KR20200093001A - Trp 채널 활성 억제제 - Google Patents

Trp 채널 활성 억제제 Download PDF

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KR20200093001A
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후미타카 후지타
가오리 사이토
후미히로 오카다
겐 이시이
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가부시키가이샤 만다무
고쿠리츠 켄큐 카이하츠 호진 이야쿠 키반 켄코 에이요 켄큐쇼
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Abstract

본 발명은, TRP 채널의 활성을 효과적으로 억제할 수 있는 TRP 채널 활성 억제제로서, TRP 채널의 활성을 억제하기 위한 유효 성분으로서 알루미늄 이온을 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 TRP 채널 활성 억제제를 제공한다.

Description

TRP 채널 활성 억제제
본 발명은, TRP 채널 활성 억제제에 관한 것이다. 더욱 자세하게는, TRP 채널 활성 억제제 및 TRP 채널의 활성 억제 방법에 관한 것이다.
피부 외용제는, 피부에 적용되어, 피부에 유용한 효과를 주는 외용제이다. 그러나, 피부 외용제는, 사용자의 피부 상태 등에 따라서는, 사용자에게 불쾌한 감각 또는 불쾌한 생리학적 사상(事象)을 일으키게 하는 경우가 있다. 그러나, 근래, 사용자의 안전 의식의 고조로부터, 불쾌한 감각 또는 불쾌한 생리학적 사상을 사용자에게 일으키게 하지 않거나, 또는 일으키게 하기 어렵고, 게다가 유용한 효과를 충분히 발현하는 물질 및 방법이 기다려지고 있다.
그런데, TRP 채널은, 외계(外界)로부터 받는 여러 가지 자극을 수용하는 감각 수용 등에 관여하는 일과성(一過性) 수용체 전위 채널이다. TRP 채널의 하나인 TRPA1은, 예를 들면, 알칼리제 등에 의한 불쾌한 감각의 발현에 관여하는 것이, 본 발명자들에 의해 발견되어 있다(예를 들면, 특허문헌 1 참조).
일본국 특개2012-62304호 공보
본 발명은, 상기 종래 기술을 감안하여 이루어진 것이며, TRP 채널의 활성을 효과적으로 억제하는 TRP 채널 활성 억제제 및 TRP 채널의 활성 억제 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은,
(1) TRP 채널의 활성을 억제하기 위한 TRP 채널 활성 억제제로서, 상기 TRP 채널의 활성을 억제하기 위한 유효 성분으로서 알루미늄 이온을 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 TRP 채널 활성 억제제,
(2) TRP 채널의 활성을 억제하기 위한 TRP 채널 활성 억제제로서, 상기 TRP 채널의 활성을 억제하기 위한 유효 성분으로서 알루미늄 이온으로 해리하는 물질이 배합되어 있는 것을 특징으로 하는 TRP 채널 활성 억제제, 및
(3) TRP 채널의 활성을 억제하는 활성 억제 방법으로서, 알루미늄 이온과 TRP 채널을 접촉시키는 것을 특징으로 하는 TRP 채널의 활성 억제 방법에 관한 것이다.
본 발명의 TRP 채널 활성 억제제 및 TRP 채널의 활성 억제 방법은, TRP 채널의 활성을 효과적으로 억제한다는 뛰어난 효과를 나타낸다.
도 1은, 시험예 1에 있어서, TRPV1 발현 세포내의 전류의 경시적(經時的) 변화를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는, 시험예 2에 있어서, TRPV1 발현 세포내의 전류의 경시적 변화를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은, 시험예 3에 있어서, 황산 알루미늄칼륨 농도와 TRPV1 활성과의 관계를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는, 시험예 4에 있어서, TRPA1 발현 세포내의 전류의 경시적 변화를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는, 시험예 5에 있어서, 염화 알루미늄 농도와 억제율과의 관계를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은, 시험예 6에 있어서, TRPM8 발현 세포내의 전류의 경시적 변화를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은, 시험예 7에 있어서, 형광 강도비의 경시적 변화를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은, 시험예 8에 있어서, 형광 강도비의 경시적 변화를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9는, 시험예 9에 있어서, 시료의 종류와 TRPV1 활성과의 관계를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10은, 시험예 10에 있어서, 시료의 종류와 TRPA1 활성과의 관계를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11은, 시험예 11에 있어서, 황산 알루미늄칼륨 농도와 억제율과의 관계를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 12는, 시험예 12에 있어서, 피험 시료의 pH와 억제율과의 관계를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
1. TRP 채널 활성 억제제
본 발명은, 하나의 측면에서는, TRP 채널의 활성을 억제하기 위한 TRP 채널 활성 억제제로서, TRP 채널의 활성을 억제하기 위한 유효 성분으로서 알루미늄 이온을 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 TRP 채널 활성 억제제(이하, 「활성 억제제 A」라고 함)에 관한 것이다.
알루미늄 이온은, 아고니스트에 의한 TRP 채널의 활성을 억제한다. 따라서, 본 발명의 활성 억제제 A는, 알루미늄 이온을 유효 성분으로서 함유하고 있기 때문에, 본 발명의 활성 억제제 A와 TRP 채널을 접촉시킴으로써, TRP 채널의 활성을 효과적으로 억제할 수 있다.
본 발명의 활성 억제제 A에서는, 알루미늄 이온은, 예를 들면, 수계 용매 중에서 해리된 상태로 존재하고 있어도 된다. 수계 용매로는, 예를 들면, 물, 구연산 완충액, 인산 완충액 등을 들 수 있지만, 본 발명은 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다. 수계 용매가 물인 경우, 본 발명의 활성 억제제 A의 pH는, 수중(水中)에서 해리된 상태로 알루미늄 이온을 안정하게 존재시키는 관점에서, 바람직하게는 7.5∼14(이하, 「고 pH」라고 함) 또는 1∼6.5(이하, 「저 pH」라고 함)이다. 본 발명의 활성 억제제 A의 pH가 고 pH인 경우, 본 발명의 활성 억제제 A의 pH는, 수중에서 해리된 상태로 알루미늄 이온을 안정하게 존재시키는 관점에서, 바람직하게는 7.5 이상, 보다 바람직하게는 8 이상, 더욱 바람직하게는 8.5 이상이고, 수중에서 해리된 상태로 알루미늄 이온을 안정하게 존재시키는 관점에서, 바람직하게는 14 이하, 보다 바람직하게는 13 이하이다. 본 발명의 활성 억제제 A의 pH가 저 pH인 경우, 수중에서 해리된 상태로 알루미늄 이온을 안정하게 존재시키는 관점에서, 바람직하게는 1 이상, 보다 바람직하게는 2 이상이고, 수중에서 해리된 상태로 알루미늄 이온을 안정하게 존재시키는 관점에서, 바람직하게는 6.5 이하, 보다 바람직하게는 6 이하, 더욱 바람직하게는 5 이하이다.
본 발명의 활성 억제제 A에서의 알루미늄 이온 농도는, 적용 대상의 TRP 채널의 종류, 본 발명의 활성 억제제 A의 용도 등에 따라 다르기 때문에 일률적으로는 결정할 수 없는 점에서, 적용 대상의 TRP 채널의 종류, 본 발명의 활성 억제제 A의 용도 등에 따라서 적절히 결정하는 것이 바람직하다. 본 발명의 활성 억제제 A에서의 알루미늄 이온 농도는, 통상, TRP 채널의 활성에 대한 억제 효과를 충분히 발휘시키는 관점에서, 바람직하게는 10μM 이상, 보다 바람직하게는 100μM 이상이고, 본 발명의 활성 억제제 A의 보존 안정성을 향상시키는 관점에서, 바람직하게는 20mM 이하, 보다 바람직하게는 10mM 이하이다. 본 명세서에 있어서, 알루미늄 이온 농도는, 금속 지시약〔(주)도진도 겐큐쇼 제조, 상품명: Cu-PAN〕을 이용하여 측정된 값이다.
본 발명의 활성 억제제 A는, 본 발명의 목적이 저해되지 않는 범위 내에서, 예를 들면, pH 조정제, 계면활성제 등의 다른 성분을 함유하고 있어도 된다.
본 발명의 활성 억제제 A는, 예를 들면, 알루미늄 이온으로 해리하는 물질과 수계 용매를 혼합함으로써 제조할 수 있다. 본 발명의 활성 억제제 A가 pH 조정제, 계면활성제 등의 다른 성분을 함유하는 경우, 당해 활성 억제제 A는, 예를 들면, 알루미늄 이온으로 해리하는 물질과 다른 성분을 혼합함으로써 제조할 수 있다.
알루미늄 이온으로 해리하는 물질로는, 예를 들면, 할로겐화 알루미늄, 무기산 알루미늄염, 유기산 알루미늄염 등을 들 수 있지만, 본 발명은 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다. 할로겐화 알루미늄으로는, 예를 들면, 염화 알루미늄 등을 들 수 있지만, 본 발명은 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다. 무기산 알루미늄염은, 무기산 알루미늄 단염이어도 되고, 무기산 알루미늄 복염이어도 된다. 무기산 알루미늄 단염으로는, 예를 들면, 인산 알루미늄 등을 들 수 있지만, 본 발명은 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다. 무기산 알루미늄 복염으로는, 예를 들면, 황산 알루미늄 복염 등을 들 수 있지만, 본 발명은 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다. 황산 알루미늄 복염으로는, 예를 들면, 황산 알루미늄나트륨, 황산 알루미늄칼륨 등의 황산 알루미늄 알칼리금속 복염, 황산 알루미늄암모늄 등을 들 수 있지만, 본 발명은 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다. 유기산 알루미늄염으로는, 예를 들면, 포름산 알루미늄, 초산(酢酸) 알루미늄, 구연산 알루미늄 등을 들 수 있지만, 본 발명은 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다. 이들 알루미늄 이온으로 해리하는 물질 중에서는, TRP 채널의 활성에 대한 억제 효과를 충분히 발휘시키는 관점에서, 할로겐화 알루미늄, 무기산 알루미늄염 및 유기산 알루미늄염이 바람직하고, 할로겐화 알루미늄 및 황산 알루미늄 복염이 보다 바람직하며, 염화 알루미늄, 황산 알루미늄칼륨 및 황산 알루미늄암모늄이 보다 더 바람직하고, 염화 알루미늄 및 황산 알루미늄칼륨이 더욱 바람직하며, 염화 알루미늄이 더욱더 바람직하다.
본 발명은, 다른 측면에서는, TRP 채널의 활성을 억제하기 위한 TRP 채널 활성 억제제로서, TRP 채널의 활성을 억제하기 위한 유효 성분으로서 알루미늄 이온으로 해리하는 물질이 배합되어 있는 것을 특징으로 하는 TRP 채널 활성 억제제(이하, 「활성 억제제 B」라고 함)에 관한 것이다.
본 발명의 활성 억제제 B와 TRP 채널을 접촉시켰을 때, 알루미늄 이온으로 해리하는 물질로부터 해리된 알루미늄 이온과 TRP 채널이 접촉함으로써, TRP 채널의 활성이 효과적으로 억제된다. 따라서, 본 발명의 활성 억제제 B는, 알루미늄 이온으로 해리하는 물질이 배합되어 있기 때문에, TRP 채널의 활성을 효과적으로 억제할 수 있다.
알루미늄 이온으로 해리하는 물질은, TRP 채널과 접촉시킬 때에, 알루미늄 이온으로 해리되어 있으면 된다. 본 발명의 활성 억제제 B에 이용되는 알루미늄 이온으로 해리하는 물질은, 본 발명의 활성 억제제 A의 제조에 이용되는 알루미늄 이온으로 해리하는 물질과 마찬가지이다. 알루미늄 이온으로 해리하는 물질 중에서는, TRP 채널의 활성에 대한 억제 효과를 충분히 발휘시키는 관점에서, 할로겐화 알루미늄, 무기산 알루미늄염 및 유기산 알루미늄염이 바람직하고, 할로겐화 알루미늄 및 황산 알루미늄 복염이 보다 바람직하며, 염화 알루미늄, 황산 알루미늄칼륨 및 황산 알루미늄암모늄이 보다 더 바람직하고, 염화 알루미늄 및 황산 알루미늄칼륨이 더욱 바람직하며, 염화 알루미늄이 더욱더 바람직하다.
본 발명의 활성 억제제 B에서는, 알루미늄 이온으로 해리하는 물질은, 수계 용매 중에 용해된 상태로 존재하고 있어도 된다. 본 발명의 활성 억제제 B에 이용되는 수계 용매는, 전술의 활성 억제제 A에 이용되는 수계 용매와 마찬가지이다. 수계 용매가 물인 경우, 본 발명의 활성 억제제 B의 pH는, 알루미늄 이온으로 해리하는 물질의 종류 등에 따라 다르기 때문에 일률적으로는 결정할 수 없는 점에서, 알루미늄 이온으로 해리하는 물질의 종류 등에 따라서 적절히 결정하는 것이 바람직하다. 수계 용매가 물일 때의 본 발명의 활성 억제제 B의 pH는, 수중에서 해리된 상태로 알루미늄 이온을 안정하게 존재시키는 관점에서, 바람직하게는 상기 고 pH 또는 상기 저 pH이다. 본 발명의 활성 억제제 B의 pH가 고 pH인 경우, 본 발명의 활성 억제제 B의 pH는, 수중에서 해리된 상태로 알루미늄 이온을 안정하게 존재시키는 관점에서, 바람직하게는 7.5 이상, 보다 바람직하게는 8 이상, 더욱 바람직하게는 8.5 이상이고, 수중에서 해리된 상태로 알루미늄 이온을 안정하게 존재시키는 관점에서, 바람직하게는 14 이하, 보다 바람직하게는 13 이하이다. 본 발명의 활성 억제제 B의 pH가 저 pH인 경우, 수중에서 해리된 상태로 알루미늄 이온을 안정하게 존재시키는 관점에서, 바람직하게는 1 이상, 보다 바람직하게는 2 이상이고, 수중에서 해리된 상태로 알루미늄 이온을 안정하게 존재시키는 관점에서, 바람직하게는 6.5 이하, 보다 바람직하게는 6 이하, 더욱 바람직하게는 5 이하이다.
본 발명의 활성 억제제 B에서의 알루미늄 이온으로 해리하는 물질의 농도는, 알루미늄 이온으로 해리하는 물질의 종류, 적용 대상의 TRP 채널의 종류 등에 따라 다르기 때문에 일률적으로는 결정할 수 없는 점에서, 알루미늄 이온으로 해리하는 물질의 종류, 적용 대상의 TRP 채널의 종류 등에 따라서 적절히 결정하는 것이 바람직하다. 본 발명의 활성 억제제 B 100 질량부당의 알루미늄 이온으로 해리하는 물질의 양은, 통상, TRP 채널의 활성에 대한 억제 효과를 충분히 발휘시키는 관점에서, 바람직하게는 0.01 질량부 이상, 보다 바람직하게는 0.05 질량부 이상이고, TRP 채널의 활성에 대한 억제 효과를 충분히 발휘시키는 관점에서, 100 질량부 이하이다. 본 발명의 활성 억제제가 알루미늄 이온으로 해리하는 물질 이외의 성분을 함유하는 경우, 본 발명의 활성 억제제 B 100 질량부당의 알루미늄 이온으로 해리하는 물질의 양의 상한치는, 본 발명의 활성 억제제 B의 보존 안정성을 향상시키는 관점에서, 바람직하게는 10 질량부 이하, 보다 바람직하게는 1 질량부 이하이다.
본 발명의 활성 억제제 B는, 본 발명의 목적이 저해되지 않는 범위 내에서, 예를 들면, pH 조정제, 계면활성제 등의 다른 성분을 함유하고 있어도 된다.
사용 시에 있어서의 본 발명의 활성 억제제 B의 알루미늄 이온 농도는, 통상, TRP 채널 활성 억제 작용을 충분히 발현시키는 관점에서, 바람직하게는 0.01mM 이상, 보다 바람직하게는 0.1mM 이상이고, TRP 채널 활성 억제 작용을 충분히 발현시키는 관점에서, 바람직하게는 10mM 이하, 보다 바람직하게는 5mM 이하이다.
본 발명의 활성 억제제 B는, 예를 들면, 알루미늄 이온으로 해리하는 물질과 수계 용매를 혼합함으로써 제조할 수 있다. 본 발명의 활성 억제제 B가 pH 조정제, 계면활성제 등의 다른 성분을 함유하는 경우, 예를 들면, 당해 활성 억제제 B는, 알루미늄 이온으로 해리하는 물질과 다른 성분을 혼합함으로써 제조할 수 있다.
TRP 채널로는, 예를 들면, TRPA1, TRPM8, TRPV1, TRPV3, TRPV4 등을 들 수 있지만, 본 발명은 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다. 이들 TRP 채널 중에서는, 효과적으로 활성을 억제할 수 있는 점에서, TRPA1, TRPM8, TRPV1, TRPV3 및 TRPV4가 바람직하다.
TRPA1으로는, 예를 들면, 인간 TRPA1(예를 들면, GenBank 액세션 번호 NM_007332 등) 등을 들 수 있지만, 본 발명은 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다. TRPA1의 활성으로는, 예를 들면, 알릴이소티오시아네이트 등에 의한 화학 자극, pH 10∼12의 조건하에서의 고 pH 자극, 17℃ 전후의 온도에서의 냉자극, 기계 자극 등의 자극에 의한 세포외에서 세포내로의 칼슘 이온의 수송능; 당해 자극에 의한 막전위의 조절능 등을 들 수 있지만, 본 발명은 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다. TRPA1이 갖는 칼슘 이온의 수송능은, 예를 들면, TRPA1 발현 세포가 갖는 TRPA1으로의 TRPA1 아고니스트의 결합에 수반하는 세포외에서 세포내로의 칼슘 이온의 유입량을 측정함으로써 조사할 수 있다. TRPA1이 갖는 막전위의 조절능은, 예를 들면, TRPA1 발현 세포가 갖는 TRPA1으로의 TRPA1 아고니스트의 결합에 수반하는 세포내에서의 전류의 증가량 등을 측정함으로써 조사할 수 있다. TRPA1 아고니스트로는, 예를 들면, 알릴이소티오시아네이트, 신남알데히드, 알리신 등을 들 수 있지만, 본 발명은 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다. TRPA1의 활성화에 기인하는 불쾌한 감각 또는 생리학적 사상으로는, 예를 들면, 염증성 동통, 신경인성 동통 등의 통증, 과도한 자극감, 과도한 냉감 등을 들 수 있지만, 본 발명은 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다.
TRPM8으로는, 예를 들면, 인간 TRPM8(예를 들면, GenBank 액세션 번호 NM_024080 등) 등을 들 수 있지만, 본 발명은 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다. TRPM8의 활성으로는, 멘톨 등에 의한 화학 자극, 25∼28℃ 전후의 온도에서의 냉자극 등의 자극에 의한 세포외에서 세포내로의 칼슘 이온의 수송능 등을 들 수 있지만, 본 발명은 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다. TRPM8이 갖는 칼슘 이온의 수송능은, 예를 들면, TRPM8 발현 세포가 갖는 TRPM8으로의 TRPM8 아고니스트의 결합에 수반하는 세포외에서 세포내로의 칼슘 이온의 유입량을 측정함으로써 조사할 수 있다. TRPM8 아고니스트로는, 예를 들면, 멘톨, 이실린 등을 들 수 있지만, 본 발명은 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다. TRPM8의 활성화에 기인하는 불쾌한 감각 또는 생리학적 사상으로는, 예를 들면, 과도한 냉감 등을 들 수 있지만, 본 발명은 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다.
TRPV1으로는, 예를 들면, 인간 TRPV1(예를 들면, GenBank 액세션 번호 NM_080704 등) 등을 들 수 있지만, 본 발명은 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다. TRPV1의 활성으로는, 예를 들면, 캡사이신 등에 의한 화학 자극, pH 3∼5.5의 조건하에서의 저 pH 자극, 43℃ 전후의 온도에서의 열자극, 통증 자극, 기계 자극 등의 자극에 의한 세포외에서 세포내로의 칼슘 이온의 수송능 등을 들 수 있지만, 본 발명은 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다. TRPV1이 갖는 칼슘 이온의 수송능은, 예를 들면, TRPV1 발현 세포가 갖는 TRPV1으로의 TRPV1 아고니스트의 결합에 수반하는 세포외에서 세포내로의 칼슘 이온의 유입량을 측정함으로써 조사할 수 있다. TRPV1 아고니스트로는, 예를 들면, 캡사이신, 캄퍼, 알리신 등을 들 수 있지만, 본 발명은 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다. TRPV1의 활성화에 기인하는 불쾌한 감각 또는 생리학적 사상으로는, 예를 들면, 과도한 열감 등을 들 수 있지만, 본 발명은 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다.
TRPV3로는, 예를 들면, 인간 TRPV3(예를 들면, GenBank 액세션 번호: NM_145068 등) 등을 들 수 있지만, 본 발명은 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다. TRPV3의 활성으로는, 예를 들면, 캄퍼 등에 의한 화학 자극, 33∼39℃ 전후의 온도에서의 열자극 등의 자극에 의한 세포외에서 세포내로의 칼슘 이온 수송능 등을 들 수 있지만, 본 발명은 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다. TRPV3이 갖는 칼슘 이온의 수송능은, 예를 들면, TRPV3 발현 세포가 갖는 TRPV3로의 TRPV3 아고니스트의 결합에 수반하는 세포외에서 세포내로의 칼슘 이온의 유입량을 측정함으로써 조사할 수 있다. TRPV3 아고니스트로는, 예를 들면, 캄퍼, 오이게놀, 카르바크롤 등을 들 수 있지만, 본 발명은 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다. TRPV3의 활성화에 기인하는 불쾌한 감각 또는 생리학적 사상으로는, 예를 들면, 과도한 열감, 피부의 과각화 등을 들 수 있지만, 본 발명은 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다.
TRPV4로는, 예를 들면, 인간 TRPV4(예를 들면, GenBank 액세션 번호: NM_021625 등) 등을 들 수 있지만, 본 발명은 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다. TRPV4의 활성으로는, 예를 들면, 4α-포르볼-12,13-디데카노에이트 등에 의한 화학 자극, 27∼34℃ 전후의 온도에서의 열자극, 저침투압 자극, 기계 자극 등의 자극에 의한 세포외에서 세포내로의 칼슘 이온 수송능 등을 들 수 있지만, 본 발명은 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다. TRPV4가 갖는 칼슘 이온의 수송능은, 예를 들면, TRPV4 발현 세포가 갖는 TRPV4로의 TRPV4 아고니스트의 결합에 수반하는 세포외에서 세포내로의 칼슘 이온의 유입량을 측정함으로써 조사할 수 있다. TRPV4 아고니스트로는, 예를 들면, 4α-포르볼-12,13-디데카노에이트 등을 들 수 있지만, 본 발명은 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다. TRPV4의 활성화에 기인하는 불쾌한 감각 또는 생리학적 사상으로는, 예를 들면, 과도한 열감, 가려움 감각 등을 들 수 있지만, 본 발명은 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 활성 억제제 A 및 활성 억제제 B가 갖는 TRP 채널 활성 억제 작용은, 예를 들면, TRP 채널을 발현하는 세포(이하, 「TRP 채널 발현 세포」라고 함)의 세포내 칼슘 이온 농도, TRP 채널 발현 세포내에서의 전류 등을 지표로서 이용함으로써 평가할 수 있다.
TRP 채널 발현 세포는, 내인성 TRP 채널을 발현하는 세포여도 되고, 외인성 TRP 채널을 발현하는 세포여도 된다. TRP 채널 발현 세포는, 1종류의 TRP 채널을 발현하는 세포여도 되고, 2종류 이상의 TRP 채널을 발현하는 세포여도 된다. 외인성 TRP 채널을 발현하는 세포로는, 예를 들면, 외인성 TRP 채널을 코드하는 핵산을 숙주 세포에 도입함으로써 얻어지는 세포 등을 들 수 있지만, 본 발명은 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다.
TRP 채널 활성 억제 작용의 평가 방법의 구체예로는, 이하의 평가법 1, 평가법 2 등을 들 수 있지만, 본 발명은 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다.
＜평가법 1＞
(1A) TRP 채널 발현 세포와 본 발명의 활성 억제제 A 또는 활성 억제제 B와 TRP 채널의 아고니스트를 접촉시키고, 당해 TRP 채널 발현 세포의 세포내 칼슘 이온 농도 A를 측정하는 스텝,
(1B) TRP 채널 발현 세포와 TRP 채널의 아고니스트를 접촉시키고, 당해 TRP 채널 발현 세포의 세포내 칼슘 이온 농도 B를 측정하는 스텝, 및
(1C) 세포내 칼슘 이온 농도 A와 세포내 칼슘 이온 농도 B를 비교하는 스텝을 포함하는 방법.
＜평가법 2＞
(2A) TRP 채널 발현 세포와 본 발명의 활성 억제제 A 또는 활성 억제제 B와 TRP 채널의 아고니스트를 접촉시키고, 당해 TRP 채널 발현 세포내에서의 전류 A를 측정하는 스텝,
(2B) TRP 채널 발현 세포와 TRP 채널의 아고니스트를 접촉시키고, 당해 TRP 채널 발현 세포내에서의 전류 B를 측정하는 스텝, 및
(2C) 전류 A와 전류 B를 비교하는 스텝을 포함하는 방법.
평가법 1에서의 세포내 칼슘 이온 농도 A 및 세포내 칼슘 이온 농도 B의 측정 방법으로는, 예를 들면, 칼슘 이온에 결합하는 칼슘 지시약을 이용하는 방법 등을 들 수 있지만, 본 발명은 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다. 칼슘 지시약을 이용하는 방법에서는, TRP 채널 발현 세포에 도입하여 당해 TRP 채널 발현 세포내의 칼슘 이온에 칼슘 지시약을 결합시키고, 칼슘 이온과 결합한 칼슘 지시약의 양을 조사함으로써 세포내 칼슘 이온 농도를 측정할 수 있다. 칼슘 지시약은, 칼슘 이온과 결합한 칼슘 지시약의 양을 간편한 조작으로 측정할 수 있는 점에서, 칼슘 이온과의 결합 전후의 변화를 광학적 특성의 변화 등에 의해 검출할 수 있는 시약인 것이 바람직하다. 광학적 특성의 변화로는, 예를 들면, 형광 강도의 변화, 흡광도의 변화 등을 들 수 있지만, 본 발명은 이러한 예시만으로 한정되는 것이 아니다. 칼슘 지시약으로는, 예를 들면, 칼슘 이온과의 결합 전후에 형광 강도가 변화하는 형광 칼슘 지시약 등을 들 수 있지만, 본 발명은 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다. 칼슘 지시약의 구체예로는, 1-[6-아미노-2-(5-카르복시-2-옥사졸릴)-5-벤조푸라닐옥시]-2-(2-아미노-5-메틸페녹시)에탄-N,N,N',N'-사초산 펜타아세톡시메틸에스테르(Fura 2-AM), 1-[2-아미노-5-(2,7-디클로로-6-히드록시-3-옥소-9-크산테닐)페녹시]-2-(2-아미노-5-메틸페녹시)에탄-N,N,N',N'-사초산 테트라아세톡시메틸에스테르(Fluo 3-AM), 1-[2-아미노-5-(2,7-디플루오로-6-아세톡시메톡시-3-옥소-9-크산테닐)페녹시]-2-(2-아미노-5-메틸페녹시)에탄-N,N,N',N'-사초산 테트라아세톡시메틸에스테르(Fluo 4-AM) 등의 형광 칼슘 지시약 등을 들 수 있지만, 본 발명은 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다.
평가법 1에서는, 세포내 칼슘 이온 농도 B에 비해 세포내 칼슘 이온 농도 A가 낮은 경우, 본 발명의 활성 억제제 A 또는 활성 억제제 B는, TRP 채널 활성 억제 작용을 갖는다고 평가할 수 있다. 또, 세포내 칼슘 이온 농도 A와 세포내 칼슘 이온 농도 B 사이의 차가 클수록, 본 발명의 활성 억제제 A 또는 활성 억제제 B는, 높은 TRP 채널 활성 억제 작용을 갖는다고 평가할 수 있다.
평가법 2에서의 전류 A 및 전류 B의 측정 방법으로는, 예를 들면, 패치 클램프법 등을 들 수 있지만, 본 발명은 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다.
평가법 2에서는, 전류 B의 절대치에 비해 전류 A의 절대치가 작은 경우, 본 발명의 활성 억제제 A 또는 활성 억제제 B는, TRP 채널 활성 억제 작용을 갖는다고 평가할 수 있다. 또, 전류 A의 절대치와 전류 B의 절대치 사이의 차가 클수록, 본 발명의 활성 억제제 A 또는 활성 억제제 B는, 높은 TRP 채널 활성 억제 작용을 갖는다고 평가할 수 있다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 TRP 채널 활성 억제제는, 불쾌한 감각 또는 생리학적 사상의 발현에 관여하는 TRP 채널의 활성을 억제할 수 있다. 따라서, 본 발명의 TRP 채널 활성 억제제는, TRP 채널의 활성화에 기인하는 불쾌한 감각 또는 생리학적 사상의 발현을 억제하는 용도, 예를 들면, TRPA1의 활성화에 기인하는 자극을 억제하는 용도에 이용되는 자극 억제제, TRPM8의 활성화에 기인하는 냉감을 조정하는 용도에 이용되는 냉감 조정제, TRPV1의 활성화에 기인하는 통증을 억제하는 용도에 이용되는 통증 억제제, TRPV3의 활성화에 기인하는 피부 세포의 과각화를 억제하는 용도에 이용되는 피부 세포의 과각화 억제제, TRPV4의 활성화에 기인하는 가려움을 억제하는 용도에 이용되는 가려움 억제제 등에 적합하게 이용할 수 있다.
2. TRP 채널의 활성 억제 방법
본 발명의 TRP 채널의 활성 억제 방법(이하, 「활성 억제 방법」이라고 함)은, TRP 채널의 활성을 억제하는 활성 억제 방법으로서, 알루미늄 이온과 TRP 채널을 접촉시키는 것을 특징으로 하는 TRP 채널의 활성 억제 방법이다. 또한, 의료 행위는, 본 발명의 활성 억제 방법의 개념으로부터 제외되어 있어도 되고, 제외되어 있지 않아도 된다. 본 명세서에 있어서, 의료 행위는, 의사 및 의사의 지시를 받은 자가 인간에 대하여 치료를 실시하는 행위를 말한다. 본 발명의 활성 억제 방법에 의하면, 알루미늄 이온과 TRP 채널을 접촉시키기 때문에, TRP 채널의 활성을 효과적으로 억제할 수 있다.
알루미늄 이온과 TRP 채널과의 접촉은, TRP 채널을 포함하는 부위에 알루미늄 이온을 공급함으로써 행할 수 있다. TRP 채널을 포함하는 부위로는, 예를 들면, 피부 표피, 기도 상피, 말초 신경, 눈 점막 등을 들 수 있지만, 본 발명은 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다.
알루미늄 이온과 TRP 채널과의 접촉 시에는, 알루미늄 이온과, 알루미늄 이온을 안정하게 유지하는 성분 등을 병용할 수 있다. 알루미늄 이온을 안정하게 유지하는 성분으로는, 예를 들면, 수계 용매 등을 들 수 있지만, 본 발명은 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다. 또, 알루미늄 이온과 TRP 채널과의 접촉 시에는, 본 발명의 활성 억제제를 이용해도 된다.
알루미늄 이온은, 통상, 액체에 포함되는 상태로 TRP 채널과 접촉시킨다. TRP 채널에 접촉시키는 액체에 포함되는 알루미늄 이온의 양은, 본 발명의 활성 억제 방법의 용도, 적용 대상의 TRP 채널의 종류, 적용 대상의 TRP 채널을 포함하는 부위의 종류 등에 따라 다르기 때문에 일률적으로는 결정할 수 없는 점에서, 본 발명의 활성 억제 방법의 용도, 적용 대상의 TRP 채널의 종류, 적용 대상의 TRP 채널을 포함하는 부위의 종류 등에 따라서 적절히 결정하는 것이 바람직하다. TRP 채널과 접촉시키는 액체에서의 알루미늄 이온의 양은, 예를 들면, 본 발명의 활성 억제 방법의 적용 대상이 말초 신경에 포함되는 TRP 채널인 경우, 통상, TRP 채널 활성 억제 작용을 충분히 발현시키는 관점에서, 바람직하게는 0.01mM 이상, 보다 바람직하게는 0.1mM 이상이고, 다른 조직에의 작용을 저감시키는 관점에서, 바람직하게는 10mM 이하, 보다 바람직하게는 5mM 이하이다.
알루미늄 이온과 TRP 채널과의 접촉 시간은, 본 발명의 활성 억제 방법의 용도, 적용 대상의 TRP 채널의 종류 등에 따라 다르기 때문에 일률적으로는 결정할 수 없는 점에서, 본 발명의 활성 억제 방법의 용도, 적용 대상의 TRP 채널의 종류 등에 따라서 적절히 결정하는 것이 바람직하다.
본 발명의 활성 억제 방법에 의한 TRP 채널 활성 억제 효과는, 상기 활성 억제제에 의한 TRP 채널 활성 억제 작용의 평가와 마찬가지의 수법에 의해 평가할 수 있다.
본 발명의 활성 억제 방법에 의하면, 통증, 과도한 자극감, 과도한 냉감, 과도한 열감, 가려움 등의 불쾌한 감각의 발현 등과의 관련성이 있는 TRP 채널의 활성을 효과적으로 억제할 수 있다. 따라서, 예를 들면, TRP 채널의 활성화에 기인하는 불쾌한 감각을 줄 가능성이 있는 성분을 포함하는 외용제를 사용할 때에, 알루미늄 이온과 당해 외용제를 병용하여 본 발명의 활성 억제 방법을 행함으로써, TRP 채널의 활성을 억제하고, TRP 채널의 활성화에 기인하는 불쾌한 감각의 발현을 억제할 수 있다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 활성 억제 방법에 의하면, 알루미늄 이온과 TRP 채널을 접촉시키기 때문에, TRP 채널의 활성을 효과적으로 억제할 수 있다. 따라서, 본 발명의 활성 억제제는, TRP 채널의 활성화에 기인하는 불쾌한 감각 또는 불쾌한 생리학적 사상의 발현을 억제하는 용도, 예를 들면, TRPA1의 활성화에 기인하는 자극을 억제하는 용도, TRPM8의 활성화에 기인하는 냉감을 조정하는 용도, TRPV1의 활성화에 기인하는 통증을 억제하는 용도, TRPV3의 활성화에 기인하는 피부 세포의 과각화를 억제하는 용도, TRPV4의 활성화에 기인하는 가려움을 억제하는 용도 등에 이용되는 것이 기대된다.
실시예
이하에 실시예에 의해 본 발명을 더욱 자세하게 설명하지만, 본 발명은 이러한 실시예만으로 한정되는 것은 아니다. 이하에 있어서, 각 약어의 의미는, 이하와 같다.
＜약어의 설명＞
DMEM: 둘베코 개변 이글 배지
FBS: 소태아혈청
NMDG-Cl: N-메틸-D-글루카민 염화물
BAPTA: 1,2-비스(o-아미노페녹시드)에탄-N,N,N',N'-테트라초산
HEPES: 2-[4-(2-히드록시에틸)피페라진-1-일]에탄술폰산
AITC: 알릴이소티오시아네이트
4αPDD: 4α-포르볼-12,13-디데카노에이트
형광 강도340nm: 여기 파장 340nm에서의 형광 강도
형광 강도380nm: 여기 파장 380nm에서의 형광 강도
조제예 1
(1) TRPV1 발현 세포의 조제
인간 TRPV1 cDNA(GenBank 액세션 번호: NM_080704로 표시되는 염기 서열의 276∼2795 위치에 대응하는 cDNA)를, 포유동물 세포용 벡터〔인비트로젠사 제조, 상품명: pcDNA3.1(+)〕의 클로닝 사이트에 삽입하여, 인간 TRPV1 발현 벡터를 얻었다. 얻어진 인간 TRPV1 발현 벡터 1㎍과, 유전자 도입용 시약〔인비트로젠사 제조, 상품명: PLUS Reagent(플러스 리젠트), 카탈로그 번호: 11514-015〕 6μL를 혼합하여, 혼합물 I을 얻었다. 또, 유전자 도입용 카티온성 지질〔인비트로젠사 제조, 상품명: 리포펙타민(등록상표), 카탈로그 번호: 18324-012〕 4μL와, 혈청 사용량 저감 배지〔인비트로젠사 제조, 상품명: OPTI-MEM(등록상표) I Reduced-Serum Medium(카탈로그 번호: 11058021)〕 200μL를 혼합하여, 혼합물 Ⅱ를 얻었다.
5 체적％ 이산화탄소 분위기 중, 37℃로 유지된 직경 35mm의 샤알레 상의 10 질량％ FBS 함유 DMEM 중에 있어서, 5×105개의 HEK293 세포를 70％의 컨플루엔시가 될 때까지 배양했다. 얻어진 세포 배양물에, 상기 혼합물 I과 혼합물 Ⅱ를 첨가함으로써, HEK293 세포에 인간 TRPV1 발현 벡터를 도입하여, TRPV1 발현 세포를 얻었다.
(2) TRPA1 발현 세포의 조제
조제예 1(1)에 있어서, 인간 TRPV1 cDNA를 이용하는 대신에 인간 TRPA1 cDNA〔GenBank 액세션 번호: NM_007332로 표시되는 염기 서열의 63∼3888 위치에 대응하는 cDNA〕를 이용한 것을 제외하고, 조제예 1(1)과 마찬가지의 조작을 행하여, TRPA1 발현 세포를 얻었다.
(3) TRPM8 발현 세포의 조제
조제예 1(1)에 있어서, 인간 TRPV1 cDNA를 이용하는 대신에 인간 TRPM8 cDNA〔GenBank 액세션 번호: NM_024080으로 표시되는 염기 서열의 41∼3355 위치에 대응하는 cDNA〕를 이용한 것을 제외하고, 조제예 1(1)과 마찬가지의 조작을 행하여, TRPM8 발현 세포를 얻었다.
(4) TRPV3 발현 세포의 조제
조제예 1(1)에 있어서, 인간 TRPV1 cDNA를 이용하는 대신에 인간 TRPV3 cDNA〔GenBank 액세션 번호: NM_145068로 표시되는 염기 서열의 323∼2695 위치에 대응하는 cDNA〕를 이용한 것을 제외하고, 조제예 1(1)과 마찬가지의 조작을 행하여, TRPV3 발현 세포를 얻었다.
(5) TRPV4 발현 세포의 조제
조제예 1(1)에 있어서, 인간 TRPV1 cDNA를 이용하는 대신에 인간 TRPV4 cDNA〔GenBank 액세션 번호: NM_021625로 표시되는 염기 서열의 90∼2705 위치에 대응하는 cDNA〕를 이용한 것을 제외하고, 조제예 1(1)과 마찬가지의 조작을 행하여, TRPV4 발현 세포를 얻었다.
실시예 1
염화 알루미늄을 그 농도가 5mM이 되도록 용매 A〔조성: 140mM NMDG-Cl, 1mM 염화마그네슘, 5mM BAPTA 및 10mM HEPES 완충액〕에 첨가하여 혼합물을 얻었다. 얻어진 혼합물에 염산을 첨가함으로써, 당해 혼합물의 pH를 5로 조정하여 피험 시료를 얻었다. 얻어진 피험 시료 중에는 알루미늄 이온이 해리된 상태로 존재하고 있었다(알루미늄 이온 농도: 5mM).
비교예 1
용매 A에 염산을 첨가함으로써, 용매 A의 pH를 5로 조정하여 저 pH 자극용 시료를 얻었다.
시험예 1
조제예 1(1)에서 얻어진 TRPV1 발현 세포를 용매 A 중, 37℃에서 2분간 진탕시키면서 인큐베이션함으로써, TRPV1 발현 세포를 세정했다. 다음으로, 세정 후의 TRPV1 발현 세포를 용매 A가 들어간 순환 정온(定溫) 챔버에 넣었다. 순환 정온 챔버 중의 TRPV1 발현 세포에 전극의 선단을 접촉시키고, 전류 기록 소프트웨어〔몰레큘라 디바이스사 제조, 상품명: pCLAMP10〕와 전류 기록 장치〔몰레큘라 디바이스사 제조, 상품명: Axopatch 200B Amplifier〕를 이용하여, 전압을 －60mV로 고정했을 때의 TRPV1 발현 세포내의 전류를 경시적으로 측정했다. 측정 개시 시로부터 30초간 경과 후에, 순환 정온 챔버 내에서, 비교예 1에서 얻어진 저 pH 자극용 시료를 순환시켰다. 저 pH 자극용 시료의 순환 개시 시로부터 50초간 경과 후에, 순환 정온 챔버 내에서, 실시예 1에서 얻어진 피험 시료를 순환시켰다. 실시예 1에서 얻어진 피험 시료의 순환 개시 시로부터 30초간 경과 후에, 순환 정온 챔버 내에서, 비교예 1에서 얻어진 저 pH 자극용 시료를 30초간 순환시켰다. 그 후, 전류 변화의 측정을 종료했다.
시험예 1에 있어서, TRPV1 발현 세포내의 전류의 경시적 변화를 조사한 결과를 도 1에 나타낸다. 도면 중, 「pH 5」는 저 pH 자극의 계속 기간, 「피험 시료」는 피험 시료의 순환 기간을 나타낸다.
도 1에 나타난 결과로부터, TRPV1 발현 세포내의 전류의 절대치는, 저 pH 자극에 의해 증가하지만, 피험 시료의 첨가에 의해 감소하는 것을 알 수 있다. 이러한 결과로부터, 염화 알루미늄으로부터 해리된 알루미늄 이온은, 저 pH 자극에 의해 활성화된 TRPV1의 활성을 억제하는 작용을 갖는 것을 알 수 있다.
실시예 2
염화 알루미늄 및 캡사이신을 염화 알루미늄의 농도가 5mM 및 캡사이신의 농도가 100nM이 되도록 용매 A에 첨가하여 혼합물을 얻었다. 얻어진 혼합물에 염산을 첨가함으로써, 당해 혼합물의 pH를 5로 조정하여 피험 시료를 얻었다. 얻어진 피험 시료 중에는 알루미늄 이온이 해리된 상태로 존재하고 있었다(알루미늄 이온 농도: 5mM).
비교예 2
캡사이신을 그 농도가 100nM이 되도록 용매 A에 첨가하여 아고니스트 함유 시료를 얻었다.
시험예 2
시험예 1에 있어서, 실시예 1에서 얻어진 피험 시료를 이용하는 대신에 실시예 2에서 얻어진 피험 시료를 이용한 것 및 비교예 1에서 얻어진 저 pH 자극용 시료를 이용하는 대신에 비교예 2에서 얻어진 아고니스트 함유 시료를 이용한 것을 제외하고, 시험예 1과 마찬가지의 조작을 행하여, TRPV1 발현 세포내의 전류를 경시적으로 측정했다.
시험예 2에 있어서, TRPV1 발현 세포내의 전류의 경시적 변화를 조사한 결과를 도 2에 나타낸다. 도면 중, 「CAP」는 캡사이신에 의한 자극의 계속 기간, 「피험 시료」는 피험 시료의 순환 기간을 나타낸다.
도 2에 나타난 결과로부터, TRPV1 발현 세포내의 전류의 절대치는, 아고니스트 함유 시료에 포함되는 캡사이신에 의한 자극에 의해 증가하지만, 피험 시료의 첨가에 의해 감소하는 것을 알 수 있다. 이러한 결과로부터, 염화 알루미늄으로부터 해리된 알루미늄 이온은, 캡사이신에 의한 자극에 의해 활성화된 TRPV1의 활성을 억제하는 작용을 갖는 것을 알 수 있다.
또한, 실시예 2에 있어서, 염화 알루미늄을 이용하는 대신에 인산 알루미늄, 황산 알루미늄칼륨 등의 무기산 알루미늄염; 초산 알루미늄 등의 알루미늄 이온으로 해리하는 다른 물질을 이용했을 때도, 염화 알루미늄을 이용했을 때와 마찬가지의 경향이 보인다. 이러한 결과로부터, 알루미늄 이온은, TRPV1의 활성을 억제하는 작용을 갖는 것을 알 수 있다.
시험예 3
(1) 시료의 조제
황산 알루미늄칼륨 및 캡사이신을 황산 알루미늄칼륨의 농도가 1μM〔알루미늄 이온 농도: 1μM(실험번호 1)〕, 10μM〔알루미늄 이온 농도: 10μM(실험번호 2)〕, 100μM〔알루미늄 이온 농도: 100μM(실험번호 3)〕, 200μM〔알루미늄 이온 농도: 200μM(실험번호 4)〕, 500μM〔알루미늄 이온 농도: 500μM(실험번호 5)〕, 1000μM〔알루미늄 이온 농도: 1000μM(실험번호 6)〕, 5000μM〔알루미늄 이온 농도: 5000μM(실험번호 7)〕 또는 10000μM〔알루미늄 이온 농도: 10000μM(실험번호 8)〕 및 캡사이신의 농도가 100nM이 되도록 용매 A에 첨가하여 혼합물을 얻었다. 얻어진 혼합물에 염산을 첨가함으로써, 당해 혼합물의 pH를 5로 조정하여 피험 시료를 얻었다.
(2) 형광 강도비아고니스트의 산출
조제예 1(1)에서 얻어진 TRPV1 발현 세포를, 형광 칼슘 이온 지시약인 FURA 2-AM(인비트로젠사 제조)을 최종 농도 5μM로 포함하는 10 질량％ FBS 함유 DMEM 중, 실온에서 60분간 인큐베이션함으로써, TRPV1 발현 세포에 FURA 2-AM을 도입하여, 지시약 도입 세포를 얻었다. 지시약 도입 세포를 순환 정온 챔버 부착 형광 측정 장치〔하마마츠 포토닉스(주) 제조, 상품명: ARGUS-50〕의 순환 정온 챔버에 넣은 후, 용매 A로 세정했다. 다음으로, 순환 정온 챔버에 비교예 2에서 얻어진 아고니스트 함유 시료를 넣었다. 그 후, 아고니스트 존재하에서의 형광 강도340nm(형광 강도 A)와 아고니스트 존재하에서의 형광 강도380nm(형광 강도 B)를 측정했다.
또, 상기에 있어서, 비교예 2에서 얻어진 아고니스트 함유 시료를 이용하는 대신에 대조(용매 A)를 이용한 것을 제외하고, 상기와 마찬가지의 조작을 행하여, 대조 존재하에서의 형광 강도340nm(형광 강도 C)와 대조 존재하에서의 형광 강도380nm(형광 강도 D)를 측정했다.
형광 강도 A∼D를 이용하여, 식 (I)에 따라, Δ형광 강도비아고니스트를 산출했다.
[Δ형광 강도비아고니스트] ＝[형광 강도 A/형광 강도 B]－[형광 강도 C/형광 강도 D] (I)
또, 비교예 2에서 얻어진 아고니스트 함유 시료를 이용하는 대신에 실험번호 1∼8의 각 피험 시료를 이용한 것을 제외하고, 비교예 2에서 얻어진 아고니스트 함유 시료를 이용했을 때와 마찬가지의 조작을 행하여, 알루미늄 이온 및 아고니스트의 존재하에서의 형광 강도340nm(형광 강도 E)와 알루미늄 이온 및 아고니스트의 존재하에서의 형광 강도380nm(형광 강도 F)를 측정했다.
형광 강도 C∼F를 이용하여, 식 (Ⅱ)에 따라, Δ형광 강도비활성 억제제를 산출했다.
[Δ형광 강도비활성 억제제] ＝[형광 강도 E/형광 강도 F]－[형광 강도 C/형광 강도 D] (Ⅱ)
산출된 Δ형광 강도비아고니스트와 Δ형광 강도비활성 억제제를 이용하여, 식 (Ⅲ)에 따라, TRPV1 활성을 산출했다.
[TRPV1 활성] ＝[Δ형광 강도비활성 억제제/Δ형광 강도비아고니스트] (Ⅲ)
시험예 3에 있어서, 황산 알루미늄칼륨 농도와 TRPV1 활성과의 관계를 조사한 결과를 도 3에 나타낸다.
도 3에 나타난 결과를 이용하여, TRPV1 활성에 대한 황산 알루미늄칼륨의 50％ 저해 농도를 산출했다. 그 결과, TRPV1 활성에 대한 황산 알루미늄칼륨의 50％ 저해 농도는, 246μM인 것을 알 수 있었다. 이상의 결과로부터, TRPV1 활성에 대한 알루미늄 이온의 50％ 저해 농도는, 246μM인 것을 알 수 있었다.
실시예 3
염화 알루미늄 및 AITC를 염화 알루미늄의 농도가 5mM 및 AITC의 농도가 20μM이 되도록 용매 A에 첨가하여 혼합물을 얻었다. 얻어진 혼합물에 염산을 첨가함으로써, 당해 혼합물의 pH를 5로 조정하여 피험 시료를 얻었다. 얻어진 피험 시료 중에는 알루미늄 이온이 해리된 상태로 존재하고 있었다(알루미늄 이온 농도: 5mM).
비교예 3
AITC를 그 농도가 20μM이 되도록 용매 A에 첨가하여 아고니스트 함유 시료를 얻었다.
시험예 4
조제예 1(2)에서 얻어진 TRPA1 발현 세포를 용매 A 중, 37℃에서 2분간 진탕시키면서 인큐베이션함으로써, TRPA1 발현 세포를 세정했다. 세정 후의 TRPA1 발현 세포를 용매 A가 들어간 순환 정온 챔버에 넣었다. 순환 정온 챔버 중의 TRPA1 발현 세포에 전극의 선단을 접촉시키고, 전류 기록 소프트웨어와 전류 기록 장치를 이용하여, 전압을 －60mV로 고정했을 때의 TRPA1 발현 세포내의 전류를 경시적으로 측정했다. 측정 개시 시로부터 30초간 경과 후에, 순환 정온 챔버 내에서, 비교예 3에서 얻어진 아고니스트 함유 시료를 순환시켰다. 비교예 3에서 얻어진 아고니스트 함유 시료의 순환 개시 시로부터 50초간 경과 후에, 순환 정온 챔버 내에서, 실시예 3에서 얻어진 피험 시료를 순환시켰다. 실시예 3에서 얻어진 피험 시료의 순환 개시 시로부터 25초간 경과 후에, 순환 정온 챔버 내에서, 비교예 3에서 얻어진 아고니스트 함유 시료를 순환시켰다. 비교예 3에서 얻어진 아고니스트 함유 시료의 순환 개시 시로부터 50초간 경과 후에, 순환 정온 챔버 내에서, 용매 A를 순환시키고, 전류 변화의 측정을 종료했다.
시험예 4에 있어서, TRPA1 발현 세포내의 전류의 경시적 변화를 조사한 결과를 도 4에 나타낸다. 도면 중, 「AITC」는 AITC에 의한 자극의 계속 기간, 「피험 시료」는 피험 시료의 순환 기간을 나타낸다.
도 4에 나타난 결과로부터, TRPA1 발현 세포내의 전류의 절대치는, 아고니스트 함유 시료에 포함되는 AITC에 의한 자극에 의해 증가하지만, 피험 시료의 첨가에 의해 감소하는 것을 알 수 있다. 이러한 결과로부터, 염화 알루미늄으로부터 해리된 알루미늄 이온은, AITC에 의한 자극에 의해 활성화된 TRPA1의 활성을 억제하는 작용을 갖는 것을 알 수 있다.
또한, 실시예 3에 있어서, 염화 알루미늄을 이용하는 대신에 인산 알루미늄, 황산 알루미늄칼륨 등의 무기산 알루미늄염; 초산 알루미늄 등의 알루미늄 이온으로 해리하는 다른 물질을 이용했을 때도, 염화 알루미늄을 이용했을 때와 마찬가지의 경향이 보인다. 이러한 결과로부터, 알루미늄 이온은, TRPA1의 활성을 억제하는 작용을 갖는 것을 알 수 있다.
실시예 4
염화 알루미늄 및 AITC를 염화 알루미늄의 농도가 500μM 및 AITC의 농도가 20μM이 되도록 용매 A에 첨가하여 혼합물을 얻었다. 얻어진 혼합물에 염산을 첨가함으로써, 당해 혼합물의 pH를 5로 조정하여 피험 시료를 얻었다. 얻어진 피험 시료 중에는 알루미늄 이온이 해리된 상태로 존재하고 있었다(알루미늄 이온 농도: 500μM).
실시예 5
염화 알루미늄 및 AITC를 염화 알루미늄의 농도가 50μM 및 AITC의 농도가 20μM이 되도록 용매 A에 첨가하여 혼합물을 얻었다. 얻어진 혼합물에 염산을 첨가함으로써, 당해 혼합물의 pH를 5로 조정하여 피험 시료를 얻었다. 얻어진 피험 시료 중에는 알루미늄 이온이 해리된 상태로 존재하고 있었다(알루미늄 이온 농도: 50μM).
시험예 5
조제예 1(2)에서 얻어진 TRPA1 발현 세포를 용매 A 중, 37℃에서 2분간 진탕시키면서 인큐베이션함으로써, TRPA1 발현 세포를 세정했다. 다음으로, 세정 후의 TRPA1 발현 세포를 용매 A가 들어간 순환 정온 챔버에 넣었다. 순환 정온 챔버 중의 TRPA1 발현 세포에 전극의 선단을 접촉시키고, 전류 기록 소프트웨어와 전류 기록 장치를 이용하여, 전압을 －60mV로 고정했을 때의 TRPA1 발현 세포내의 전류를 경시적으로 측정했다. 측정 개시 시로부터 30초간 경과 후에, 순환 정온 챔버 내에서, 비교예 3에서 얻어진 아고니스트 함유 시료를 순환시켰다. 비교예 3에서 얻어진 아고니스트 함유 시료의 순환 개시 시로부터 50초간 경과 후에, 순환 정온 챔버 내에서, 실시예 5에서 얻어진 피험 시료를 30초간, 실시예 4에서 얻어진 피험 시료를 30초간, 실시예 3에서 얻어진 피험 시료를 30초간 순환시켰다. 그 후, 순환 정온 챔버 내에서, 비교예 3에서 얻어진 아고니스트 함유 시료를 순환시켰다. 비교예 3에서 얻어진 아고니스트 함유 시료의 순환 개시 시로부터 30초간 경과 후에, 순환 정온 챔버 내에서, 용매 A를 순환시키고, 전류 변화의 측정을 종료했다.식 (IV)에 따라, 억제율을 산출했다.
[억제율] ＝[(아고니스트 함유 시료의 순환 전후의 전류의 변화량)－(피험 시료의 순환 전후의 전류의 변화량)]/[아고니스트 함유 시료의 순환 전후의 전류의 변화량] (IV)
시험예 5에 있어서, 염화 알루미늄 농도와 억제율과의 관계를 조사한 결과를 도 5에 나타낸다.
도 5에 나타난 결과로부터, 염화 알루미늄은, 농도 의존적으로 TRPA1의 활성을 억제하는 것을 알 수 있다. 이러한 결과로부터, 염화 알루미늄으로부터 해리된 알루미늄 이온은, 농도 의존적으로 TRPA1의 활성을 억제하는 것을 알 수 있다.
실시예 6
염화 알루미늄 및 멘톨을 염화 알루미늄의 농도가 5mM 및 멘톨의 농도가 1mM이 되도록 용매 A에 첨가하여 혼합물을 얻었다. 얻어진 혼합물에 염산을 첨가함으로써, 당해 혼합물의 pH를 5로 조정하여 피험 시료를 얻었다. 얻어진 피험 시료 중에는 알루미늄 이온이 해리된 상태로 존재하고 있었다(알루미늄 이온 농도: 5mM).
비교예 4
멘톨을 그 농도가 1mM이 되도록 용매 A에 첨가하여 아고니스트 함유 시료를 얻었다.
시험예 6
조제예 1(3)에서 얻어진 TRPM8 발현 세포를 용매 A 중, 37℃에서 2분간 진탕시키면서 인큐베이션함으로써, TRPM8 발현 세포를 세정했다. 다음으로, 세정 후의 TRPM8 발현 세포를 용매 A가 들어간 순환 정온 챔버에 넣었다. 순환 정온 챔버 중의 TRPM8 발현 세포에 전극의 선단을 접촉시키고, 전류 기록 소프트웨어와 전류 기록 장치를 이용하여, 전압을 －60mV로 고정했을 때의 TRPM8 발현 세포내의 전류를 경시적으로 측정했다. 측정 개시 시로부터 20초간 경과 후에, 순환 정온 챔버 내에서, 비교예 1에서 얻어진 저 pH 자극용 시료를 순환시켰다. 저 pH 자극용 시료의 순환 개시 시로부터 15초간 경과 후에, 순환 정온 챔버 내에서, 비교예 4에서 얻어진 아고니스트 함유 시료를 순환시켰다. 비교예 4에서 얻어진 아고니스트 함유 시료의 순환 개시 시로부터 30초간 경과 후에, 순환 정온 챔버 내에서, 실시예 6에서 얻어진 피험 시료를 순환시켰다. 실시예 6에서 얻어진 피험 시료의 순환 개시 시로부터 30초간 경과 후에, 순환 정온 챔버 내에서, 비교예 4에서 얻어진 아고니스트 함유 시료를 순환시켰다. 비교예 4에서 얻어진 아고니스트 함유 시료의 순환 개시 시로부터 50초간 경과 후에, 순환 정온 챔버 내에서, 비교예 1에서 얻어진 저 pH 자극용 시료를 순환시켰다. 저 pH 자극용 시료의 순환 개시 시로부터 60초간 경과 후에, 순환 정온 챔버 내에서, 용매 A를 순환시키고, 전류 변화의 측정을 종료했다.
시험예 6에 있어서, TRPM8 발현 세포내의 전류의 경시적 변화를 조사한 결과를 도 6에 나타낸다. 도면 중, 「멘톨」은 멘톨에 의한 자극의 계속 기간, 「pH 5」는 저 pH 자극의 계속 기간, 「피험 시료」는 피험 시료의 순환 기간을 나타낸다.
도 6에 나타난 결과로부터, TRPM8 발현 세포내의 전류의 절대치는, 아고니스트 함유 시료에 포함되는 멘톨에 의한 자극에 의해 증가하지만, 저 pH 자극에 의해 감소하고, 피험 시료의 첨가에 의해 더욱 감소하는 것을 알 수 있다. 이러한 결과로부터, 염화 알루미늄으로부터 해리된 알루미늄 이온은, 멘톨에 의한 자극에 의해 활성화된 TRPM8의 활성을 억제하는 작용을 갖는 것을 알 수 있다.
또한, 실시예 6에 있어서, 염화 알루미늄을 이용하는 대신에 인산 알루미늄, 황산 알루미늄칼륨 등의 무기산 알루미늄염; 초산 알루미늄 등의 알루미늄 이온으로 해리하는 다른 물질을 이용했을 때도, 염화 알루미늄을 이용했을 때와 마찬가지의 경향이 보인다. 이러한 결과로부터, 알루미늄 이온은, TRPM8의 활성을 억제하는 작용을 갖는 것을 알 수 있다.
실시예 7
염화 알루미늄 및 캄퍼를 염화 알루미늄의 농도가 5mM 및 캄퍼의 농도가 1mM이 되도록 용매 A에 첨가하여 혼합물을 얻었다. 얻어진 혼합물에 염산을 첨가함으로써, 당해 혼합물의 pH를 5로 조정하여 피험 시료를 얻었다. 얻어진 피험 시료 중에는 알루미늄 이온이 해리된 상태로 존재하고 있었다(알루미늄 이온 농도: 5mM).
비교예 5
캄퍼를 그 농도가 1mM이 되도록 용매 A에 첨가하여 아고니스트 함유 시료를 얻었다.
시험예 7
조제예 1(4)에서 얻어진 TRPV3 발현 세포를, 형광 칼슘 이온 지시약인 FURA 2-AM(인비트로젠사 제조)을 최종 농도 5μM으로 포함하는 10 질량％ FBS 함유 DMEM 중, 실온에서 60분간 인큐베이션함으로써, TRPV3 발현 세포에 FURA 2-AM을 도입하여, 지시약 도입 세포를 얻었다. 지시약 도입 세포를 용매 A 중, 37℃에서 2분간 진탕시키면서 인큐베이션함으로써, 지시약 도입 세포를 세정했다. 세정 후의 지시약 도입 세포를 순환 정온 챔버 부착 형광 측정 장치〔하마마츠 포토닉스(주) 제조, 상품명: ARGUS-50〕의 순환 정온 챔버에 넣은 후, 대조(용매 A)를 순환시키는 동시에, 형광 강도340nm 및 형광 강도380nm의 측정을 개시했다. 대조(용매 A)의 순환 개시 시로부터 50초간 경과 후에, 순환 정온 챔버 내에서, 비교예 5에서 얻어진 아고니스트 함유 시료를 순환시켰다. 비교예 5에서 얻어진 아고니스트 함유 시료의 순환 개시 시로부터 100초간 경과 후에, 순환 정온 챔버 내에서, 실시예 7에서 얻어진 피험 시료를 100초간 순환시켰다.
형광 강도340nm 및 형광 강도380nm를 이용하여, 식 (V)에 따라 형광 강도비를 산출했다.
[형광 강도비] ＝[형광 강도340nm/형광 강도380nm] (V)
시험예 7에 있어서, 형광 강도비의 경시적 변화를 조사한 결과를 도 7에 나타낸다. 도면 중, 「캄퍼」는 캄퍼에 의한 자극의 계속 기간, 「피험 시료」는 피험 시료의 순환 기간을 나타낸다.
도 7에 나타난 결과로부터, 형광 강도비는, 아고니스트 함유 시료에 포함되는 캄퍼에 의한 자극의 개시에 의해 증가하지만, 피험 시료의 첨가에 의해 감소하는 것을 알 수 있다. 이러한 결과로부터, 염화 알루미늄으로부터 해리된 알루미늄 이온은, 캄퍼에 의한 자극에 의해 활성화된 TRPV3의 활성을 억제하는 작용을 갖는 것을 알 수 있다.
또한, 실시예 7에 있어서, 염화 알루미늄을 이용하는 대신에 인산 알루미늄, 황산 알루미늄칼륨 등의 무기산 알루미늄염; 초산 알루미늄 등의 알루미늄 이온으로 해리하는 다른 물질을 이용했을 때도, 염화 알루미늄을 이용했을 때와 마찬가지의 경향이 보인다. 이러한 결과로부터, 알루미늄 이온은, TRPV3의 활성을 억제하는 작용을 갖는 것을 알 수 있다.
실시예 8
염화 알루미늄 및 4αPDD를 염화 알루미늄의 농도가 5mM 및 4αPDD의 농도가 10μM이 되도록 용매 A에 첨가하여 혼합물을 얻었다. 얻어진 혼합물에 염산을 첨가함으로써, 당해 혼합물의 pH를 5로 조정하여 피험 시료를 얻었다. 얻어진 피험 시료 중에는 알루미늄 이온이 해리된 상태로 존재하고 있었다(알루미늄 이온 농도: 5mM).
비교예 6
4αPDD를 그 농도가 10μM이 되도록 용매 A에 첨가하여 아고니스트 함유 시료를 얻었다.
시험예 8
시험예 7에 있어서, 조제예 1(4)에서 얻어진 TRPV3 발현 세포를 이용하는 대신에 조제예 1(5)에서 얻어진 TRPV4 발현 세포를 이용한 것, 비교예 5에서 얻어진 아고니스트 함유 시료를 이용하는 대신에 비교예 6에서 얻어진 아고니스트 함유 시료를 이용한 것, 및 실시예 7에서 얻어진 피험 시료를 이용하는 대신에 실시예 8에서 얻어진 피험 시료를 이용한 것을 제외하고, 시험예 7과 마찬가지의 조작을 행하여, 형광 강도비의 경시적 변화를 조사했다.
시험예 8에 있어서, 형광 강도비의 경시적 변화를 조사한 결과를 도 8에 나타낸다. 도면 중, 「4αPDD」는 4αPDD에 의한 자극의 계속 기간, 「피험 시료」는 피험 시료의 순환 기간을 나타낸다.
도 8에 나타난 결과로부터, 형광 강도비는, 아고니스트 함유 시료에 포함되는 4αPDD에 의한 자극의 개시에 의해 증가하지만, 피험 시료의 첨가에 의해 감소하는 것을 알 수 있다. 이러한 결과로부터, 염화 알루미늄으로부터 해리된 알루미늄 이온은, 4αPDD에 의한 자극에 의해 활성화된 TRPV4의 활성을 억제하는 작용을 갖는 것을 알 수 있다.
또한, 실시예 8에 있어서, 염화 알루미늄을 이용하는 대신에 인산 알루미늄, 황산 알루미늄칼륨 등의 무기산 알루미늄염; 초산 알루미늄 등의 알루미늄 이온으로 해리하는 다른 물질을 이용했을 때도, 염화 알루미늄을 이용했을 때와 마찬가지의 경향이 보인다. 이러한 결과로부터, 알루미늄 이온은, TRPV4의 활성을 억제하는 작용을 갖는 것을 알 수 있다.
비교예 7
수산화 알루미늄 겔(수산화 알루미늄의 함유율 1.3 질량％) 및 캡사이신을 수산화 알루미늄 겔의 농도가 5 질량％(20배 희석) 및 캡사이신의 농도가 1μM이 되도록 용매 A에 첨가하여 피험 시료를 얻었다.
비교예 8
캡사이신을 그 농도가 1μM이 되도록 용매 A에 첨가하여 피험 시료를 얻었다.
시험예 9
조제예 1(1)에서 얻어진 TRPV1 발현 세포를, 형광 칼슘 이온 지시약인 FURA 2-AM(인비트로젠사 제조)을 최종 농도 5μM로 포함하는 10 질량％ FBS 함유 DMEM 중, 실온에서 60분간 인큐베이션함으로써, TRPV1 발현 세포에 FURA 2-AM을 도입하여, 지시약 도입 세포를 얻었다. 지시약 도입 세포를 용매 A 중, 37℃에서 2분간 진탕시키면서 인큐베이션함으로써, 지시약 도입 세포를 세정했다. 세정 후의 지시약 도입 세포를 순환 정온 챔버 부착 형광 측정 장치의 순환 정온 챔버에 넣었다. 그 후, 용매 A를 순환시키는 동시에, 형광 강도340nm 및 형광 강도380nm의 측정을 개시했다. 용매 A의 순환 개시 시로부터 50초간 경과 시(대조의 순환 종료 시)에 대조 존재하에서의 형광 강도340nm(형광 강도 G) 및 대조 존재하에서의 형광 강도380nm(형광 강도 H)를 취득했다. 순환 정온 챔버 내에서, 비교예 7에서 얻어진 피험 시료를 50초간 순환시키고, 당해 피험 시료의 순환 종료 시에 수산화 알루미늄 겔 및 아고니스트 존재하에서의 형광 강도340nm(형광 강도 I) 및 수산화 알루미늄 겔 및 아고니스트 존재하에서의 형광 강도380nm(형광 강도 J)를 취득했다. 다음으로, 순환 정온 챔버 내에서, 대조(용매 A)를 100초간 순환시켰다. 그 후, 순환 정온 챔버 내에서, 비교예 8에서 얻어진 피험 시료를 50초간 순환시키고, 당해 피험 시료의 순환 종료 시에 아고니스트 존재하에서의 형광 강도340nm(형광 강도 K) 및 아고니스트 존재하에서의 형광 강도380nm(형광 강도 L)를 취득했다.
형광 강도 G, H, I 및 J를 이용하여, 식 (Ⅵ)에 따라, Δ형광 강도비수산화 알루미늄 겔을 산출했다.
[Δ형광 강도비수산화 알루미늄 겔] ＝[형광 강도 I/형광 강도 J]－[형광 강도 G/형광 강도 H] (Ⅵ)
형광 강도 G, H, K 및 L을 이용하여, 식 (Ⅶ)에 따라, Δ형광 강도비아고니스트를 산출했다.
[Δ형광 강도비아고니스트] ＝[형광 강도 K/형광 강도 L]－[형광 강도 G/형광 강도 H] (Ⅶ)
산출된 Δ형광 강도비수산화 알루미늄 겔과 Δ형광 강도비아고니스트를 이용하여, 식(Ⅷ)에 따라 TRPV1 활성을 산출했다.
[TRPV1 활성 또는 TRPA1 활성] ＝[Δ형광 강도비수산화 알루미늄 겔/Δ형광 강도비아고니스트] (Ⅷ)
시험예 9에 있어서, 시료의 종류와 TRPV1 활성과의 관계를 조사한 결과를 도 9에 나타낸다. 도면 중, 레인 1은 비교예 7에서 얻어진 피험 시료를 이용했을 때의 TRPV1 활성, 레인 2는 비교예 8에서 얻어진 피험 시료를 이용했을 때의 TRPV1 활성을 나타낸다.
도 9에 나타난 결과로부터, 수산화 알루미늄 겔과 아고니스트를 포함하는 피험 시료(비교예 7)를 이용했을 때의 TRPV1 활성은, 아고니스트를 포함하는 피험 시료(비교예 8)를 이용했을 때의 TRPV1 활성에 비해 높은 것을 알 수 있다. 이러한 결과로부터, 수산화 알루미늄 겔은, TRPV1 활성 억제 작용을 갖고 있지 않고, TRPV1 활성 촉진 작용을 갖고 있는 것을 알 수 있다.
비교예 9
수산화 알루미늄 겔(수산화 알루미늄의 함유율 1.3 질량％) 및 AITC를 수산화 알루미늄 겔의 농도가 5 질량％(20배 희석) 및 AITC의 농도가 20μM이 되도록 용매 A에 첨가하여 피험 시료를 얻었다.
비교예 10
AITC를 그 농도가 20μM이 되도록 용매 A에 첨가하여 피험 시료를 얻었다.
시험예 10
시험예 9에 있어서, 조제예 1(1)에서 얻어진 TRPV1 발현 세포를 이용하는 대신에 조제예 1(2)에서 얻어진 TRPA1 발현 세포를 이용한 것, 비교예 7에서 얻어진 피험 시료를 이용하는 대신에 비교예 9에서 얻어진 피험 시료를 이용한 것, 및 비교예 8에서 얻어진 피험 시료를 이용하는 대신에 비교예 10에서 얻어진 피험 시료를 이용한 것을 제외하고, 시험예 9와 마찬가지의 조작을 행하여, TRPA1 활성을 산출했다.
시험예 10에 있어서, 시료의 종류와 TRPA1 활성과의 관계를 조사한 결과를 도 10에 나타낸다. 도면 중, 레인 1은 비교예 9에서 얻어진 피험 시료를 이용했을 때의 TRPA1 활성, 레인 2는 비교예 10에서 얻어진 피험 시료를 이용했을 때의 TRPA1 활성을 나타낸다.
도 10에 나타난 결과로부터, 수산화 알루미늄 겔과 아고니스트를 포함하는 피험 시료(비교예 9)를 이용했을 때의 TRPA1 활성은, 아고니스트를 포함하는 피험 시료(비교예 10)를 이용했을 때의 TRPA1 활성에 비해 높은 것을 알 수 있다. 이러한 결과로부터, 수산화 알루미늄 겔은, TRPA1 활성 억제 작용을 갖고 있지 않고, TRPA1 활성 촉진 작용을 갖고 있는 것을 알 수 있다.
조제예 2
(1) 피험 시료 A의 조제
황산 알루미늄칼륨을 그 농도가 1μM〔알루미늄 이온 농도: 1μM(실험번호 9)〕, 10μM〔알루미늄 이온 농도: 10μM(실험번호 10)〕, 100μM〔알루미늄 이온 농도: 100μM(실험번호 11)〕, 200μM〔알루미늄 이온 농도: 200μM(실험번호 12)〕, 500μM〔알루미늄 이온 농도: 500μM(실험번호 13)〕, 1000μM〔알루미늄 이온 농도: 1000μM(실험번호 14)〕, 5000μM〔알루미늄 이온 농도: 5000μM(실험번호 15)〕 또는 10000μM〔알루미늄 이온 농도: 10000μM(실험번호 16)〕이 되도록 용매 A에 첨가하여 혼합물을 얻었다. 얻어진 혼합물에 염산을 첨가함으로써, 당해 혼합물의 pH를 4로 조정하여 피험 시료 A를 얻었다.
(2) 피험 시료 B의 조제
황산 알루미늄칼륨 및 AITC를 황산 알루미늄칼륨의 농도가 1μM〔알루미늄 이온 농도: 1μM(실험번호 9)〕, 10μM〔알루미늄 이온 농도: 10μM(실험번호 10)〕, 100μM〔알루미늄 이온 농도: 100μM(실험번호 11)〕, 200μM〔알루미늄 이온 농도: 200μM(실험번호 12)〕, 500μM〔알루미늄 이온 농도: 500μM(실험번호 13)〕, 1000μM〔알루미늄 이온 농도: 1000μM(실험번호 14)〕, 5000μM〔알루미늄 이온 농도: 5000μM(실험번호 15)〕 또는 10000μM〔알루미늄 이온 농도: 10000μM(실험번호 16)〕 및 AITC의 농도가 5μM이 되도록 용매 A에 첨가하여 혼합물을 얻었다. 얻어진 혼합물에 염산을 첨가함으로써, 당해 혼합물의 pH를 4로 조정하여 피험 시료 B를 얻었다.
조제예 3
AITC를 그 농도가 5μM이 되도록 용매 A에 첨가하여 혼합물을 얻었다. 얻어진 혼합물에 염산을 첨가함으로써, 당해 혼합물의 pH를 4로 조정하여 아고니스트 함유 시료를 얻었다.
시험예 11
조제예 1(2)에서 얻어진 TRPA1 발현 세포를, FURA 2-AM(인비트로젠사 제조)을 최종 농도 5μM로 포함하는 10 질량％ FBS 함유 DMEM 중, 실온에서 60분간 인큐베이션함으로써, TRPA1 발현 세포에 FURA 2-AM을 도입하여, 지시약 도입 세포를 얻었다. 지시약 도입 세포를 용매 A 중, 37℃에서 2분간 진탕시키면서 인큐베이션함으로써, 지시약 도입 세포를 세정했다. 세정 후의 지시약 도입 세포를 순환 정온 챔버 부착 형광 측정 장치의 순환 정온 챔버에 넣었다. 그 후, 순환 정온 챔버 내에서, 용매 A를 순환시키는 동시에, 형광 강도340nm 및 형광 강도380nm의 측정을 개시했다.
용매 A의 순환 개시 시로부터 50초간 경과 시(대조의 순환 종료 시)에 대조 존재하에서의 형광 강도340nm(형광 강도 M) 및 대조 존재하에서의 형광 강도380nm(형광 강도 N)를 취득했다. 그 후, 순환 정온 챔버 내에서, 실험번호 9의 피험 시료 A를 50초간 순환시켰다. 다음으로, 순환 정온 챔버 내에서, 실험번호 9의 피험 시료 B를 100초간 순환시키고, 당해 피험 시료 B의 순환 종료 시에 알루미늄 이온 및 아고니스트(AITC) 존재하에서의 형광 강도340nm(형광 강도 O) 및 알루미늄 이온 및 아고니스트(AITC) 존재하에서의 형광 강도380nm(형광 강도 P)를 취득했다. 다음으로, 순환 정온 챔버 내에서, 대조(용매 A)를 100초간 순환시켰다. 그 후, 순환 정온 챔버 내에서, 조제예 3에서 얻어진 아고니스트 함유 시료를 100초간 순환시키고, 당해 아고니스트 함유 시료의 순환 종료 시에 아고니스트 존재하에서의 형광 강도340nm(형광 강도 Q) 및 아고니스트 존재하에서의 형광 강도380nm(형광 강도 R)를 취득했다.
형광 강도 M, N, O 및 P를 이용하여, 식 (Ⅸ)에 따라, Δ형광 강도비활성 억제제를 산출했다.
[Δ형광 강도비활성 억제제] ＝[형광 강도 O/형광 강도 P]－[형광 강도 M/형광 강도 N] (Ⅸ)
형광 강도 M, N, Q 및 R를 이용하여, 식 (Ⅹ)에 따라, Δ형광 강도비아고니스트를 산출했다.
[Δ형광 강도비아고니스트] ＝[형광 강도 Q/형광 강도 R]－[형광 강도 M/형광 강도 N] (Ⅹ)
산출된 Δ형광 강도비활성 억제제와 Δ형광 강도비아고니스트를 이용하여, 식 (XI)에 따라, TRPA1 활성의 억제율을 산출했다.
[억제율] ＝[Δ형광 강도비아고니스트－Δ형광 강도비활성 억제제]/[Δ형광 강도비아고니스트] (XI)
또, 상기에 있어서, 실험번호 9의 피험 시료 A 및 피험 시료 B를 이용하는 대신에 실험번호 10∼16의 피험 시료 A 및 피험 시료 B를 이용한 것을 제외하고, 실험번호 9의 피험 시료 A 및 피험 시료 B를 이용했을 때와 마찬가지의 조작을 행하여, TRPA1 활성의 억제율을 산출했다.
시험예 11에 있어서, 황산 알루미늄칼륨 농도와 TRPA1 활성의 억제율과의 관계를 조사한 결과를 도 11에 나타낸다.
도 11에 나타난 결과를 이용하여, TRPA1 활성에 대한 황산 알루미늄칼륨의 50％ 저해 농도를 산출했다. 그 결과, TRPA1 활성에 대한 황산 알루미늄칼륨의 50％ 저해 농도는, 103μM인 것을 알 수 있었다. 이상의 결과로부터, TRPA1 활성에 대한 알루미늄 이온의 50％ 저해 농도는, 103μM인 것을 알 수 있었다.
조제예 4
(1) 피험 시료 C의 조제
황산 알루미늄칼륨을 그 농도가 1000μM〔알루미늄 이온 농도: 1000μM〕이 되도록 용매 A에 첨가하여 혼합물을 얻었다. 얻어진 혼합물에 염산 또는 수산화 나트륨을 첨가함으로써, 당해 혼합물의 pH를 4(실험번호 17), 6(실험번호 18) 또는 7.4(실험번호 19)로 조정하여 피험 시료 C를 얻었다.
(2) 피험 시료 D의 조제
황산 알루미늄칼륨과 캡사이신을 황산 알루미늄칼륨의 농도가 1000μM〔알루미늄 이온 농도: 1000μM] 및 캡사이신의 농도가 100nM이 되도록 용매 A에 첨가하여 혼합물을 얻었다. 얻어진 혼합물에 염산 또는 수산화 나트륨을 첨가함으로써, 당해 혼합물의 pH를 4(실험번호 17), 6(실험번호 18) 또는 7.4(실험번호 19)로 조정하여 피험 시료 D를 얻었다.
(3) 피험 시료 E의 조제
황산 알루미늄칼륨과 AITC를 황산 알루미늄칼륨의 농도가 1000μM〔알루미늄 이온 농도: 1000μM] 및 AITC의 농도가 5μM이 되도록 용매 A에 첨가하여 혼합물을 얻었다. 얻어진 혼합물에 염산 또는 수산화 나트륨을 첨가함으로써, 당해 혼합물의 pH를 4(실험번호 17), 6(실험번호 18) 또는 7.4(실험번호 19)로 조정하여 피험 시료 E를 얻었다.
조제예 5
캡사이신을 그 농도가 100nM이 되도록 용매 A에 첨가하여 혼합물을 얻었다. 얻어진 혼합물에 염산 또는 수산화 나트륨을 첨가함으로써, 당해 혼합물의 pH를 4(실험번호 17), 6(실험번호 18) 또는 7.4(실험번호 19)로 조정하여 아고니스트 함유 시료를 얻었다.
조제예 6
AITC를 그 농도가 5μM이 되도록 용매 A에 첨가하여 혼합물을 얻었다. 얻어진 혼합물에 염산 또는 수산화 나트륨을 첨가함으로써, 당해 혼합물의 pH를 4(실험번호 17), 6(실험번호 18) 또는 7.4(실험번호 19)로 조정하여 아고니스트 함유 시료를 얻었다.
시험예 12
(1) TRPV1 활성의 억제율의 산출
조제예 1(1)에서 얻어진 TRPV1 발현 세포를, FURA 2-AM(인비트로젠사 제조)을 최종 농도 5μM로 포함하는 10 질량％ FBS 함유 DMEM 중, 실온에서 60분간 인큐베이션함으로써, TRPV1 발현 세포에 FURA 2-AM을 도입하여, 지시약 도입 세포를 얻었다. 지시약 도입 세포를 용매 A 중, 37℃에서 2분간 진탕시키면서 인큐베이션함으로써, 지시약 도입 세포를 세정했다. 세정 후의 지시약 도입 세포를 순환 정온 챔버 부착 형광 측정 장치의 순환 정온 챔버에 넣은 후, 용매 A를 순환시키는 동시에, 형광 강도340nm 및 형광 강도380nm의 측정을 개시했다.
용매 A의 순환 개시 시로부터 50초간 경과 시(대조의 순환 종료 시)에 대조 존재하에서의 형광 강도340nm(형광 강도 M) 및 대조 존재하에서의 형광 강도380nm(형광 강도 N)를 취득했다. 그 후, 순환 정온 챔버 내에서, 실험번호 17의 피험 시료 C를 50초간 순환시켰다. 다음으로, 순환 정온 챔버 내에서, 실험번호 17의 피험 시료 D를 100초간 순환시키고, 당해 피험 시료 D의 순환 종료 시에 알루미늄 이온 및 아고니스트(캡사이신) 존재하에서의 형광 강도340nm(형광 강도 O), 및 알루미늄 이온 및 아고니스트(캡사이신) 존재하에서의 형광 강도380nm(형광 강도 P)를 취득했다. 다음으로, 순환 정온 챔버 내에서, 대조(용매 A)를 100초간 순환시켰다. 그 후, 순환 정온 챔버 내에서, 조제예 5에서 얻어진 실험번호 17의 아고니스트 함유 시료를 100초간 순환시키고, 당해 아고니스트 함유 시료의 순환 종료 시에 아고니스트 존재하에서의 형광 강도340nm(형광 강도 Q) 및 아고니스트 존재하에서의 형광 강도380nm(형광 강도 R)를 취득했다.
형광 강도 M∼R을 이용하여, 식 (Ⅸ), 식 (Ⅹ) 및 식 (XI)에 따라, TRPV1 활성의 억제율을 산출했다.
또, 상기에 있어서, 실험번호 17의 피험 시료 C 및 피험 시료 D를 이용하는 대신에 실험번호 18∼19의 피험 시료 C 및 피험 시료 D를 이용한 것을 제외하고, 실험번호 17의 피험 시료 C 및 피험 시료 D를 이용했을 때와 마찬가지의 조작을 행하여, TRPV1 활성의 억제율을 산출했다.
시험예 12에 있어서, 피험 시료의 pH와 TRPV1 활성의 억제율과의 관계를 조사한 결과를 도 12에 나타낸다.
(2) TRPA1 활성의 억제율의 산출
시험예 12(1)에 있어서, 조제예 1(1)에서 얻어진 TRPV1 발현 세포를 이용하는 대신에 조제예 1(2)에서 얻어진 TRPA1 발현 세포를 이용한 것, 피험 시료 D를 이용하는 대신에 피험 시료 E를 이용한 것, 및 조제예 5에서 얻어진 아고니스트 함유 시료를 이용하는 대신에 조제예 6에서 얻어진 아고니스트 함유 시료를 이용한 것을 제외하고, 시험예 12(1)과 마찬가지의 조작을 행하여, TRPA1 활성의 억제율을 산출했다.
시험예 12에 있어서, 피험 시료의 pH와 TRPA1 활성의 억제율과의 관계를 조사한 결과를 도 12에 나타낸다. 도면 중, 흑색 바는 TRPV1 활성의 억제율, 백색 바는 TRPA1 활성의 억제율을 나타낸다.
도 12에 나타난 결과로부터, TRPV1 활성의 억제율 및 TRPA1 활성의 억제율은, pH가 4, 6 및 7.4의 순으로 높은 것을 알 수 있다. 이러한 결과로부터, 알루미늄 이온으로 해리하는 물질로서 황산 알루미늄칼륨을 이용한 경우, 활성 억제제의 pH를 1∼6.5, 바람직하게는 4∼6으로 조정함으로써, TRPV1 활성 및 TRPA1 활성의 억제율을 향상시킬 수 있는 것을 알 수 있다.
이상 설명한 바와 같이, 알루미늄 이온은, TRPA1, TRPV1, TRPM8, TRPV3, TRPV4 등의 TRP 채널의 활성을 억제하는 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 활성 억제제는, 알루미늄 이온을 함유하기 때문에, TRP 채널의 활성화에 기인하는 불쾌한 감각 또는 생리학적 사상의 발현을 억제 또는 조정하는 약제, 예를 들면, TRPA1의 활성화에 기인하는 자극을 억제하는 용도에 이용되는 자극 억제제, TRPM8의 활성화에 기인하는 냉감을 조정하는 용도에 이용되는 냉감 조정제, TRPV1의 활성화에 기인하는 통증을 억제하는 용도에 이용되는 통증 억제제, TRPV3의 활성화에 기인하는 피부 세포의 과각화를 억제하는 용도에 이용되는 피부 세포의 과각화 억제제, TRPV4의 활성화에 기인하는 가려움을 억제하는 용도에 이용되는 가려움 억제제 등의 용도에 이용되는 것이 기대된다. 또, 본 발명의 활성 억제 방법은, 알루미늄 이온과 TRP 채널을 접촉시키기 때문에 TRP 채널의 활성화에 기인하는 불쾌한 감각 또는 생리학적 사상의 발현의 억제 또는 조정, 예를 들면, TRPA1의 활성화에 기인하는 자극의 억제, TRPM8의 활성화에 기인하는 냉감의 조정, TRPV1의 활성화에 기인하는 통증의 억제, TRPV3의 활성화에 기인하는 피부 세포의 과각화의 억제, TRPV4의 활성화에 기인하는 가려움의 억제 등에 이용되는 것이 기대된다.

Claims (3)

  1. TRP 채널의 활성을 억제하기 위한 TRP 채널 활성 억제제로서, 상기 TRP 채널의 활성을 억제하기 위한 유효 성분으로서 알루미늄 이온을 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 TRP 채널 활성 억제제.
  2. TRP 채널의 활성을 억제하기 위한 TRP 채널 활성 억제제로서, 상기 TRP 채널의 활성을 억제하기 위한 유효 성분으로서 알루미늄 이온으로 해리하는 물질이 배합되어 있는 것을 특징으로 하는 TRP 채널 활성 억제제.
  3. TRP 채널의 활성을 억제하는 활성 억제 방법으로서, 알루미늄 이온과 TRP 채널을 접촉시키는 것을 특징으로 하는 TRP 채널의 활성 억제 방법.
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