JP5548498B2 - 皮膚外用剤の評価方法 - Google Patents
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(1) アルコールを含む皮膚外用剤の評価方法であって、前記皮膚外用剤を、TRPA1発現細胞、TRPV1発現細胞およびTRPA1−TRPV1共発現細胞からなる群より選ばれた少なくとも1種と接触させ、前記皮膚外用剤によりTRPA1を介して引き起こされる生理学的事象および/または前記皮膚外用剤によりTRPV1を介して引き起こされる生理学的事象を測定することを特徴とする皮膚外用剤の評価方法、
(2) 生理学的事象が、前記皮膚外用剤との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化である前記(1)に記載の評価方法、
(3) 前記皮膚外用剤との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化の度合いをヒトの皮膚に対する前記皮膚外用剤の刺激の強さの指標として用い、ヒトの皮膚に対する前記皮膚外用剤の刺激の強さごとに前記皮膚外用剤を分類する前記(1)または(2)に記載の評価方法、ならびに
(4) 前記皮膚外用剤との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化の度合いをヒトの皮膚に対する前記皮膚外用剤の刺激の強さの指標として用い、ヒトの皮膚に対する前記皮膚外用剤の刺激を評価する前記(1)または(2)に記載の評価方法
に関する。
本発明の皮膚外用剤の評価方法は、アルコールを含む皮膚外用剤の評価方法であって、前記皮膚外用剤を、TRPA1発現細胞、TRPV1発現細胞およびTRPA1−TRPV1共発現細胞からなる群より選ばれた少なくとも1種と接触させ、前記皮膚外用剤によりTRPA1を介して引き起こされる生理学的事象および/または前記皮膚外用剤によりTRPV1を介して引き起こされる生理学的事象を測定することを特徴とする。
(A)配列番号:1に示される塩基配列に対して、BLASTアルゴリズムにより、Cost to open gap 11、Cost to extend gap 1、expect value 10、wordsize 11の条件でアライメントして算出される配列相同性の値が、それぞれの生理学的機能を十分に発揮させる観点から、好ましくは60%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上である塩基配列からなり、かつコードされるポリペプチドが少なくとも前記生理学的機能を発現するポリペプチドである核酸、
(B)配列番号:2において、1個または数個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列をコードし、コードされるポリペプチドが少なくとも陽イオンを透過させる機能を発現するポリペプチドである核酸、
(C)ストリンジェントな条件下で、配列番号:1に示される塩基配列からなる核酸に対する相補鎖核酸とハイブリダイズし、コードされるポリペプチドが、陽イオンを透過させる機能を発現するポリペプチドである核酸
などが挙げられる。
(a)配列番号:3に示される塩基配列に対して、BLASTアルゴリズムにより、Cost to open gap 11、Cost to extend gap 1、expect value 10、wordsize 11の条件でアライメントして算出される配列相同性の値が、それぞれの生理学的機能を十分に発揮させる観点から、好ましくは60%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上である塩基配列からなり、かつコードされるポリペプチドが少なくとも前記生理学的機能を発現するポリペプチドである核酸、
(b)配列番号:4において、1個または数個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列をコードし、コードされるポリペプチドが少なくとも前記生理学的機能を発現するポリペプチドである核酸、
(c)ストリンジェントな条件下で、配列番号:3に示される塩基配列からなる核酸に対する相補鎖核酸とハイブリダイズし、コードされるポリペプチドが、前記生理学的機能を発現するポリペプチドである核酸
などが挙げられる。
=〔(皮膚外用剤存在下での蛍光強度340nm/皮膚外用剤存在下での蛍光強度380nm−対照存在下での蛍光強度340nm/対照存在下での蛍光強度380nm)〕
÷〔(アゴニスト存在下での蛍光強度340nm/アゴニスト存在下での蛍光強度380nm−対照存在下での蛍光強度340nm/対照存在下での蛍光強度380nm)〕 (I)
ヒトTRPA1をコードするcDNA〔配列番号:1(GenBankアクセッション番号:NM_007332)に示される塩基配列の63位〜3888位のポリヌクレオチド〕を、哺乳動物細胞用ベクター〔インビトロジェン社製、商品名:pcDNA3.1(+)〕のクローニングサイトに挿入し、ヒトTRPA1発現ベクターを得た。得られたヒトTRPA1発現ベクター1μgと、遺伝子導入用試薬〔インビトロジェン社製、商品名:PLUS Reagent(プラスリージェント)、カタログ番号:11514−015〕6μLとを混合し、混合物Iを得た。また、遺伝子導入用カチオン性脂質〔インビトロジェン社製、商品名:リポフェクタミン(登録商標)、カタログ番号:18324−012〕4μLと、血清使用量低減培地〔インビトロジェン社製、商品名:OPTI−MEM(登録商標)I Reduced−Serum Medium(カタログ番号:11058021)200μLとを混合し、混合物IIを得た。
製造例1において、ヒトTRPA1をコードするcDNAの代わりにヒトTRPV1をコードするcDNA〔配列番号:3(GenBankアクセッション番号:MN_080704.3)に示される塩基配列の276位〜2795位のポリヌクレオチド〕を用いたことを除き、製造例1と同様にしてTRPV1発現細胞を得た。
(1)TRPA1発現細胞による評価
製造例1で得られたTRPA1発現細胞を、細胞内カルシウムイオン測定用試薬であるFURA 2−AM(インビトロジェン社製)を最終濃度5μMで含む10質量%ウシ胎仔血清含有DMEM培地中、室温で60分間インキュベーションすることにより、前記TRPA1発現細胞にFURA 2−AMを導入し、FURA 2−AM導入TRPA1発現細胞を得た。
前記(1)において、製造例1で得られたTRPA1発現細胞の代わりに製造例2で得られたTRPV1発現細胞を用い、アゴニストとして、TRPV1に対する既知のアゴニストであるカプサイシン(1μMカプサイシン水溶液)を用いたことを除き、前記(1)と同様にして、Δ蛍光強度比試料/Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。その結果を表2に示す。
頸部の耳下部を濡れタオルで軽く拭いて皮脂汚れなどを除去した20歳代から30歳代の女性11名の被験者を、室温21〜23℃、相対湿度45〜60%の試験室内で約10分間馴化させた。
刺激には、チクチクとした痛み、ヒリヒリとした痛みおよび灼熱感が含まれる。そこで、本刺激の評価方法においては、チクチクとした痛み、ヒリヒリとした痛みおよび灼熱感を刺激として評価に用いた。
0点:刺激をまったく感じない。
1点:かすかな刺激を感じる。
3点:はっきりとした刺激を感じる。
5点:我慢できない刺激を感じる。
被験者のなかから、試験用シートについて、前記平均値が2以上であり、かつ対照シートについて、前記平均値が1以下である被験者をスティンガーとして採用した。
前記(3)で選ばれたスティンガーを被験者とし、試料として、50体積%エチルアルコール水溶液、50体積%プロピレングリコール水溶液または50体積%グリセリン水溶液を用い、前記(3)と同様にして刺激の強さを評価した。その結果を表3に示す。
前記(1)で算出されたTRPA1発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料/Δ蛍光強度比アゴニスト(表1を参照)と前記(4)のスティンギングテストによる頸部におけるスティンギングスコア(最大値)の平均値(表3を参照)とを、試料ごとにプロットし、頸部におけるスティンギングスコア(最大値)の平均値とTRPA1発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料/Δ蛍光強度比アゴニストとの関係を調べた。実施例1において、頸部におけるスティンギングスコア(最大値)の平均値とTRPA1発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料/Δ蛍光強度比アゴニストとの関係を図1に示す。
(1)TRPA1発現細胞による評価
実施例1の(1)において、試料として、前記溶媒Aによって、エチルアルコールをエチルアルコール濃度が1Mとなるように希釈した溶液、前記溶媒Aによって、プロピレングリコールをプロピレングリコールが1Mとなるように希釈した溶液、前記溶媒Aによって、グリセリンをグリセリン濃度が1Mとなるように希釈した溶液または前記溶媒Aによって、ジプロピレングリコールをジプロピレングリコール濃度が1Mとなるように希釈した溶液を用いたことを除き、前記実施例1の(1)と同様にして、Δ蛍光強度比試料/Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。その結果を表4に示す。
実施例1の(2)において、試料として、前記溶媒Aによって、エチルアルコールをエチルアルコール濃度が1Mとなるように希釈した溶液、前記溶媒Aによって、プロピレングリコールをプロピレングリコールが1Mとなるように希釈した溶液、前記溶媒Aによって、グリセリンをグリセリン濃度が1Mとなるように希釈した溶液または前記溶媒Aによって、ジプロピレングリコールをジプロピレングリコール濃度が1Mとなるように希釈した溶液を用いたことを除き、前記実施例1の(2)と同様にして、Δ蛍光強度比試料/Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。その結果を表5に示す。
目の下周辺を中心に顔を洗った健常な男性86名の被験者を、室温25℃、相対湿度45〜60%の試験室内で5分間馴化させた。
以下の評価基準に基づいて、各被験者が、各時間の経過時に試験用シートおよび対照用シートのそれぞれについて刺激の強さを評価した。
0点:刺激をまったく感じない。
1点:かすかな刺激を感じる。
2点:「かすかな刺激」と「はっきりとした刺激」との中間の強さの刺激を感じる。
3点:はっきりとした刺激を感じる。
4点:「はっきりとした刺激」と「我慢できない刺激」との中間の強さの刺激を感じる。
5点:我慢できない刺激を感じる。
被験者のなかから、試験用シートについて、前記平均値が3以上であり、かつ対照シートについて、前記平均値が1以下である被験者をスティンガーとして採用した。
前記(3)において、前記(3)で選ばれたスティンガーを被験者とし、試料として、50体積%エチルアルコール水溶液、50体積%プロピレングリコール水溶液、50体積%グリセリン水溶液または50体積%ジプロピレングリコール水溶液を用い、前記(3)と同様にして刺激の強さを評価した。その結果を表6に示す。
前記(1)で算出されたTRPA1発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料/Δ蛍光強度比アゴニスト(表4参照)と前記(4)のスティンギングテストによる顔におけるスティンギングスコア(最大値)の平均値(表6参照)とを、試料ごとにプロットし、顔におけるスティンギングスコア(最大値)の平均値とTRPA1発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料/Δ蛍光強度比アゴニストとの関係を調べた。実施例2において、顔におけるスティンギングスコア(最大値)の平均値とTRPA1発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料/Δ蛍光強度比アゴニストとの関係を図3に示す。
(1)TRPA1発現細胞による評価
実施例1の(1)において、試料として、前記溶媒Aによって、表7の試料番号1の皮膚外用剤を皮膚外用剤濃度が10体積%となるように希釈した溶液、前記溶媒Aによって、表7の試料番号2の皮膚外用剤を皮膚外用剤濃度が10体積%となるように希釈した溶液または前記溶媒Aによって、表7の試料番号3の皮膚外用剤を皮膚外用剤濃度が10体積%となるように希釈した溶液を用いたことを除き、前記実施例1の(1)と同様にして、蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmを測定した。なお、表7中、「%」は、体積%を示す。
実施例1の(2)において、試料として、前記溶媒Aによって、表7の試料番号1の皮膚外用剤を皮膚外用剤濃度が10体積%となるように希釈した溶液、前記溶媒Aによって、表7の試料番号2の皮膚外用剤を皮膚外用剤濃度が10体積%となるように希釈した溶液または前記溶媒Aによって、表7の試料番号3の皮膚外用剤を皮膚外用剤濃度が10体積%となるように希釈した溶液を用いたことを除き、前記実施例1の(2)と同様にして、蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmを測定した。
実施例3の(4)において、被験者として、30名の健常男性からなるスティンガーを用い、試料として、表7に示される試料番号1〜3の皮膚外用剤を用いたことを除き、前記実施例3の(4)と同様にして刺激の強さを評価した。その結果を表8に示す。
TRPA1発現細胞におけるΔ蛍光強度比皮膚外用剤/Δ蛍光強度比アゴニスト(図5参照)およびTRPV1発現細胞におけるΔ蛍光強度比皮膚外用剤/Δ蛍光強度比アゴニスト(図6参照)それぞれの値の大きさに基づき、顔の皮膚に対する各試料の刺激を評価した。
Claims (4)
- アルコールを含む皮膚外用剤の評価方法であって、前記アルコールが、炭素数2〜10の直鎖または分岐鎖の脂肪族一価アルコールおよび脂肪族多価アルコールからなる群より選ばれた少なくとも1種のアルコールであり、前記皮膚外用剤を、TRPA1発現細胞、TRPV1発現細胞およびTRPA1−TRPV1共発現細胞からなる群より選ばれた少なくとも1種と接触させ、前記皮膚外用剤によりTRPA1を介して引き起こされる生理学的事象および/または前記皮膚外用剤によりTRPV1を介して引き起こされる生理学的事象を測定することを特徴とする皮膚外用剤の評価方法。
- 生理学的事象が、前記皮膚外用剤との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化である請求項1に記載の評価方法。
- 前記皮膚外用剤との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化の度合いをヒトの皮膚に対する前記皮膚外用剤の刺激の強さの指標として用い、ヒトの皮膚に対する前記皮膚外用剤の刺激の強さごとに前記皮膚外用剤を分類する請求項1または2に記載の評価方法。
- 前記皮膚外用剤との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化の度合いをヒトの皮膚に対する刺激の強さの指標として用い、ヒトの皮膚に対する前記皮膚外用剤の刺激を評価する請求項1または2に記載の評価方法。
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