KR101122415B1

KR101122415B1 - 반점 부위 항진 유전자군을 지표로 한 피부 반점 형성 예지방법, 피부 반점 형성 억제제의 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR101122415B1
Application number: KR1020067008348A
Authority: KR
Inventors: 히로후미 아오키; 다츠히코 고다마; 기요타카 하세가와; 겐타로 가지야; 유미코 이시마츠; 마사시 오고우; 세이이치 요시다; 지로 기시모토; 오사무 모로
Original assignee: 가부시키가이샤 시세이도
Priority date: 2003-10-01
Filing date: 2004-09-30
Publication date: 2012-03-09
Also published as: EP1691199B1; EP1691199A4; US20070249915A1; EP1691199A1; WO2005033710A1; DE602004020378D1; TW200516084A; TWI332511B; KR20060125730A

Abstract

본 발명은 피부 반점 형성을 예지하기 위한 피부 검사 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 이 방법은 표피중의 MCP-2 유전자 또는 마우스 AKO12157 유전자, 인간 FLJ21763 유전자 또는 래트 S74257 유전자에 대하여 엄격도가 높은 조건 하에서 하이브리드화 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 Mcp9, Mcp10, Isg15, Usp18, Oas12, Gbp2, Gtpi, Ifi47, Igtp, Tgtp, Sprr2A, Krt2-6b, Cdk5rap2, Mef2C, Gsta4, Osf2, Tnc, Igfbp6, Ppicap, MCP-6 또는 Mm.74656 유전자의 발현이 정상 표피중의 발현에 비하여 항진하고 있는 경우, 반점 형성이 쉬운 피부라고 판단하는 것을 특징으로 한다.

Description

반점 부위 항진 유전자군을 지표로 한 피부 반점 형성 예지 방법, 피부 반점 형성 억제제의 스크리닝 방법{METHOD OF PREDICTING SPOT FORMATION ON THE SKIN WITH THE USE OF SPOT SITE-ACCELERATING GENES AS INDICATION AND METHOD OF SCREENING INHIBITOR FOR SPOT FORMATION ON THE SKIN}

본 발명은 피부 반점 형성을 예지하기 위한 피부 검사 방법에 관한 것이다.

자외선이나 호르몬의 불균형, 정신적 스트레스 등에 의해 멜라노사이트(색소 형성 세포)내의 효소 티로시나제의 작용이 매우 활성화되면, 멜라닌 색소가 계속해서 생성되어 주변의 표피 세포로 보내지게 된다. 멜라닌 색소가 생성되는 페이스가 빠르고, 또한 자외선 등의 영향으로 회복이 정상적이지 않게 되면, 멜라닌 색소가 밖으로 배출되지 않고 피부에 남게 되며, 그 결과 피부에 반점이 생기게 되는 것으로 생각된다.

반점이 생기게 되면, 가능한 한 조기에 그 관리를 하는 것이 바람직하며, 그러기 위해서 미용 기술자에 의한 시감(시각)에 따른 반점의 관능 평가나 피부 상태의 촬상 장치, 측색계(測色計) 등의 기기를 이용한 반점의 정량적 평가에 의해 반점 유무의 조기 판정이 요구된다(일본 특허 공개 제2003-144393호 공보).

일단 반점이 생기게 되면, 그 제거는 용이하지 않으며, 피부의 신진 대사를 좋게 하여 불필요한 멜라닌을 빠르게 배출시켜 쓸데없는 멜라닌을 만들지 않도록 하는 등의 관리가 필요하게 된다. 따라서, 반점이 생기기 전에 피부 관리를 행하는 것이 바람직하다. 그러나, 반점이 생기기 쉬운 것에는 개체차가 있으며, 또한 그 원인이 되는 조건도 다양하기 때문에, 반점이 생기는 것을 예지하는 것은 일반적으로 곤란하다. 따라서, 반점이 생기기 전에 반점이 생기기 쉬운 상태인지 아닌지를 예지할 수 있는 수단이 있으면 반점 예방 대책으로서 매우 유효하다.

본 발명의 발명자는 상기 문제를 감안하여 피부에 반점이 생기기 전에 피부가 반점이 생기기 쉬운 상태인지 아닌지를 예지할 수 있는 수단을 제공할 수 있는지를 예의 검토하였다. 그리고, 본 발명의 발명자는 자외선 조사를 행한 후 조사를 멈추어 햇볕에 탄 것 같은 색을 나타내는 것이 탈색된 후, 잠시 후 노인성 색소반(色素斑)과 같은 반점 모양의 색소반을 형성하는 반점 모델 마우스(M. Naganuma et al., Journal of Dermatological Science 25(2001) 29-35)의 반점 부위 및 비반점 부위의 각각의 표피에서 유래된 RNA의 마이크로 어레이 해석의 결과, 자외선을 조사하지 않고, 반점 모양의 색소반을 형성하지 않는 비반점 부위에 비하여 반점 부위의 표피에 있어서 하기 유전자의 발현이 특이적으로 항진되고 있는 것을 발견하였다. 따라서, 인간의 표피에 있어서, 하기 유전자의 발현을 조사함으로써 반점 형성이 쉬운 피부라고 판단할 수 있는 것이 명백해졌다.

(1) AK012157 유전자(서열 번호 1)

유전자의 염기 서열만 이미 알려져 있고, 기능에 관한 보고는 되어 있지 않은 유전자이다(Meth. Enzymol. 303, 19-44(1999)). 래트에게 있어서 이 유전자와 약 80% 상동인 유전자(S74257; 서열 번호 3)가 암의 침윤?전이에 관계하고 있다는 보고는 있지만(Oncogene, 1994, 9(12), 3591-3600), 이 유전자에 대해서도 피부 색소 관련의 보고는 없다. 또한, 인간에게 있어서 마우스 AK012157 유전자와 약 70% 상동인 유전자(인간 FLJ21763 유전자(서열 번호 2))의 존재가 알려져 있지만, 이 유전자에 대해서도 피부 색소 관련의 보고는 없다.

(2) MCP-2(Monocyte Chemoattracting Protein 2: 단구 화학 유인 단백질-2)

케모카인(분자량 약 1만의 소형 시토킨 패밀리)의 일종이며, 그 패밀리의 MCP-1에서는 단구의 유인을 통해 비종양 형성성인 멜라노마 세포를 종양 형성시킨다고 하는 보고는 있지만(Journal Immunol. Jun 1; 166(11): 6483-6490), 피부 색소 관련한 보고는 없다.

(3) 인터페론에 의해 발현이 항진되는 것이 알려진 유전자군(이하, 「유전자군 1」이라 칭하는 경우가 있음)

a) 케모카인계

Mcp9(소형 유도성 시토카인 B 서브패밀리(Cys-X-Cys), 멤버 9) [Arthritis Rheum 2002 Oct; 46(10): 2730-41];

Mcp10(소형 유도성 시토카인 B 서브패밀리(Cys-X-Cys), 멤버 10)[J Immunol. 2002 Aprl; 168(7): 3195-204];

b) 시그널 전달계

Isg15(인터페론-자극 단백질(15kDa) isg15(유비퀴틴-유사))[Genes Dev 2003 Feb 15; 17(4): 455-460)];

Usp18(유비퀴틴 특이 프로테아지 18)[J. Biol. Chem. 2002 Mar 22; 277(12): 9976-9981]

c) 항 바이러스계

Oas12(2'-5' 올리고아데닐레이트 신타제-유사 OASL2(IFN induced))[J. Interferon Cytokine Res 2002 sep; 22(9): 981-993];

Gbp2(IFN 유도성 구아닐레이트 누클레오티드 결합 단백질 2 gbp2(항바이러스))[J. Interferon Cytokine Res 1998 Nov; 18(11): 977-985];

Gtpi(GTPase; 인터페론-g 유도성 GTPase(19440));

Ifi47(인터페론 감마 유도성 단백질, 47kDa(GTP-결합 모티프))[J Immunol. 1992 May 15; 148(10): 3275-81];

Igtp(GTPase; 인터페론 감마 유도성 GTPase igtp))[Infect Immun. 2002 Dec; 70(12): 6933-9];

Tgtp(GTPase; T-세포 특이 GTPase(IFN gamma)) J Leukoc Biol. 1995 Mar; 57(3): 477-83]

인터페론에 의해 발현이 항진되는 유전자의 프로모터 영역에는 인터페론 반응성 엘리먼트가 존재하고, 이것에 인산화에 의해 활성화된 STAT-1(signal transducers and activators of transcription)이 결합함으로써 이들 유전자의 발현이 항진된다(Free Radical Biology & Medicine 2000; 28(9): 1430-1437, Exp Dermatol 1999; 8: 96-108). 따라서, 상기 유전자군(1)은 인산화됨으로써 활성화된 인산화 STAT-1의 존재 하에서 발현이 항진되는 유전자군이라고도 말할 수 있다. 그리고 실제로 도 6에 도시된 바와 같이 인산화 STAT-1도 반점 부위에서 높은 발현을 하고 있는 것을 이번에 나타내고 있다.

(4) 기능이 이미 알려진 기타 유전자군(이하, 「유전자군 2」라고 칭하는 경우가 있음)

a) 케라틴계

Sprr2A(소형 프롤린-풍부 단백질 2A)[Mamm. Genome 2003; 14(2): 140-148];

Krt2-6b(케라틴 복합체 2, 염기성, 유전자 6a)[Genomics 1998; 53(2): 170-183]

b) 셀 사이클계

Cdk5rap2(CKK5 조절 서브유닛 회합 단백질 2)[Neuron. 2003 Apr 10; 38(1): 33-46];

Mef2C(단구 증대제 인자 2C)[Brain Res Mol Brain Res. 2001 Dec 16; 97(1): 70-82]

c) 산화 환원계

Gsta4(글루타티온 S-트랜스퍼라아제, 알파 4)[J. Biol. Chem. 2002 May 17; 277(20): 17892-17900]

d) 골계(骨系)

Osf2(조골세포 특이 인자(파실린 I-유사))[Protein Expr Purif 1995 Jun; 6(39); 305-311]

e) 세포외 매트릭스(ECM)계

Tnc(테나신 C)[Matrix Biol 2000 Dec; 19(7): 581-596]

f) 인슐린계

Igfbp6(인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 6)[Mol. Cell. Endocrinol. 1994; 104(1): 57-66]

g) 시클로스포린계

Ppicap(펩티딜프롤릴 이소머라아제 C(시클로필린 C)-회합 단백질)[Proc Natl Acad Sci USA. 1993 Jul 15; 90(14): 6815-9]

MCP-6(비만세포 프로테아제 6)[J. Biol. Chem. 1991 Feb 25; 266(6): 3847-3853].

(5) 기능이 아직 알려지지 않은 유전자군(이하, 「유전자군 3」이라 칭하는 경우가 있음)

Mm. 74656 유전자(GenBank Acc: AA519023)

상기 유전자군(3) 모두 피부 색소 관련한 보고는 없다. 따라서, 반점와의 관계로 이들 유전자의 발현이 항진되는 것은 매우 놀랄만한 사실이다.

제1 관점에서, 본 발명은 피부 반점 형성을 예지하기 위한 피부 검사 방법을 제공한다. 이 방법은 표피중의 MCP2의 발현이 정상 표피중의 발현에 비하여 항진하고 있는 경우, 반점 형성이 쉬운 피부라고 판단하는 것을 특징으로 한다.

적합한 형태에 있어서, 상기 피부 반점 형성은 UVB 조사를 원인으로 하는 것이다.

더욱 적합한 형태에 있어서, 상기 표피중의 MCP2 발현의 항진은 표피중의 MCP2의 양을 측정함으로써 결정된다.

더욱 적합한 형태에 있어서, 상기 측정은 MCP2에 특이적인 항체를 이용하는 ELISA법 또는 RIA법에 의한다.

더욱 적합한 형태에 있어서, 상기 표피중의 MCP2 발현의 항진은 표피로부터 추출된 MCP2를 코딩하는 mRNA의 양을 측정함으로써 결정된다.

더욱 적합한 형태에 있어서, 상기 mRNA의 측정은 폴리머라아제 연쇄 반응법에 의해 행한다.

제2 관점에서, 본 발명은 피부 반점 형성 억제 인자 및/또는 피부 반점 제거 인자를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 이 방법은 후보 화합물을 MCP2의 발현 및/또는 활성을 억제하는 능력에 대해서 평가하고, 그 억제 능력을 갖는 MCP2 억제제를 피부 반점 형성 억제 인자 및/또는 피부 반점 제거 인자로서 선정하는 것을 특징으로 한다.

적합한 형태에 있어서, 이 방법은 상기 억제 능력을 갖는 MCP2 억제제를 반점 형성 모델 동물에게 적용하고, 피부 반점 형성 억제 및/또는 피부 반점 제거 효과를 갖는 억제제를 선정하는 것을 포함하여 이루어진다.

제3 관점에서, 본 발명은 별도의 피부 반점 형성을 예지하기 위한 피부 검사 방법을 제공한다. 이 방법은 표피중의 서열 번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드(인간 FLJ21763 유전자) 또는 그 중의 적어도 50, 바람직하게는 적어도 100, 보다 바람직하게는 적어도 200, 특히 바람직하게는 적어도 400개의 연속 뉴클레오티드의 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 발현, 또는 표피중의 서열 번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드(인간 FLJ21763 유전자), 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드(마우스 AK012157 유전자) 또는 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드(래트 S74257 유전자) 또는 이들 중 적어도 50, 바람직하게는 적어도 100, 보다 바람직하게는 적어도 200, 특히 바람직하게는 적어도 400개의 연속 뉴클레오티드의 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 대하여 엄격도가 높은 조건 하에서 하이브리드화 가능한 폴리뉴클레오티드의 발현이 정상 표피중의 발현에 비하여 항진하고 있는 경우, 반점 형성이 쉬운 피부라고 판단하는 것을 특징으로 한다. 인간 FLJ21763 유전자 및 래트 S74257 유전자는 마우스 AK012157 유전자에 대하여 높은 상동성을 나타내는 유전자이다(각각 약 70% 및 약 80%). 마우스 AK012157 유전자, 인간 FLJ21763 유전자 및 래트 S74257 유전자의 대비를 도 1 내지 도 2에 나타낸다. 하이브리드화은 주지의 방법 또는 그것에 준하는 방법, 예컨대 J. Sambrook 연구진 Molecular Cloning 2nd, Cold Spring Harbor. Lab. Press, 1989에 기재한 방법에 따라 행할 수 있으며, 엄격도가 높은 하이브리드화 조건이란 예컨대 나트륨 농도가 약 10～40 mM, 바람직하게는 약 20 mM, 온도가 약 50～70℃, 바람직하게는 약 60～65℃인 것을 포함하는 조건을 말한다.

적합한 형태에 있어서, 상기 피부 반점 형성은 UVB 조사를 원인으로 한다.

더욱 적합한 형태에 있어서, 상기 표피중의 상기 폴리뉴클레오티드의 발현의 항진은 표피로부터 추출된 상기 해당 폴리뉴클레오티드에 상보성인 mRNA의 양을 측정함으로써 결정된다.

제4 관점에서, 본 발명은 별도의 피부 반점 형성 억제 인자 및/또는 피부 반점 제거 인자를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 이 방법은 후보 화합물을 표피중의 서열 번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드(인간 FLJ21763 유전자) 또는 그 중 적어도 50, 바람직하게는 적어도 100, 보다 바람직하게는 적어도 200, 특히 바람직하게는 적어도 400개의 연속 뉴클레오티드의 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 발현, 또는 표피중의 서열 번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드(인간 FLJ21763 유전자), 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드(마우스 AK012157 유전자) 또는 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드(래트 S74257 유전자) 또는 이들 중 적어도 50, 바람직하게는 적어도 100, 보다 바람직하게는 적어도 200, 특히 바람직하게는 적어도 400개의 연속 뉴클레오티드의 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 대하여 엄격도가 높은 조건 하에서 하이브리드화 가능한 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하는 능력에 대해서 평가하고, 그 억제 능력을 갖는 억제제를 피부 반점 형성 억제 인자 및/또는 피부 반점 제거 인자로서 선정하는 것을 특징으로 한다.

적합한 형태에 있어서, 이 방법은 상기 억제 능력을 갖는 상기 억제제를 반점 형성 모델 동물에게 적용하고, 피부 반점 형성 억제 및/또는 피부 반점 제거 효과를 갖는 억제제를 선정하는 것을 더 포함하여 이루어진다.

제5 관점에서, 본 발명은 또 다른 피부 반점 형성을 예지하기 위한 피부 검사 방법을 제공한다. 이 방법은 인산화 STAT-1(signal transducers and activators of transcription) 및 인터페론의 존재 하에서 발현이 항진되는 표피중의 유전자의 발현이 정상 표피중의 발현에 비하여 항진하고 있는 경우, 반점 형성이 쉬운 피부라고 판단하는 것을 특징으로 한다. 여기서, 반점이란 피부에 나타나는 다갈색 내지 진갈색의 평면형 반점무늬를 말한다(고지엔: 일본에서 가장 유명한 국어사전). 그 중에서도 이번 반점 모델 마우스에 대해서 표기하는 반점은 주로 노인성 색소반과 같은 색소반을 가리킨다.

적합한 형태에 있어서, 인산화 STAT-1 및 인터페론의 존재 하에서 발현이 항진되는 표피중의 유전자는 Mcp9, Mcp10, Isg15, Usp18, Oas12, Gbp2, Gtpi, Ifi47, Igtp 및 Tgtp로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 코딩하는 유전자이다.

제6 관점에서, 본 발명은 또 다른 피부 반점 형성을 예지하기 위한 피부 검사 방법으로서, Sprr2A, Krt2-6 b, Cdk5rap2, Mef2C, Gsta4, Osf2, Tnc, Igfbp6 및 Ppicap로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 정상 표피중의 발현에 비하여 항진하고 있는 경우, 반점 형성이 쉬운 피부라고 판단하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

제7 관점에서, 본 발명은 또 다른 피부 반점 형성을 예지하기 위한 피부 검사 방법으로서, MCP-6(Mast cell protease 6) 단백질의 발현이 정상 표피중의 발현에 비하여 항진하고 있는 경우, 반점 형성이 쉬운 피부라고 판단하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

적합하게는, 상기 피부 반점 형성은 UVB 조사를 원인으로 한다.

적합한 형태에 있어서, 상기 표피중의 유전자 발현의 항진은 표피중의 상기 단백질의 양을 측정함으로써 결정된다.

더욱 적합하게는, 상기 측정은 상기 단백질에 특이적인 항체를 이용하는 ELISA법 또는 RIA법에 의해 행해진다.

다른 적합한 형태에 있어서, 상기 표피중의 상기 유전자 발현의 항진은 표피로부터 추출된 상기 단백질을 코딩하는 mRNA의 양을 측정함으로써 결정된다. 바람직하게는, 상기 mRNA의 측정은 폴리머라아제 연쇄 반응법에 의해 행해진다.

제8 관점에서, 본 발명은 또 다른 피부 반점 형성 억제 인자 및/또는 피부 반점 제거 인자를 스크리닝하는 방법으로서, 후보 화합물을 상기 유전자의 발현 및/또는 그 유전자 산물인 단백질의 활성을 억제하는 능력에 대해서 평가하고, 그 억제 능력을 갖는 억제제를 피부 반점 형성 억제 인자 및/또는 피부 반점 제거 인자로서 선정하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

적합한 형태에 있어서, 이 방법은 또 다른 상기 억제 능력을 갖는 억제제를 반점 형성 모델 동물에게 적용하고, 피부 반점 형성 억제 및/또는 피부 반점 제거 효과를 갖는 억제제를 선정하는 것을 포함하여 이루어진다.

제9 관점에서, 본 발명은 또 다른 피부 반점 형성을 예지하기 위한 피부 검사 방법으로서, 표피중의 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드(Mm. 74656)에 대하여 엄격도가 높은 조건 하에서 하이브리드화 가능한 폴리뉴클레오티드의 발현이 정상 표피중의 발현에 비하여 항진하고 있는 경우, 반점 형성이 쉬운 피부라고 판단하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

적합한 형태에 있어서, 상기 표피중의 상기 폴리뉴클레오티드의 발현의 항진은 표피로부터 추출된 상기 해당 폴리뉴클레오티드에 상보성인 mRNA의 양을 측정함으로써 결정된다.

적합하게는, 상기 mRNA의 측정은 폴리머라아제 연쇄 반응법에 의해 행해진다.

제10 관점에서, 본 발명은 또 다른 피부 반점 형성 억제 인자 및/또는 피부 반점 제거 인자를 스크리닝하는 방법으로서, 후보 화합물을 표피중의 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드(Mm. 74656)에 대하여 엄격도가 높은 조건 하에서 하이브리드화 가능한 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하는 능력에 대해서 평가하고, 그 억제 능력을 갖는 억제제를 피부 반점 형성 억제 인자 및/또는 피부 반점 제거 인자로서 선정하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 하이브리드화은 주지의 방법 또는 그것에 준하는 방법, 예컨대 J. Sambrook 연구진의 Molecular Cloning 2nd, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989에 기재한 방법에 따라 행할 수 있으며, 엄격도가 높은 하이브리드화 조건이란 예컨대 나트륨 농도가 약 10～40 mM, 바람직하게는 약 20 mM, 온도가 약 50～70℃, 바람직하게는 약 60～65℃인 것을 포함하는 조건을 말한다.

본 발명에 의해 피부 반점 형성을 예지하기 위한 피부 검사 방법을 제공할 수 있게 된다.

도 1은 마우스 AK012157 유전자, 인간 FLJ21763 유전자 및 래트 S74257 유전자의 대비.

도 2는 도 1에 이어지는 도면.

도 3은 PCR에 의한 반점 모델 마우스의 표피 및 진피에 있어서의 AK012157 유전자 및 MCP-2 유전자의 발현을 도시한 도면.

도 4는 in situ 하이브리드화에 의한 반점 모델 마우스의 표피에 있어서의 AK012157 유전자의 발현을 도시한 도면.

도 5는 면역 조직 염색에 의한 반점 모델 마우스의 표피에 있어서의 MCP-2의 발현을 도시한 도면.

도 6은 웨스턴 블롯에 의한 주요한 시그널 단백의 반점 부위와 정상 부위에서의 발현차를 도시한 도면.

전술한 바와 같이, 마우스 AK012157 유전자, 이 유전자에 대하여 높은 상동성을 나타내는 래트 S74257 유전자나 인간 FLJ21763 유전자, 나아가서는 상기 유전자군 (1)에서 (3)에 관하여 피부 색소 관련한 보고는 없다. 또한, 마우스 및 인간 MCP-2도 피부 색소 관련한 보고는 없다. 본 발명의 발명자는 자외선 조사를 행한 반점 모델 마우스의 반점 부위 및 비반점 부위의 각각의 표피에서 유래된 RNA의 마이크로 어레이 해석의 결과, 비반점 부위에 비하여 반점 부위의 표피에 있어서 AK012157 유전자, MCP-2 유전자 및 상기 유전자군 (1)에서 (3)의 유전자의 발현이 특이적으로 항진되고 있는 것을 발견하였다. 따라서, 이들 유전자를 지표로 함으로써 피부 반점 형성을 예지할 수 있는 것이라고 추측하여 확인할 수 있다. 특히, AK012157 유전자, MCP-2 유전자 발현의 항진은 반점 모델 마우스에게 있어서 UV 조사기에 그치지 않고, UV 조사를 끝낸 후에 UV 조사에 의한 표피의 갈색이 탈색되기 시작하는 탈색기, 나아가서는 그 후 반점이 출현하기 시작하여 반점이 형성되는 색소반 형성기에서도 확인되었다. 반점 모델 마우스의 표피에 있어서 이들 유전자의 발현이 탈색기에서도 항진하고 있기 때문에, 인간에게 있어서도 이들 유전자와 상동인 유전자를 지표로 하면, 반점이 형성되기 전의 탈색기에서도 장래 반점이 형성될 것을 예지할 수 있게 된다.

반점 모델 마우스

반점 모델 마우스는 M. Naganuma et al., 전술한 바와 같이 제작할 수 있다. 간단하게는, 예컨대 7주령 전후의 마우스에게 자외 광원(Toshiba FL-SE; UVB) 하에서 약 8주에 걸쳐 주 약 3회, 99 mJ/㎠ 정도의 강도로 자외선을 조사한다(UV 조사기). 이러한 UV 조사기 동안, 피부의 균일한 색소 침착(피부의 갈색화)을 확인할 수 있게 된다. 이 색소 침착은 UV 조사를 멈추고 나서 2주일 정도로 거의 완전히 소실된다(탈색기). 그 후, 직경 약 2 ㎜ 이하의 작고 옅은 다색의 색소반(소위 노인성 색소반과 같은 「반점 」)이 출현하기 시작한다(색소반 출현 및 형성기).

피부 반점 형성을 예지하기 위한 피부 검사 방법

본 발명은 피부, 바람직하게는 인간 피부 반점 형성을 예지하기 위한 피부 검사 방법을 제공한다. 이 방법은 표피중의 MCP-2 유전자 혹은 인간 FLJ21763 유전 자, 또는 인간 FLJ21763 유전자, 마우스 AK012157 유전자 혹은 래트 S74257 유전자에 대하여 엄격도가 높은 조건 하에서 하이브리드화 가능한 폴리뉴클레오티드 또는 표피중의 Mcp9, Mcp10, Isg15, Usp18, Oas12, Gbp2, Gtpi, Ifi47, Igtp, Tgtp, Sprr2A, Krt2-6b, Cdk5rap2, Mef2C, Gsta4, Osf2, Tnc, Igfbp6 및 Ppicap로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 발현이 정상 표피중의 발현에 비하여 항진하고 있는 경우, 반점 형성이 쉬운 피부라고 판단하는 것을 특징으로 한다. 그 평가 기준으로서 예컨대 표피중의 MCP-2 유전자 혹은 인간 FLJ21763 유전자, 또는 인간 FLJ21763 유전자, 마우스 AK012157 유전자 혹은 래트 S74257 유전자에 대하여 엄격도가 높은 조건 하에서 하이브리드화 가능한 폴리뉴클레오티드, 또는 표피중의 Mcp9, Mcp10, Isg15, Usp18, Oas12, Gbp2, Gtpi, Ifi47, Igtp, Tgtp, Sprr2A, Krt2-6b, Cdk5rap2, Mef2C, Gsta4, Osf2, Tnc, Igfbp6 및 Ppicap로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 발현이 대조군 표피중의 것들에 비하여 10% 이상, 또는 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 50% 이상, 또는 70% 이상, 또는 100% 이상 항진하고 있었다면 「반점 형성이 쉬운 피부」라고 판단하여도 좋다. 검사해야 할 피부는 예컨대 얼굴, 목, 팔, 손발 등, 반점이 생기기 쉽고, 또한 반점 형성이 신경 쓰이는 모든 부분의 표피라도 좋다. 반점이 형성되지 않은 정상 표피, 즉 대조군 표피로서는 예컨대 동일 개체의 예컨대 자외선에 쉽게 노출되지 않고, 비교적 반점이 쉽게 생기지 않는 부위의 표피, 예컨대 복부, 둔부의 표피라도 좋다.

본 발명은 또한 피부, 바람직하게는 인간 피부 반점 형성을 예지하기 위한 피부 검사 방법으로서, 표피중의 MCP-6 또는 Mm. 74656 유전자에 대하여 엄격도가 높은 조건 하에서 하이브리드화 가능한 폴리뉴클레오티드의 발현이 정상 표피중의 발현에 비하여 항진하고 있는 경우, 반점 형성이 쉬운 피부라고 판단하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 그 평가 기준으로서 예컨대 표피중의 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 대조군 표피중의 그들에 비하여 10% 이상, 또는 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 50% 이상, 또는 70% 이상, 또는 100% 이상 항진하고 있었다면 「반점 형성이 쉬운 피부」라고 판단하여도 좋다.

하이브리드화은 주지의 방법 또는 그것에 준하는 방법, 예컨대 J. Sambrook 연구진 Molecular Cloning 2nd, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989에 기재한 방법에 따라 행할 수 있으며, 엄격도가 높은 하이브리드화 조건이란 예컨대 나트륨 농도가 약 10～40 mM, 바람직하게는 약 20 mM, 온도가 약 50～70℃, 바람직하게는 약 60～65℃인 것을 포함하는 조건을 말한다.

표피중의 상기 유전자의 항진은 예컨대 표피중의 그 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 양을 측정함으로써 결정된다. 예컨대, 표피중의 MCP-2 발현의 항진은 예컨대 표피중의 MCP-2의 양을 측정함으로써 결정된다. 바람직하게는, 이 측정은 상기 단백질에 특이적인 항체를 이용하고, 당업계에 있어서 주지의 방법, 예컨대 형광 물질, 색소, 효소 등을 이용하는 면역 염색법, 웨스턴 블롯법, 면역 측정 방법, 예컨대 ELISA법, RIA법 등의 다양한 방법에 의해 실시할 수 있다. 또한, 표피로부터 RNA를 추출하고, 이 유전자를 코딩하는 mRNA의 양을 측정함으로써 결정할 수도 있다. mRNA의 추출, 그 양의 측정도 당업계에 있어서 주지이며, 예컨대 RNA의 정량은 정량 폴리머라아제 연쇄 반응법(PCR)에 의해 행해진다.

표피중의 상기 유전자에 대하여 엄격도가 높은 조건 하에서 하이브리드화 가능한 폴리뉴클레오티드의 발현은 표피로부터 RNA를 추출하고, 상기 폴리뉴클레오티드에 대응하는 mRNA의 양을 측정함으로써 결정할 수도 있다. 예컨대, 표피중의 인간 FLJ21763 유전자, 또는 인간 FLJ21763 유전자, 마우스 AK012157 유전자 혹은 래트 S74257 유전자에 대하여 엄격도가 높은 조건 하에서 하이브리드화 가능한 폴리뉴클레오티드의 발현은 표피로부터 RNA를 추출하고, 상기 폴리뉴클레오티드에 대응하는 mRNA의 양을 측정함으로써 결정할 수도 있다. mRNA의 추출, 그 양의 측정도 당업계에 있어서 주지이며, 예컨대 RNA의 정량은 정량 폴리머라아제 연쇄 반응법(PCR)에 의해 행해진다.

전술한 바와 같이, 본 발명은 자외선 조사를 행한 반점 모델 마우스의 반점 부위 및 비반점 부위의 각각의 표피에서 유래된 RNA의 마이크로 어레이 해석의 결과, 비반점 부위에 비하여 반점 부위의 표피에 있어서 AK012157 유전자, MCP-2 유전자, 유전자군 (1)에서 (3)의 유전자의 발현이 특이적으로 항진되고 있는 것을 발견한 것에 기초한다. 따라서, 표피중의 상기 유전자의 발현 및/또는 그 유전자 산물인 상기 단백질의 활성을 억제하는 것, 예컨대 표피중의 MCP-2 유전자의 발현 및/또는 MCP-2의 활성을 억제하거나, 표피중의 인간 FLJ21763 유전자의 발현을 억제하거나, 또는 인간 FLJ21763 유전자, 마우스 AK012157 유전자 혹은 래트 S74257 유전자에 대하여 엄격도가 높은 조건 하에서 하이브리드화 가능한 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하는 것을 지표로 한 피부의 반점 형성을 억제 및/또는 형성된 반점을 제거하는 약제를 개발할 수 있는 것이라고 추측하여 확인할 수 있다.

따라서, 본 발명은 상기 유전자의 발현을 억제하는 억제제를 피부 반점 형성 억제 인자 및/또는 피부 반점 제거 인자로서 함유하여 이루어진 의약 또는 피부 외용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 조성물은 피부의 반점 형성을 예방 또는 반점을 제거할 수 있다.

MCP-2의 활성을 억제하는 억제제로서는 예컨대 일본 특허 공표 제2001-518296호 공보에 기재되어 있는 천연 MCP-2의 아미노산 1, 1～2, 1～3, 1～4 또는 1～5에 해당하는 NH₂-말단 아미노산을 없애고, 케모카인 길항 활성을 갖는 아미노 말단 절제형 MCP-2를 들 수 있다.

또한, MCP-2의 억제제에는 MCP-2가 결합함으로써 알려진 CCR-1, 3 또는 5 수용체의 길항제가 함유된다. CCR-3 수용체의 길항제는 예컨대 일본 특허 공개 평성 제11-14782호 공보, 일본 특허 공표 제2002-512957호 공보, 일본 특허 공표 제2002-512960호 공보, 일본 특허 공표 제2002-530374호 공보, 일본 특허 공표 제2002-512957호 공보, 제2003-510248호 공보에 기재되어 있다. 그 구체예로서는 예컨대 N-{1-(S)-[4-(3,4-디클로로벤질)피페라진-1-일메틸]-2-메틸프로필}-4-메틸벤즈아미드2염산염;

N-{1-(S)-[4-(3,4-디클로로벤질)피페라진-1-일메틸]-2,2-디메틸프로필}-4-메틸벤즈아미드2염산염;

N-{1-(S)-[4-(3,4-디클로로벤질)피페리딘-1-일메틸]2-메틸프로필}-4-메틸벤즈아미드2염산염;

N-{1-(R)-[4-(3,4-디클로로벤질)피페리딘-1-일메틸]-2-메틸프로필}-4-(2-아미노에틸)벤즈아미드2염산염;

N-{1-(R)-[4-(3,4-디클로로벤질)피페리딘-1-일메틸]-2-메틸프로필}-5-메틸티오펜-2-카르복사미드염산염;

1-{1-(R)-[4-(3,4-디클로로벤질)피페라진-1-일메틸]-2-메틸프로필}-3-(3-메톡시페닐)요소;

1-{1-(R)-[4,-(3,4-디클로로벤질)피페리딘-1-일메틸]-2-메틸프로필}-3-(3-메톡시페닐)요소;

(S)-에틸-2-(4-메틸벤젠술포닐아미노)-3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-(5-디메틸아미노나프탈렌-1-술포닐아미노)-3-(4-히드록시-페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-(나프탈렌-2-술포닐아미노)-3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-(티오펜-2-술포닐아미노)-3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-(퀴놀린-8-술포닐아미노)-3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-(2,4,6-트리메틸벤젠술포닐아미노)-3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-(4-브로모벤젠술포닐아미노)-3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-(4-클로로벤젠술포닐아미노)-3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-(4-메톡시벤젠술포닐아미노)-3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-메탄술포닐아미노-3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-[2-(E)-스티릴술포닐아미노]-3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-(3-트리플루오로메틸벤젠술포닐아미노)-3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-(2,5-디클로로티오펜-3-술포닐아미노)-3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-(2-브로모벤젠술포닐아미노)-3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-[5-(2-피리딜)티오펜-2-술포닐아미노]-3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-(1,3-디메틸-5-클로로-2-피라졸린-4-술포닐아미노)-3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-(4-비페닐술포닐아미노)-3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-(2-니트로-4-메톡시벤젠술포닐아미노)-3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-(2,5-디클로로벤젠술포닐아미노)-3-[4-(2,5-디클로로벤젠술포닐옥시)페닐]프로피오네이트;

(S)-에틸-2-(2,4-디플루오로벤젠술포닐아미노)-3-[4-(2,4-디플루오로벤젠술포닐옥시페닐)]프로피오네이트;

(S)-에틸-2-(5-디메틸아미노나프탈렌-1-술포닐아미노)-3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-(2,5-디클로로벤젠술포닐아미노)-3-[4-(2,5-디클로로벤젠술포닐옥시)페닐]프로피오네이트

(S)-에틸-2-(1-나프토일아미노)-3-(4-니트로페닐)프로피오네이트;

(S)-이소프로필-2-(1-나프토일아미노)-3-(4-니트로페닐)프로피오네이트;

(S)-메틸-2-(1-나프토일아미노)-3-(4-니트로페닐)프로피오네이트;

(S)-벤질-2-(1-나프토일아미노)-3-(4-니트로페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-(1-나프토일아미노)-3-(4-클로로페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-벤조일아미노-3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트;

(S,S)-에틸-2-(2-벤질옥시카르보닐아미노-3-페닐프로피오닐아미노)-3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트;

(S,S)-에틸-2-(N-아세틸피롤리딘-2-벤조일아미노)-3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-시클로헥사닐아미노-3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-(3,3-디페닐프로피오닐아미노)-3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-(3-페닐프로피오닐아미노)-3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-[2-(2-나프틸)아세틸아미노)-3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-(4-페닐부티릴아미노)-3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-펜타닐아미노-3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-(4-벤조일벤조일아미노)-3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-(2-푸라닐)아미노-3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-(1-나프토일아미노)-3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-(5-히드록시인도닐)아미노-3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-피페로닐아미노-3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-피코리닐아미노-3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-(3-니트로-4-클로로벤조일아미노)-3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-(3-히드록시-4-니트로벤조일아미노)-3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-(8-퀴놀리닐아미노)-3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-벤조일아미노-3-페닐프로피오네이트;

(S)-메틸-2-벤조일아미노-3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트;

(S)-벤질-2-벤조일아미노-3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-벤조일아미노-3-(4-메톡시페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-tert-부틸옥시카르보닐아미노-3-(4-니트로페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-tert-부틸옥시카르보닐아미노-3-(4-아미노페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-벤조일아미노-3-(3,5-디요오드-4-히드록시페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-카르복시벤조일아미노-3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-벤조일아미노-3-(1-나프틸)프로피오네이트;

(±)-에틸-2-벤졸릴아미노-3-[3-(벤조일옥시)페닐]프로피오네이트;

(±)-에틸-2-벤조일아미노-3-(3-히드록시페닐)프로피오네이트;

(R,S)-에틸-2-벤조일아미노-3-(2-히드록실페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-벤조일아미노-3-(4-아미노페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-벤조일아미노-3-(4-니트로페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-(2-페닐아세틸아미노)-3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-벤조일아미노-3-(3-인도일)프로피오네이트;

(±)-에틸-2-(벤조일아미노)-2-페닐아세테이트;

(±)-에틸-2-(벤조일아미노)-4-페닐부틸레이트;

(S)-에틸-2-벤조일아미노-3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트;

(S)-벤질-2-벤조일아미노-3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-벤조일아미노-3-(4-메톡시페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-벤조일아미노-3-(1-나프틸)프로피오네이트;

(±)-에틸-2-벤조일아미노-3-(3-히드록시페닐)프로피오네이트;

(S)-에틸-2-벤조일아미노-3-(4-니트로페닐)프로피오네이트;

(±)-에틸-2-(벤조일아미노)-2-페닐아세테이트;

(±)-에틸-2-(벤조일아미노)-4-페닐부틸레이트;

(S)-에틸-2-벤조일아미노-3-(4-니트로페닐)프로피오네이트 등을 들 수 있다.

CCR-1 수용체의 길항제에는 예컨대 일본 특허 출원 공개 WO97/24325; Pfizer, Inc.에 의한 WO98/38167; 데이진 가부시키가이샤에 의한 WO97/44329; 반유세이야꾸 가부시키가이샤에 의한 WO98/04554; Merck & Co., Inc.에 의한 WO98/27815, WO98/25604, WO98/25605, WO98/25617 및 WO98/31364; Leuko Site, Inc.에 의한 WO98/02151 및 동 WO99/37617; Leuko Site, Inc. 등에 의한 WO99/37651 및 WO99/37619; 미국 특허 가출원 제60/021,716호 명세서(1996년 7월12일 출원); 미국 특허 출원 제09/146,827호 명세서 및 동 제09/148,236호 명세서(1998년 9월4일 출원); Hesselgesser 연구진, J. Biol. Chem. 273(25): 15687～15692(1998); 및 Howard 연구진, J. Medicinal Chem. 41(13): 2184～2193(1998)에 기재한 화합물을 들 수 있다.

또한, CCR-5 수용체의 길항제에는 예컨대 일본 특허 공표 제2002-543186호 공보에 기재한 것을 들 수 있다.

본 발명의 의약 또는 피부 외용 조성물은 예컨대 수용액, 오일액, 그 밖의 용액, 유액, 크림, 겔, 현탁액, 마이크로 캡슐, 분말, 과립, 캡슐, 고형제 등의 형태로 적용된다. 종래부터 공지의 방법에 의해 이들 형태로 조제한 후에, 로션 제 제, 유액제, 크림제, 연고제, 경고제, 파프제, 에어졸제, 물-오일 2층계, 물-오일-분말 3층계, 주사제, 내복제(정제, 산제, 과립제, 환제, 시럽제, 트로키제 등), 좌제 등으로서, 신체에 도포, 첩부(貼付), 분무, 주사, 음용, 삽입할 수 있다. 이 조성물은 상기 억제제를 피부 반점 형성 억제 인자 및/또는 피부 반점 제거 인자로서, 특별히 한정하지 않고, 조성물 전량에 기초하여 예컨대 0.001 mM～1 M, 바람직하게는 0.01～100 mM, 보다 바람직하게는 0.1～10 mM 정도 함유할 것이다.

이들 제형 중에서도 로션 제제, 유액제, 크림제, 연고제, 경고제, 파프제, 에어졸제 등의 피부 외용제가 본 발명의 목적에 알맞는 제형이다. 또한, 여기서 기재한 피부 외용제에는 의약품, 의약부외품(연고제 등), 화장료[세안료, 유액, 크림, 젤, 에센스(미용액), 팩 및 마스크 등의 기초 화장품; 파운데이션, 입술 연지 등의 메이컵 화장품; 구강 화장품, 방향 화장품, 모발 화장품, 보디 화장품 등]가 포함된다. 특히, 본 발명의 의약 또는 피부 외용 조성물은 반점 예방 화장료로서의 적용이 적합하다.

본 발명의 의약 또는 피부 외용 조성물에 있어서는 원하는 제형에 따라 종래 공지의 부형제나 향료 등을 비롯하여 유지류, 계면활성제, 방부제, 금속 이온 봉쇄제, 수용성 고분자, 증점제, 안료 등의 분말 성분, 자외선 방어제, 보습제, 산화방지제, pH 조정제, 세정제, 건조제, 유화제 등이 적절하게 배합된다. 또한, 이 밖의 약효 성분을 본 발명의 의약 또는 피부 외용 조성물에 배합하는 것은 그 배합에 의해 소기의 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 가능하다.

피부 반점 형성 억제 인자 및/또는 피부 반점 제거 인자를 스크리닝하는 방 법

본 발명은 추가로 피부 반점 형성 억제 인자 및/또는 피부 반점 제거 인자를 스크리닝하는 방법도 제공한다. 이 방법은 후보 화합물을 표피중의 상기 유전자 예컨대 MCP-2의 발현 및/또는 활성을 억제하거나 또는 인간 FLJ21763 유전자, 마우스 AK012157 유전자 혹은 래트 S74257 유전자에 대하여 엄격도가 높은 조건 하에서 하이브리드화 가능한 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하는 능력에 대해서 평가하고, 그 억제 능력을 갖는 억제제를 피부 반점 형성 억제 인자 및/또는 피부 반점 제거 인자로서 선정하는 것을 특징으로 한다.

적합한 형태에 있어서, 상기 스크리닝 방법은 상기 억제 능력을 갖는 억제제를 반점 모델 동물에게 적용하고, 피부 반점 형성 억제 및/또는 피부 반점 제거 효과를 갖는 억제제를 선정하는 것을 더 포함하여 이루어진다.

상기 억제제의 피부 반점 형성 억제 및/또는 피부 반점 제거 효과에 대한 확인하는 공정은 이 억제제를 반점 모델 동물, 예컨대 반점 모델 마우스를 이용하여 실시할 수 있다. 동물로서는 마우스 외에 래트, 토끼 등의 다양한 동물을 이용할 수 있다. 적합한 형태에 있어서는, 이 억제제의 용액, 예컨대 수용액을 조제하고 나서 피부 반점 모델 동물의 피부에 반복 도포하여 반점의 형성을 평가함으로써, 상기 효과의 유무를 판정할 수 있다.

이하, 구체예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 또한, 본 발명은 이것에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예

반점 모델 마우스의 제작

반점 모델 마우스는 M. Naganuma et al., 전술한 바와 같이 제작하였다. 간단하게는, 7주령의 마우스에게 자외 광원(Toshiba FL-SE; UVB) 하에서 8주에 걸쳐 주 3회, 99 mJ/㎠의 강도로 자외선 조사하였다(UV 조사기). 주령 15～23주(UV 조사기가 종료되고 나서 약 8주까지) 사이에 탈색기를 맞이하고, 주령 23～35주(UV 조사기가 종료되고 나서 약 18～30주 후) 사이에 색소반 출현기를 맞이하며, 주령 35～52주(UV 조사기가 종료되고 나서 30～47주 후) 사이에 색소반 형성기를 맞이하였다.

피부로부터의 RNA 채취

마우스 배부(背部)의 피부 전층을 채취하여 지방층을 제거하고, 가열에 의해 표피를 박리하며, 표피를 ISOGEN(NIPPON GENE CO., LTD., 메이커 장려 프로토콜)에 의해 RNA를 추출하여 RNeasy(Qiagen사)에 의해 정제하였다. 진피 쪽은 1센티각으로 절단하여 액체 질소로 동결시켜 파쇄한 후, ISOGEN(NIPPON GENE CO., LTD., 메이커 장려 프로토콜)에 의해 RNA를 추출하여 RNeasy(Qiagen사)에 의해 정제하였다. RNA는 TBE 아가로스겔로 영동하고, SYBR green(Moleculer probes사)으로 염색하여 품질, 정제도를 확인하였다.

UV 조사기의 시료는 주령 약 10주째에 마우스로부터 채취하고, 이 시료에 대한 대조군은 주령 약 14주째의 마우스로부터 채취하였다. 탈색기의 시료는 주령 약 20주째에 마우스로부터 채취하고, 이 시료에 대한 대조군도 주령 약 20주째의 마우스로부터 채취하였다. 색소반 형성기의 시료는 주령 약 42주째에 마우스로부터 채 취하고, 이 시료에 대한 대조군은 주령 약 40주째의 마우스로부터 채취하였다.

마이크로 어레이용 샘플의 반응

마이크로 어레이 해석은 어피메트릭스사 유전자 칩을 이용하였다.

어피메트릭스사용 샘플 조제

어피메트릭스사 장려 프로토콜에 준하여 반응을 행하였다. RNA10 ㎍을 oligo-dT 프라이머(24 mer), 100 pmol(Sigma사)과 함께 70℃에서 10분간 반응시켰다. 그 후, 5x제1쇄 반응 버퍼 4 ㎕, 0.1M DTT 2 ㎕, 10 mM dNTP 믹스 1 ㎕, Superscript II 2 ㎕(전부 Invitrogen사)를 첨가하여 42℃에서 1시간 반응시켰다. 이 반응물에 Rnase 비함유수 91 ㎕, 5x제2쇄 반응 버퍼 30 ㎕, 10 mM dNTP 믹스 3 ㎕, 10U/㎕ E. coli DNA 리가아제 1 ㎕, 10U/㎕ E. coli DNA 폴리메라아제 I4 ㎕, 2U/㎕ Rnase H 1 ㎛(전부 Invitrogen사)를 첨가하여 16℃에서 2시간 반응시켰다. 또한, 2 ㎕(10U/㎕)의 T4 DNA 폴리머라아제(Invitrogen사)를 첨가하여 16℃에서 5분간 반응시킨 후, 10 ㎕의 0.5M EDTA를 첨가하여 반응을 정지시켰다. Phase Lock Gels(Qiagen사)를 이용하여 클린업을 행하고, Rnase 비함유수 12 ㎕에 용출시켰다. 얻어진 cDNA로부터 in vitro 전사 반응에 의해 비오틴부가 cRNA를 제작하고(Enzo, Farmingdale), RNeasy(Qiagen사)에 의해 정제하였다. cRNA를 프래그먼테이션 버퍼 속에서 94℃로 35분간 분단시킨 후, 유전자 칩 하이브리드화에 이용하였다. 칩 세정한 후, 어피메트릭스사 스캐너에 의해 데이터 판독을 행하였다.

해석 결과

약 9,000종의 유전자의 발현을 망라하여 해석한 결과, 반점 모델 마우스의 표피에 있어서, 대조군 마우스의 표피에 비하여 AK012157 유전자, MCP-2 유전자 및 유전자군 (1)～(3)이 유전자의 발현이 현저히 항진되고 있는 것이 발견되었다. 흥미로운 것은 AK012157 유전자, MCP-2 유전자 발현의 항진은 UV 조사기에 그치지 않고, UV 조사를 끝냄으로써 UV 조사에 의한 표피의 갈색이 탈색되기 시작하는 탈색기, 나아가서는, 그 후 반점이 출현하기 시작하여 반점이 형성되는 색소반 형성기에서도 항상 확인되었다. 반점 모델 마우스의 표피에 있어서 이들 유전자의 발현이 반점이 생기기 전의 탈색기에 있어서도 항진하고 있기 때문에, 이들 유전자를 지표로 하면, 반점이 형성되기 전의 탈색기에서도 장래 반점이 형성될 것을 예지할 수 있게 된다. 이하의 표 1 및 표 2에 그 결과를 나타낸다.

	각 대조군에 대한 변동율
	UV 조사기	탈색기	색소반 형성기
MCP-2	4.7	13.8	3.2
AK012157	5.3	5.5	6.4

정상 부위 또는 UV 비조사 부위를 1로 했을 때의 발현비이고, UV 조사기, 탈색기는 n=2, n=3의 평균치이다.

유전자명	반점 부위/비반점 부위 (n=4)
Mcp9	3.9
Mcp10	3.6
Isg15	4.1
Usp18	2.2
Oas12	4.1
Gbp2	3.3
Gtpi	3.2
Ifi47	2.8
Igtp	2.7
Tgtp	2.6
Sprr2A	23.3
Krt2-6b	3.4
Cdk5rap2	12.4
Mef2C	4.8
Gsta4	3.0
Osf2	2.9
Tnc	2.9
Igfbp6	2.9
Ppicap	2.6
Mcp-6	1.8
Mm.74656	2.9

RT-PCR

피부로부터 채취한 RNA 각(반점 부위, 비반점 부위의 표피 또는 진피) 1 ㎍을 올리고-dT프라이머(24 mer) 100 pmol(Sigma)과 함께 70℃에서 10분(총용량 20 ㎕) 반응시켰다. 그 후, 5x제1쇄 반응 버퍼 4 ㎕, 0.1M DTT 2 ㎕, 2.5 mM dNTP 믹스 4 ㎕, SuperscriptII 1 ㎕(전부 invitrogen)를 첨가하여 42℃에서 1시간 반응시켰다. 마지막으로 70℃에서 10분 반응시켜 신장시키고, cDNA 템플릿을 조제하였다. rTaq용 10×버퍼 5 ㎕, 25 mM MgCl₂3 ㎕, 2.0 mM dNTP 믹스 5 ㎕, rTaq 0.5 ㎕(전부 TOYOB0사), ddH₂0 33.5 ㎕, cDNA 템플릿 각 1 ㎕, 프라이머(하기 서열 참조), 센스 및 안티센스 각 20 mM 1 ㎕(총용량 50 ㎕)를 전부 첨가하여 PCR 반응[94℃ 2분, (94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분)을 30사이클, 72℃ 10분]을 행하였다.

MCP-2프라이머 서열

센스 TTCTTTGCCTGCTGCTCATA(서열 번호 4)

안티센스 GACAAGGATGAGAAAACACG(서열 번호 5)

AK012157 프라이머 서열

센스 ACTCCGGCTCCTTCACTATG(서열 번호 6)

안티센스 CTTTGGAATGAGGACTTGGA(서열 번호 7)

마지막으로 1.5% 에튬브로마이드 함유 아가로스겔로써 전기 영동하여 약 300 bp의 밴드를 얻었다. 이 결과를 도 3에 나타낸다. 도 3으로부터 밝혀진 바와 같이, AK012157 유전자 및 MCP-2 유전자는 표피의 반점 부위에 있어서 현저히 발현되고, 표피의 비반점 부위에서는 거의 발현되지 않는 것이 확인되었다. 또한, 진피에 있어서는 모두 발현차가 없었다.

in situ 하이브리드화(ISH)

마우스 피부 조직을 10% 중성 포르말린으로 고정하고, 파라핀 포매한 후, 통상적인 방법에 따라 조직 세그먼트 슬라이드를 작성하였다. 이것을 벤타나사 HX 시스템 자동 슬라이드 처리기를 사용하여 in situ 하이브리드화 반응을 행하였다(프로토콜: Japan open blue 8.0). 전처리로서 조직 세그먼트를 블로킹, 프로테아제 처리한 후, AKO12157 서열로부터 T7 폴리메라아제를 이용하여 작성한 Dig 라벨 리보프로브 500 ng과, 68℃에서 6시간 하이브리드화시켰다. 그 후, 세정하여 Anti-Dig-알칼리 포스파타아제를 반응시켜 세정한 후, 기질 NBT/BCIP를 이용하여 정색시켜 봉입하여 광학현미경으로 관찰하였다.

그 결과를 도 4에 나타낸다. 도 4로부터 밝혀진 바와 같이, AK012157 유전자는 표피의 반점 부위에서 현저히 발현되고, 표피의 비반점 부위에서는 거의 발현되지 않는 것을 확인할 수 있었다.

면역 조직 염색(IHC)

마우스 피부 조직을 중성 포르말린 고정하고, 파라핀 포매한 후, 통상적인 방법에 따라 조직 세그먼트를 작성하였다. 이것을 1% H₂0₂로 15분 처리한 후, 30분 블로킹하여 1/50 희석의 항마우스 MCP2 항체(R&D Systems)를 1주야 반응시켰다. 이것을 티라미드 증감법(TSA 시스템, 퍼킨엘머사) 키트에 의해 검출을 행하였다. 세정 후, HRP에 대해 2차 항체를 반응시켜 세정하고, FITC 라벨 티라미드를 반응시켜 세정, 포매하여 형광현미경으로 관찰을 행하였다.

그 결과를 도 5에 나타낸다. 도 5로부터 밝혀진 바와 같이, MCP-2 유전자는 표피 반점 부위에서 현저히 발현되고, 표피의 비반점 부위에서는 거의 발현되지 않는 것을 확인할 수 있었다.

주요한 시그널 전달계 단백질군의 발현 비교

반점 모델 마우스의 반점 부위와 정상 부위의 표피 단백질을 추출하여, 도 6에 도시된 주요한 시그널 단백군의 발현량을 웨스턴 블롯에 의해 조사한 결과, 인산화 STAT1가 특히 반점 부위/정상 부위에서 큰 발현차를 나타내고 있었다. 이 결과는 인터페론 유도 유전자군[유전자군(1)]이 반점 부위에서 항진하고 있는 것과 정합성이 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Shiseido Co. Ltd. <120> Methods for Predicting Skin Stain Formation and for Screening Agent Capable of Inhibiting Skin Stain Formation By Means of Promoted Genes in Stained Regions as an Indicator <130> P871 <150> JP 2003-343549 <151> 2003-10-01 <150> JP 2003-344786 <151> 2003-10-02 <160> 7 <210> 1 <211> 758 <212> DNA <213> Mouse <400> 1 aaaccntttt cgtggcacag cttcctccct aggcgtgaga ctccggctcc ttcactatga 60 gacttctagc cctttccggt ctgctctgca tgctgctcct ctgtttctgc attttctcct 120 cagaagggag aagacatcct gccaagtcct tgaaactcag gcgctgctgt cacctatctc 180 ctagatccaa gctgacaacc tggaaaggaa accacacaag gccctgcaga ctctgcagaa 240 acaagctacc agtcaagtca tgggtggtgc ctggggctct cccacagata tagggcctcc 300 tccgcccaga tgaagcgttg atgcccagat gtggagacac cagaagcata cacactatgt 360 tgccttgccc cttgccaatg agctgtgaca ctggaatgct tcacttcaga catcagggcg 420 gatggattgc agaattccaa gtcctcattc caaaggtgtc accaaccttc agagtcacta 480 aggtccaggc tcagcccaca agtcaccatg gctcctccag agtaaaagtc caagattcca 540 cctgtgggag ctacagatcc agagactttc aagctgacta 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Antisense Primer <400> 7 ctttggaatg aggacttgga 20

Claims

피부 반점 형성을 예지하기 위한 피부 검사 방법으로서, 표피중의 MCP2(Monocyte Chemoattracting Protein 2: 단구 화학 유인 단백질-2)의 발현을 정상 표피중의 발현과 비교하되, 그 항진 여부를 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 피부 반점 형성이 UVB 조사를 원인으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 표피중의 MCP2 발현의 항진이 표피중의 MCP2의 양을 측정함으로써 결정되는 것인 방법.
제3항에 있어서, 상기 측정이 MCP2에 특이적인 항체를 이용하는 ELISA법 또는 RIA법에 의한 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 표피중의 MCP2 발현의 항진이 표피로부터 추출된 MCP2를 코딩하는 mRNA의 양을 측정함으로써 결정되는 것인 방법.
제5항에 있어서, 상기 mRNA의 측정을 폴리머라아제 연쇄 반응법에 의해 행하 는 것인 방법.
피부 반점 형성 억제 인자, 피부 반점 제거 인자, 또는 피부 반점 형성 억제 인자 및 피부 반점 제거 인자를 스크리닝하는 방법으로서, 후보 화합물 중에서 표피 중의 MCP2의 발현, 활성, 또는 발현 및 활성을 억제하는 능력을 갖는 MCP2 억제제를 피부 반점 형성 억제 인자, 피부 반점 제거 인자, 또는 피부 반점 형성 억제 인자 및 피부 반점 제거 인자로서 선정하는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 억제 능력을 갖는 MCP2 억제제를 반점 형성 모델 동물에게 적용하고, 피부 반점 형성 억제, 피부 반점 제거, 또는 피부 반점 형성 억제 및 피부 반점 제거 효과를 갖는 억제제를 선정하는 것을 더 포함하여 이루어지는 것인 방법.
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