TWI332511B

TWI332511B - Methods for predicting skin stain formation and for screening agent capable of inhibiting skin stain formation by means of promoted genes in stained regions as an indicator

Info

Publication number: TWI332511B
Application number: TW093129918A
Authority: TW
Inventors: Hirofumi Aoki; Tatsuhiko Kodama; Kiyotaka Hasegawa; Kentaro Kajiya; Yumiko Ishimatsu; Masashi Ogou; Seiichi Yoshida; Jiro Kishimoto; Osamu Moro
Original assignee: Shiseido Co Ltd
Priority date: 2003-10-01
Filing date: 2004-10-01
Publication date: 2010-11-01
Also published as: EP1691199B1; EP1691199A4; KR101122415B1; US20070249915A1; EP1691199A1; WO2005033710A1; DE602004020378D1; TW200516084A; KR20060125730A

Description

1332511 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明係關於預知皮膚斑點 r A 胃點㊉成用之皮膚檢查方法。【先前技術】若紫外線、荷爾蒙不平衡、棹、Α ^ ㈣豕忖衡精神壓力等引起之黑色素形成細胞内之酵素酪胺酸酶之作下用破異常地活化，黑色素將破逐漸地產生送往週邊之表古您<衣皮細胞》若黑色素之產生速度快，且因紫外線等之影響表古衣皮細胞換新變得不正常，黑色素無法排出至外部而殘留在肌肉 ^ j門將在肌肉中產生斑點。右斑點已經出現，以儘早伴基盔献7土、· 干保蚕為較佳，因此期望由美容業者以視覺進行斑點之官能畔僧 ^ 此D子價，或者使用皮膚狀態之攝影裝置、測色計等機器進行斑點定』點足1砰價，以早期判定斑點之有無（特開2003_144393號公報）。斑點-旦出現，其之除去不易，必須進行促進肌肉新陳代謝、早曰找出不需要的黑色素，以及不產生多餘的黑色素等保養。因此以在斑點出現前進行肌肉之保養為較佳。但是，由於斑點出現之容易度有個人差異，且造成斑點之條件有各式各樣，所以要預知斑點是否會出現有所困難。因此’若有在斑點出現前預知是否為斑點容易出現狀態之手段’將為預防斑點極為有效之策略。【發明内容】本發明者鑑於上述問題，深入檢討以提供在肌肉出現斑點前預知肌肉是否為斑點易於產生狀態之手段。本發明者發現’在施予紫外線照射後停止照射，並於日曬後所呈顏 96506.doc 1332511 色脫色後，不久形成老人性色素斑樣之斑點狀色素斑之斑點模型小鼠（M. Naganuma et al·，Journal 〇f Dermatological Science 25 (2001) 29-35) 中，來自斑點部位及非斑點部位之各表皮之RNA之微量陣列（microarray)解析結果，與未照射紫外線，未形成斑點狀色素斑之部位相比，斑點部位之表皮中下述基因之表現特異性地亢進。因此，在人類之表皮中，藉由調查下述基因之表現可以判斷出易於形成斑點之皮膚。 (1) AK012157基因（序列編號1) 該基因之驗基序列為已知’但是沒有關於其機能的報告 (Meth. Enzymol. 303，19-44 (1999))。又，雖有「在大鼠中，與該基因80%相同之基因（S74257 ;序列編號3)與癌之浸潤及轉移相關」之報告（Oncogene，1994, 9 (12)，3591-3600) ’ 但沒有該基因與皮膚色素相關的報告。再者，目前已知在人類中存在與ΑΚ0 12157基因約70%相同之基因（人類 FLJ2 1 763基因（序列編號2)) ’但沒有該基因與皮膚色素相關的報告。 (2) MCP-2(單核球化學誘引蛋白質·2，monocyte chemoattracting protein 2) 雖有藉由化學趨向素（分子量約1萬之小型細胞激素家族）之一種，即該群之MCP-1誘引單核球而使非腫瘤形成性黑色素瘤細胞形成腫瘤之報告（Journal Immunol. Jun 1; 166(11): 6483-6490)，但無與皮膚色素相關之報告。 (3) 已知表現會被干擾素促進之基因群（在下文中有時稱為 96506.doc 1332511 「基因群1」） a) 化學趨向素

Mcp9(小型可誘生細胞激素B亞群（Cys-X-Cys)，成員 9) [Arthritis Rheum 2002 Oct; 46(10):2730-41]；

Mcpl0(小型可誘生細胞激素B亞群（Cys-X-Cys)，成員 10) [J Immunol. 2002 Apr 1; 168 (7):3 195-204]； b) 信號傳達系統

Isgl5 (經由干擾素刺激之蛋白質（15kDa) isgl5 (類泛素） [Genes Dev 2003 Feb 15; 17(4): 455-460]；

Uspl8(泛素特異性蛋白酶 18) [J. Biol. Chem. 2002 Mar 22; 277(12):9976-9981]； c) 抗病毒糸

Oasl2 (2’-5'寡聚腺苷酸合成酶樣OASL2(干擾素誘生性）) [J. Interferon Cytokine Res 2002 sep; 22(9): 981-993]；

Gbp2 (干擾素誘生之鳥苷酸結合蛋白質2 gbp2(抗病毒）） [J. Interferon Cytokine Res 1998 Nov; 18(1 1): 977-985]； Gtpi (GTPase ;可由干擾素-γ誘生之 GTPase (19440)); Ifi47 [可由干擾素-γ誘生之蛋白質，47kDa (GTP-結合基序（motif))] [J Immunol. 1992 May 15; 148(10); 3275-81];

Igtp (GTPase ;可由干擾素-γ誘生之 GTPase igtp)) [Infect Immun. 2002 Dec; 70(12): 6933-9]；

Tgtp (GTPase; T-細胞特異性GTPase (干擾素-γ)) [J Leukoc Biol. 1995 Mar; 57(3): 477-83] ° 在表現會被干擾素促進之基因之啟動子領域，存在干擾 96506.doc 1332511 素反應性單元，藉由被填酸化而活性化之1 (信號轉導因子及轉錄活化因子）與之結合，此等基因之表現將被促進 (Free Radical Biology & Medicine 2002; 28(9): 1430- 1437,

Exp Dermatol 1999; 8: 96-108)。因此，上述基因群⑴係於可藉由磷酸化而活性化之磷酸化STAT·丨存在下，表現會被促進之基因群。所以如圖6所示，在斑點部位磷酸化STAT_工亦被高度表現。 (4)已知機能之其他基因群（以下，有時亦稱為「基因群2」） a) 角質蛋白系

Sprr2A (小型、畐含脯私酸之蛋白質2a) [Mamm. Genome 2003; 14(2): 140-148]；

Krt2 6b (角質蛋白複合物2，驗性，基因6a) [Genomics 1998; 53(2): 170-183]； b) 細胞週期系

Cdk5rap2 (CKK5調節亞單元相關蛋白質2) [Neur〇n 2〇〇3 Apr 10; 38(1): 33-46]；

Mef2C (肌細胞增強因子2C) [Brain Res Mol Brain Res. 2001 Dec 16; 97(1): 70-82] c) 氧化還原系

Gsta4 (谷胱甘肽 S-轉移酶，α 4) [j. Biol. Chem. 2002 May 17; 277(20): 17892-17900] d) 骨系

Osf2 (成骨細胞特異性因子（類成束蛋白i，fasciiin I-like)) [Protein Expr Purif 1995 Jun; 6(39); 305-3 11] 96506.doc 1332511 之 r:二較佳態樣中，上述測定係利用對MCP2具特異性抗體之EUSA法或RIA法。異性又在較佳態樣中，上述表皮中之聽2表現測定從表皮t萃取之編賴CWNA之量而決定係藉由再者，在較佳態樣中，上述mRNA之測定係藉鎖反應法而進行。鉍連從第一觀點言之，本發明提 — 贫績供種師選皮膚斑點形成抑制因子，及/或皮膚斑點除去因子之方法。該方法之特評價候ϋ化合物抑制聽2之表現及/或活性之能力，選定 ”有抑制此力之MCP2抑制劑作為皮膚斑點形成抑制因子及/或皮膚斑點除去因子。在較佳態樣中，該方法尚包含將具有上述抑制能力之 MCP2抑制劑用於斑點形成模型動物中，以及選定具有皮膚斑點形成抑制及/或皮膚斑點去除效果之抑制劑。從第三觀點言之，本發明提供一種預知皮膚斑點形成用之皮膚檢查方法。該方法之特徵為若表皮中下列聚核苷酸之表現與其在正常表皮中之表現相較顯得亢進，則判定為易於形成斑點之皮膚：由序列編號2所示之鹼基序列組成之聚核苷酸（人類FLJ2 1763基因）或由其中至少5〇個，較佳至少100個’更佳至少200個，特佳至少4〇〇個連續核苦酸之序列組成之聚核4酸，或者在南度厫苛條件下，與下列聚核苷酸可以雜交之核苷酸：由序列編號2所示之鹼基序列組成之聚核苷酸（人類FLJ2 1763基因）、由序列編號1所示之鹼基序列組成之聚核苷酸（小鼠ΑΚ012157基因）、或由序列編號3 96506.doc 1332511 所示之鹼基序列組成之聚核苷酸（大鼠S74257基因）、或者由彼等中至少50個，較佳至少100個，更佳至少200個，特佳至少400個連續核苷酸之序列組成之聚核苷酸。人類 FLJ21763基因及大鼠S74257基因為與小鼠AK012157基因顯示高度同源性之基因（分別為約70%及約80%)。將小鼠八尺012157基因、人類？〇21763基因及大鼠374257基因之對比示於圖1至2中。雜交可依照周知之方法或以其為基準之方法，例如於J_ Sambrook et al.，Molecular Cloning 2nd， Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989 中記載之方法而進行，. 且所謂高度嚴苛雜交條件係包含例如鈉濃度為約10至40 mM，較佳約20mM，溫度約50至70°C，較佳約60至65°C之條件。在較佳之態樣中，上述皮膚斑點形成之原因為UVB照射。在更佳之態樣中，上述表皮中之上述聚核苷酸之表現亢進係藉由測定萃取自表皮之與上述聚核苷酸互補之mRNA 之量而決定。在更佳之態樣中，上述mRNA之測定係藉由聚合酶連鎖反應法而進行。從第四觀點言之，本發明提供篩選皮膚斑點形成抑制因子及/或皮膚斑點除去因子之方法。該方法之特徵為：評價候選化合物抑制表皮中下列聚核苷酸表現之能力：由序列編號2所示之鹼基序列組成之聚核苷酸（人類 FLJ21763基因）或由其中至少50個，較佳至少100個，更佳至少200個，特佳至少400個連續核苷酸之序列組成之聚核苦酸；或者 96506.doc 1332511 在兩度嚴苛條件下’可與下列聚核苷酸序列雜交之序歹J .由序列編號2所示之驗基序列組成之聚核苷酸（人類 FLJ21763基因）' 由序列編號i所示之鹼基序列組成之聚核苷酸（小鼠AK012157基因）、或由序列編號3所示之鹼基序列組成之聚核苷酸（大鼠S74257基因）' 或者彼等中至少50個，較佳至少1〇〇個，更佳至少2〇〇個，特佳至少個連續核苷酸之序列組成之聚核苷酸；然後選定具有該抑制能力之抑制劑做為皮膚斑點形成抑制因子及/或皮膚斑點除去因子。在較佳態樣中，該方法尚包含將具有上述抑制能力之上述抑制劑用於斑點形成模型動物中，然後選定具有皮膚斑點形成抑制效果及/或皮膚斑點除去效果之抑制劑。從第五觀點言之，本發明尚提供—種預知皮膚斑點形成用之皮膚檢查方法。該方法之特徵為若表皮中於磷酸化 STAT-1(信號轉導因子及轉錄之活化因子）及干擾素存在下表現會變得完進之基因之表現，與其在正常表皮令之表現相較顯得宄進，則判定為易於形成斑點之皮膚。其令，所謂「斑點」意指在皮膚上出現之茶褐色至濃褐色之平面狀斑紋（廣辭苑）。在本模擬小鼠模型中紀錄之斑點主要為老人性色素斑樣之色素斑。在較佳態樣中，表皮中於球酸化似以及干擾素存在下表現會變得宄進之基因係編碼下列者所組成之群中之蛋白質之基因：MCP9、Mcpl〇、IsgI5、Uspl8、〇如、_、 Gtpi、lfi47、Igtp及 Tgip。 96506.doc • 13- 1332511 從弟六觀點言之，太旅i 1 本發明尚提供預知皮膚斑點形成用之皮膚檢查方法，复牲〇将徵為編碼選自Sprr2A、Krt2-6b、 Cdk5rap2 ' Mef2r . ^ sta4、〇sf2、Tnc、Igfbp6及 Ppicap 組成之群中選出之蛋ό 質之基因之表現，與正常表皮中之表現相比顯得充進之惜、、. ^ 兄’判疋為易於形成斑點之皮膚。 ' 觀’ έ。之，本發明尚提供預知皮膚斑點形成用之皮膚檢查方法，其特徵為若Mcp，肥大細胞蛋白轉白表見與正$表皮中之表現相比顯得宄進，則判定為易於形成斑點之皮膚。上述皮膚斑點形成之原因較佳為UVB照射。在較佳態樣中，上诚类士士上述表皮争基因表現之亢進，藉由測定表皮中上述蛋白質之量而決定。之ELISA法或RJA法進行上述敎更佳藉由利用對於上述蛋白質具特異性之抗體在另一較佳態樣中，上述 ^ 通衣皮中之上述基因之表現完 ^藉由敎編碼萃取自表皮之上述蛋白質之邮财量㈣疋上述mRNA之測定藉由聚合酶連鎖反應法而進行。從第八觀點言之，本發明尚提供篩選皮膚斑點形成抑制因子及/或皮膚斑點去除因子之方法，其特徵為評價候選化 :物抑制上述基因之表現及/或蛋白質（基因產物）之活性之月巨力，然後選定具有該抑制能力之抑 ⑷假局皮膚斑點形成抑制因子及/或皮膚斑點除去因子。在較佳態樣中，該方法尚包含將且右门G 3將具有上述抑制能力之制劑用於斑點形成模型動物中，然後、另反屑斑點形 96506.doc 1332511 成抑制效果及/或皮膚斑點除去效果之抑制劑。從第九觀點言之，本發明提供一種預知皮膚斑點形成用之皮膚檢查方法，其特徵為若在高度嚴苛條件下，可與表皮中由序列編號1所示之鹼基序列組成之聚核苷酸（Mm. 74656)雜交之聚核苷酸之表現，與其在正常表皮中之表現相較顯得亢進，則判定為易於形成斑點之皮膚。上述皮膚斑點形成之原因為UVB照射。在較佳態樣中’上述表皮中上述聚核#酸表現之宄進，精由測定與萃取自纟皮之上述聚核苦酸互補之mRNA之量而決定。上述mRNA之測定更佳藉由聚合酶連鎖反應而進行。從第十觀點言之，本發明尚提供筛選皮膚斑點形成抑制因子及/或皮膚斑點除去因子之方法，其特徵為評價候選化合物在高度嚴苛條件下，抑制可與表皮中之序列編…表示之驗基序列組成之聚核㈣（Mm 74656)雜交之聚核苦酸表現之此力’然後選定具有該抑制能力之抑制劑做為皮膚斑點形成抑制因子及/或皮膚斑點除去因子。雜交可以依照周知之方法或以其為基準之方法，例如在】Sambr〇〇k d ^， Molecular Cloning 2nd, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989 中揭不之方法進行’而且所謂高度嚴苛之雜交條件係指包 3鈉辰度為約1 〇至4〇 mM，較佳約2〇，溫度約5〇至7〇。匸，較佳約60至65°C之條件。依”、、本發明，可以提供預知皮膚斑點形成用之皮膚檢查方法。 96506.doc •15- 1332511 【實施方式】實施發明之最佳形態如上述’無有關小鼠AK012157基因、與該基因呈現高度同源性之大鼠S74257基因或人類FLJ21763基因以及上述基因群（1)至（3)與皮膚色素相關之報告。又，亦無有關小鼠及人類MCP-2與皮膚色素相關之報告。本發明者將施予紫外線照射之斑點模型小鼠中來自斑點部位及非斑點部位之各表皮之RNA藉由微陣列（microarray)解析，結果發現斑點部位之表皮中之AK012157基因、MCP-2基因及上述基因群（1) 至（3)中之基因之表現，與未形成斑點之部位相比，特異地亢進。因此，推認以此等基因做為基因指標，可預知皮膚斑點之形成。尤其，AK012157基因及MCP_2基因表現之亢進，在斑點模型小鼠之uv照射期並未出現，而係在uv照射終了後因UV照射產生之表皮褐色開始脫色之脫色期，以及在隨後斑點開始出現，形成斑點之色素斑形成期中才被見到。由於斑點模型小鼠之表皮中此等基因之表現，在脫色期中即顯得亢進，在人類中若亦以與此等基因相同之基因做為指標’則在斑點形成前之脫色期即可預知未來是否會形成斑點。斑點模型小鼠斑點核5M、鼠可依照先前揭示之M.…㈣麵氏等揭示之方式加以製作。簡單而言’例如將7週齡左右之小鼠在紫外光源（ToWba FL.SE ’ UVB)下，用％ mJ/cm2強度之紫外線照射（UV照射期），每週3次，共歷8週。於該w照射期間， 96506.doc 1332511 可見到皮膚之均勻色素沉積（皮膚之褐色化）β該色素沉積在 UV照射停止後2週左右幾乎完全消失（脫色期）。隨後，直徑約2 mm以下之微小淡茶色色素斑（所謂老人性色素斑樣之「斑點」）開始出現（色素斑出現及形成期）。預知皮膚斑點形成用之皮膚檢査方法本發明提供預知皮膚（以人類皮膚為較佳）斑點形成用之皮膚檢查方法。s亥方法之特徵為若表皮中之下列基因或聚核苷酸之表現，與其在正常表皮中之表現相較顯得亢進，則判疋為易形成斑點之皮膚：MCP-2基因或人類FLJ21763 基因’或者在命度嚴苛條件下與人類FLj2i763基因、小鼠入〖012157基因或大鼠374257基因可雜交之聚核苷酸；或者從表皮中之McP9、McplO、ISgi5、Uspl8、〇asl2、Gbp2、

Gtpi、Ifi47、Igtp、Tgtp、Sprr2A、Krt2-6b、Gdk5rap2、

Mef2C、Gsta4、〇sf2、TnC、Igfbp6 及 Ppicap 組成之群中選出之基因。其之判定基準，例如表皮中之]^(：：1)_2基因或人類FLJ21763基因，或者在高度嚴苛條件下與人類flj21763 基因、小鼠AK012157基因或大鼠S74257基因可雜交之聚核苷酸，或者從表皮中之Mcp9、MCpl〇、lSg15、Uspl8、〇asl2、

Gbp2、Gtpi、Ifi47、Igtp、Tgtp、SPrr2A、Krt2-6b、Gdk5rap2、

Mef2C、Gsta4、〇sf2、Tne、Igfbp6 及 ppicap 組成之群中選出之基因之表現，與其在對照表皮中之表現相較，若超過 10%以上、或20%以上、或3〇%以上、或5〇%以上、或7〇% 以上、或100%以上，則可判定為「易形成斑點之皮膚」。可檢查之皮膚，可為例如臉部、頭部、腕部或四肢等又 96506.doc 1332511 例如ELISA法或ria法等各種方法。又，從表皮萃取RNA可藉由測定該基因編螞之mRNA之量而決定。mRNA之萃取及其量之測定’亦為業界所周知，例如RNA之定量可藉由定量聚合酶連鎖反應法（PCR)而進行。在高度嚴苛條件下可與表皮中之上述基因雜交之聚核苷酸之表現’可藉由從表皮萃取RNA，測定對應於上述聚核苷酸之mRNA之量而決定。例如，表皮中之人類FLJ21763 基因，或在高度嚴苛條件下可與FLj2 1763基因、小鼠 AK012157基因或大鼠S74257基因雜交之聚核苷酸之表現，可藉由從表皮萃取RNA，測定對應於上述聚核苷酸之 mRNA之量而決定。mRNA之萃取及其量之測定，亦為業界所周知’例如RNA之定量可藉由定量聚合酶連鎖反應法 (PCR)而進行。如上述，本發明係基於在施予紫外線照射之斑點模型小鼠中，來自斑點部位及非斑點部位之各表皮中之RNA藉由微陣列（microarray)解析時，斑點部位之表皮中AK012157 基因、MCP-2基因、基因群（1)至（3)中之基因之表現，與其在未形成斑點之部位中之表現相較特異地亢進。因此，推認以抑制表皮中上述基因之表現及/或為此等基因產物之上述蛋白質之活性（例如抑制表皮中MCP-2基因之表現及/ 或MCP-2之活性、抑制表皮中人類FLJ21763基因之表現、或抑制在高度嚴苛條件下可與人類FLJ21 763基因、小鼠八〖012157基因或大鼠874257基因雜交之聚核苷酸之表現）為指標，將可以開發一種抑制皮膚之斑點形成及/或除去已 96506.doc 19 1332511 形成之斑點之藥劑。因此，本發明提供-種含有以抑制上述基因表現之抑制劑作為皮膚斑點形成抑制因子及/或皮膚斑點除去因子之醫藥或皮膚外用組合物。依照本發明之組成物可以預防皮膚斑點之形成.或除去斑點。作為抑制MCP-2之活性之抑制劑者，例如可列舉曰本特表2001.5 18296號公報中揭示之欠缺相當於天然Mcp_2之胺基酸1、1〜2、1〜3、丨〜4或^之^^2終端胺基酸，且具有化于趨向素拮抗劑活性之胺基終端切除型。又，MCP-2之抑制劑中，包含已知可與Mcp_2結合之 CCR-卜3或5受器之拮抗劑。CCR_3受器之拮抗劑例如被揭不於日本特開平H-U782號公報、特表2〇〇2_512957號公報、特表2002-512960號公報、特表2〇〇2_53〇374號公報、特表2002-512957號公報及2003-510248號公報中。其之具體例，例如可列舉： N {l-(S)-[4-(3,4-二氯苄基）哌畊q基甲基]_2_曱基丙基}·4-甲基苄醯胺二鹽酸鹽； N {l-(S)-[4-(3,4-二氣苄基）n底畊基曱基]_2,2·二甲基丙基} -4-甲基苄醯胺二鹽酸鹽； N {l-(S)-[4-(3,4-二氯苄基）哌啶小基曱基]_2甲基丙基卜4-曱基苄醯胺二鹽酸鹽； N-{l-(R)-[4-(3,4-二氯苄基）哌啶·i •基曱基]_2甲基丙基} 4-(2-胺基乙基）卞酿胺二鹽酸鹽； N {l-(R)-[4-(3,4-二氣苄基）哌啶」基曱基]_2_甲基丙 96506.doc •20· 1332511 基}-5-甲基塞吩-2-甲酿胺鹽酸鹽； l-{l-(R)-[4-(3,4-二氣苄基）哌畊-丨_基曱基;μ〗-甲基丙基}-3-(3_曱氧基笨基）尿素； ^^•(…-[‘^，“二氣苄基^底啶-^基甲基^-甲基丙基}-3-(3·曱氧基苯基）尿素； (S)-2-(4-甲基苯磺醯胺基）_3_(4_羥基苯基）丙酸乙酯； (S)-2-(5-二曱胺基萘_丨_磺醯胺基）_3_(4_羥基苯基）丙酸乙酯；

(S)-2-(萘-2-磺醯胺基）-3-(4-羥基苯基）丙酸乙酯； (S)-2-〇塞吩-2-磺醯胺基）-3-(4-羥基笨基）丙酸乙酯； (S)-2-(喹啉-8-磺醯胺基）-3-(4-羥基苯基）丙酸乙酯； (S)-2-(2,4,6-三曱基苯磺醯胺基）_3_(4-羥基苯基）丙酸乙

(S)-2-(4-溴苯磺醯胺基）_3_(4-羥基苯基）丙酸乙酯； (S)-2-(4-氯笨磺醯胺基）-3-(4-羥基苯基）丙酸乙酯； (S)-2-(4-甲氧基苯磺醯胺基）_3_(4-羥基苯基）丙酸乙酯； (S)-2-曱磺醯胺基_3-(4-羥基苯基）丙酸乙酯； (S)-2-[2-(E)-苯乙烯磺醯胺基]-3-(4-羥基笨基）丙酸乙酯； (S)-2-(3-三氟曱基苯磺醯胺基）_3_(4_羥基苯基）丙酸乙酯； (S)-2-(2,5-一鼠p塞吩-3·續酿胺基）-3-(4 -輕基苯基）丙酸乙 (3)-2-(2-溪苯確酿胺基）-3-(4-輕基苯基）丙酸乙0旨； (S)-2-[5-(2-吼啶基）嘍吩-2-磺醯胺基]-3-(4-羥基苯基）丙 96506.doc -21 · 酸乙酯； (S)-2-(l，3-二甲基-5-氣-2-吡唑啉-4-磺醯胺基）-3-(4-羥基苯基）丙酸乙酯； (S)-2-(4-聯苯磺醯胺基）-3-(4-羥基苯基）丙酸乙酯； (S)-2-(2-硝基-4-甲氧基苯磺醯胺基）-3-(4-羥基苯基）丙酸乙酯； (S)-2-(2,5-二氯苯磺醯胺基）-3-[4-(2,5-二氯苯磺醯氧基）苯基]丙酸乙酯； (S)-2-(2,4-二氟苯磺醯胺基）-3-[4-(2,4-二氟苯磺醯氧苯基）]丙酸乙酯； (S)-2-(5-二甲胺基萘-1-磺醯胺基）-3-(4-羥基苯基）丙酸乙醋； (S)-2-(嘍吩_2-磺醢胺基）-3-(4-羥基苯基）丙酸乙酯； (S)-2-(2,4,6-三甲基苯磺醯胺基）-3-(4-羥基苯基）丙酸己酯； (8)-2-(4 -臭苯確酿胺基）-3-(4 -輕基本基）丙酸乙S旨； (S)-2-(4-氯苯績酿胺基）-3-(4-經基本基）丙酸乙S旨； (S)-2-(4-甲氧基苯磺醯胺基）-3-(4-羥基苯基）丙酸乙酯； (S)-2-[2-(E)-苯乙烯基磺醯胺基]-3-(4-羥基苯基）丙酸乙酯； (s)-2-(3-三氟甲基苯磺醯胺基）-3-(4-羥基苯基）丙酸乙酯； (S)-2-(2,5-二氯u塞吩-3-續醢胺基）-3-(4-經基苯基）丙酸乙酯； 96506.doc -11· 1332511 (S)_2_(2'溴笨磺醯胺基）-3-(4-羥基苯基）丙酸乙酯； (S)_2-[5-(2·。比啶基）4吩-2-磺醯胺基]-3-(4-羥基苯基）丙酸乙酯； (S)-2-(2-硝基-4-甲氧基苯磺醯胺基）-3-(4-羥基苯基）丙酸乙酯； (S)-2-(2,5-二氣苯磺醯胺基）_3_[4-(2,5-二氣苯磺醯氧基）苯基]丙酸乙酯； (s)-2-(2,5-二氣嘍吩_3_磺醯胺基）-3-(4-羥基笨基）丙酸乙酯； (S)-2_(2-溴笨磺醯胺基)-3-(4-羥基笨基）丙酸乙酯； (S)-2-(2,5·二氯苯磺醯胺基）_3_[4-(2,5-二氣苯磺醯氧基）苯基]丙酸乙酯； (S)-2-(l-萘曱醯胺基）·3_(4_硝基苯基）丙酸乙酯； (S)-2-(b萘甲醯胺基）-3-(4-硝基苯基）丙酸異丙酯； (S)-2-(l-萘曱醯胺基）_3_(4_硝基苯基）丙酸甲酯； (S)-2-(l-萘子醯胺基）_3_(4_硝基苯基）丙酸苄酯； (S)-2-(l-萘甲醯胺基）_3_(4_氣苯基）丙酸乙酯； (S)-2-苄醯胺基-3-(4-羥基苯基）丙酸乙酯； (S，S)-2-(2-苄氧羰胺基-3_苯基丙酿胺基羥基苯基）丙酸乙S旨； (S，S)-2-(N-乙醯基D比咯啶·2·苄醯胺基）-3-(4-羥基苯基）丙酸乙酯； (S)-2-環己胺基-3-(4-羥基笨基）丙酸乙酯； (S)-2-(3,3-二笨基丙醯胺基）-3-(4-羥基苯基）丙酸乙酯； 96506.doc -23- 1332511 (S)-2-(3-苯基丙醯胺基）-3-(4-羥基苯基）丙酸乙酯； (S)-2-[2-(2-萘基）乙醯胺基-3-(4-羥基苯基）丙酸乙酯； (S)-2-(4-苯基丁醯胺基）-3-(4·羥基苯基）丙酸乙酯； (S)-2-戊胺基-3-(4-經基苯基）丙酸乙g旨； (S)-2-戊胺基-3-(4-經基笨基）丙酸乙醋；

(S)-2-(4-苄醯基苄醯胺基）-3-(4-羥基苯基）丙酸乙酯； (S)-2-(2-呋喃基）胺基-3-(4-羥基苯基）丙酸乙酯； (S)-2-(l-萘曱醯胺基）-3-(4-羥基苯基）丙酸乙酯； (8)-2-(5-羥基蚓哚基）胺基_3-(4-羥基苯基）丙酸乙酯； (S)-2-胡椒胺基-3-(4-經基苯基）丙酸乙酯； (S)-2-皮考啉胺基-3-(4-羥苯基）丙酸乙酯； (S)-2-(3-硝基-4-氯苄醯胺基）-3-(4-羥基笨基）丙酸乙酯； (S)-2-(3-羥基-4-硝基苄醯胺基）-3-(4-羥基苯基）丙酸乙酯； (S)-2-(8-喹啉胺基）-3-(4-羥基苯基）丙酸乙酯；

(S)-2-卞酿胺基-3 -苯基丙酸乙g旨； (S)-2·苄醯胺基-3-(4-羥基苯基）丙酸曱酯； (S)-2-苄醯胺基-3-(4-羥基苯基）丙酸苄酯； (S)-2·苄醯胺基-3-(4-甲氧基苯基）丙酸乙酯； (s)-2·第三丁氧羰胺基-3-(4-硝基苯基）丙酸乙酯； (s)-2-第三丁氧羰胺基_3-(4·胺基苯基）丙酸乙酯； (S)-2-苄醯胺基-3-(3，5-二碘_4_羥基苯基）丙酸乙酯； (S)-2-鲮基苄醯胺基-3·(4_羥基苯基）丙酸乙酯； (S)-2-苄醯胺基-3-(1-萘基）丙酸乙酯； 965〇6.doc -24- 1332511 (±)-2-苄醯胺基-3-[3-(苄醯氧基）苯基]丙酸乙酯； (土）-2 -卞酿胺基- 3- (3 -經基笨基）丙酸乙g旨； (R，S)-2-苄醯胺基-3-(2-羥基苯基）丙酸乙酯； (S)-2-卞酿胺基-3-(4-胺基苯基）丙酸乙g旨； (S)-2-卞酿胺基- 3- (4 -确基苯基）丙酸乙g旨； (S)-2-(2-苯基乙醯胺基）-3-(4-羥基苯基）丙酸乙酯； (S)-2-苄醯胺基-3-(3-吲β朵基）丙酸乙酯； (士）_2-(卞酿胺基）-2 -本基乙酸乙醋；

(±)-2-(卡酿胺基）-4 -苯基丁酸乙g旨； (S)-2-(I-萘甲醯胺基）-3-(4-硝基苯基）丙酸乙酯； (S)-2-苄醯胺基-3-(4-羥基笨基）丙酸乙酯； (S)-2-環己胺基-3-(4-羥基苯基）丙酸乙酯； (S)-2-(l-萘甲醯胺基）-3-(4-羥基苯基）丙酸乙酯； (S)-2-苄酿胺基-3-(4-經基苯基）丙酸苄酯； (S)-2-苄醯胺基-3-(4-甲氧基苯基）丙酸乙酯；

(S)-2-苄醯胺基-3-(1-萘基）丙酸乙酯； (±)-2-苄醯胺基-3-[3-(苄醯氧基）苯基]丙酸乙酯； (±)·2-苄醯胺基-3-(3-羥基苯基）丙酸乙酯； (R，S)-2-苄醯胺基-3-(2-羥基苯基）丙酸乙酯； (S)-2-苄醯胺基-3-(4-硝基苯基）丙酸乙酯； (±)-2-(苄醯胺基）-2-苯基乙酸乙酯； (±)-2-(苄醯胺基）·4-苯基丁酸乙酯； (S)-2-(l-萘曱醯胺基）-3-(4-硝基苯基）丙酸乙酯； (S)-2-(l-萘曱醯胺基）-3-(4-羥基苯基）丙酸乙酯； 96506.doc •25- 1332511 (S)-2-苄醯胺基-3-(4-硝基苯基）丙酸乙酯等。 CCR-1受器之拮抗劑例如於國際專利申請案公開公報 W0 97/24325、輝瑞公司（Pfizer, Inc.)之 WO 98/38 1 67、帝人 (股）公司之W0 97/44329 ;萬有製藥（股）公司之W0 98/045 54、默克公司（Merck & Co.，Inc.)之 W0 98/27815、 WO 98/25604、WO 98/25605、WO 98/25617 及 WO 98/31364、Leukosite，Inc.之 WO 98/02151 及 WO 99/37617、 Leukosite，Inc.等之 WO 99/37651 及 WO 99/37619、美國專利申請案第60/021,716號說明書（1996年7月12日申請）；美國專利申請案第09/146,827號說明書及第〇9/148,236號說明書 (1998年 9月 4日申請）；Hesselgesser氏等，J. Biol. Chem. 273 (25): 15687_15692 (1998)及 Howard 氏等，J. Medicinal

Chem· 4l(i3): 2184〜2193(1998)中記载之化合物。又’ CCR-5^：器之拮抗劑例如於日本特表2〇〇2_543186號公報中記載者。本發明之醫藥或皮膚用組合物，可適用例如水溶液、油

96506.doc -26- 1332511 去因子之里並無特別限制，然而舉例言之，基於組合物全量而言含有0.001 mM至1 μ，而以0.01至100 mM為較佳，以0.1至10 mM左右為更佳。此等劑型中’以洗液製劑、乳液劑、乳膏劑、軟紊劑、硬膏劑、敷料及氣溶膠劑等皮膚外用劑為適於本發明之目的之劑型。再者，其中之皮膚外用劑包含醫藥品、醫藥部外品（軟膏等）及化妝品[如洗面乳、乳液、乳膏、凝膠、香精（美容液）、化妝包.面臈等基礎化胺品，粉底或口紅等美容化妝品，及口腔化妝品、芳香化妝品、毛髮化妝品及身體化妝品等]。尤其，本發明之醫藥或皮膚外用組合物，以適用做為斑點預防化妝料者為較佳。本發明之醫藥或皮膚外用組合物中，除可依照所需劑空添加先前公知之賦型劑或巷斗立楚劁次香枓專之外，亦可適宜地添加油脂類、界面活性劑、防腐劑、金屬離子封鎖劑、水溶性高增黏劑、顏料等粉末成分、紫外線防紫劑、保渥劑、氣化防止劑、pH調整劑、咮逸态 .^ fJ洗淨劑、乾燥劑或乳化劑等。再本發明之醫藥或皮膚外用粗合物中添加其他藥效亦可在該添加無損於期望效果之範圍内進行。筛選皮膚斑點形成抑制因方法则四于及/或皮膚斑點除去因子之本發明尚提供一種籂還由膚斑心點形成抑制因子及/或皮贗斑點除去因子之方法。 φ, * , , ^ , + 人之特徵為評價候選化合物抑制表皮中之上述基因，例如Mc 者抑制在高度嚴苛條件下可表見及/或活性，或件下了與人類阳21763基因小鼠 96506.doc -27- 1332511 二:ι:157基因或大鼠S74257基因雜交之聚核苷酸之表現 :力；然後選定具有該抑制能力之抑制劑做為皮膚斑點 /成抑制因子及/或皮膚斑點除去因子。处在較佳之形態中，上述篩選方法尚包含將具有上述抑制 t*力之上述抑制劑用於斑點模型動物中，然後選定具有皮膚斑點形成抑制效果及/或皮膚斑點除去效果之抑制劑。上述抑制劑對於皮膚斑點形成抑制效果及/或皮膚斑點除去效果之確認步驟，可藉由將該抑制劑使用於斑點模型動物（例如斑點模型小鼠）而實施。該動物除小鼠外，亦可利用大鼠或兔等各種動物。在較佳形態中’於調製該抑制劑之溶液（例如水溶液）後，重覆塗布於皮膚斑點模型動物之皮膚’藉由評價斑點之形成，判定有無上述效果。以下’舉出具體例更具體地說明本發明。不過本發明並受此等限定。實施例斑點模型小鼠之製作斑點模型小鼠如先前揭示之M. Naganuma氏等記載之方式製作。簡單言之，將7週齡之小鼠在紫外光源（Toshiba FL-SE ’ UVB)下，照射99 mJ/cm2強度之紫外線（UV照射

期）’母週3次’經歷8週。週齡15至23週（UV照射期終了後約8週為止）之間進入脫色期，週齡23至35週（UV照射期終了後約18至30週後）之間進入色素斑出現期，週齡35至52週 (UV照射期終了後約30至47週後）之間進入色素斑形成期。從皮膚採取RNA 96506.doc -28· 相對於各對照組之變 uv照射期脫色g動率 4-7 138 色素斑形成期 5·3 5·5 6 4 6.4

表I MCP-2 AK012157 J〇 6 4 _位或_射部位當做1 比及脫色期心色素斑形成期㈣之平均值）。…射期表2 基因名稱 Mcp9 Mcp 10 Isgl5 Uspl8 Oas 12 Gbp2 Gtpi Ifi47 Igtp Tgtp Sprr2 A Krt2-6b Gdk5rap2 Mef2C Gsta4 Osf2 Tnc Igfbp6 Ppicap Mcp-6 Mm.74656 斑點部位/非斑點部位（n=4) 3.9 3.6 4.1 2 2 6 23.3 .4 12.4 4, 2 96506.doc *31- 1332511

PT-PCR

將從皮膚（斑點部位、非斑點部位之表皮或真皮）採取之 RNA各 1 gg與寡聚 dT引子（24 mer) 100 pmol (Sigma)—起於 70°C反應10分鐘（總容量20 μΐ)。然後，添加5x第一鏈反應緩衝液4 μΐ、0.1 M DTT 2 /xl、2.5 mM dNTP混合物 4 jLd、 Superscript II 1 /il(全為 Invitrogen公司製），於 42°C 反應 1 小時。最後於70 °C延長反應10分鐘，調製cDNA模板 (template)。將 rTaq用 10x緩衝液5 μΐ、25 mM MgCh 3 /xl、 2.0 mM dNTP混合物 5 μΐ、rTaq 0·5 μΐ(全為 Toyobo公司製）、 ddH20 33.5 μ卜cDNA模板各1 μ、意義及反義引子（參照下列序列）各20 mM 1 μ1(總容量50 μΐ)全部加入，進行PCR反應[94°C 2分鐘，（94°C 30秒、55°C 30秒、72°C 1 分鐘）共30個循環，72°C 10分鐘]。 MCP-2引子序列意義 TTCTTTGCCTGCTGCTCATA (序列編號4)

反義 GACAAGGATGAGAAAACACG (序列編號 5) AK012157引子序列意義 ACTCCGGCTCCTTCACTATG (序列編號 6) 反義 CTTTGGAATGAGGACTTGGA (序歹ij 編號 7) 最後，於含有1.5%溴化乙鍵（ethidium bromide)之瓊脂糖凝膠中進行電泳，得到約300 bp之帶區（band) »結果如圖3 所示。從圖3明顯地發現AK012157基因及MCP-2基因在表皮之斑點部位中顯著地表現，而在表皮之非斑點部位中幾乎沒有表現。又，在真皮中任一種之表現均無差異。 96506.doc -32- 1332511 原位雜交（ISH) 將小鼠皮膚組織用10%中性福馬林固定，石蠟包埋後，依照吊法製成組織切片之薄片。將其使用Ventana公司HX 系統自動薄片處理機，進行原位雜交反應（規程（pr0t0C0l): Japan open blue 8.0)。將組織切片密封（bl〇cking)並以蛋白酶處理（前處理）後，與使用T7聚合酶從ΑΚ01215 7序列做成之Dig標記之核糖探針（Rib〇pr〇be) 500 ng，在68。(：進行6小時雜交。之後洗淨，與Anti-Dig-鹼性磷酸酯酶反應並洗淨後，使用基質NBT/BCIP使之呈色並封入，用光學顯微鏡觀察。結果如圖4所示。從圖4可明顯地發現AK〇丨2丨57基因在表皮之斑點部位中顯著地表現，而在表皮之非斑點部位中幾乎沒有表現。免疫組織染色（IHC) 將小鼠皮膚組織用中性福馬林固定並以石蠟包埋後，依照常法製成組織切片。將其用1 % H2〇2處理丨5分鐘後，進行 30分鐘密封’使其與1/50稀釋之抗小鼠Mcp2抗體（R&D系統公司製）進行一晝仪反應。將其藉由酪胺醯胺（tyramide)增感法（TSA系統，Perkin Elmer公司製）套組進行檢測。洗淨後，與附有HRP之二次抗體反應並洗淨，及與FITC標記之酪胺醯胺（tyramide)反應並洗淨，包埋，用螢光顯微鏡進行觀察。結果如圖5所示。從圖5可明顯地發現河(：1>_2基因在表皮之斑點部位中顯著地表現，而在表皮之非斑點部位令幾乎沒有表現。 96506.doc •33- 1332511 序列表 <110〉資生堂公司 <12°:SSiSi標之皮膚斑點形成之預知 <130> P871 <140〉093129918 <141〉2004-10-01 <160> 3 <150> JP 2003-343549 <151〉 2003-10-01 <150> JP 2003-344786 <151〉 2003-10-02 方法、皮膚

<210〉 1 <211〉 758 <212> DNA <213〉小鼠 <400〉 1 aaaccntttt cgtggcacag cttcctccct gacttctagc cctttccggt ctgctctgca cagaagggag aagacatcct gccaagtcct ctagatccaa gctgacaacc tggaaaggaa acaagctacc agtcaagtca tgggtggtgc tccgcccaga tgaagcgttg atgcccagat tgccttgccc cttgccaatg agctgtgaca gatggattgc agaattccaa gtcctcattc aggtccaggc tcagcccaca agtcaccatg cctgtgggag ctacagatcc agagactttc tcagtgtgat cagccgagac tacagcatct acacttaacc actggtctcc aaaccaacac ataccaaaag aaataaacca taaatcagca aggcgtgaga ctccggctcc ttcactatga tgctgctcct ctgtttctgc attttctcct tgaaactcag gcgctgctgt cacctatctc accacacaag gccctgcaga ctctgcagaa ctggggctct cccacagata tagggcctcc gtggagacac cagaagcata cacactatgt ctggaatgct tcacttcaga catcagggcg caaaggtgtc accaaccttc agagtcacta gctcctccag agtaaaagtc caagattcca aagctgacta gagtgcagag aagcaagacc tgggaaccct cagtcagccc caaaccccta ctgtaacttc ctaatgaaat catcaggagg tacacacg 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720

<210〉 2 <211〉 2063 <212> DNA 96506.doc 758 1332511 <213〉人 <400〉 2 ctctgcccat tgggaaacac ctctctatga ctctataaat gtccaaggtg gccccaaggg 60 aggacttctg cagcacagct cccttcccag gacgtgaaaa tctgccttct caccatgagg 120 cttctagtcc tttccagcct gctctgtatc ctgcttctct gcttctccat cttctccaca 180 gaagggaaga ggcgtcctgc caaggcctgg tcaggcagga gaaccaggct ctgctgccac 240 cgagtcccta gccccaactc aacaaacctg aaaggacatc atgtgaggct ctgtaaacca 300 tgcaagcttg agccagagcc ccgcctttgg gtggtgcctg gggcactccc acaggtgtag 360 cactcccaaa gcaagactcc agacagcgga gaacctcatg cctggcacct gaggtaccca 420 gcagcctcct gtctcccctt tcagccttca cagcagtgag ctgcaatgtt ggagggcttc 480 atctcgggct gcaaggaccc tgggaaagtt ccagaactcc acgtccttgt ctcaattgtg 540 ccatcaactt tcagagctat catgagccaa cctcagcctt ccgagtagct gggattacag 600 gtgtgcgcca ccacacccgg ctaatttttg cttttttttt ttttgagaca gaatctcgct 660 ctgttgctca ggctggagtg gagtgcagtg gcacgatctc agctcactgc agcctctgcc 720 tcccgggttc aggagattct cctgactcaa cctcctgagt agctgggatt acaggtgcct 780 gccactatgc ctagctaatt tttgtatttt tagtggagac ggggttttgc cgtgttggcc 840 ggggtggtct cgaactcctg acctcaagtg atccacccgc atcggccccc caaagtgctg 900 ggattatagg cgtgaaccac cgcgcctgtc ccattgttgt gtaattttaa taattagttt 960 tttaagtact tgattttatg ggcacatttt tgtgggatga ttggagttaa tcaaataaag 1020 cttgtcatgt gtgtagtttg gtaagataac ttctttaaat tcatgttttc tctgccttga 1080 ggtagtgagg gaaagatctt aatcagtatt ttggtaatta actgattgaa ttcaagcaaa 1140 tgagacatca tgaacttcag tggttattga tatttcaggg tatatacctg aaatgcctag 1200 aggatacaga tttctcattt cattctttgg tctttcattt ctctatatac agaaatgaaa 1260 tgacacttct gggaggcagt agaagcagga agtcaatgaa ttgagtagag ggtcccattc 1320 cctcaggctg tcattgatca gtgacaattt ataaaaacaa actgcaaagt ctgtggcaag 1380 tggctgcctg cttcctagaa ggagcccatg aaggttaaac tctgtggtcg gtatttgcaa 1440 gcgccgggcg tggtggctca cgcctgtaat cctagcacct tgggaggcca aggcaggcgg 1500 atcacccgag gtcaggagtt tgaggatttg caagcaaaag gtcctctcct gagtctttcc 1560 cagataccca gcagtgcaga ggctagctgt ggaaggttgc agtgggacag gaatgtattg 1620 tatgccttgc cttacttgtc accattgaga tttccagaga aatgggcata ac-gtctctta 1680 acaacaacag cagaaagcaa aatacattaa cttaaggttg acaacaaaag attatcaagt 1740 accatgtttt ccaaccaacc agttattcgt ggtaataata aaataaaggt gggaaaatgt 1800 tataattttt aaggaaactg tgtactttaa aaatcttctt tatgaatatc caatgttact 1860 gtaatcctgc tccattaaat gcagcattgt tgtcaggtgc tgcctcttgc ttgggaacag 1920 cattgggctt ttaaatgtct gcagaatctc tgcgttcgaa gggaattgag aatgaacttc 1980 ctggtactgt aatgaaaata aggtctgctc aacacagtaa acgtttcctc tcttctttaa 2040

96506.doc 1332511 2063 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa <210〉 3 <211〉 742 <212> DNA 〈213〉大鼠 <400〉 3 tttttttgtg ccactgcttc ctctctagcc gtgagactcc agctacttca ctatgcgact 60 tctcaccctc tccggtttgt tcttcatgct gttcctctgt ctctgcgttc tctcctcaga 120 agggagaaag cgtcctgcca agttcccgaa actcaggcct gctgtcatct atctcctaga 180 tccaaaccaa taactggaaa ggaaaccaca caagaccctg cagaccatgc agaaagctag 240 aatccaattc atggggtggt gcctggggct ctcccacaga tatagggcct cccgaagctg 300

gcctccaccg agatgaaacg ttgatgtcca gttatggaga caaccttctg gcccctacca 360 accttcatgg ccagaaagct gtgacaccag aatgtttcac ttcagacagc tgaaggatta 420 cagaattcca agccctcgtt ccaaaggtgc aaccaacctt cagagtcact atgatccagg 480 gtcagcccac aagtcttcat ggctcctgca gagtaaaagt ccaagattcc atccctggga 540 gctacagatt cagagacttc caagctgact ggcgaacaga gtagcaagac ttccttgtga 600 tcagatgaga ttacagcatc ttaggaaccc tcggacaccc ccaaacccat agcatttaat 660 caacgggata tgaaccaact cctgtaactt cctaatgtaa tcaccaggag aacaccaaaa 720 ataataaatc ataaatcaat gt 742

<210〉 4 <211> 20 <212〉 DNA 〈213〉人造序列 <223〉意義引子 <400> 4 20 ttctttgcct gctgctcata <210〉 5 <211〉 20 <212> DNA <213〉人造序列 <223〉反義引子 <400〉 5 gacaaggatg agaaaacacg 96506.doc 20 1332511 <210> 6 <211> 20 <212〉 DNA <213〉人造序列 <223〉意義引子 <400〉 6 20 actccggctc cttcactatg <210〉 7 <211> 20 <212> DNA <213〉人造序列 <223〉意義引子 <400〉 7 20 ctttggaatg aggacttgga 96506.doc 4-

Claims

月丨丨曰修正本 129918號專利申請案請專利範圍替換本(99年6f 申請專利範圍一種預知皮膚斑點形成用之皮膚檢查方法，該方法之特徵為若表皮中之MCP2(單核球化學誘引蛋白質_2， monocyte chemoattracting protein 2)之表現與正常表皮中之表現相較顯得亢進，則判定為易於形成斑點之皮膚。 2.如請求項1之方法，其中該皮膚斑點之形成係以UVB照射為原因。 3·如請求項1之方法’其中在該表皮中MCP2之表現亢進係藉由測定表皮中MCP2之量而決定。

4. 如请求項2之方法，其中在該表皮中MCP2之表現亢進係藉由測定表皮中MCP2之量而決定。 5. 如請求項3之方法，其中該測定係藉由使用對Mcp2具特異性之抗體之ELISA法或RIA法而進行。 6. 如吻求項4之方法，其中該測定係藉由使用對MCp2具特異性之抗體之ELISA法或RIA法而進行。 7. 如2求項1至4中任一項之方法，其中該表皮中MCP2之表現几進係藉由測定從表皮中抽出之編碼Mcp22 之參量而決定。 8. 9. 如請求項7之方法，其中該顯之測定係藉由聚合酶丄鎖反應法而進行。一種於活體料選皮膚斑點形成抑制因子及/或皮膚斑· 牙、因子之方法’該方法之特徵為評價候選化合物抑， MCP2之表現及/或活性之能力，後選^具有該抑制能；之MCP2抑制劑作為皮膚斑點形成抑制因子及/或皮心點除去因子。 96506-9906ll.doc