실로 변형됨을 고려하여, 메틸화와 비메틸화 프라이머가 유사한 Tm 값을 갖도록 제작된 것으로, 상기 프라이머 세트를 사용해 PCR을 수행했을 때 DNA 메틸화를 정확히 측정할 수 있는 프라이머 세트를 의미한다.

구체적으로, 상기 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드를 증폭하기 위한 PCR 프라이머 세트는 서열번호 6 의 염기서열 및 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 제1 프라이머 쌍, 및 서열번호 8의 염기서열 및 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 제2 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트일 수 있다.

예를 들어, IVL 5'-UTR부위에 메틸화된 CpG 섬의 위치를 파악하기 위해, methylation specific PCR은 서열번호 6 의 염기서열 및 서열번호 7의 염기서열 로 이루어진 제1 프라이머쌍을 사용하고, unmethylation specific PCR은 서열번호 8의 염기서열 및 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 제2 프라이머 쌍을 사용할 수 있다.

상기 Involucrin 유전자의 5'-UTR의 메틸화를 측정하는 제제의 검출은 PCR, 메틸화 특이 PCR (methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR(real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, DNA 칩, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트시퀀싱으로 구성된 군에서 선택되는 방법에 의해 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 또한, 프라이머는, 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산으로서, DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 프라이머의 서열은 반드시 주형의 서열과 정확히 동일할 필요는 없으며, 충분히 상보적이어서 주형과 혼성화될 수 있으면 된다. 프라이머의 위치 혹은 프라이머 결합부위는 프라이머가 혼성화하는 표적 DNA 절편을 말한다.

본 발명의 키트는 피부노화에 따라 발현이 증가되는 Involucrin 유전자 5’-UTR 의 메틸화를 측정하는 제제가 포함될 수 있으며, 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다. 또한, 상기 키트는 Involucrin 유전자 5’-UTR 부위의 메틸화를 측정함으로써 피부노화 마커를 탐지하고, 피부노화정도를 측정할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 피부노화는 광피부노화 또는 UV에 의한 피부노화를 의미할 수 있고, 상기 피부노화는 주름 형성이 증가하거나 피부 상피세포의 두께가 증가하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 광피부노화를 의미할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일예는 Involucrin 유전자의 5’-UTR의 메틸화를 측정하는 단계를 포함하는 피부노화 또는 피부노화 진행단계의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 UV에 의한 피부 손상부위를 모니터링, 피부노화 진단 바이오마커 개발, 및 피부노화 방지 화장품 개발에 활용이 가능하다.

상기 Involucrin 유전자의 5’-UTR 메틸화부분은 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드 서열에서 680, 699, 783번째 뉴클레오타이드에 존재하는 CpG 섬 (CpG island)의 시토신 (cytosine)에서 메틸화가 된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 메틸화의 측정은 PCR, 메틸화 특이 PCR (Methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR (Real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, DNA 칩, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱으로 구성된 군에서 선택되는 방법에 의해 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 메틸화를 측정하는 단계는 Involucrin 유전자의 메틸화된 5’-UTR의 메틸화된 CpG 섬을 포함하는 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드를 증폭하기 위한 PCR 프라이머 세트를 사용하여 증폭한 결과물의 생성 유무 또는 서열분석으로 수행하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

구체적으로, 상기 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드를 증폭하기 위한 PCR 프라이머 세트는 서열번호 6 의 염기서열 및 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 제1 프라이머 쌍, 및 서열번호 8의 염기서열 및 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 제2 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트일 수 있다.

본 발명은 인볼루크린(Involucrin) 유전자의 메틸화된 5’-UTR를 포함하는, 피부노화 특이적 바이오마커 및 상기 바이오마커의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 피부노화 또는 피부노화 진행단계의 탐지용 조성물에 관한 것으로서, 이를 이용해 피부노화 특이적 피부노화 또는 피부노화 진행단계를 확인할 수 있고, 빛에 의한 피부의 환부부위 치료 과정의 모니터링에도 적용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예 2-1에 따라, 피부 광노화 모델에서 인볼루크린 (Involucrin) DNA 메틸화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 실시예 2-2에 따라, 피부 광노화 모델에서 인볼루크린 유전자 발현을 분석한 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 실시예 2-3에 따라, 피부 광노화 모델에서 DNA 메틸화와 인볼루크린 유전자 발현의 관계를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 실시예 3에 따라, 피부 광노화 모델에서 인볼루크린 mRNA 발현 변화를 확인한 것을 나타낸다.
도 5a는 본 발명의 실시예 4-3에 따라, 인간유래 불멸화된 각질형성세포(HaCaT)의 IVL 유전자 methylation specific PCR 결과를 나타낸다.
　도 5b는 본 발명의 실시예 4-3에 따라, 인간유래 불멸화된 각질형성세포(HaCaT)에 UV만을 처리했을 때와, UV 처리 후 DHPV를 처리했을 때의 Methylation/Unmethylation(M/U) 비율 측정결과를 나타낸다.
도 5c는 인볼루크린 유전자의 5’-UTR 부위 DNA를 Meth Primer 툴에 삽입하고 이 툴을 이용하여 확보한 IVL 염기서열의 CpG부위와 최종 선발된 5개의 프라이머 세트를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 실시예 4-5에 따라, 인간유래 불멸화된 각질형성세포(HaCaT)에 UV만을 처리했을 때와, UV 처리 후 DHPV를 처리했을 때의 상대적인 IVL mRNA 발현수치 측정 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 실시예 4-5에 따라, 인간유래 불멸화된 각질형성세포(HaCaT)에 UV만을 처리했을 때와, UV 처리 후 DHPV를 농도 0.5nM, 1nM로 처리했을 때의 IVL 단백질의 발현 변화를 측정한 결과이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 피부 광노화 마우스 모델의 제작

피부 광노화 모델에서 Involucrin 프로모터 메틸화를 확인하기 위해서, 하기와 같은 방법으로 피부 광노화 마우스 모델을 제작하였다.

구체적으로, 6주령의 암컷 albino hairless mice (Skh-1)에 주 5회 156.25 mg/kg/day으로 카카오 파우더 (cacao powder, baba Callebaut, Lebbeke-Wieze, Belgium) 또는 주 5회 625 mg/kg/day으로 피크노제놀 (Pycnogenol, 이하 Pyc)을 섭취시키고, 주 3회 TL20W/12RS UV lamps (Philips, Eindhoven, The Netherlands)를 이용하여 100 ~ 200 mJ/cm²의 UV를 조사하여 광노화 마우스 모델을 만들었다. 대조군의 경우 8주에 걸쳐 동일 조건에서 마우스를 키우되, UVB조사와 카카오 파우더(이하, CP)는 섭취시키지 않았다. CP를 먹어지 않고 UVB만 조사한 마우스는 UV 마우스로서 실험군에 포함시켰다. UV는 1주차에 100 mJ/cm², 2 ~ 3주차에 150 mJ/cm², 4 ~ 8주차에 200 mJ/cm²로 점차 UV 의 강도를 올려 조사했다. 광노화 마우스 모델은 8주차에 생검 (Biopsy)을 통해 조직을 획득하였다.

피부 노화 마커 유전자를 선별하기 위해서, 상기 방법으로 제작한 광노화 마우스에서 조직을 채취하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 상기 제작한 광노화 마우스에서 마우스 조직을 생검하고 액체 질소를 이용해 급속 냉각시킨 뒤, G-spinTM Total DNA Extraction Kit (Intron, Gyeonggi-do, Korea)를 이용하여 유전체 DNA를 추출하거나, RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen, Valencia, USA)를 이용하여 전체 RNA를 추출하였다. 추출한 전체 RNA는 1% (w/v) agarose gel에 전기영동하여 18S와 28S RNA 밴드를 확인하여 양질의 전체 RNA가 추출되었음을 확인했다.

<실시예 2> 피부 광노화 모델에서 Involucrin DNA 메틸화와 Involucrin 유전자 발현의 관계

2-1. DNA메틸화 패턴 분석

피부 광노화 모델에서 Involucrin DNA 메틸화를 분석하기 위해서 실시예 1과 같은 방법으로 제작한 광노화 마우스에서 조직을 채취하여 유전체 DNA를 추출하고, Hiseq 2000 (illumina, USA)을 이용하여 유전자의 염기서열을 분석하였으며, bowtie2 프로그램을 이용하여 마우스 지놈 (genome) 지도 분석을 수행하였다. 다음으로 feng J의 논문을 참조하여 (geng J et al., Nat Protoc. 2012, 7, 1728-40) Mode-based analysis of Chip-seq (MACS)을 통한 유전자 전체 서열 중 메틸화 서열 분석을 진행하였다. 이 후 GeneSpring 7.3 (silicon. Genetics, USA)을 이용하여 메틸화된 유전자 서열의 표준화, 통계 분석 및 군집 분석을 시행하였으며 마지막으로 WashU genome browser를 통해 분석된 유전자 메틸화 결과를 도 1에 나타냈다.

도 1에 나타난 것과 같이, 피부 광노화 마우스의 경우 염색체 3번에 위치한 Involucrin의 프로모터를 포함하는 프로모터의 업스트림 부위, 즉 엑손 부위와 프로모터 부위의 특정 염기에서 메틸화가 일어나며 특히, 프로모터 부분에서 메틸화가 강하게 나타났다. 상기 메틸화는 UV 조사에 의해서 증가하지만, UV 조사 후 항노화 물질인 CP를 처리하면 메틸화가 감소하고, 또한 Pyc 처리에 따라 전체적으로 메틸화가 감소함을 확인할 수 있었다.

따라서, 이를 통해 마우스에 UV 조사시 염색체 3번에 위치한 Involucrin의 프로모터를 포함하는 프로모터의 업스트림 부위에서 메틸화가 증가됨을 알 수 있었다.

2-2. Involucrin 유전자 발현 분석

마우스 피부 광노화 모델에서 Involucrin 유전자 발현을 분석하기 위해서 실시예 1과 같은 방법으로 제작한 광노화 마우스에서 조직을 채취하고, 전체 RNA를 추출하였으며, 상기 추출한 전체 RNA를 사용하여 RNA-sequencing 데이터 분석 (TheragenEtex, Korea)을 수행하였다. UV + CP 실험군 마우스는 UV 조사 후 156.3 mg/kg/day로 CP를 섭취하도록 하였다.

도 2에 나타난 것과 같이, UV 처리에 의해서 Involucrin mRNA의 발현이 약 1.5배 증가했고, 반대로 UV와 카카오 CP 처리군 또는 UV와 Pyc 처리시, UV에 의해서 증가된 mRNA의 양이 다시 회복됨을 확인하였다.

　

2-3. 마우스 피부 광노화 모델에서 Involucrin DNA 메틸화와 Involucrin 유전자 발현과의 관계

마우스 피부 광노화 모델에서 Involucrin(Ivl) DNA 메틸화와 Involucrin(Ivl) 유전자 발현의 관계를 분석하기 위해서, 실시예 2-1 및 2-2에서 얻은 결과를 이용하고 correlation plot을 통해 RNA 발현양과 유전자 메틸화의 상관관계를 파악하였으며, 이 결과를 도 3에 나타냈다.

도 3에 나타낸 것과 같이 x축의 상대적인 Ivl 유전자 메틸화가 증가할수록, y축에 해당하는 Ivl 유전자 발현이 정비례하여 증가함을 확인하였다.

<실시예 3> 마우스 피부 광노화 모델에서 Involucrin 유전자 발현 변화

마우스 피부 광노화 모델에서 Involucrin 유전자 발현 변화를 확인하기 위해서, 실시예 2-1과 같은 방법으로 제작한 광노화 마우스에서 조직을 채취하고, 실시예 2-2와 같은 방법으로 전체 RNA를 추출하고, 하기와 같은 방법으로 q-PCR(quantitative PCR)을 수행하였다.

구체적으로, 실시예 2-2와 같은 방법으로 추출한 전체 RNA를 miScript II RT Kit (Qiagen, Hilden, Germany)에 적용하여 cDNA를 합성하고, miScript SYBR Green PCR Kit(Qiagen, Hilden, Germany)와 miScript microRNA PCR Array(Qiagen, Hilden, Germany) 및 QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하였으며, 하기 표 2의 mIVL_F, mIVL_R 프라이머세트(F: 서열번호12 / R: 서열번호13)를 사용해 q-PCR을 수행하였다. 또한 하기 표2의 GAPDH_F와 GAPDH_R 프라이머세트(F: 서열번호14 / R: 서열번호15)는 유전자 발현의 house keeping 유전자 즉, 대조군으로 사용하였다. 모든 반응은 96-well plate에서 수행하였고, 평균값을 사용해 상대적인 mRNA 발현 수치를 계산하였다.

명명	서열 (5’> 3’)	Tm (℃)	서열번호
IVL_MF	GGATTCGGGATTTTTAATAGTATACG	55.2	6
IVL_MR	AACACTTTTCTCTCAATACTCTAACTCG	58.5	7
IVL_UF	TGGGATTTGGGATTTTTAATAGTATAT	54	8
IVL_UR	AAAACACTTTTCTCTCAATACTCTAACTCA	58.6	9
hIVL_F	CCCATCAAAGCAAGAGGAAA	54	10
hIVL_R	AGCTGCTGATCCCTTTGTGT	53.5	11
mIVL_F	GTGAAGCCAAAACTAAAGCAAC	56	12
mIVL_R	CATAGACAAGAGGATGGTCAGG	56.7	13
GAPDH_F	ACCACAGTCCATGCCATCAC	59.3	14
GAPDH_R	TCCACCACCCTGTTGCTGTA	60.1	15

도 4에 나타낸 것과 같이, UV 처리시 Involucrin mRNA의 발현이 대조군에 비해 약 3배 가량 증가했고, 반대로 UV처리 후 카카오 CP를 처리한 실험군에서는 UV에 의해서 증가된 mRNA의 양이 다시 감소함을 확인하였다.

<실시예 4> In vitro 피부 광노화 모델에서 Involucrin 유전자 5’-UTR부위 메틸화와 Involucrin 유전자 발현의 관계

4-1. 인간 피부 광노화 세포 모델의 제작

인간 피부 광노화 세포 모델에서 Involucrin DNA에서 메틸화되는 부위를 확인하기 위해, 하기와 같은 방법으로 인간 피부 광노화 세포 모델을 제작하였다.

인간유래 불멸 상피세포주 (Immortalized human keratinocyte) HaCaT 세포 (ATCC, USA) 5 x 10⁵ cell을 DMEM (5% FBS) 배지가 들어있는 100-mm dish에 분주하여 48시간 동안 37℃ CO₂ incubator에서 배양하였다. 이후 incubator에서 세포를 꺼내어 serum free media로 배지를 교체하였으며, 교체 후 12시간이 지난 후 PBS로 washing하고, 다시 dish에 4 mL의 PBS를 넣고 UV crosslinker (UVP, CA, USA)를 이용하여 100 mJ/cm²의 UV를 쪼여주었다. 다음으로, Dish에서 PBS를 제거하고 8 mL의 DMEM (5 % FBS) 배지를 채워 24시간 동안 재배양하여 피부 광노화 세포 모델을 제작하였다.

피부 광노화를 회복시킨 각질형성세포(HaCaT)를 제조하기 위해, UV 조사 이후에 DMEM 배지에 Cacao powder 4 ug/mL 및 Cacao의 대사산물인 DHPV [5-(3',4'-19 dihydroxyphenyl)-gamma-calerolactone] 를 10 ng/mL를 포함시켜 24시간 동안 배양했다. UV 조사 및 상기 DHPV를 처리하지 않은 세포를 대조군세포로 사용하였다.

DHPV는 카카오 파우더에 대한 양성 대조군 (positive control)으로 사용한다. 쥐 또는 인간의 경우, 다양한 물질이 조합되어 있는 카카오 파우더를 섭취 또는 처리 하였을 때, 생체 내 대사 작용에 의해 카카오 파우더의 물성이 바뀌고 상기 바뀐 물성의 카카오파우더에 의해 실제 체내에서 효과가 나타난다.

HaCaT 세포는 생체 내에서 일어나는 대사 작용을 모식할 수 없다. 따라서 실제 생체 내에서 카카오 파우더가 대사되어 나오는 산물인 DHPV를 처리할 경우 보다 명확한 카카오 파우더의 효과를 측정할 수 있으며, 카카오 파우더의 대사산물 중 광노화 방지 효과를 나타내는 물질을 정확한 판단할 수 있다.

4-2. Involucrin DNA 메틸화 위치 분석

실시예 4-1에서 제작한 인간 광노화 피부세포를 harvest하고, NucleoSin® Tissue Kit (Macherey-Nagel, Germany)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA를 Nano Drop을 이용하여 정량하고 Quality를 확인하였다. 다음으로 추출한 DNA의 메틸화 분석을 위해 EZ DNA Methylation-Lightning^TM Kit (Zymoresearch, CA, USA)를 이용하고 Bisulfite 를 처리하여 메틸화가 되지 않은 시토신 (Cytosine) 잔기를 우라실 (Uracil) 잔기로 변환하였다.

상기 Bisulfited DNA 100ng, 프라이머 쌍(IVL_MF/IVL_MR) (20pmole)을 각각 1uL, TaKaRa EpiTaq HS (5U/㎕) 0.25uL, 10X EpiTaq PCR Buffer (Mg²⁺ free) 5uL, 25mM MgCl₂ 5uL, dNTP Mixture (2.5mM each) 6 uL 를 첨가하고 최종 볼륨이 50 uL가 되도록 증류수를 첨가한 후, 98℃에서 3분간 반응시킨 후, 40 주기로 98℃에서 10초, 55℃에서 1 분, 72℃에서 30초 과정을 반복하여 반응시켰다. 다음으로 72℃에서 5분간 신장(elongation)시킨 다음 2 % (w/v) 아가로오스 겔에서 결과를 분석하였다.

메틸화 특이 PCR 프라이머를 제작함에 있어서 프라이머 내에 최소한 하나 이상의 CpG 서열을 포함시키고, 메틸화와 비메틸화 프라이머가 유사한 Tm 값을 갖도록 제작하였으며, Bisulfite conversion 과정에 있어 비메틸화된 시토신은 우라실로 변형되므로 이를 고려하며 프라이머를 제작하였다. 한편, 상기 유전자의 메틸화는 전체 유전자 풀의 0~100% 일 수 있으며, 이에 발현될 수 있는 동일 유전자 서열 전체에서 비메틸화 대비 메틸화 유전자의 양을 측정함으로써 DNA의 메틸화를 정확히 측정하였다. 상기 사항을 고려하여 메틸화 특이 PCR을 수행하기 위해 IVL_MF/IVL_MR 프라이머 쌍 (F: 서열번호 6 / R: 서열번호 7)을 제작하여 사용하였다(표 2).

구체적으로, transcription start site와 시작 코돈 사이에 위치하는 untranslated region 인 5’-UTR 부위, 즉 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 1번째 내지 1853번째 서열까지를 (ATG를 기준으로 -1bp ~ -1853bp에 해당) Meth Primer tool 프로그램에 삽입하였다. Meth Primer tool은 입력된 서열내의 CpG 부위를 선별하여 각 프라이머에 하나 이상의 CpG 부위를 포함하도록 메틸화 및 비메틸화 프라이머 서열을 제공한다. 상기 Meth primer tool을 통해 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드의 5'말단으로부터 673번째 내지 783번째에 해당하는 IVL 염기서열을 CpG 부위로 선별하였으며, 이 tool을 이용하여 총 5개의 프라이머 세트를 확보했다(도 5c). 이 중 상기 표 2의 서열번호 6 내지 서열번호 9번까지의 프라이머 염기서열을 이용하여 실험을 수행하였다. Involucrin 폴리뉴클레오타이드 염기서열(서열번호 1) 중 개시코돈인 ATG로부터 -1179 내지 -1065 부위는 IVL_MF(서열번호 6), IVL_MR(서열번호 7) 프라이머 세트를 사용해 methylation specific PCR을 수행하였으며, ATG로부터 -1181 내지 -1067 부위는 IVL_UF(서열번호 8) 및 IVL_UR(서열번호 9)을 사용하여 unmethylation specific PCR을 수행하였다.

Methylation specific PCR 수행결과, IVL의 메틸화가 된 부위가 IVL의 5’-UTR 부분이며, 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드의 5’ 말단으로부터 680. 699. 783번째 에 존재하는 CpG 섬에서 메틸화가 일어남을 확인하였다.

4-3. Involucrin DNA 메틸화 수준 분석

Involucrin DNA 메틸화 수준을 분석하기 위해, 상기 실시예 4-1에서 제조한 UV를 조사하여 광노화가 유도된 피부 세포 및 UV를 처리하고 DHPV를 처리하여 피부 노화를 회복시킨 세포 각각에 대해서, IVL_MF(서열번호 6), IVL_MR(서열번호 7) 프라이머를 사용해 상기 실시예 4-2에 기재한 PCR방법과 동일한 조건에서 methylation specific PCR을 수행하였으며, IVL_UF(서열번호 8) 및 IVL_UR(서열번호 9)을 사용하여 unmethylation specific PCR을 수행하였으며, 그 결과로부터 IVL 유전자 부위에 발생한 메틸화의 수준을 확인하였다(도 5a 및 도 5b).

　도 5a 및 도 5b에 나타난 바와 같이, UV를 조사하여 광노화가 유도된 피부 세포에서 methylation specific PCR을 수행하였을 때(M line)가 unmethylation specific PCR을 수행했을 때(U line) 보다 IVL의 5-UTR에서 메틸화 (M)가 약 1.5배 증가하였고, 이러한 메틸화는 DHPV 처리에 의해 급격히 감소됨을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 UV 조사에 의한 피부 노화 세포에서 CpG 부위로 선별된 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 673번째 내지 783번째에 해당하는 IVL의 5’-UTR 부위 서열의 메틸화 수준이 증가하며, 특히, 680 번째. 699 번째 및 783번째 염기가 UV 조사에 의해 메틸화되고, 상기 IVL의 메틸화된 5’-UTR 부위의 피부 노화 특이적 마커로 사용 가능함을 확인했다.

4-4. Involucrin 유전자 발현 분석

광노화 유도 인간 피부 세포 모델에서 Involucrin 유전자 발현을 분석하기 위해서, 상기 실시예 4-1에서 제조한 광노화 유도 인간 피부 세포를 채취하고, 상기 실시예 2-2와 동일한 방법을 사용하여, Involucrin 유전자 발현 분석을 수행하였다. 이에 PCR 프라이머는 표 2의 hIVL_F(서열번호 10), hIVL_R(서열번호 11)프라이머를 사용하였다. GAPDH_F와 GAPDH_R 프라이머세트(F: 서열번호14 / R: 서열번호15)는 유전자 발현의 house keeping 유전자 즉, 대조군으로 사용하였다.

도 6에 나타난 것과 같이, UV에 의해서 Involucrin mRNA의 발현이 약 3배 증가하였으며, UV 처리 후 DHPV 처리시에 증가된 mRNA의 양이 다시 회복됨을 확인하였다.

4-5. 인간 피부 광노화 세포에서 Involucrin 단백질 발현 수준 분석

실시예 4-1에서 제작한 광노화 유도 인간 피부 세포에서 IVL 단백질의 발현 변화를 분석하기 위해, 하기와 같은 방법으로 실험을 수행하였다.

구체적으로, 인간 피부 광노화 세포에 대하여 면역블롯 분석을 수행하였으며, 세포를 protease inhibitor cocktail kit (P3100-005; GenDEPOT, Barker, TX), 및 phosphatase inhibitor (sc-45065; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)를 포함한 세포 용해 버퍼를 사용하여 분해하였다 (#9803; Cell SignalingTechnology, Danvers, MA). 세포 용해물 20 ug을 포함하는 부분 표본을 SDS-polyacrylamide 젤 상에서 전기영동하여 분리한 후, transfer buffer (25 mM Tris, 192 mM glycine, 20% [v/v] methanol [pH8.3]), 75 V, 40℃ 조건에서 180분 동안 니트로셀룰로즈 막 (Amersham, Buckinghamshire, UK)으로 이동시켰다. 다음으로 막을 상온에서 60분 동안 0.1% (v/v) Tween-20를 포함하는 3% (w/v) BSA의 PBS로 블락킹한 후, 항-IVL(1:1000, sc-28557, Santa Cruz) 항체와 함께 배양하였다. 이차 항체는 HRP-결합된 염소 항-마우스 IgG (1:1000; sc 2005, SantaCruz)를 사용하였으며, ECL lumi Femto solution A/B(Dogen, Seoul, Korea)를 사용하여 블롯들을 현상하고 분석하였고 그 결과를 도 7에 나타냈다.

도 7에 나타낸 것과 같이, 인간 피부 세포에 대하여 UV를 처리하여 광노화가 유도된 경우 IVL 단백질의 발현량이 UV를 처리하지 않았을 때에 비해서 β-actin 대비 약 3배 이상 증가함을 확인할 수 있었다. 다만, UV를 처리했을 때 증가했던 PFN1의 단백질의 양이 카카오의 대사 산물 DHPV를 처리한 경우, IVL 단백질의 양이 어느 정도 회복됨을 확인하였다.

<110> SUNGKWANG MEDICAL FOUNDATION College of Medicine Pochon CHA University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> PCR primer set for detecting skin aging-specific Epigenetic gene markers <130> DPP20194153KR <160> 15 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 4542 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Involucrin gene full sequence <400> 1 ctcctagaag ccttctactt gactctactt ggcctaaagt caaactccct ccaccaaaga 60 cagagtttat ttccacatag gatggagtta aaaaatatat tctgagagag gaagggcttg 120 tggcccaaga gaacacccca gaaataccac cccttcatgg gaagtgactc tatcttcaaa 180 catataaccc agcctggaca tccccgaaag acacataact ttccatttca tgcccttgaa 240 agtgaatctt ttggcctaat aatgagaaca aactcatttt gaaagtggaa aaattgagat 300 tcagagcaga agtttgacta aggtcacaaa acagtaggat gcctcactca gctccctgtg 360 cctaggtcag aaaagcatca caggaatagt tgagctacca gaatcctctg gccaggcagg 420 agctgtgtgt ccctgggaaa tggggcccta aagggtttgc tgcttaagat gcctgtggtg 480 agtcaggaag gggttagagg aagttgacca actagagtgg tgaaacctgt ccatcacctt 540 caacctggag ggaggccagg ctgcagaatg atataaagag tgccctgact cctgctcagc 600 tcagcactcc accaaagcct ctgcctcagc cttactgtga gtctggtaag tgtcggatgg 660 tagaaccagg gttgggactc gggacctcca acagcatacg atgtggtggg ggtgggcagc 720 ctgggtgggg gtgggcatta ctctggggct ggattcagct ggactttcat tctaggggga 780 ctcgagtcag agtactgaga gaaaagtgcc ttggcacaga agtgcagaac agagagtaat 840 catcctatgt cccatctttt cttgtgacca tatttttgga tttgtgtgtg agagagaatt 900 atggaaggga ggaggggaat agcattcaac ttctttccta aacctcttgg gttttgacag 960 accatcattt tgccttcttt atggagggag aggttcaggg aagagcttct accttttggc 1020 tatgctgcac agagggatgg cagaatgggg aaacctttct atttggagaa acctaggcag 1080 agctgggaca ggaaaactca acttagaagt ataagacttg gaagaacaac ctccaactct 1140 cagcaacctt ccagctcccg cagccccacc ccagacacaa ggactgcagc taaacctcag 1200 aaggtcagga gagaaagcag ccctggggtt gaataggcca acctgctggc tttacagggg 1260 ggaaaaccaa atcccaggag actaagtgac atgcccagaa acacacagca ttccaatggg 1320 agattcaggc ctagagcatg tcctgtggct ccagtctgga ggtcacacca tgacctctta 1380 ggtcctctct ggcacggcct attggttttc taggacttgg tgttctccaa gagacatttc 1440 attccctaag gccttactcc tcactgtgac ataatcccag aacgcatctc tgctccttgg 1500 tcagtgaagc gatgagggtg gacacaagga ctagacaaga gcagacagtg agctggcacc 1560 tgacccaccc ttgcagaaca gccctgcaga cagatctcct tgttggctct cacctgggaa 1620 caaggaggct cctaggagga cctttctctg cccctccaca tttccaccct tctctctctg 1680 ctgcttttgg gaaatgatag tccagaggtg gtagaacagt accctgccca agggaagagg 1740 ggatgctaaa aaaccagata cttctgcaga ttcccaaggt ttcatctatt tcctttgcct 1800 tcagcctgtg catcagacct cttctgtctt tcaggttgac agtagcttct aagatgtccc 1860 agcaacacac actgccagtg accctctccc ctgccctcag tcaggagctc ctcaagactg 1920 ttcctcctcc agtcaatacc catcaggagc aaatgaaaca gccaactcca ctgcctcccc 1980 catgccagaa ggtgcctgtc gagctcccag tggaggtccc atcaaagcaa gaggaaaagc 2040 acatgactgc tgtaaaggga ctgcctgagc aagaatgtga gcaacagcag aaggagccac 2100 aggagcagga gctgcagcaa cagcactggg aacagcatga ggaatatcag aaagcagaaa 2160 acccagagca gcagcttaag caggagaaaa cacaaaggga tcagcagcta aacaaacagc 2220 tggaagaaga gaagaagctc ttagaccagc aactggatca agagctagtc aagagagatg 2280 agcaactggg aatgaagaaa gagcaactgt tggagctccc agagcagcag gaggggcacc 2340 tgaagcacct agagcagcag gagggacagc tgaagcaccc ggagcagcag gaggggcagc 2400 tggagctccc agagcagcag gaggggcagc tggagctccc agagcagcag gaggggcagc 2460 tggagctccc agagcagcag gaggggcagc tggagctccc agagcagcag gaggggcagc 2520 tggagctccc agagcagcag gaggggcagc tggagctccc acagcagcag gaggggcagc 2580 tggagctctc tgagcagcag gaggggcagc tggagctctc tgagcagcag gagggacagc 2640 tgaagcacct ggagcaccag gaggggcagc tggaggtccc agaggagcag atggggcagc 2700 tgaagtacct ggaacagcag gaggggcagc tgaagcacct ggatcagcag gagaagcagc 2760 cagagctccc agagcagcag atggggcagc tgaagcacct ggagcagcag gaggggcagc 2820 ctaagcatct ggagcagcag gaggggcaac tggagcagct ggaggagcag gaggggcagc 2880 tgaagcacct ggagcagcag gaggggcagc tggagcacct ggagcaccag gaagggcagc 2940 tggggctccc agagcagcag gtgctgcagc tgaagcagct agagaagcag caggggcagc 3000 caaagcacct ggaggaggag gaggggcagc tgaagcacct ggtgcagcag gaggggcagc 3060 tgaagcatct ggtgcagcag gaggggcagc tggagcagca ggagaggcag gtggagcacc 3120 tggagcagca ggtggggcag ctgaagcacc tagaggagca ggagggacaa ctgaagcatc 3180 tggagcagca gcaggggcag ttggaggtcc cagagcagca ggtggggcag ccaaagaacc 3240 tggagcagga ggagaagcaa ctggagctcc cagagcagca agagggccag gtgaagcacc 3300 tggagaagca ggaggcacag ctggagctcc cagagcagca ggtaggacag ccaaagcacc 3360 tggaacagca ggaaaagcac ctagagcacc cagagcagca ggacggacaa ctaaaacatc 3420 tggagcagca ggaggggcag ctgaaggacc tggagcagca gaaggggcag ctggagcagc 3480 ctgtgtttgc cccagctcca ggccaggtcc aagacattca accagccctg cccacaaagg 3540 gagaagtatt gcttcctgta gagcaccagc agcagaagca ggaggtgcag tggccaccca 3600 aacataaata accacccgca gtgtccagag gccctcagat cgtctcatac aagggaagag 3660 agagccactg gctccactta tttcgggtcc gctaggtggc ccgtctcatc tgtgaacttg 3720 actctgtccc tctacatgtc tctttaatgg ggtgagggtg ggggagagag ggaattattg 3780 tccagtgcca accccaatga ccccaatccc aacctcaggt gagcagagcc tctacttgag 3840 ggactattgt tactatagga atccttactt ccccagtatt gaagctgaat cagtgagtgt 3900 gtacaatgat acataataaa tcctggaagt cttgggatcc tatattctct ttagcatttt 3960 cttctatcac accacataaa aacctgtgta tgggtcaatg gctgcaagag actcccacgg 4020 cccattctca aaggaggaca gactcttttt aaattttggt cctcaaacca ctcaatagat 4080 ctaacagttc ctgaaaaaga aacaaacccc cccccaaaaa aaatcagctt cacttgatgt 4140 acttgaaaac aacacttgcc agccatgaaa aggggatacg ttgttctggt tgcatctcag 4200 tccaacacta ccttccacca caacaccaca ctcaacccct ggcagagccc accctacact 4260 tctgctccag actcagctcc tctcaggagg gggactggga agatgctagg aaagcttggg 4320 ggctccatct gggttctagt cccttccctg gaaacatttc ctggctcttc ttcttgggtt 4380 ttctctctta gaaaatctca tgatttcaaa aagtcttatg gtctgcctac ttggctgagg 4440 aagactttag caaagcaata gaagtagaat tgggcaaggt gggaagagga ggtgttccag 4500 attgtctctg agggaaagtg acagcgttat taaagtaagt aa 4542 <210> 2 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exon1 of Involucrin gene <400> 2 tcagcactcc accaaagcct ctgcctcagc cttactgtga gtctg 45 <210> 3 <211> 1192 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-UTR of Involucrin gene <400> 3 accagggttg ggactcggga cctccaacag catacgatgt ggtgggggtg ggcagcctgg 60 gtgggggtgg gcattactct ggggctggat tcagctggac tttcattcta gggggactcg 120 agtcagagta ctgagagaaa agtgccttgg cacagaagtg cagaacagag agtaatcatc 180 ctatgtccca tcttttcttg tgaccatatt tttggatttg tgtgtgagag agaattatgg 240 aagggaggag gggaatagca ttcaacttct ttcctaaacc tcttgggttt tgacagacca 300 tcattttgcc ttctttatgg agggagaggt tcagggaaga gcttctacct tttggctatg 360 ctgcacagag ggatggcaga atggggaaac ctttctattt ggagaaacct aggcagagct 420 gggacaggaa aactcaactt agaagtataa gacttggaag aacaacctcc aactctcagc 480 aaccttccag ctcccgcagc cccaccccag acacaaggac tgcagctaaa cctcagaagg 540 tcaggagaga aagcagccct ggggttgaat aggccaacct gctggcttta caggggggaa 600 aaccaaatcc caggagacta agtgacatgc ccagaaacac acagcattcc aatgggagat 660 tcaggcctag agcatgtcct gtggctccag tctggaggtc acaccatgac ctcttaggtc 720 ctctctggca cggcctattg gttttctagg acttggtgtt ctccaagaga catttcattc 780 cctaaggcct tactcctcac tgtgacataa tcccagaacg catctctgct ccttggtcag 840 tgaagcgatg agggtggaca caaggactag acaagagcag acagtgagct ggcacctgac 900 ccacccttgc agaacagccc tgcagacaga tctccttgtt ggctctcacc tgggaacaag 960 gaggctccta ggaggacctt tctctgcccc tccacatttc cacccttctc tctctgctgc 1020 ttttgggaaa tgatagtcca gaggtggtag aacagtaccc tgcccaaggg aagaggggat 1080 gctaaaaaac cagatacttc tgcagattcc caaggtttca tctatttcct ttgccttcag 1140 cctgtgcatc agacctcttc tgtctttcag gttgacagta gcttctaaga tg 1192 <210> 4 <211> 140 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-UTR portion to be methylated <400> 4 tgggactcgg gacctccaac agcatacgat gtggtggggg tgggcagcct gggtgggggt 60 gggcattact ctggggctgg attcagctgg actttcattc tagggggact cgagtcagag 120 tactgagaga aaagtgcctt 140 <210> 5 <211> 2108 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exon2 of Involucrin gene <400> 5 gttgacagta gcttctaaga tgtcccagca acacacactg ccagtgaccc tctcccctgc 60 cctcagtcag gagctcctca agactgttcc tcctccagtc aatacccatc aggagcaaat 120 gaaacagcca actccactgc ctcccccatg ccagaaggtg cctgtcgagc tcccagtgga 180 ggtcccatca aagcaagagg aaaagcacat gactgctgta aagggactgc ctgagcaaga 240 atgtgagcaa cagcagaagg agccacagga gcaggagctg cagcaacagc actgggaaca 300 gcatgaggaa tatcagaaag cagaaaaccc agagcagcag cttaagcagg agaaaacaca 360 aagggatcag cagctaaaca aacagctgga agaagagaag aagctcttag accagcaact 420 ggatcaagag ctagtcaaga gagatgagca actgggaatg aagaaagagc aactgttgga 480 gctcccagag cagcaggagg ggcacctgaa gcacctagag cagcaggagg gacagctgaa 540 gcacccggag cagcaggagg ggcagctgga gctcccagag cagcaggagg ggcagctgga 600 gctcccagag cagcaggagg ggcagctgga gctcccagag cagcaggagg ggcagctgga 660 gctcccagag cagcaggagg ggcagctgga gctcccagag cagcaggagg ggcagctgga 720 gctcccacag cagcaggagg ggcagctgga gctctctgag cagcaggagg ggcagctgga 780 gctctctgag cagcaggagg gacagctgaa gcacctggag caccaggagg ggcagctgga 840 ggtcccagag gagcagatgg ggcagctgaa gtacctggaa cagcaggagg ggcagctgaa 900 gcacctggat cagcaggaga agcagccaga gctcccagag cagcagatgg ggcagctgaa 960 gcacctggag cagcaggagg ggcagcctaa gcatctggag cagcaggagg ggcaactgga 1020 gcagctggag gagcaggagg ggcagctgaa gcacctggag cagcaggagg ggcagctgga 1080 gcacctggag caccaggaag ggcagctggg gctcccagag cagcaggtgc tgcagctgaa 1140 gcagctagag aagcagcagg ggcagccaaa gcacctggag gaggaggagg ggcagctgaa 1200 gcacctggtg cagcaggagg ggcagctgaa gcatctggtg cagcaggagg ggcagctgga 1260 gcagcaggag aggcaggtgg agcacctgga gcagcaggtg gggcagctga agcacctaga 1320 ggagcaggag ggacaactga agcatctgga gcagcagcag gggcagttgg aggtcccaga 1380 gcagcaggtg gggcagccaa agaacctgga gcaggaggag aagcaactgg agctcccaga 1440 gcagcaagag ggccaggtga agcacctgga gaagcaggag gcacagctgg agctcccaga 1500 gcagcaggta ggacagccaa agcacctgga acagcaggaa aagcacctag agcacccaga 1560 gcagcaggac ggacaactaa aacatctgga gcagcaggag gggcagctga aggacctgga 1620 gcagcagaag gggcagctgg agcagcctgt gtttgcccca gctccaggcc aggtccaaga 1680 cattcaacca gccctgccca caaagggaga agtattgctt cctgtagagc accagcagca 1740 gaagcaggag gtgcagtggc cacccaaaca taaataacca cccgcagtgt ccagaggccc 1800 tcagatcgtc tcatacaagg gaagagagag ccactggctc cacttatttc gggtccgcta 1860 ggtggcccgt ctcatctgtg aacttgactc tgtccctcta catgtctctt taatggggtg 1920 agggtggggg agagagggaa ttattgtcca gtgccaaccc caatgacccc aatcccaacc 1980 tcaggtgagc agagcctcta cttgagggac tattgttact ataggaatcc ttacttcccc 2040 agtattgaag ctgaatcagt gagtgtgtac aatgatacat aataaatcct ggaagtcttg 2100 ggatccta 2108 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IVL_MF <400> 6 ggattcggga tttttaatag tatacg 26 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IVL_MR <400> 7 aacacttttc tctcaatact ctaactcg 28 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IVL_UF <400> 8 tgggatttgg gatttttaat agtatat 27 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IVL_UR <400> 9 aaaacacttt tctctcaata ctctaactca 30 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hIVL_F <400> 10 cccatcaaag caagaggaaa 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hIVL_R <400> 11 agctgctgat ccctttgtgt 20 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mIVL_F <400> 12 gtgaagccaa aactaaagca ac 22 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mIVL_R <400> 13 catagacaag aggatggtca gg 22 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_F <400> 14 accacagtcc atgccatcac 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_R <400> 15 tccaccaccc tgttgctgta 20

Claims (1)

1. 인볼루크린(Involucrin) 유전자의 5'-UTR(Untranslated region)의 메틸화된 CpG 섬을 포함하는 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드를 증폭하기 위한 PCR 프라이머 세트로서,
   상기 5'-UTR의 메틸화는 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드 서열의 5' 말단으로부터 680번째, 699번째, 및 783번째 뉴클레오타이드에 존재하는 CpG 섬 메틸화이며,
   상기 PCR 프라이머 세트는 서열번호 6 의 염기서열과 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 제1 프라이머 쌍, 및 서열번호 8의 염기서열과 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 제2 프라이머 쌍을 포함하는 것인, PCR 프라이머 세트.

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