JP6576203B2 - 被験物質の評価方法 - Google Patents
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さらに、メントール単独での鎮痛効果は十分ではないことから、より優れた鎮痛効果を発揮する処方の開発が求められている。
(1) 被験物質がメントールによるTRPV1活性抑制作用を増幅させる作用を有する物質であるかどうかを評価する被験物質の評価方法であって、TRPV1発現細胞を、被験物質とTRPV1アゴニストとメントールとを含有する被験試料およびTRPV1アゴニストとメントールとを含有する比較試料のそれぞれに接触させ、前記被験試料の接触前後のTRPV1発現細胞の細胞内カルシウム濃度の変化と、前記比較試料の接触前後のTRPV1発現細胞の細胞内カルシウム濃度の変化とを測定し、前記被験試料の接触前後のTRPV1発現細胞の細胞内カルシウム濃度の変化と前記比較試料の接触前後のTRPV1発現細胞の細胞内カルシウム濃度の変化とに基づき、前記被験物質がメントールによるTRPV1活性抑制作用を増幅させる物質であるかどうかを評価する被験物質の評価方法であり、前記被験試料および比較試料のそれぞれにおけるメントールの濃度が10mM以下であることを特徴とする被験物質の評価方法、ならびに
(2) 前記被験試料および比較試料のそれぞれにおけるメントールの濃度が少なくとも3mMである前記(1)に記載の評価方法
に関する。
(I)配列番号:2に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードし、コードされるポリペプチドが、前記TRPV1の生理学的機能の少なくとも1種を発現するポリペプチドである核酸、
(II)配列番号:2において、1個または数個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列をコードし、コードされるポリペプチドが、前記TRPV1の生理学的機能の少なくとも1種を発現するポリペプチドである核酸、
(III)配列番号:1に示される塩基配列中の276位〜2795位からなる塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつ前記TRPV1の生理学的機能の少なくとも1種を少なくとも発現するポリペプチドをコードする核酸、
(IV)配列番号:1に示される塩基配列中の276位〜2795位の配列からなる核酸とオルタナティブスプライシングを介して異なる塩基配列からなり、かつ前記TRPV1の生理学的機能の少なくとも1種を発現するポリペプチドである核酸(以下、「スプライシングバリアント」という)
などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されない。
a)カルシウムイオンと特異的に結合するカルシウム指示薬をTRPV1発現細胞に導入するステップ、
b)前記ステップa)でカルシウム指示薬が導入されたTRPV1発現細胞内のカルシウムイオンに前記カルシウム指示薬を結合させ、カルシウムイオンと結合したカルシウム指示薬の量を継時的に測定する方法などによって測定することができる。
前記Δ蛍光強度比メントールは、式(III):
ヒトTRPV1をコードするcDNA〔配列番号:3(GenBankアクセッション番号:MN_080704.3)に示される塩基配列の276位〜2795位のポリヌクレオチド〕を、哺乳動物細胞用ベクター〔ライフテクノロジーズ(Life Technologies)社製、商品名:pcDNA3.1(+)〕のクローニングサイトに挿入し、ヒトTRPV1発現ベクターを得た。得られたヒトTRPV1発現ベクター1μgと、遺伝子導入用試薬〔ライフテクノロジーズ社製、商品名:PLUS Reagent〕6μLとを混合し、混合物Iを得た。また、遺伝子導入用カチオン性脂質〔ライフテクノロジーズ社製、商品名:Lipofectamine(登録商標) Transfection Reagent〕4μLと、血清使用量低減培地〔インビトロジェン社製、商品名:Opti−MEM(登録商標) I Reduced Serum Medium〕200μLとを混合し、混合物IIを得た。
カプサイシンをその濃度が0.1μMとなるように溶媒A〔組成:140mM塩化ナトリウム、5mM塩化カリウム、2mM塩化マグネシウム、2mM塩化カルシウム、10mMグルコースおよび10mMヘペス塩酸緩衝液(pH7.4)〕に溶解させ、カプサイシン含有試料料を得た。
メントールおよびカプサイシンをメントールの濃度が5mMおよびカプサイシンの濃度が0.1μMとなるように溶媒Aに溶解させ、カプサイシン−メントール含有試料を得た。
メントールをその濃度が0.03mM(製造例4)、0.1mM(製造例5)、0.3mM(製造例6)、1mM(製造例7)、3mM(製造例8)または10mM(製造例9)となるように溶媒Aに溶解させ、メントール含有試料を得た。
製造例3において、メントールをその濃度が0.03mM(製造例10)、0.1mM(製造例11)、0.3mM(製造例12)、1mM(製造例13)、3mM(製造例14)または10mM(製造例15)となるように溶媒Aに溶解させたことを除き、製造例3と同様の操作を行ない、カプサイシン−メントール含有試料を得た。
製造例1で得られたTRPV1発現細胞を溶媒A中、37℃で2分間振盪させながらインキュベーションすることにより、TRPV1発現細胞を洗浄した。つぎに、洗浄後のTRPV1発現細胞を溶媒Aが入った循環定温チャンバーに入れた。循環定温チャンバー中のTRPV1発現細胞に、電極の先端を接触させ、電流記録ソフトウェア〔モルキュラーデバイス社製、商品名:pCLAMP10〕と電流記録装置〔モルキュラーデバイス社製、商品名:Axopatch 200B Amplifier〕とを用い、電圧を−60mVに固定したときの電流変化を測定した。測定開始時から30秒間経過後に、TRPV1発現細胞が入った循環定温チャンバー内において、製造例2で得られたカプサイシン含有試料を循環させることにより、TRPV1発現細胞をカプサイシンに曝露した。前記カプサイシン含有試料循環開始時から20秒間経過後に、TRPV1発現細胞が入った循環定温チャンバー内において、製造例3で得られたカプサイシン−メントール含有試料を循環させることにより、TRPV1発現細胞をカプサイシンとメントールとに曝露した。前記カプサイシン−メントール含有試料循環開始時から15秒間経過後に、TRPV1発現細胞が入った循環定温チャンバー内において、製造例2で得られたカプサイシン含有試料を循環させることにより、TRPV1発現細胞をカプサイシンに曝露した。前記カプサイシン含有試料循環開始時から30秒間経過後に、電流変化の測定を終了した。
(1)FURA 2−AM導入TRPV1発現細胞の調製
製造例1で得られたTRPV1発現細胞を、細胞内カルシウムイオン測定用試薬であるFURA 2−AM(ライフテクノロジーズ社製)を最終濃度5μMで含む10質量%FBS含有DMEM中、室温(25℃)で60分間インキュベーションすることにより、前記TRPV1発現細胞にFURA 2−AMを導入し、FURA 2−AM導入TRPV1発現細胞を得た。
参考例2(1)で得られたFURA 2−AM導入TRPV1発現細胞を循環定温チャンバー付蛍光測定装置〔浜松ホトニクス(株)製、商品名:ARGUS−50〕の循環定温各チャンバーに入れた。その後、各チャンバー中のFURA 2−AM導入TRPV1発現細胞を、溶媒Aで洗浄した。以下において、循環定温チャンバーにおいて、励起波長340nmにおけるTRPV1発現細胞に導入され、かつ細胞内のカルシウムイオンに結合したFURA 2−AMに基づく蛍光の強度(以下、「蛍光強度340nm」という)および励起波長380nmにおけるTRPM1発現細胞に導入されたFURA 2−AMに基づく蛍光の強度(以下、「蛍光強度380nm」という)を経時的に測定した。
FURA 2−AM導入TRPV1発現細胞をカプサイシンのみに曝露したときの測定された蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmから、Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。前記Δ蛍光強度比アゴニストは、式(VI)に基づいて算出した。なお、前記対照は、溶媒Aである。
メントール、被験物質としてのポリエチレングリコール(オキシエチレン基の平均付加モル数が1500;以下、「PEG1500」いう)およびカプサイシンをメントールの濃度が5mM、PEG1500の濃度が0.01質量%およびカプサイシンの濃度が0.1μMとなるように溶媒Aに溶解させ、被験試料を得た。
製造例16において、被験物質としてPEG1500を用いる代わりにポリエチレングリコール(オキシエチレン基の平均付加モル数が1500;以下、「PEG400」いう)を用いたことを除き、製造例16と同様の操作を行ない、被験試料および比較試料を得た。
メントール、被験物質としてのエタノールおよびカプサイシンをメントールの濃度が5mM、エタノールの濃度が1Mおよびカプサイシンの濃度が0.1μMとなるように溶媒Aに溶解させ、被験試料を得た。
製造例18において、被験物質としてエタノールを用いる代わりにプロピレングリコールを用いたことを除き、製造例18と同様の操作を行ない、被験試料および比較試料を得た。
メントール、被験物質としてのカプサゼピンおよびカプサイシンをメントールの濃度が5mM、カプサゼピンの濃度が1μMおよびカプサイシンの濃度が0.1μMとなるように溶媒Aに溶解させ、被験試料を得た。
製造例20において、被験物質としてカプサゼピンを用いる代わりにルテニウムレッドを用いたことを除き、製造例20と同様の操作を行ない、被験試料および比較試料を得た。
メントールをその濃度が5mMとなるように溶媒Aに溶解させ、メントール含有試料を得た。
(1)FURA 2−AM導入TRPV1発現細胞の調製
参考例2(1)と同様の操作を行ない、FURA 2−AM導入TRPV1発現細胞を得た。
実施例1(1)で得られたFURA 2−AM導入TRPV1発現細胞を循環定温チャンバー付蛍光測定装置〔浜松ホトニクス(株)製、商品名:ARGUS−50〕の各循環チャンバーに入れた。その後、各チャンバー中のFURA 2−AM導入TRPV1発現細胞を、溶媒Aで洗浄した。以下において、循環定温チャンバーにおいて、蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmを経時的に測定した。
FURA 2−AM導入TRPV1発現細胞をカプサイシンのみに曝露したときの測定された蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmを用い、式(VI)に基づいてΔ蛍光強度比アゴニストを算出した。
実施例1(3)で算出されたΔ蛍光強度比アゴニストおよびΔ蛍光強度比被験物質を用い、抑制率被験物質を算出した。抑制率被験物質は、式(IV)に基づいて算出した。また、実施例1(3)で算出されたΔ蛍光強度比アゴニストおよびΔ蛍光強度比メントールを用い、抑制率メントールを算出した。抑制率メントールは、式(V)に基づいて算出した。算出された抑制率被験物質および抑制率メントールを用い、抑制比率を算出した。抑制比率は、式(VII)に基づいて算出した。
Claims (2)
- 被験物質がメントールによるTRPV1活性抑制作用を増幅させる作用を有する物質であるかどうかを評価する被験物質の評価方法であって、TRPV1発現細胞を、TRPV1アゴニストと被験物質とメントールとを含有する被験試料およびTRPV1アゴニストとメントールとを含有する比較試料のそれぞれに接触させ、前記被験試料の接触前後のTRPV1発現細胞の細胞内カルシウム濃度の変化と、前記比較試料の接触前後のTRPV1発現細胞の細胞内カルシウム濃度の変化とを測定し、前記被験試料の接触前後のTRPV1発現細胞の細胞内カルシウム濃度の変化と前記比較試料の接触前後のTRPV1発現細胞の細胞内カルシウム濃度の変化とに基づき、前記被験物質がメントールによるTRPV1活性抑制作用を増幅させる物質であるかどうかを評価する被験物質の評価方法であり、前記被験試料および比較試料のそれぞれにおけるメントールの濃度が10mM以下であることを特徴とする被験物質の評価方法。
- 前記被験試料および比較試料のそれぞれにおけるメントールの濃度が少なくとも3mMである請求項1に記載の評価方法。
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