JP4917858B2 - パラベン類の刺激を抑制する物質のスクリーニング方法 - Google Patents

Description

本発明は、パラベン類の刺激を抑制する物質のスクリーニング方法に関する。更に詳しくは、ＴＲＰＡ１を介したパラベン類の刺激を抑制する物質のスクリーニング方法に関する。

皮膚に使用する外用剤は、外部からの菌類の混入を想定し、繁殖を防ぐために抗菌力を製剤に付与しておく必要がある。そのため、化粧料等には抗菌剤が古くから添加されているが、抗菌力と安全性とを兼ね備えた抗菌剤は数少ない。その中で、パラベン類は抗菌力及び安全性が共に高い抗菌剤として、皮膚外用剤だけでなく食品等の分野にも応用されている。

しかし、人によっては、まれにパラベン類によってピリピリ感やヒリヒリ感等の一過性の不快な刺激感を有する場合がある。また、昨今の安全性志向の高まりから、特に洗い流さない外用剤の場合は皮膚に長時間付着した状態が続くので、刺激感等の違和感があるものは使用されない傾向にある。

そこで、パラベン類の唯一の欠点である、その刺激感を抑制するため、これまでに様々な検討がなされてきた。皮膚に対する刺激感を抑制するものとして、例えば、疎水性基含有多糖類誘導体からなる刺激抑制剤（特許文献１）、非イオン性界面活性剤とイオン性界面活性剤とを含有する組成物（特許文献２）、及び、水溶性二価ストロンチウムカチオンを含有する組成物（特許文献３）が挙げられる。また、パラベン類に代えて、抗菌力を有する２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール及び１，２−ペンタンジオール等の多価アルコールを利用する技術が知られている（特許文献４、５及び６）。しかしながら、パラベン類の刺激を抑制する物質を簡便な手法によりスクリーニングする方法については今だ報告例がなく、該抑制物質の特定、及び、そのパラベン類に対する刺激感の抑制効果に関する知見を得るための具体的な評価等は容易ではなかった。

一方、刺激の伝達メカニズムは未だ不明な部分は多いが、刺激受容体としてイオンチャネル型ＡＴＰ受容体（Ｐ２Ｘ受容体）や温度受容体としても機能しているＴＲＰ（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）チャネル等がこれまでにクローニングされている。これらの中で、ＴＲＰＡ１はシナモンやマスタードの刺激受容体として報告されている。ＴＲＰＡ１はその他、冷刺激、機械刺激の受容体としても知られているが、特に化学刺激受容体としての働きが主要であると考えられている（非特許文献１）。
特開２００１−６４１８５号公報 特開平１１−１０６３２７号公報 特表平１１−５０２５０５号公報 特開２００２−２１２０２１号公報 特開２００２−１４５７１９号公報 特開２００２−１２８６３３号公報 日薬理誌（Ｆｏｌｉａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｊｐｎ．）１２４，ｐ．２１９−２２７（２００４）．

本発明は、上記現状に鑑み、パラベン類を含有し、且つ、低刺激性の外用剤を提供するための、パラベン類の刺激を抑制する物質を簡便な手法によりスクリーニングする方法を提供することを目的とするものである。

本発明者らは上記課題を解決するため、パラベン類の刺激メカニズムについて鋭意検討を行った。その結果、本発明者らは、ＴＲＰＡ１で形質転換させた細胞に対してパラベン類を添加すると、細胞内へのカルシウムの流入が起こることを見出した。更に、このような細胞に対してパラベン類と共にＴＲＰＡ１の抑制物質を添加することにより、細胞内カルシウムの流入が抑制されることを見出した。上記発見に基づき、本発明者らは、パラベン類の刺激を抑制する物質を簡便な手法によりスクリーニングする方法を確立し、本発明を完成させた。

すなわち本発明は、ＴＲＰＡ１遺伝子により形質転換させた細胞に対して被験物質と共にパラベン類を添加し、そのときの該細胞内のカルシウム濃度の変化を測定することを特徴とするパラベン類の刺激を抑制する物質のスクリーニング方法に関する。
以下に本発明を詳述する。

パラベン類とは、パラオキシ安息香酸エステルの総称であり、抗菌剤として使用されるものとしては、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、イソプロピルパラベン、ブチルパラベン、イソブチルパラベン、ベンジルパラベン等が挙げられる。

ＴＲＰＡ１遺伝子は、既に知られているＴＲＰＡ１遺伝子配列の情報、例えば、既知のヒトＴＲＰＡ１遺伝子配列の情報（Ｊａｑｕｅｍａｒ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎ Ａｎｋｙｒｉｎ−ｌｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ Ｄｏｍａｉｎｓ Ｉｓ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ Ｌｏｓｔ ａｆｔｅｒ Ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７４（１１），７３２５−７３３３（１９９９））等を元に該配列から作成した適当なプローブを用いて、周知のＰＣＲ法やｃＤＮＡライブラリーからのハイブリダイゼーション法等により得ることができる。

遺伝子をクローン化する方法としては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８９等に記載された一般的な方法を用いることができる。

上記ＴＲＰＡ１遺伝子としては、形質転換後に形質転換細胞内で刺激受容体として機能する範囲で、遺伝子配列の内部または末端の一部が、挿入、置換あるいは削除されたものも含まれる。

また、本発明に用いられる宿主としては、導入した遺伝子が効率よく発現され、培養が容易なものであれば特に限定されないが、大腸菌等の細菌類、酵母等の菌類及びＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等の動物細胞等が挙げられる。

ベクターとしては、調整が容易で効率よく導入できるものであれば特に限定されないが、大腸菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、更にレトロウイルス等の動物ウイルスが好ましい。更に、該遺伝子を発現させるために、例えば、遺伝子の上流に適当な発現プロモーターを接続することができる。使用するプロモーターは宿主に応じて選択可能である。

形質転換は、ＤＮＡが染色体外要素として、あるいは、染色体組み込みによりＤＮＡが複製可能となるようにＤＮＡを生体内に導入することを意味する。上記組み換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換する方法としては、各宿主細胞に対して一般的に用いられる形質転換方法、リポフェクション、エレクトロポレーション等が適用可能である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８９等）。

こうして得られた形質転換細胞を適当な選択培地で培養して、スクリーニングに用いることができる。このスクリーニングのための培養は、細胞をカバーグラス上で培養して用いることが好ましい。例えば形質転換細胞を濃度５×１０^７／ｍＬとなるように培地に懸濁し、適量をカバーグラスに載せ、２４〜４８時間程度、約３７℃で培養することができる。

スクリーニングの方法としては、培養細胞にパラベン類と共に被験物質を添加し、細胞内のカルシウム濃度の変化を測定することにより行うことができる。培養細胞へのパラベン類の添加方法としては特に限定されるものではなく、例えば、エタノール等に溶解したものを添加してもよいし、そのまま添加してもよい。同様に被験物質の添加方法についても特に限定されるものではなく、例えば、エタノール等に溶解したものを添加してもよいし、そのまま添加してもよい。培養細胞に対するパラベン類の添加量は、細胞内のカルシウム濃度が測定可能な程度に変化する範囲であれば特に限定されるものではないが、１００μＭ〜２０μＭが好ましく、１ｍＭ〜１０ｍＭがより好ましい。また、培養細胞に対する被験物質の添加量についても、細胞内のカルシウム濃度が測定可能な程度に変化する範囲であれば特に限定されるものではないが、１μＭ〜２０ｍＭが好ましく、１０μＭ〜１０ｍＭがより好ましい。

細胞内カルシウム濃度の変化を測定する方法としては特に限定されるものではなく、例えば、カルシウム結合量によってその蛍光特性が変化する周知の蛍光カルシウム指示薬であるＦＵＲＡ ２（シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社製）、ＦＵＲＡ ２−ＡＭ（シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社製）、Ｆｌｕｏ−３（シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社製）等を用いて蛍光比を測定する方法等が挙げられる。これらの方法により、被験物質と共にパラベン類を添加したときの細胞内でのカルシウム濃度変化の測定を行い、被験物質と共にパラベン類を添加した結果、パラベン類を単独で添加した場合と比較して細胞内のカルシウム濃度上昇が抑制された場合は、該被験物質にパラベン類の刺激を抑制する効果が有ると判断できる。一方、パラベン類を単独で添加した場合と同程度の細胞内のカルシウム濃度上昇が観測された場合、パラベン類と共に添加された該被験物質には、パラベン類の刺激を抑制する効果は無いと判断できる。

本発明により、パラベン類の刺激を抑制する物質を簡便な手法でスクリーニングすることが可能となり、更に該抑制物質の特定、及び、そのパラベン類に対する刺激感の抑制効果の評価が可能になった。

以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。

実施例１
目的遺伝子の細胞への形質転換
ＨＥＫ２９３細胞（５×１０^５個／直径３５ｍｍシャーレ）を１０％牛胎児血清含有ＤＭＥＭ培地にて５％ＣＯ_２下、３７℃で培養した。別にＴＲＰＡ１ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３ベクターに導入し、既報（Ｊａｑｕｅｍａｒ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎ Ａｎｋｙｒｉｎ−ｌｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ Ｄｏｍａｉｎｓ Ｉｓ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ Ｌｏｓｔ ａｆｔｅｒ Ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７４（１１），７３２５−７３３３ （１９９９））に準じて発現ベクターを得た。作成はヒトＴＲＰＡ１のｃＤＮＡの６３〜３８８８のヌクレオチドをｐｃＤＮＡ３．１（＋）（インビトロジェン社製）のＫｐｎＩ／ＸｂａＩサイトに挿入して行った。こうして得られたｐｃＤＮＡをリポフェクトアミン、プラスリージェント及びＯＰＴＩ−ＭＥＭ１試薬を用いて、既報（Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ：Ａ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，ｌｉｐｉｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ＤＮＡ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３−７４１７ （１９８７））に準じて、トランスフェクトした。

また、５ｍＭのメチルパラベンと共に、被験物質としてＴＲＰＡ１の既知のアンタゴニストである、カンファー（シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社製）、ルテニウムレッド（シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社製）及びガドリニウムクロライド（シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社製）をそれぞれ５ｍＭ、１０μＭ、１００μＭ、緩衝液（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２ｍＭ ＣａＣｌ_２、１０ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジン］エタンスルホン酸）／ＮａＯＨ（ｐＨ７．４））に溶解し、試験液を作成した。更に、被験物質としてグリセリン（和光純薬工業株式会社製）、１，３−ブタンジオール（和光純薬工業株式会社製）、プロピレングリコール（和光純薬工業株式会社製）及びポリオキシエチレン（２）オレイルエーテル（和光純薬工業株式会社製）をそれぞれ５ｍＭ、５ｍＭ、５ｍＭ、５００μＭ、上記緩衝液に溶解し、同様に試験液を作成した。また５ｍＭメチルパラベンのみを溶解させた標準試験液も作成した。次に、１〜２０μｇ／ｍＬのＦＵＲＡ ２−ＡＭを２０〜４０分間ロードし、循環定温チャンバー付蛍光測定装置（商品名：ＡＲＧＵＳ−５０、浜松フォトニクス社製）等を用いて、上記緩衝液にて洗浄した後、０．１〜１０ｍＭのパラベン類と共に上記の被験物質を溶解させたタイロード液を循環させ、試験液の３４０ｎｍと３８０ｎｍの蛍光比の、標準試験液での蛍光比に対する減少率を抑制率とした。抑制率は以下の式に基づき算出した。
「抑制率」＝（パラベン処理時の蛍光比−被験物質とパラベン処理時の蛍光比）
／（パラベン処理時の蛍光比−緩衝液処理時の蛍光比）
ここで、該抑制率が５％以上であれば、被験物質のパラベンに対する刺激の抑制効果を有するものと判断することができる。更に、該抑制率が２０％以上であれば、被験物質のパラベンに対する刺激に対し、高い抑制効果を有するものと判断することができる。
その結果を図１に示す。

図１の結果から、ＴＲＰＡ１の既知のアンタゴニストであるカンファー及びルテニウムレッドは、該抑制率がそれぞれ３２．５％、４７．３％であるため、メチルパラベンの刺激に対して、高い抑制効果を有することが判断できる。一方、ガドリニウムについては、ＴＲＰＡ１の既知のアンタゴニストであるにも関わらず、該抑制率が５．８％となり、メチルパラベンの刺激に対して一定の抑制効果を有するものの、他のアンタゴニストであるカンファー及びルテニウムレッドよりもメチルパラベンに対する刺激の抑制効果が低いことが、本発明のスクリーニング方法を実施することにより容易に判断できる。また、グリセリン、１，３−ブタンジオール、プロピレングリコール及びポリオキシエチレン（２）オレイルエーテルは該抑制率がそれぞれ−０．２％、０．１％、−０．６％、−１．９％であるため、本発明におけるスクリーニング方法によると、メチルパラベンの刺激に対する抑制効果が殆ど無いことが判断できる。

本発明は、パラベン類の刺激を抑制する物質のスクリーニング方法を提供する。該スクリーニング方法により、パラベン類を含有し、且つ、低刺激性の外用剤を提供することが可能になる。

各被験物質とメチルパラベンの刺激抑制率との関係を示すグラフ。

Claims (4)

1. ＴＲＰＡ１遺伝子により形質転換させた細胞に対して被験物質と共にパラベン類を添加し、そのときの該細胞内のカルシウム濃度の変化を測定することを特徴とするパラベン類の刺激を抑制する物質のスクリーニング方法。
2. ＴＲＰＡ１遺伝子により形質転換させた細胞が、ＴＲＰＡ１遺伝子を宿主ベクター法により導入した細胞である請求項１記載のスクリーニング方法。
3. 使用する宿主が、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞及びＮＩＨ３Ｔ３細胞からなる群より選ばれた少なくとも１種の動物細胞である請求項２記載のスクリーニング方法。
4. 使用するベクターが、大腸菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド及び動物ウイルスからなる群より選ばれた少なくとも１種である請求項２又は３記載のスクリーニング方法。

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